Artykuł metodologiczny

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

DOI:

10.3791/59375

⸱

10 maja 2019

 , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wyrazić fenotypy komórkowe w organizmach, żywe komórki odpowiednio wykonują ekspresję genów, a programy transkrypcyjne odgrywają kluczową rolę w ekspresji genów. Komórkowa maszyneria transkrypcyjna i jej białka modyfikujące chromatynę koordynują się, aby regulować transkrypcję. Aby przeanalizować regulację transkrypcji na poziomie molekularnym, dostępnych jest kilka metod eksperymentalnych, takich jak przesunięcie ruchliwości elektroforetycznej, przejściowe badanie reporterowe i testy immunoprecypitacji chromatyny (ChIP). W tym artykule szczegółowo opisujemy zmodyfikowany test ChIP ze względu na jego zalety w bezpośrednim pokazywaniu modyfikacji histonów i interakcji między białkami a DNA w komórkach. Jednym z kluczowych kroków w udanym teście ChIP jest ścinanie chromatyny. Chociaż sonikacja jest powszechnie stosowana do ścinania chromatyny, trudno jest określić powtarzalne warunki. Zamiast ścinania chromatyny za pomocą sonikacji, zastosowaliśmy trawienie enzymatyczne za pomocą nukleazy mikrokokowej (MNazy), aby uzyskać bardziej powtarzalne wyniki. W tym artykule przedstawiamy prosty protokół testu ChIP przy użyciu MNazy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja genów w komórkach ssaków jest ściśle i dynamicznie regulowana, a transkrypcja jest jednym z kluczowych etapów. Transkrypcja genów jest regulowana głównie przez czynniki transkrypcyjne i histony. Czynnik transkrypcyjny to białko, które wiąże się z określonymi sekwencjami DNA i kontroluje transkrypcję genów. Czynniki te albo promują, albo hamują rekrutację polimerazy RNA II (PolII), która inicjuje syntezę mRNA z genomowego DNA jako matrycy1. Modyfikacje histonów, takie jak acetylacja i metylacja reszt ogona histonów, pozytywnie i negatywnie wpływają na transkrypcję genów poprzez zmianę struktury chromatyny2. Ponieważ zmiany w ekspresji genów wpływają na kontekst komórkowy, konieczne jest zbadanie mechanizmów molekularnych, za pomocą których regulowana jest transkrypcja.

Do tej pory dostępnych jest kilka metod badania regulacji transkrypcji genów. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), zwany również testem przesunięcia żelu, służy do analizy interakcji białko-DNA3. Ekstrakt jądrowy z komórek będących przedmiotem zainteresowania inkubuje się z sondą DNA znakowaną radioaktywnym izotopem (na przykład 32P) i elektroforezą na żelu poliakrylamidowym. Autoradiogram pokazuje, że kompleks DNA-białko migruje wolniej niż sonda w żelu. W obecności przeciwciała przeciwko białku kompleks DNA-białko-przeciwciało migruje w żelu wolniej niż kompleks DNA-białko. To przesunięte prążki ujawniają specyficzne wiązanie między DNA a białkiem. Jednak EMSA określa tylko specyficzną interakcję DNA-białko w systemie bezkomórkowym, a zatem nie wiadomo, czy interakcja kontroluje transkrypcję w żywych komórkach. Przejściowy test reporterowy, powszechnie nazywany testem reporterowym lucyferazy, został opracowany w celu rozwiązania problemu regulacji ekspresji genów w komórkach. Zazwyczaj region genomowy genu będącego przedmiotem zainteresowania jest wprowadzany do plazmidu reporterowego, przejściowo transfekowany do komórek i mierzona jest aktywność reporterowa. Różnorodność mutantów delecyjnych pozwala na identyfikację regionów odpowiedzialnych za regulację genów. Mimo że test reporterowy jest użytecznym narzędziem do identyfikacji czynników transkrypcyjnych i wiązania sekwencji DNA kontrolujących transkrypcję, metoda ta ma główną wadę polegającą na tym, że plazmid reporterowy jest wolny od struktury chromatyny i nie odzwierciedla "prawdziwej" maszynerii transkrypcyjnej. Ponadto zmiany w modyfikacjach histonów nie mogą być określone przez system.

