Prezentujemy zoptymalizowaną procedurę miejscowego wyrzucania za pomocą szklanej mikropipety i szybkiej metody obrazowania dwufotonowego hiperstosu, która pozwala na precyzyjny pomiar zmian średnicy kapilary i badanie jej regulacji w trzech wymiarach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trójwymiarowa mikroskopia dwufotonowa in vivo do badania przeprowadziła odpowiedzi naczyniowe poprzez miejscowy wyrzut ATP za pomocą szklanej mikropipety
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Utrzymanie prawidłowego funkcjonowania mózgu wymaga wystarczającego i wydajnego dostarczania tlenu i składników odżywczych przez złożoną sieć naczyń. Jednak regulacja przepływu krwi w mózgu (CBF) nie jest w pełni zrozumiała, zwłaszcza na poziomie naczyń włosowatych. Mikroskopia dwufotonowa jest potężnym narzędziem szeroko stosowanym do badania CBF i jego regulacji. Obecnie pole to jest ograniczone przez brak badań in vivo z użyciem mikroskopii dwufotonowej badających (1) odpowiedzi CBF w trzech wymiarach, (2) przeprowadzone odpowiedzi naczyniowe oraz (3) interwencje miejscowe w sieci naczyniowej. W tym miejscu opisujemy metodę 3D in vivo wykorzystującą mikroskopię dwufotonową do badania przeprowadzonych odpowiedzi naczyniowych wywołanych przez miejscowy wyrzut ATP za pomocą szklanej mikropipety. Nasza metoda wykorzystuje szybkie i powtarzalne obrazowanie dwufotonowe hyperstack, zapewniając precyzyjne pomiary średnicy poprzez projekcję maksymalnej intensywności uzyskanych obrazów. Ponadto pokazujemy, że ta metoda może być również wykorzystana do badania 3D astrocytarnych odpowiedzi wapniowych. Omówiono również zalety i ograniczenia wprowadzania szklanych mikropipet i obrazowania dwufotonowego hiperstosu.
Wprowadzenie
Mózg ma wysoki wskaźnik zużycia energii. Około 20% tlenu i 25% glukozy zużywanych przez ludzkie ciało jest przeznaczone do funkcjonowania mózgu, podczas gdy mózg zajmuje tylko 2% całkowitej masy ciała. Utrzymanie prawidłowego funkcjonowania mózgu wymaga wystarczającego i wydajnego zaopatrzenia w tlen i składniki odżywcze poprzez przepływ krwi w złożonej sieci naczyń. Lokalna aktywność mózgu i mózgowy przepływ krwi (CBF) są silnie sprzężone, w zależności od właściwości funkcjonalnych neuronów, astrocytów, perycytów, komórek mięśni gładkich (SMC) i komórek śródbłonka (EC)1. Ostatnio kilka pierwszych rzędów naczyń włosowatych rozgałęziających się ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Duński Krajowy Komitet Etyki zgodnie z wytycznymi zawartymi w Konwencji Rady Europejskiej o ochronie zwierząt kręgowych wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych i były zgodne z wytycznymi ARRIVE. Jest to procedura terminalna, w której myszy są poddawane eutanazji przed odzyskaniem znieczulenia.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
- Oczyść stół operacyjny i całe otoczenie 70% etanolem. Przed zabiegiem dokładnie oczyść i osusz narzędzia chirurgiczne.
- Znieczulić mysz NG2DsRed (Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; obi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po zakończeniu zabiegu myszy przetransportowano do mikroskopu dwufotonowego (Rycina 1A). Szklaną mikropipetę zawierającą 1 mM ATP wprowadzono w pobliże docelnego naczynia krwionośnego w wyznaczonym miejscu (Rycina 1B).
Wykonaliśmy obrazowanie w trybie hyperstack podczas podawania impulsu 1 mM ATP (Rycyna 2A, Wideo uzupełniające 1). Każdy .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jednym z wyzwań związanych z badaniami naczyniowymi jest precyzyjny pomiar średnic naczyń. Metoda, którą tutaj opisujemy, wykorzystywała zmotoryzowany obiektyw piezoelektryczny do szybkiego i powtarzalnego obrazowania hiperstosu za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Po pierwsze, metoda ta pozwala na wielokrotne badanie tętniczki penetrującej, naczyń włosowatych 1. i 2. rzędu bez utraty ostrości i doprowadziła do odkrycia wolno prowadzonych odpowiedzi naczyniowych w naczyniach włosowatych in vivo. Po d.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Fundację Lundbeck, Fundację NOVO-Nordisk, Duńską Radę Niezależnych Badań | Nauk Medycznych oraz grant Fundacji NORDEA dla Centrum Zdrowego Starzenia się.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agaroza | Sigma– Aldrich | A6138 | Nakładaj na odsłoniętą korę w celu ochrony |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Barwnik do czerwonego koloru fluorescencyjnego |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Środek rozszerzający naczynia krwionośne i zwężający naczynia krwionośne, środek do zaciągania |
| Klej i aktywator cyjanoakrylanu | Kleje Loctite | i SF7452 | Klej do elementu metalowego i szkła nakrywkowego |
| Oko lubrykant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Dania | Utrzymuj nawilżenie oczu myszy | |
| FITC-dekstran | Sigma-Aldrich | FD500S | Barwnik surowicy krwi, zielony kolor fluorescencyjny |
| NG2DsCzerwone myszy Jackson | Laboratory | 8241 | Te transgeniczne myszy wyrażają wariant białka czerwonej fluorescencji (DsRed) pod kontrolą mysiego promotora NG2 (Cspg4) |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Wektory wirusowe specyficzne dla astrocytów przenoszące genetycznie kodowane wskaźniki wapnia |
| TRITC-dekstran | Sigma-Aldrich | 52194 | Barwnik surowicy krwi, czerwony kolor fluorescencyjny |
| < silny>Lista urządzeń< / silny> | |||
| Pompa powietrza | WPI | PV830 | Daj ciśnienie powietrza do zaciągania pipety |
| Analizator gazometrii Radiometr | ABL 700 | Pomiar parametrów gazometrycznych krwi | |
| Ciśnieniomierz | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor ciśnienia krwi pod |
| Regulator temperatury ciała | CWE | Model TC-1000 | Utrzymuj temperaturę ciała myszy w zakresie fizjologicznym |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Typ 340 | Monitoruj końcowo-wydechowy CO2 od myszy |
| Stymulator elektryczny | A.M.P.I. | ISO-flex | Zastosuj stymulację poduszki wąsów |
| Wentylator mechaniczny | Aparat Harvard | D-79232 | Mechanicznie wentylować mysz w zakresie fizjologicznym |
| Ściągacz do mikropipet | Instrument Sutter | P-97 | |
| Mikroskop dwufotonowy | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| Lista narzędzi chirurgicznych | |||
| Pęseta anatomiczna | Lawton | 09-0007 | |
| Pęseta kątowa i zrównoważona | S& T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Nożyczki do irysa | Lawton | 05-1450 | |
| Zacisk mikronaczyniowy | S& T AG | 462 | |
| Mysie cewniki naczyniowe | Verutech | 100828 |
Bibliografia
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
