Zdolność różnicowania ludzkich okołonaczyniowych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej ludzkiej aorty

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest przetestowanie zdolności komórek progenitorowych pochodzących z ludzkiej okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej do różnicowania się w wiele linii komórkowych. Różnicowanie porównano z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z ludzkiego szpiku kostnego, o których wiadomo, że różnicują się w linie adipocytów, osteocytów i chondrocytów.

Streszczenie

Tkanka tłuszczowa jest bogatym źródłem wielu silnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) zdolnych do różnicowania się w linie osteogenne, adipogenne i chondrogenne. Różnicowanie adipogenne komórek progenitorowych jest głównym mechanizmem napędzającym ekspansję i dysfunkcję tkanki tłuszczowej w odpowiedzi na otyłość. Zrozumienie zmian w okołonaczyniowej tkance tłuszczowej (PVAT) jest zatem klinicznie istotne w chorobach metabolicznych. Jednak wcześniejsze badania przeprowadzono głównie na myszach i innych modelach zwierzęcych. W protokole tym wykorzystuje się ludzkie próbki PVAT klatki piersiowej pobrane od pacjentów poddawanych operacji pomostowania aortalno-wieńcowego. Pobrano tkankę tłuszczową z aorty wstępującej i wykorzystano do eksplantacji zrębowej frakcji naczyniowej. Wcześniej potwierdziliśmy obecność komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej w ludzkim PVAT ze zdolnością do różnicowania się w adipocyty zawierające lipidy. W tym badaniu dalej analizowaliśmy potencjał różnicowania komórek z frakcji zrębu naczyniowego, przypuszczalnie zawierających multipotencjalne komórki progenitorowe. Porównaliśmy komórki pochodzące z PVAT z ludzkim szpikiem kostnym MSC w celu różnicowania na linie adipogenne, osteogenne i chondrogenne. Po 14 dniach różnicowania wykorzystano specyficzne barwniki do wykrycia nagromadzenia lipidów w adipocytach (czerwień olejowa O), złogów zwapnienia w komórkach osteogennych (czerwień alizarynowa) lub glikozaminoglikany i kolagen w komórkach chondrogenicznych (trichrom Massona). Podczas gdy MSC szpiku kostnego skutecznie różnicował się we wszystkich trzech liniach, komórki pochodzące z PVAT miały potencjał adipogenny i chondrogeniczny, ale brakowało im silnego potencjału osteogennego.

Wprowadzenie

Tkanka tłuszczowa jest bogatym źródłem wielu silnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) zdolnych do różnicowania się w linie osteogenne, adipogenne i chondrogenne¹. Tkanka ta rozszerza się poprzez przerost dojrzałych adipocytów i różnicowanie de novo rezydentnych MSC do adipocytów. Okołonaczyniowa tkanka tłuszczowa (PVAT) otacza naczynia krwionośne i reguluje pracę naczyń krwionośnych^2,3. Wywołana otyłością ekspansja PVAT zaostrza patologie sercowo-naczyniowe. Chociaż potencjał multipotencjalny MSC z ludzkich podskórnych magazynów tkanki tłuszczowej został dobrze zbadany^4,5, żadne badania nie eksplantowały i nie oceniały zdolności różnicowania ludzkich komórek progenitorowych pochodzących z PVAT, prawdopodobnie ze względu na inwazyjność pobierania. W związku z tym celem tej pracy jest przedstawienie metodologii eksplantacji i rozmnażania komórek progenitorowych z ludzkiego aorty PVAT od pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi oraz przetestowanie ich skłonności do różnicowania się do linii osteogennych, chondrogenicznych i adipogennych. Źródłem PVAT jest miejsce zespolenia pomostowania aortalnego na aorcie wstępującej u otyłych pacjentów poddawanych operacji pomostowania aortalno-wieńcowego. Świeżo wyizolowany PVAT jest dysocjowany enzymatycznie, a frakcja naczyniowa zrębu jest izolowana i rozmnażana in vitro, co pozwala nam po raz pierwszy przetestować zdolność różnicowania ludzkich komórek progenitorowych pochodzących z PVAT.