Rozwój metody immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) opierał się na raportach Jacksona i Chalkleya, że "cała komórka" utrwalanie formaldehydem zachowywało strukturę chromatyny4,5. Od tego czasu opracowano i udoskonalono wiele powiązanych technik6. W testach ChIP komórki są utrwalane formaldehydem w celu usieciowania DNA i białek. Chromatyna jest rozdrobniona, a następnie immunoprecypitowana za pomocą interesujących przeciwciał. Kompleks immunologiczny jest myty, a DNA oczyszczane. Amplifikacja PCR starterami ukierunkowanymi na określony region genomu ujawnia zajęcie interesujących białek w genomie.

Chociaż ChIP jest potężnym narzędziem do identyfikacji interakcji białek, takich jak czynniki transkrypcyjne i zmodyfikowane histony, metoda ta wiąże się w praktyce z pewnymi trudnościami, takimi jak etap fragmentacji chromatyny. Sonikacja jest szeroko stosowana do ścinania chromatyny; Identyfikacja powtarzalnych warunków jest jednak kłopotliwa. Leczenie nukleazą mikrokokową (MNazą) jest alternatywną metodą ścinania chromatyny. MNaza to endoegzonukleaza, która trawi dwuniciowe, jednoniciowe, koliste i liniowe DNA i RNA. Stosunkowo łatwo jest określić warunki, w tym ilość chromatyny i enzymu, temperaturę i czas inkubacji, dla optymalnej fragmentacji chromatyny. Zmodyfikowaliśmy i uprościliśmy istniejące protokoły oraz opracowaliśmy prostą i powtarzalną metodę. W artykule przedstawiono protokół testu ChIP z wykorzystaniem MNazy w komórkach ssaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotować 18,5% roztwór paraformaldehydu (PFA). Dodaj 0,925 g PFA, 4,8 ml wody (używaj ultraoczyszczonej wody w całym protokole) i 35 μl 1 M KOH w stożkowej plastikowej probówce o pojemności 50 ml. Zamknij szczelnie nakrętkę i podgrzej probówkę w szklanej zlewce o pojemności 400-600 ml zawierającej około 200 ml wody za pomocą kuchenki mikrofalowej. Wyjmij probówkę, zanim woda zacznie wrzeć i przekręć rurkę, aby rozpuścić PFA. Pozwól PFA ostygnąć do temperatury pokojowej i przechowuj na lodzie.
    nuta: Powtarzaj podgrzewanie i mieszanie, aż PFA całkowicie się rozpuści. Przygotuj roztwór PFA bezpośrednio przed sieciowaniem (krok 2.1.3).
  2. Przygotować 1,25 M roztwór glicyny. Rozpuść 14,07 g glicyny w 150 ml wody i przefiltruj przez filtr o wielkości porów 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Zrób bufor do lizy komórek ChIP. Rozpuść 378 mg PIPES, 10,6 ml 2 M KCl i 1,25 g rozgałęzionego poli(etylenoksy)etanolu oktylofenoksy w wodzie. Doprowadzić pH do 8,0 za pomocą 1 M KOH w temperaturze 4 °C i uzupełnić do 250 ml. Przefiltrować przez filtr o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Zrób bufor trawienia nukleazy mikrokokowej (MNazy). Aby uzyskać 1 ml, wymieszaj 0,1 ml 10x buforu do wytrawiania MNazy, 10 μl 100x roztworu BSA, 10 μl 0,1 M ditiotreitolu i 0,88 ml wody.
