Oczyszczanie frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia

Podsumowanie

W tym protokole wprowadzamy metodę oczyszczania bogatej w filopodia frakcji dendrytycznej z fagocytarnej struktury wypukłości przypominającej miseczkę na hodowanych neuronach hipokampa, wykorzystując specyficzne i silne powinowactwo między cząsteczką adhezyjną filopodialną, TLCN, a cząsteczką macierzy zewnątrzkomórkowej, witronektyną.

Streszczenie

Filopodia dendrytyczne to cienkie i długie wypukłości oparte na włóknie aktyny, które rozciągają się i chowają, jakby szukały docelowego aksonu. Kiedy filopodia dendrytyczne nawiązują kontakt z docelowym aksonem, zaczynają dojrzewać do kolców, co prowadzi do powstania synapsy. Kresomózgowienie (TLCN) jest obficie zlokalizowane w filopodiach dendrytycznych i jest stopniowo wykluczane z kolców. Nadekspresja TLCN w hodowanych neuronach hipokampa indukuje tworzenie filopodiów dendrytycznych. Wykazaliśmy, że kresomózgowienie silnie wiąże się z cząsteczką macierzy zewnątrzkomórkowej, witronektyną. Mikrogranulki pokryte witronektyną indukowały tworzenie miseczek fagocytarnych na dendrytach neuronalnych. W miseczce fagocytarnej gromadzą się białka wiążące TLCN, takie jak fosforylowane Ezrin/Radixin/Moesin (fosfo-ERM) i F-aktyna, co sugeruje, że składniki miseczki fagocytarnej są podobne do tych z filopodiów dendrytycznych. W ten sposób opracowaliśmy metodę oczyszczania kielicha fagocytarnego zamiast filopodiów dendrytycznych. Magnetyczne kulki polistyrenowe pokryto witronektyną, która jest obficie obecna w pożywce hodowlanej neuronów hipokampa i która indukuje tworzenie miseczek fagocytarnych na dendrytach neuronalnych. Po 24 godzinach inkubacji kubki fagocytarne zostały delikatnie rozpuszczone z detergentem i zebrane za pomocą separatora magnetycznego. Po umyciu kulek białka wiążące zostały wymyte i przeanalizowane przez barwienie srebrem i Western blot. We frakcji wiążącej TLCN i aktyna były obficie obecne. Ponadto wiele białek zidentyfikowanych na podstawie frakcji było zlokalizowanych w filopodiach dendrytycznych; Dlatego nazwaliśmy frakcję wiążącą frakcją bogatą w filopodia dendrytyczne. W artykule opisano szczegóły dotyczące metody oczyszczania frakcji bogatej w filopodia dendrytyczne.

Wprowadzenie

Filopodia dendrytyczne są uważane za prekursory kolców. Filamenty aktynowe w filopodiach dendrytycznych regulują ich wydłużanie i retrakcję^1,2,3. Po zetknięciu się z aksonem, wybrane filopodia dendrytyczne rozpoczynają dojrzewanie do kolców i tworzy się synapsa^4,5. Składniki kolców zostały określone na podstawie kompleksowej analizy postsynaptycznych frakcji gęstości^6,7, podczas gdy składniki filopodiów dendrytycznych pozostają w dużej mierze nieznane. Wykazano, że telencefalina (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, kinaza PI3, Akt, mTOR, kinaza polo-podobna 2, CaMKII, syndecan-2, paralemina-1, ARF6 i EphB regulują powstawanie filopodiów dendrytycznych 5^,8,9,10,11, podczas gdy nie opracowano metody kompleksowej analizy cząsteczek obecnych w filopodiach dendrytycznych.

TLCN (ICAM-5) jest specyficznie wyrażany przez neurony kolczaste w najbardziej rostralnym segmencie mózgu, telencephalon¹². TLCN ma 9 domen podobnych do Ig w regionie zewnątrzkomórkowym, region transbłonowy i ogon cytoplazmatyczny¹³. TLCN wiąże się z witronektyną (VN) i integryną LFA-1 w regionie zewnątrzkomórkowym, z preseniliną w regionie transbłonowym oraz z fosfo-ERM i α-aktyniną w regionie cytoplazmatycznym5^,8,14,15,16. TLCN wiąże się z cytoszkieletem aktynowym poprzez fosfo-ERM na końcach filopodiów dendrytycznych i α-aktyniny w kolcach i trzonach dendrytycznych^8,16.