Korzystając z pierwotnej hodowli ludzkiej frakcji zrębu zrębowego PVAT, przetestowaliśmy trzy testy mające na celu indukowanie komórek macierzystych/progenitorowych do różnicowania się w kierunku linii adipogennych, osteogennych lub chondrogennych. Nasze poprzednie badanie zidentyfikowało populację komórek CD73+, CD105+ i PDGFRa+ (CD140a), które mogą silnie różnicować się w adipocyty⁶, chociaż ich wielomoc nie została przetestowana. PVAT bezpośrednio reguluje napięcie naczyniowe i stan zapalny⁷. Uzasadnieniem dla testowania potencjału różnicowania tej nowej populacji komórek jest rozpoczęcie zrozumienia wyspecjalizowanego wpływu PVAT na funkcję naczyń krwionośnych i mechanizmy ekspansji PVAT podczas otyłości. Metodologia ta poszerza naszą wiedzę na temat funkcji komórek progenitorowych pochodzących z tkanki tłuszczowej oraz umożliwia identyfikację i porównanie podobieństw i różnic między komórkami progenitorowymi z różnych źródeł tkankowych. Opieramy się na uznanych i zatwierdzonych podejściach do izolowania i różnicowania MSC w kierunku różnych linii i optymalizujemy procedury, aby zmaksymalizować żywotność ludzkich komórek progenitorowych pochodzących z PVAT. Techniki te mają szerokie zastosowanie w dziedzinie badań nad komórkami macierzystymi i progenitorowymi oraz rozwoju tkanki tłuszczowej.

Protokół

Użycie tkanek ludzkich w tym badaniu zostało ocenione i zatwierdzone przez Institutional Review Board of Maine Medical Center, a cały personel przeszedł odpowiednie szkolenie przed eksperymentem.

1. Przygotowania

1. Sporządzić bufor dysocjacyjny, odtwarzając 50 mg bezzwierzęcego roztworu kolagenazy/mieszaniny dispazy I w 1 ml nanoczystego_H2O. Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 1 mg/ml, dodając 49 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającego 1% w/v BSA do odtworzonego roztworu kolagenazy/dypazy. Przed użyciem przechowywać 5 ml porcji roboczych w temperaturze -20 °C i ogrzać do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
2. Przygotuj roztwór antybiotyku, dodając 1 ml 100x roztworu antybiotyku/antybiotyku (końcowe stężenie to 200 jednostek/ml penicyliny, 200 jednostek/ml streptomycyny i 0,5 μg/ml fungizone) do 49 ml HBSS i przechowywać na lodzie.
3. Przygotować roztwór żelatyny (0,2% w/v) rozpuszczając 200 mg żelatyny ze skóry bydlęcej w 100 ml nanoczystego_H2O. Roztwór należy sterylizować w autoklawie przez 20 minut i przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Przygotuj 500 ml pożywki wzrostowej PVAT: DMEM/F12 o wysokiej zawartości glukozy z suplementem glutaminy, pirogronianem sodu i wodorowęglanem sodu, uzupełnionymi 10% FBS i 100 μg/ml środka przeciwdrobnoustrojowego (patrz tabela materiałów).
5. Przygotuj 50 ml adipogenicznej pożywki indukcyjnej: 40,8 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej 7,5 ml pożywki wzrostowej PVAT, 500 μL 100x roztworu antybiotyku/antybiotyku (końcowe stężenie to 100 jednostek/ml penicyliny, 100 jednostek/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml fungizone), 0,5 mM IBMX (500 mM zapasu w 0,1 M NaOH), 1 μM deksametazonu (1 mM zapasu w etanolu), 5 μM rozyglitazon (5 mM zapas w DMSO), 33 μM biotyna (66 mM zapas w DMSO), 100 nM insulina (200 μM zapas w 0,1% kwasie octowym) i 20 μM kwas pantotenowy (100 mM zapas w H₂O).
6. Przygotuj 50 ml kontrolnej pożywki indukcyjnej dla linii adipogennej: 40,8 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 7,5 ml pożywki wzrostowej PVAT i 500 μl paciorkowca (100x zapas).
7. Przygotuj 50 ml adipogennej pożywki podtrzymującej: 41,5 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 7,5 ml pożywki wzrostowej PVAT z kroku 1.3, 500 μL pen-strep (100x zapas), 1 μM deksametazon (1 mM zapas w EtOH), 33 μM biotyna (66 mM zapas w DMSO), 100 nM insulina (200 μM zapas w 0,1% kwasie octowym), i 20 μM kwasu pantotenowego (100 mM zapas w_H2O).
8. Przygotuj 500 ml pożywki wzrostowej dla linii osteogennych i chondrogennych: αMEM o wysokim poziomie glukozy uzupełniony 10% FBS, 1x suplement glutaminy (patrz Tabela materiałów) i 5 ml pen-strep (100x zapas).
9. Przygotować 50 ml pożywki indukcyjnej dla linii osteogennej: 50 ml pożywki wzrostowej MSC szpiku kostnego uzupełnionej 10 nM deksametazonem i 10 mM β-glicerofosforanem.
10. Przygotuj 50 ml pożywki indukcyjnej dla linii chondrogennej: 50 ml pożywki wzrostowej MSC szpiku kostnego uzupełnionej 100 nM deksametazonem, 50 μg/ml askorbinian-2-fosforanu sodu i 10 ng/ml TGFβ1. W stanach osteogennych i chondrogennych pożywka wzrostu MSC szpiku kostnego będzie służyć jako pożywka nieindukcyjna.