  5. Zrób 1 M NaHCO3. Rozpuść 4,2 g NaHCO3 w 50 ml wody i przefiltruj przez filtr o wielkości porów 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  6. Zrób 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS). Rozpuścić 5 g SDS w 50 ml wody. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  7. Wykonać bufor elucyjny. Zmieszać 15 μl 1 M NaHCO3, 15 μl 10% SDS i 120 μl wody, aby uzyskać 150 μl buforu elucyjnego na jedną próbkę.
    nuta: Objętości należy zwiększać proporcjonalnie w zależności od liczby próbek.
  8. Przygotować 3 M roztwór octanu sodu (pH 5,2). Rozpuścić 24,6 g bezwodnego octanu sodu w wodzie. Doprowadzić pH do 5,2 za pomocą kwasu octowego i uzupełnić 100 ml. Przefiltruj przez filtr o wielkości porów 0,22 μm i przechowuj w temperaturze pokojowej.

2. Określanie warunków trawienia MNazy

UWAGA: W kroku 2 protokołu przedstawiono przykład użycia VCaP, ludzkie komórki raka prostaty. Można użyć dowolnych linii komórkowych ssaków; zobacz Uwaga w krokach.

  1. Przygotowanie usieciowanej chromatyny
    1. Utrzymuj komórki VCaP w wysokim poziomie glukozy DME, uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w inkubatorze dwutlenku węgla. Nasiona komórek VCaP w formacie 4 x 106 komórek w sześciu 6-centymetrowych szalkach w 4 ml pożywki hodowlanej i kultury przez 3 dni.
      nuta: Używaj odpowiednich pożywek hodowlanych dla każdej linii komórkowej. Do 10 x 106 komórek można wysiać w naczyniu o średnicy 6 cm lub 10 cm. W przypadku komórek zawieszonych, komórki nasienne w kolbach T25. Liczba szalek lub kolb zależy od tego, ile dawek jest testowanych pod kątem trawienia MNazy. Jeśli badane są 4 dawki, przygotuj 6 szalek lub kolb. Patrz także krok 2.2.
    2. Odłącz komórki VCaP od jednego naczynia za pomocą trypsyny i policz komórkę. Oblicz numer komórki w jednym naczyniu. W przypadku zawieszonych komórek należy usunąć niewielką ilość zawiesiny komórek z jednej kolby i policzyć liczbę komórek.
    3. Dodaj 0,229 ml 18,5% PFA do 6 cm naczynia w 4 ml pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu 1%. Delikatnie, ale dokładnie zamieszaj naczynie lub kolbę, aby równomiernie rozprowadzić PFA. Inkubować w temperaturze pokojowej dokładnie przez 10 minut
      nuta: Na tym etapie chromatyna i białka są sieciowane. Ponieważ PFA jest toksyczny, należy wykonać ten krok w dygestoriach chemicznych i używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
    4. Po 10 minutach dodać 0,47 ml 1,25 M roztworu glicyny o końcowym stężeniu 125 mM. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      nuta: Glicyna neutralizuje nadmiar PFA, aby zatrzymać dalsze sieciowanie.
    5. Odessać formaldehyd/glicynę/pożywkę hodowlaną. Umyj komórki, dodając dwukrotnie 4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). W przypadku komórek zawieszonych przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i dodać jedną objętość pożywki PBS i całkowicie zawiesić. Powtórz ten krok. Odpady płynne należy utylizować w odpowiedni sposób, ponieważ zawierają one formaldehyd.
    6. Przygotować PBS zawierający koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (), dodając 1/100 objętości 100x do PBS. Odessać PBS z naczynia i dodać 1 ml na każde naczynie PBS zawierającego. Zeskrobać komórki i przenieść zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. W przypadku zawieszonych komórek wystarczy przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 1,5 ml.
    7. Probówki wirówkowe o masie 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu odzyskania osadu komórkowego. Całkowicie usuń PBS za pomocą pipety. Zapisać liczbę komórek w probówce i przechowywać osad komórek w temperaturze -80 °C.