Wykazaliśmy, że nadekspresja TLCN zwiększa tworzenie dendrytycznych filopodiów i indukuje powrót kolców do filopodia¹⁰. Konstytutywna aktywna forma ezryny związana z regionem cytoplazmatycznym TLCN i wzmocniona powstawanie filopodiów dendrytycznych ⁸. W ten sposób TLCN reguluje tworzenie filopodiów dendrytycznych poprzez białka wiążące aktynę. Esselens i wsp. wykazali, że mikrogranulki indukują akumulację TLCN na hodowanych neuronach¹⁷. Wykazaliśmy, że struktury miseczek fagocytarnych powstawały na dendrytach neuronalnych wokół mikrokulek pokrytych VN w sposób zależny od TLCN¹⁵. Składniki filopodiów dendrytycznych są podobne do tych z miseczki fagocytarnej. Trudno jest zebrać filopodia dendrytyczne, ale stosunkowo łatwiej jest zebrać kubek fagocytarny za pomocą mikrokulek magnetycznych. W związku z tym opracowaliśmy metodę oczyszczania miseczki fagocytarnej zamiast filopodiów dendrytycznych¹⁸. W tym miejscu opisujemy metodę oczyszczania frakcji bogatej w filopodia dendrytyczne.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania RIKEN Wako.

1. Kultura neuronów hipokampa

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej
   1. Przygotowanie 200x mieszanki witaminowej. Rozpuść 100 mg soli półwapniowej kwasu D-pantotenowego, 100 mg chlorku choliny, 100 mg kwasu foliowego, 180 mg i-inozytolu, 100 mg niacynamidu, 100 mg chlorowodorku pirydoksalu i 100 mg chlorowodorku tiaminy w 500 ml ultraczystej wody za pomocą mieszadła magnetycznego. Roztwór nie jest całkowicie rozpuszczony. Ostrożnie wymieszać, podać porcję w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Przygotowanie roztworu ryboflawiny. Rozpuść 100 mg ryboflawiny w 500 ml ultraczystej wody za pomocą mieszadła magnetycznego. Roztwór nie jest całkowicie rozpuszczony. Ostrożnie wymieszać, podać porcję w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   3. Przygotowanie 1 M CaCl₂. Rozpuścić 7,35 g CaCl₂·2H₂O w 50 ml ultraczystej wody za pomocą mieszadła magnetycznego.
   4. Przygotowanie minimalnej ilości niezbędnej pożywki (MEM). Rozpuścić 400 mg KCl, 6800 mg NaCl, 2 200 mg NaHCO₃, 158 mg NaH₂PO₄·2H₂O, 7000 mg D-glukozy i 200 mg MgSO 4-7H₂O w 950 ml ultraczystej wody za pomocą mieszadła magnetycznego.
   5. Miareczkować 1,8 ml 1 M CaCl₂ do MEM kropla po kropli za pomocą pipety o pojemności 1 ml i stałym mieszadłem na mieszadle magnetycznym. Dostosuj pH MEM do pH 7,25 za pomocą 1 mol/l HCl.
   6. Dodaj 5 ml mieszanki witamin 200x i 200 μl roztworu ryboflawiny do MEM. Dostosuj objętość roztworu do 1 000 ml z ultraczystą wodą. Przefiltrować roztwór za pomocą systemu filtrów 0,22 μm i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
   7. Przygotowanie 10 roztworów podstawowych DNazy-I. Rozpuścić 100 mg DNazy-I w 12,5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS), przefiltrować przez filtr 0,22 μm, podwielokrotność w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać probówki w temperaturze -20 °C.
   8. Przygotowanie roztworu podstawowego cytozyny β-D-arabinofuraranozydu (Ara-C). Rozpuścić 25 mg Ara-C w 8,93 ml ultraczystej wody (końcowe stężenie 10 mM), przefiltrować przez filtr 0,22 μm, podwielokrotność w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C
   9. Przygotowanie podłoża galwanicznego. Wymieszaj 1 ml roztworu aminokwasów MEM, 750 μl 1 M HEPES, 1 ml B27, 125 μl 200 mM glutaminy, 250 μl penicyliny/streptomycyny, 2,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 44,375 ml MEM w probówce o pojemności 50 ml.
   10. Przygotowanie pożywki stopowej. Wymieszaj 1 ml roztworu aminokwasów MEM, 750 μl 1 M HEPES, 5 ml FBS (ostatnie 10%) i 43,25 ml MEM w probówce o pojemności 50 ml.
2. Przygotowanie potraw pokrytych poli-L-lizyną
   1. Pokryj 35 mm plastikowe szalki do hodowli komórkowych 0,2 mg/ml bromowodorku poli-L-lizyny przez 1 dzień w temperaturze 25 °C.
      nuta: Nie należy stosować poli-L-lizyny zamiast bromowodorku poli-L-lizyny.
   2. Umyj naczynia 2 ml ultraczystej wody 3 razy. Inkubować naczynia z 1,5 ml pożywki Stop w temperaturze 25 °C aż do użycia.
3. Wypreparowanie neuronów hipokampa z zarodka myszy
   1. Tkankowe źródło neuronów hipokampa. Wypreparuj hipokamp od myszy C57BL6 / J typu dzikiego i z niedoborem TLCN w dniach embrionalnych 16-17 zgodnie z metodą Lu et al.¹⁹.
   2. Wypreparowane hipokampy inkubować w 0,25% trypsyny i 1x DNaseI w HBSS zawierającym 15 mM HEPES, pH 7,2 przez 15 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem co 3 minuty. Usunąć roztwór. Inkubować hipokampy w 10 ml pożywki STOP w celu dezaktywacji trypsyny w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
   3. Przenieść hipokampy do 10 ml świeżej pożywki STOP i inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Przenieść hipokampy do 10 ml świeżej pożywki STOP i inkubować w temperaturze 4 °C przez kolejne 5 minut. Przenieść hipokampy do 900 μl pożywki STOP i 100 μl 10x DNaseI w probówce o pojemności 15 ml. Podziel hipokampy na izolowane neurony, pipetując 20 razy za pomocą 1 ml pipet.
      nuta: Końcówka pipety o pojemności 1 ml lekko dotyka dna probówki o pojemności 15 ml podczas dysocjacji hipokampa.
   4. Dodać 9 ml pożywki galwanicznej i przefiltrować przez sitko o wielkości 70 μm do probówki o pojemności 50 ml. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i dostosuj do 3,5 x 10⁴ komórek/ml w pożywce galwanicznej.
   5. Odessać pożywkę STOP z naczyń pokrytych poli-L-lizyną. Umieść komórki na szalkach pokrytych poli-L-lizyną w proporcji 7 x 10⁴ komórki / naczynie (2 ml / naczynie).
   6. Po 60-64 godzinach inkubacji w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C dodać 2 μl roztworu podstawowego Ara-C (ostatnie 10 μM) do neuronów i powoli wstrząsać naczyniem. Przechowywać szalki hodowlane w wilgotnym pudełku bez zmiany pożywki w temperaturze poniżej 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.