2. Protokół 1: Hodowla ludzkich komórek PVAT z frakcji naczyniowej zrębu

UWAGA: PVAT jest wycinany z miejsca zespolenia przeszczepu na aorcie wstępującej u znieczulonych pacjentów poddawanych zabiegom pomostowania aortalno-wieńcowego. PVAT aorty umieszcza się w stożkowym zbiorniku o pojemności 15 ml zawierającym 10 ml lodowato zimnego DMEM F12 o wysokiej zawartości glukozy i przenosi z sali operacyjnej do laboratorium w ciągu 2 godzin od resekcji. PVAT aorty jest tkanką odrzucaną podczas procedury pomostowania i została uznana za badanie nieprzeznaczone dla ludzi przez Wewnętrzną Komisję Rewizyjną Maine Medical Center.

1. Ten protokół dotyczy ~500 mg kawałka ludzkiego PVAT (około 3 x 1 x 0,5 cm³). Przenieść świeży ludzki PVAT z DMEM do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu antybiotyku. Inkubować z kołysaniem przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Gdy PVAT znajduje się w roztworze antybiotyku, rozmrozić porcję buforu dysocjacyjnego w temperaturze 37 °C.
2. Dodaj 50 μl 100x roztworu antybiotyku/antybiotyku do 5 ml buforu dysocjacyjnego i sterylizuj za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Dodaj 1 ml roztworu żelatyny do 1 dołka 24-dołkowej płytki. W okapie z przepływem laminarnym użyj sterylnych kleszczy i nożyczek, aby przenieść PVAT z roztworu antybiotyku na sterylną szalkę Petriego. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego buforu dysocjacyjnego do tkanki i drobno zmiel całą tkankę na zawiesinę (nie kawałki większe niż ~2 x 2 mm²) za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek do preparowania.
3. Przenieść zawiesinę o objętości 1 ml do buforu dysocjacyjnego o pojemności 4 ml i inkubować probówkę na boku we wstępnie ogrzanej wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 37 °C przy prędkości obrotowej 200 obr./min przez 1 godzinę. Po 1 godzinie nie będzie widocznych kawałków tkanki, a roztwór pojawi się jako mętna zawiesina komórek.
4. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 70 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przepłucz sitko dodatkowymi 10 ml roztworu antybiotyku, aby uchwycić jak najwięcej komórek. Nie ściskaj sitka.
5. Granulować komórki przez 12 minut przy 300 x g w wirówce z odchylanym wiadrem.
   nuta: Po odwirowaniu probówka zostanie oddzielona na tłuszczową górną warstwę adipocytów, interfazę i osad. Osad jest frakcją naczyniową zrębu zawierającą komórki śródbłonka, komórki odpornościowe, komórki krwi i komórki progenitorowe.
6. Zawiesić osad w 10 ml HBSS i odwirowywać przez 5 minut przy 300 x g. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie 2 prania w HBSS. Po ostatnim umyciu nie należy lizować czerwonych krwinek. Wielokrotne próby z kilkoma dostępnymi na rynku i czasami inkubacji doprowadziły do znacznego zmniejszenia przyczepiania i żywotności komórek progenitorowych.