  2. Liza komórek i trawienie MNazy
    nuta: Objętość odczynnika w poniższych krokach jest oparta na jednej probówce zawierającej 6 x 106 komórek. Dostosuj objętość odczynnika proporcjonalnie w zależności od liczby komórek; gdy jedna probówka zawiera 2 x 106 komórek, użyj 100 μl buforu do lizy komórek ChIP (krok 2.2.1), buforu do wytrawiania MNazy (krok 2.2.3) i buforu rozcieńczającego ChIP (krok 2.2.5) oraz 10 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) (krok 2.2.4).
    1. Rozmrozić przechowywaną osadkę komórkową (komórki VCaP, zawierające 6 x 106 komórek w probówce) przygotowaną w kroku 2.1.7 na lodzie. Przygotować bufor do lizy komórek ChIP uzupełniony poprzez dodanie 1/100 objętości 100x do buforu. Dodać 300 μl buforu do lizy komórek ChIP uzupełnionego i dokładnie zawiesić osad. Wirować rurkę przez 15 s i inkubować zawiesinę na lodzie przez 10 minut.
    2. Wirować przy 9 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i całkowicie usunąć supernatant. Zawiesić osad w 300 μl buforu do wytrawiania MNazy.
    3. Rozcieńczyć MNazę (2 000 jednostek żelu/μl) buforem do wytrawiania MNazy, aby uzyskać 50 jednostek żelu/μl. Dodać 0, 0,5, 1, 2, 4 μl z 50 jednostek żelu/μl MNazy do zawiesiny i inkubować w temperaturze 37 °C dokładnie przez 10 minut, mieszając przez inwersję co 2,5 min.
      UWAGA: Tabela 1 przedstawia optymalne ilości MNazy w kilku liniach komórkowych.
    4. Dodaj 30 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0), aby zakończyć trawienie MNazy i krótko wirować. Inkubować przez 5 minut na lodzie. Wirować przy 9 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i całkowicie usunąć supernatant.
    5. Przygotować bufor rozcieńczający ChIP uzupełniony poprzez dodanie do buforu 1/100 objętości 100x. Zawiesić osad w 300 μl buforu rozcieńczającego ChIP uzupełnionego.
    6. Sonikować zawiesinę na lodzie za pomocą sonikatora wyposażonego w sondę z mikrokońcówką. Stosować następujące warunki sonikacji: amplituda 2, czas przetwarzania 15 s, impuls włączony 5 s, impuls wyłączony 30 s. Pobrać 1 μl zawiesiny i umieścić na szkiełku podstawowym i obserwować je pod mikroskopem. Upewnij się, że struktura komórkowa jest prawie uszkodzona.
      UWAGA: Rysunek 1A pokazuje reprezentatywne mikrofotografie zawiesiny komórek VCaP przed i po sonikacji. Ten etap polega na uwolnieniu strawionej chromatyny do supernatantu poprzez zerwanie błon jądrowych. Ustawienie mocy powinno być ustawione na mniej niż 5% mocy maksymalnej i próbować sonikacji przez 5 s trzy razy w odstępie dłuższym niż 30 s. Jeśli dostępna jest kontrola mocy, ustaw moc na 5 W i przetwarzaj próbki łącznie przez 15 sekund, jak wspomniano powyżej, aby uzyskać łączną moc 70-75 J. Sprawdź, czy struktura komórki nie jest uszkodzona, jak wspomniano powyżej. Jeśli to nie wystarczy, powtórz jeszcze raz. Opisany powyżej warunek jest praktycznie stosowany do wszystkich badanych linii komórkowych.
    7. Wirować przy 9 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zachować 20 μl strawionej chromatyny na krok 2.3. Pozostałą część przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Odwrotne sieciowanie, oczyszczanie DNA i analiza strawionej chromatyny
    1. Dodać 75 μl wody, 4 μl 5 M NaCl i 1 μl proteinazy K do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 μl strawionej chromatyny z różnych warunków trawienia MNazy przygotowanych w kroku 2.2.7 do probówek zawierających wodę, NaCl i proteinazę K. Zamknąć szczelnie nakrętkę, całkowicie wymieszać i inkubować probówkę w temperaturze 65 °C przez noc.
      nuta: Ten krok ma na celu usunięcie usieciowania między białkiem a DNA.