2. Oczyszczanie frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia

1. Po 13 dniach in vitro (DIV) dodaj magnetyczne mikrogranulki polistyrenowe (3 x 10⁶ cząstek na talerz) do 20 szalek zawierających wyhodowane neurony. Po 1 dniu przemyj neurony w 1 ml PBS z mieszaniem 3 razy, aby usunąć pożywkę i niezwiązane mikrogranulki. Po usunięciu PBS należy poddać neurony lizie za pomocą 500 μl / naczynie buforu do lizy (PBS zawierający 0,01% Triton X-100, koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA i koktajl inhibitorów fosfatazy).
2. Zebrać lizat za pomocą skrobaka do komórek i przenieść lizat do mikroprobówek o niskim poziomie wiązania białka (10 probówek). Ustaw rurki na separatorze magnetycznym i odczekaj 1 min. Zebrać supernatant i użyć go jako frakcji niezwiązanej do barwienia srebrem i analizy Western blot.
3. Przenieś kulki do nowej mikroprobówki o niskiej wiązalności białek, umieść na separatorze magnetycznym i całkowicie usuń supernatant. Dodać 500 μl buforu do lizy i myć kulki za pomocą mieszalnika wirowego przez 15 sekund. Umieść probówkę na separatorze magnetycznym, odczekaj 1 minutę, usuń supernatant i dodaj 500 μl buforu do lizy. Powtórz mycie koralików 10 razy i usuń supernatant.
4. Elutować białka związane z kulkami (frakcja związana) przez dodanie 50 μl 1x buforu próbki SDS (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS i 10% glicerolu) i gotować probówkę w temperaturze 98 °C przez 5 minut. Odwirować probówkę o stężeniu 860 x g przez 10 s i umieścić probówkę na separatorze magnetycznym na 1 minutę. Zebrać supernatant i użyć go jako frakcji związanej.
   nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
5. Zmierzyć stężenia białek we frakcjach niezwiązanych i związanych za pomocą testu białka BCA. Wizualizacja roztworów białkowych z błękitem bromofenolowym i dostosowanie stężenia do 5 ng/μL dla SDS-PAGE.