7. Odessać żelatynę z płytki 24-dołkowej. Delikatnie umyj studzienkę 1x HBSS, aby usunąć niezwiązaną żelatynę.
8. Zawiesić osad frakcji zrębu naczyniowego z nienaruszonymi krwinkami czerwonymi w 1 ml pożywki wzrostowej i nasion na studzience pokrytej żelatyną. Dodać ludzki FGF2 (ponownie zawieszony w PBS uzupełniony 0,01% BSA w/v) do końcowego stężenia 25 ng / ml w pożywce. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
9. Następnego dnia usuń pożywkę wzrostową i przemyj studzienki 5 razy HBSS, aby usunąć czerwone krwinki i martwe komórki. Dodać 1 ml świeżej pożywki wzrostowej uzupełnionej 25 ng/ml FGF2.
10. Zmieniaj pożywkę co 48 godzin, upewniając się, że za każdym razem uzupełniasz 25 ng/ml świeżego FGF2.
11. Komórki zazwyczaj osiągają 100% konfluencji 7-10 dni po eksplantacji; komórki pasażujące wtedy:
    1. Odessać pożywkę wzrostową i przemyć monowarstwę 2x w 1 ml HBSS. Odessać wszystkie HBSS ze studzienek i dodać kilka kropli roztworu do dysocjacji komórek.
    2. Postukać i zakręcić płytką kilka razy, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 5–7 minut w celu podniesienia komórek. Dodaj ~ 1 ml świeżej pożywki hodowlanej do oderwanych komórek i rozprowadź 500 μl do 2 dołków 24-dołkowej płytki, z których każda zawiera 500 μl pożywki wzrostowej i 25 ng FGF2.
12. Kontynuuj ekspansję ludzkich komórek pochodzących z PVAT, jak wskazano w poprzednim kroku. Każdy fragment nie powinien być większy niż podział 1:2. Komórki są pasażowane 5–7 razy przed przydzieleniem do testów różnicowania.

3. Protokół 2: Hodowla Ludzkich Kolonii Szpiku Kostnego MSC

UWAGA: MSC ludzkiego szpiku kostnego są izolowane zgodnie z opisem⁸ i przechowywane jako zamrożone materiały do wczesnego pasażu w pożywkach do zamrażania (70% FBS, 20% bazowe DMEM i 10% DMSO) w ~100 000 komórek/ml w płynie N₂.

1. Szybko rozmrozić fiolkę z MSC szpiku kostnego z cieczy N₂ w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i płytce do jednego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej 3 ml pożywki wzrostowej MSC i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Następnego dnia odessać pożywkę hodowlaną MSC i przemyć komórki 3x w 2 ml HBSS. Przy 100% konfluencji odessać pożywkę wzrostową i przemyć komórki 3x w 2 ml HBSS. Dodać 500 μl/roztwór do oddzielania komórek studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 5 minut. Postukaj w płytkę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte i równomiernie rozprowadź zawartość do 2 dołków 6-dołkowej płytki zawierającej 2 ml pożywki wzrostowej MSC.
3. Rozszerzać ludzki szpik kostny i MSC pochodzące z PVAT równolegle przez około 5–7 pasaży lub do momentu, gdy zostaną osiągnięte ilości wystarczające do badania.