    2. Przygotuj dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na każdy warunek. Dodać 100 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) (PCI) do jednej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 10 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 2 μl glikogenu do innej probówki.
      nuta: Stosowanie chloroformu:alkoholu izoamylowego nie jest konieczne7. Zwiększenie objętości może skutkować niskim odzyskiem DNA po wytrąceniu etanolu8.
    3. Odwirować krótko probówkę zawierającą strawioną chromatynę z kroku 2.3.1 i dodać 100 μl PCI. Zamknij szczelnie nakrętkę i energicznie wiruj, aby utworzyć emulsję. Odwiruj probówkę z maksymalną prędkością (np. 20 000 x g) przez 30 s w temperaturze pokojowej.
    4. Ostrożnie pobrać górną fazę zawierającą DNA i dodać do probówki zawierającej PCI przygotowanej w kroku 2.3.2. Energicznie przetrząsnąć i odwirować probówkę zgodnie z krokiem 2.3.3.
      nuta: Jeśli dolna faza jest zanieczyszczona, ponownie odwiruj probówkę lub najpierw usuń większość dolnej fazy, odwiruj probówkę i weź górną fazę.
    5. Ostrożnie pobrać górną fazę, jak opisano w kroku 2.3.4 i dodać do probówki zawierającej octan sodu i glikogen przygotowane w kroku 2.3.2. Dodać 250 μl etanolu. Wymieszać przez odwrócenie i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wirować probówkę z maksymalną prędkością (np. 20 000 x g) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      nuta: Inkubacja roztworu w temperaturze pokojowej nie wpływa na odzyskiwanie DNA8,9.
    6. Potwierdź granulki na spodzie tuby. Ostrożnie usunąć sklarat sklarowany, aby nie naruszyć osadu i dodać 500 μl 70% etanolu. Odwirować probówkę z maksymalną prędkością (np. 20 000 x g) przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Całkowicie usunąć sklarowany osad i suszyć osad przez około 5 minut w temperaturze pokojowej. Rozpuścić osad w 20 μl 10 mM Tris·HCl/1 mM EDTA (pH 8,0) (TE). Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV.
    8. Wymieszaj 0,5 μg DNA z barwnikiem ładującym żel i nałóż na 2% żelu agarozowego. Próbki należy poddać elektroforezie pod napięciem 100 V w buforze tris-octanu-EDTA, aż fioletowy barwnik przeniesie się do dwóch trzecich żelu i zabarwić żel 0,5 μg/ml bromku etydyny przez 10 minut. Zrób zdjęcie żelu.
      nuta: Zobacz Rysunek 2, aby uzyskać szczegółowe informacje.

3. ChromatynaImmunoprecypitacja

  1. Przygotowanie strawionej chromatyny
    1. Przygotuj komórki. W przypadku komórek przylegających należy wysiać 2-10 x 106 komórek na szalkę w 2 szalkach (6 cm lub 10 cm) na grupę poddawaną działaniu substancji i pozwolić komórkom przyłączyć się do dna szalek na dłużej niż 1 dzień. W przypadku komórek zawieszonych, wysiewać nasiona w 2 kolbach T25 na grupę poddawaną działaniu substancji. Traktuj komórki zgodnie z potrzebami.
    2. Weź po jednym naczyniu lub kolbie z każdej grupy i policz liczbę komórek zgodnie z opisem w kroku 2.1.2. Przygotuj usieciowaną chromatynę, jak wspomniano w krokach 2.1.3-2.1.7.