3. Barwienie srebrem i analiza Western Blot

1. Oddzielić frakcje związane i niezwiązane (50 ng) za pomocą SDS-PAGE za pomocą żelu gradientowego 5-20%. Żel poplamić srebrem.
2. Western blot z użyciem anty-TLCN-C (1/3 000), anty-bydlęcej witronektyny (1/5 000), anty-aktyny (1/1 000) i anty-α-tubuliny (1/1 000) jako przeciwciał pierwszorzędowych oraz koziej anty-króliczej IgG sprzężonej z HRP jako przeciwciała drugorzędowego. Wizualizacja antygenów za pomocą chemiluminescencyjnego odczynnika do wykrywania Western Blotting i obrazowania chemiluminescencyjnego.

Wyniki

W hodowlach neuronów hipokampa TLCN występował obficie w filopodiach dendrytycznych, trzonie oraz somie i kolokalizował się z F-aktyną (Rysunek 1A, B). Po dodaniu polistyrenowych mikrokulek do hodowlanych neuronów hipokampa, kulki zostały automatycznie pokryte witronektyną (VN) pochodzącą z płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zawartej w medium hodowlanym; wiązały się one głównie z dendrytami i indukowały tworzenie się pucharów fagocytarnych (

Dyskusja

Opracowaliśmy metodę oczyszczania frakcji bogatej w filopodia dendrytyczne z wykorzystaniem powinowactwa między cząsteczką adhezyjną TLCN a białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej witronektyną. W porównaniu z frakcją PSD możliwe jest zidentyfikowanie białek synaptycznych działających na niedojrzałą synapsę z frakcji bogatej w filopodia dendrytyczne. Tym samym składniki frakcji bogatej w filopodia dendrytyczne różnią się od składników frakcji PSD o 74%. W odróżnieniu od frakcji PSD, użyliśmy hodowanych neuronów hipokampa do ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1,7 mLl Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamina	Gibco	2530149
35 mm plastikowe naczynia do hodowli komórkowych	Corning	430165
Anty-aktyna	Sigma-Aldrich	A-5060
Anty-alfa-aktynina	Sigma-Aldrich	A-5044
Anty-alfa-tubulina	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Klon Sigma-Aldrich3C12	, SAB4200806
Anty-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anty-MAP2	Chemicon	klon AP20, MAB3418
Anty-Moesin	Klon Sigma-Aldrich	38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo	23227
Błękit bromofenolowy	Merck	1.08122.0005
Chrolek wapnia, wodny	Wako	038-19735
Skrobak do komórek	Falcon	353085
Sitko do komórek	Falcon	352350
Chlorek choliny	Sigma-Aldrich	C7527
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA	Roche	11873580001
Cytozyna beta-D-arabinofuranozyd	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
Kwas D-pantotenowy sól hemiwapniowa	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Kwas foliowy	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
IgG	ImmunoResearch	111-035-144
Inozytol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Folia Fuji	LAS-1000 mini	Do wykrywania luminescencji z membrany WB
Magnetyczne mikrokulki polistyrenowe	Sperotech	PM-20-10
MEM roztwór aminokwasów	Gibco	11130-051	30 mM chlorowodorek L-argininy, 5 mM L-cystyna, 10 mM chlorowodorek L-histydyny-H2O, 20 mM L-izoleucyna, 20 mM L-leucyna, 19,8 mM chlorowodorek L-lizyny, 5,1 mM L-metionina, 10 mM L-fenyloalanina, 20 mM L-treonina, 2,5 mM L-tryptofan, 10 mM L-tyrozyna i 20 mM L-walina
System elektroforezy wielkości mini-płyty	ATTO	AE-6530
Niacynamid	Sigma-Aldrich	N0636
Penicylina / Streptomycyna	Gibco	15070063
Koktajl inhibitorów fosfatazy PhosSTOP	Roche	4906845001
Bromowodorek poli-L-lizyny	Nacali	28360-14
Pirydoksal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Ryboflawina	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit	wako Wako	291-5031
Tiamina HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Półsucha komórka transferowa	Bio-rad	1703940JA
Ultra czysta woda	MilliQ		Do produkcji ultra czystej wody

Jackson