4. Protokół 3: Płytka i indukcja linii adipogennych, osteogennych i chondrogennych

1. Na płytce 12-dołkowej należy umieścić odpowiednią liczbę komórek pochodzących ze szpiku kostnego i PVAT na basenie oraz odpowiednie kontrpróby dla każdego warunku doświadczalnego. W stanach adipogennych i osteogennych potrzeba ~200 000–225 000 komórek/studzienkę, w stanach chondrogennych potrzeba 150 000–175 000 komórek/studzienkę.
   nuta: Przeprowadziliśmy co najmniej N = 3 powtórzone studnie dla warunków kontrolnych i indukowanych dla każdej linii eksperymentalnej, w sumie 2 niezależne serie (N = łącznie 6 powtórzeń).
2. Odłącz komórki zarówno od populacji ludzkich komórek progenitorowych PVAT, jak i populacji MSC ludzkiego szpiku kostnego za pomocą roztworu do oddzielania komórek i inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 5 minut. Pulić populacje w oddzielnych stożkowych fiolkach o pojemności 15 ml. Obracać fiolkę w temperaturze 500 x g przez 7 minut, aby otoczkować komórki. Ponownie zawiesić w 1 ml PBS i użyć hemocytometru, aby oszacować liczbę komórek.
3. Umieść komórki w 12-dołkowych naczyniach, jak wskazano w kroku 4.1. Zapewnij oddzielne szalki dla indukowanych i nieindukowanych stanów adipogennych, osteogennych i takich, aby stan nieindukowany mógł zostać naprawiony we wcześniejszym punkcie czasowym bez zakłócania ciągłej hodowli stanu indukowanego.
4. Dodaj 1,5 ml adipogennej i osteogennej pożywki indukcyjnej do każdego dołka indukowanego stanu. Dodaj 1,5 ml adipogennej i osteogennej pożywki nieindukcyjnej do każdego dołka stanu nieindukowanego. Rozpocząć inkubację populacji komórek indukowanych i nieindukowanych adipogennie i osteogennych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
5. Odwirowywać pozostałą objętość ludzkich komórek progenitorowych PVAT i MSCs ludzkiego szpiku kostnego przez 7 minut przy 500 x g.
6. Określ objętość potrzebną do ponownego zawieszenia pozostałego szpiku kostnego i granulek komórek pochodzących z PVAT, aby osiągnąć gęstość 100 000 komórek/10 μL (10,⁶ komórek/ml). Zawiesić osady w obliczonej objętości pożywki wzrostowej MSC w celu indukcji linii chondrogennej. Delikatnie przesuwaj objętość komórek w górę i w dół za pomocą pipety, aby zapewnić jednorodny rozkład.
7. Odpipetować 10 μl kropli stężonego roztworu komórkowego do środka każdej studzienki, aby utworzyć mikromasę 100 000 komórek. Umieść 1 ml sterylnego_H2Ow sąsiedniej studzience, aby zapobiec parowaniu. Inkubować kultury mikromasy przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ , aby umożliwić agregację mikromasy.
8. Po 2 godzinach ostrożnie dodaj chondrogenne pożywki różnicujące wzbogacone 10 ng / ml ludzkiego TGFβ1 do każdej z dołków o stanie indukowanym. Ostrożnie dodać 1,5 ml pożywki nieindukcyjnej (pożywki do wzrostu MSC szpiku kostnego) do studzienek w stanie nieindukowanym. Użyj oddzielnych płytek 12-dołkowych dla warunków indukowanych i nieindukowanych, tak aby stan nieindukowany można było ustalić we wcześniejszym punkcie czasowym.