    3. Lizować osad komórkowy i trawienie MNazy zgodnie z opisem w krokach 2.2.1-2.2.7. Użyj optymalnej ilości MNazy do trawienia chromatyny, jak określono w kroku 2. Strawioną chromatynę przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. Odwróć sieciowanie 20 μl strawionej chromatyny i oczyść DNA zgodnie z opisem w kroku 2.3.8. Zmierzyć stężenie DNA zgodnie z opisem w kroku 2.3.7. Poddać próbki elektroforezie w 2% żelu agarozowym, aby sprawdzić wielkość strawionej chromatyny, jak wspomniano w kroku 2.3.
      nuta: Stężenie DNA jest identyczne z koncentracją przechowywanej strawionej chromatyny przygotowanej w kroku 3.1.3.
    5. Rozcieńczyć próbkę chromatyny z odwróconym trawieniem usieciowanym z kroku 3.1.4 do uzyskania 10 ng/μl wodą i seryjnie rozcieńczyć do uzyskania stężeń 1, 0,1 i 0,01 ng/μL. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
      nuta: Próbki te są używane do wzorców PCR w czasie rzeczywistym.
  2. Immunoprecypitacja
    UWAGA: W krokach 3.2-3.5 protokołu określa się obecność antytrimetylowanego histonu H3 lizyny 4 (H3K4me3) w komórkach VCaP. Zobacz też Rysunek 3.
    1. Rozmrozić strawioną chromatynę z kroku 3.1.3. Wszystkie próbki należy przechowywać na lodzie.
    2. Przygotować bufor rozcieńczający ChIP uzupełniony poprzez dodanie do buforu 1/100 objętości 100x. Rozcieńczyć strawioną chromatynę do 5 μg/500 μl buforem rozcieńczającym ChIP uzupełnionym. Przygotuj 1,000 μl plus dodatkowe dla (1) IP z nieimmunologiczną IgG (kontrolną IgG), (2) IP z H3K4me3.
    3. Dodać 5 μl 5 μg/500 μl strawionej chromatyny do probówki śrubowej o pojemności 1,5 ml jako próbkę wejściową (1% jednego IP). Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C.
    4. Dodać po 500 μl z 5 μg/500 μl strawionej chromatyny do probówki śrubowej o pojemności 1,5 ml jako próbkę IP. Dodać 2 μg przeciwciała do probówki. Zamknąć nakrętkę i inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie mieszając, używając platformy kołyszącej.
      nuta: Chociaż optymalna ilość przeciwciał powinna być określona empirycznie, na początku zaleca się 2 μg na IP.
    5. Dodać 30 μl kulek magnetycznych białka G klasy ChIP na IP. Inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, delikatnie mieszając, korzystając z platformy kołyszącej.
      nuta: Mycie wstępne kulek magnetycznych nie jest konieczne.
  3. Mycie kompleksu immunologicznego i odwrócenie sieciowania
    1. Krótko zakręć rurką z kroku 3.2.5. Umieść probówkę w stojaku polietylenowym zawierającym magnesy neodyniowe na 1 minutę. Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację.
    2. Dodać 0,5 ml na probówkę kompleksowego buforu myjącego o niskiej zawartości soli. Rozprowadź koraliki, delikatnie stukając lub krótko obracając rurkę. Inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 5 minut, delikatnie mieszając, używając platformy kołyszącej. Po 5 minutach powtórz krok 3.3.1.
    3. Dodać 0,5 ml wysokosolowego buforu do przemywania kompleksu immunologicznego na probówkę. Rozproszyć i umyć kulki zgodnie z krokiem 3.3.2. Po umyciu powtórz krok 3.3.1.
    4. Dodać 0,5 ml buforu do płukania kompleksu immunologicznego LiCl na probówkę. Rozproszyć i umyć kulki zgodnie z krokiem 3.3.2. Po umyciu powtórz krok 3.3.1.
    5. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 1 minutę. Całkowicie usuń pozostały supernatant.
    6. Dodać 150 μl buforu elucyjnego do probówki. Wiruj rurkę, aby całkowicie rozproszyć koraliki. Zamknąć nakrętkę i inkubować probówkę w temperaturze 65 °C przez 30 minut, mieszając przez odwrócenie lub wirowanie co 5 minut, aby dokładnie rozproszyć kulki.
    7. Podczas inkubacji przygotować probówkę śrubową o pojemności 1,5 ml i dodać 6 μl 5 M NaCl i 2 μl proteinazy K. Rozmrozić 1% próbkę wejściową przygotowaną w kroku 3.2.3. Dodać 150 μl buforu elucyjnego, 6 μl 5 M NaCl i 2 μl proteinazy K do 1% próbki wejściowej.
    8. Po inkubacji odwirować probówkę. Umieścić probówkę w stojaku magnetycznym na 1 minutę i przenieść supernatant do probówki śrubowej zawierającej NaCl i proteinazę K przygotowanych w kroku 3.3.7.
    9. Zamknij nakrętkę i zwiruj wszystkie próbki IP i wejściowe, aby całkowicie się wymieszały. Inkubować probówkę w temperaturze 65 °C przez noc.
  4. Oczyszczanie DNA
    1. Przygotować probówkę zgodnie z opisem w ppkt 2.3.2 i dodać 150 μl PCI zamiast 100 μl. Do innej probówki dodać 12 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 2 μl glikogenu.
    2. Wyjąć probówkę z inkubatora. Zakręć probówkę i dodaj 150 μl PCI.
    3. Energicznie przekręć rurkę, aby utworzyć emulsję. Odwirować probówkę z maksymalną prędkością (np. 20 000 x g) przez 30 s w temperaturze pokojowej.
    4. Ostrożnie przenieść 140 μl górnej fazy do probówki zawierającej PCI, przygotowanej w kroku 3.4.1. Powtórz krok 3.4.3.
      nuta: Patrz także uwaga w kroku 2.3.4.
    5. Ostrożnie przenieść 120 μl górnej fazy do probówki zawierającej octan sodu i glikogen przygotowanych w kroku 3.4.1.
      nuta: Patrz także uwaga w kroku 2.3.4.
    6. Dodać 300 μl etanolu. Wymieszać przez odwrócenie i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Odwirować probówkę z maksymalną prędkością (np. 20 000 x g) przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Umyć osad zgodnie z opisem w kroku 2.3.6.
    8. Po wysuszeniu osadu zgodnie z opisem w kroku 2.3.7, rozpuścić go w 50 μl TE. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Wykrywanie fragmentów DNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym
    1. Rozmrozić następujące próbki: (1) IP z kontrolną IgG, (2) IP z anty-H3K4me3, (3) 1% próbka wejściowa. Rozmrozić również 4 dawki wzorców przygotowanych w kroku 3.1.5 (łącznie 7 próbek).
      nuta: Do ilościowego określenia ilości DNA w próbkach wejściowych i IP należy stosować wzorce z tej samej grupy.
    2. Przygotuj roztwór roboczy PCR dla 8 próbek. Wymieszaj 40 μl 2x supermix PCR w czasie rzeczywistym, po 8 μl 4 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 8 μl wody.
      nuta: Jedna mieszanina reakcyjna PCR zawiera 5 μl 2x supermix PCR w czasie rzeczywistym, po 1 μl 4 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 1 μl wody. Sekwencje starterów są wymienione w Tabeli 2.
    3. Podaniec 8 μl roztworu roboczego PCR do jednego dołka płytki PCR. Dodać 2 μl próbek z kroku 3.4.8 lub wzorce z kroku 3.1.5.
    4. Uszczelnić płytkę PCR i uruchomić PCR w następujących warunkach: 1) 95 °C przez 3 minuty w celu wstępnej denaturacji, 2) 95 °C przez 10 s w przypadku denaturacji, 3) 56 °C przez 30 s w przypadku wyżarzania, 4) 72 °C przez 30 s w celu przedłużenia i zebrania danych, powtórz kroki od 2) do 4) przez 55 cykli. Po cyklach zmierz krzywą topnienia produktu PCR. Analizowanie danych.