5. Protokół 4: Hodowla linii adipogennych, osteogennych i chondrogennych przez 14 dni

1. Hodowla warunków indukowanych i nieindukowanych wszystkich trzech linii przez 4 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} odświeżanie pożywek co 2 dni. W dniu 4 zmień stan indukowanej linii adipogennej z pożywki indukcyjnej na pożywkę podtrzymującą na pozostałą część testu.
2. Napraw wszystkie niewywołane stany w 10% formalinie przez 12 godzin. Wyrzuć formalinę i umyj wszystkie stałe studzienki 2x w PBS, aby usunąć wszelkie ślady formaliny. Przechowywać płytki w PBS w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.
3. Hodowla indukowanych warunków przez łącznie 14 dni, odświeżanie pożywki co 2 dni. Dodawać świeży TGFβ1 w końcowym stężeniu 10 ng/ml przy każdym odświeżeniu chondrogenicznej pożywki indukcyjnej. Kontynuuj hodowlę linii adipogennej w pożywce podtrzymującej adipogennej i pożywce indukcyjnej linii osteogennej, odświeżając co 2 dni. W dniu 14 ustal wszystkie wywołane warunki przez 12 godzin w 10% formalinie do barwienia.
4. Zeskrob lub wlej mikromasę w indukowanym stanie chondrogeniznym do kasety w celu zatopienia. Odwodnić mikromasę w serii coraz bardziej skoncentrowanych kąpieli alkoholowych przez 5 minut, zaczynając od 70%, następnie 80%, dwa razy w 95% i jeszcze dwa razy w alkoholu bezwodnym. Umieść kasetę w środku dealkoholizującym, a następnie na koniec zanurz kasetę w wosku parafinowym w celu przekrojenia i barwienia.

6. Protokół 5: Barwienie stanu adipogennego za pomocą czerwonego oleju O

1. Przygotować roztwór podstawowy czerwieni olejowej O, rozpuszczając 350 mg czerwonej oliwy o w 100 ml 100% izopropanolu. Mieszać przez 2 godziny za pomocą mieszadła i odkurzyć przez filtr 0,2 μm. Roztwór podstawowy można przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 rok.
2. Przygotować roztwór roboczy Oil Red O, mieszając 3 części roztworu podstawowego z 2 częściami diH₂0 (np. 60 ml roztworu podstawowego na 40 ml diH₂0). Końcowe stężenie czerwonego oleju O w roztworze roboczym wynosi 2,1 mg/ml.
3. Usuń cały płyn ze studzienek. Umyj każdą studzienkę 2x 60% izopropanolem, upewniając się, że całkowicie usunąłeś całą wodę z boków studzienek. Odessać 60% izopropanolu i szybko dodać roztwór roboczy Oil Red O, nie dotykając ścianek studzienek, aby przykryć dno. Bardzo ważne jest, aby ten krok został wykonany szybko, aby studnie nie wyschły.
4. Po dodaniu czerwonego oleju O inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.
5. Usuń cały czerwony olej O i natychmiast dodaj destylowany H₂O. Myj destylowanym H₂O przez 10 m, aby rozpocząć usuwanie niezwiązanego czerwonego oleju O. Po 10 minutach odessać Oil Red O i powtórzyć procedurę prania 3x.
6. Po zakończeniu mycia dodaj PBS i zobrazuj komórki. Barwione komórki przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C.

7. Protokół 6: Barwienie stanu osteogennego za pomocą czerwieni alizarynowej

1. Usuń cały płyn z każdej studzienki. Dodaj odpowiednią objętość 2% roztworu czerwonego barwnika Alizaryny do każdego dołka (1,5 ml na studzienkę dla płytki 12-dołkowej) i delikatnie przechylaj płytkę na boki, aż roztwór całkowicie pokryje dno studzienki.
2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń Alizarin Red ze studzienek. Delikatnie przepłukać każdą studzienkę cztery razy destylowanym_H2O, uważając, aby nie usunąć kryształów wapnia. Pozostawić do wyschnięcia.

8. Protokół 7: Barwienie stanu chondrogennego za pomocą trichromu Massona

1. Piec szkiełka w suchym piekarniku w temperaturze 60 °C przez 30 minut. Odparafinować i uwodnić sekcje do wody destylowanej.
   1. Aby się nawodnić, umieść szkiełka w trzech 5-minutowych inkubacjach ze środkami dealkoholizującymi, a następnie 5-minutowe inkubacje w malejących stężeniach alkoholu w następujący sposób: dwie w 100% (absolutny etanol), dwie w 95% alkoholu, dwie w 80%, dwie w 70% i wreszcie dwie w destylowanym_H2O. Szkiełka mogą pozostać w H₂O, podczas gdy utrwalacz Bouina jest przygotowany.
2. Umieść 40 ml utrwalacza Bouina w plastikowym słoiku coplin do kuchenki mikrofalowej (bez przykrycia). Kuchenka mikrofalowa na wysokim poziomie, aby doprowadzić temperaturę do 55 °C. Umieścić szkiełko w podgrzanym roztworze na 20 minut; Pozostaw na blacie przykrytym. Myj pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut lub do momentu, gdy cały żółty kolor zniknie.
3. Zabarwić skrawki w hematoksylinie Weigerta przez 10 min. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 10 min.
4. Skrawki plamić w roztworze szkarłatnej fuksyny kwasu szkarłatnego Beibricha przez 10 min. Myć 3x 10 min w wodzie z kranu. Zaprawa ślizga się w roztworze kwasu fosfowolframowego/fosfomolibdynowego przez 10 minut. Nie spłukiwać.
5. Umieść szkiełka bezpośrednio w roztworze błękitu anilinowego na 10 minut. Spłucz dwoma krótkimi zanurzeniami w wodzie z kranu.
6. Umieść szkiełka w 1% roztworze kwasu octowego na 3 do 5 minut. Myj w wodzie z kranu przez 1 minutę. Umieść w 95% etanolu na 1 minutę. Odwodnić zgodnie ze wskazówkami w kroku 5.4 i zamontuj z żywicą syntetyczną.

Wyniki

Izolacja frakcji zrębu naczyniowego od ludzkiego PVAT

Rysunek 1A pokazuje schemat obszaru anatomicznego, w którym uzyskano PVAT pokrywający aortę wstępującą. Wcześniej opisaliśmy populacje pacjentów poddawanych pomostowaniu aortalno-wieńcowego, z których pochodziły te próbki⁶. Rysunek 1B pokazuje przykład ludzkiego PVAT uzyskaneg...

Dyskusja

Komórki progenitorowe tkanki tłuszczowej z różnych depozytorów różnią się znacznie pod względem fenotypu i potencjału różnicowania⁹. Hodowla komórek progenitorowych pochodzących z PVAT od jednego dawcy pacjenta w jednoczesnej indukcji w dół trzech różnych linii, adipogennej, osteogennej i chondrogenicznej, pozwala na dobrze kontrolowane badanie zdolności pluripotencjalnych tej nowej populacji komórek progenitorowych. Metodologia opisana w tym raporcie może być wykorzystana do zbadania zdolności ró...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mieszanka kolagenazy i dispazy bez produktów pochodzenia zwierzęcego I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
Alcian Blue	NewComerSupply	1003A	1% roztwór wodny pH 2,5
Alizarin Red	Amresco	9436-25G
alpha-MEM	ThermoFisher	12561056
Aniline Blue	NewComerSupply	10073C
Antybiotyk/Antybiotyk	ThermoFisher	15240062
Fuksyna szkarłatna Beibricha	Millipore-Sigma	A3908-25G
b-glicerofosforan	Milipore-Sigma	G9422-10G
Biebrich Scarlet	EKI	2248-25G
Biotyna	Milipore-Sigma	B4501-100MG
Utrwalacz Bouina	NewComerSupply	1020A
Bydło albumina surowicy	Calbiochem	12659	przechowywana w temperaturze 4 stopni C
Roztwór do odłączania komórek	Accutase	AT104
Sitko dzwonkowe (70 mm)	Corning	352350
Deksametazon	Milipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	4,5 g/L glukozy, L-glut i pirogronian
DMEM/F12 średni	ThermoFisher	10565-042	wysoka glukoza, glutamax, sód bikarbinian
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
Płodowa surowica bydlęca	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
Formalina	NewComerSupply	1090
Żelatyna ze skóry bydlęcej	Millipore-Sigma	G9391-500G
Glutamax	ThermoFisher	35050061	suplement glutaminy
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
Roztwór insuliny	Millipore-Sigma	I9278-5ML
Olej czerwony O	Millipore-Sigma	O0625-100G
Kwas pantotenowy	Millipore-Sigma	P5155-100G
Roztwór penicyliny-streptomycyny	ThermoFisher		15240062 100ml
Permount	Fisher	SP15-500
Roztwór kwasu fosfowolframowego/fosfoomybdiowego	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Odczynnik przeciwdrobnoustrojowy do pożywek hodowlanych.
Rozyglitazon	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
Hematoksylina Weigerta	EKI	4880-100G