      nuta: Surowe dane dla Rysunek 3 przedstawiono w tabeli 3. Obliczyć ilość początkową (SQ) próbek przy użyciu krzywej standardowej. Pomnóż SQ w 1% danych wejściowych przez 100, aby dostosować SQ 1% próbki wejściowej do jednego IP, aby uzyskać skorygowane SQ w danych wejściowych (równanie 1). Podziel SQ w próbce IP przez skorygowaną SQ w wejściu, aby uzyskać % wartości wejściowej (metoda procentowego wejścia, równanie 2). Aby obliczyć wzbogacenie fałdowania, podziel SQ w IP za pomocą anty-H3K4me3 przez SQ w IP z kontrolną IgG (metoda wzbogacania fałdowania, równanie 3).
      Skorygowane wejście SQ = (wejście SQ 1%) x 100 (1)
      Procentowe wejście H3K4me3 = 100 x (SQ in IP z anty-H3K4me3) / (Adjusted SQ in Input) (2)
      Wzbogacenie fałdy H3K4me3 = (SQ w IP z anty-H3K4me3) / (SQ w IP z kontrolą IgG) (3)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trawienie chromatyny jest jednym z ważnych etapów testu ChIP. Użyliśmy MNazy do trawienia chromatyny w celu uzyskania mieszaniny oligomerów nukleosomów. Na etapie trawienia MNazy MNaza może przejść przez błonę jądrową i trawić chromatynę. Jednak strawiona chromatyna nie może przejść przez błonę i pozostaje w jądrach. Aby uwolnić strawioną chromatynę z jąder, potrzebna jest krótka sonikacja. Rysunek 1A pokazuje mikrofotografie przed i po sonikacji zawiesiny komórek VCaP. Bez sonikacji struktura komórki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż sonikacja jest powszechnie stosowana w celu uzyskania rozdrobnionej chromatyny, identyfikacja powtarzalnych warunków jest czasochłonna i kłopotliwa. W tym protokole zastosowaliśmy trawienie MNazy, ponieważ trawienie enzymatyczne powinno być łatwiejsze do zidentyfikowania powtarzalnych warunków. Krótki etap sonikacji po trawieniu MNazy (patrz krok 2.2) był konieczny do przerwania błony komórkowej i uwolnienia strawionej chromatyny. Dlatego moc sonikacji w naszym protokole powinna być jak najniższa. Używamy tych sa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania są wspierane przez tantiemy Genentech dla City of Hope. Prace te nie są wspierane w całości ani w części przez National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA (pH 8,0)Thermo ScientificAM9010
2 M KClThermo ScientificAM9010
2x iQ SYBR Green supermixBio-Rad1706862
5 M NaClThermo ScientificAM9010
50 pz drabinka DNANew England BiolabsN3236S
agarozy Międzynarodowy A20090
Rozgałęziony poli(etylenoksy)etanol oktylofenoksyMillipore SigmaI8896IGEPAL CA-630
Kulki magnetyczne białka G klasy ChIPTechnologia sygnalizacji komórkowej9006S
Bufor do rozcieńczania chromatyny (ChIP)Millipore Sigma20-153Skład buforu: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024S
GlycineBio-Rad161-0724Glikogen klasy elektroferezy
Millipore SigmaG176719-22 mg / ml
Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy Halt, bez EDTA (100x)Thermo Scientific78445
Kompleks immunologiczny o wysokiej zawartości soli Bufor do płukaniaMillipore Sigma20-155Skład buforu: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl.
Przeciwciało histonowe H3K4me3 (pAb)Aktywny motyw39915
LiCl Immune Complex Bufor do płukaniaMillipore Sigma20-156Skład buforu: 0,25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% kwas dezoksycholowy (sól sodowa), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,1.
Low Salt Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-154Skład buforu: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl.
Stojak Magna GrIP (8 dołków)Millipore Sigma20-400Każdy rodzaj magnetycznych stojaków separacyjnych, które są kompatybilne z probówką 1,5 ml, jest w porządku.
Nukleaza mikrokokowaNew England BiolabsM0247Sjest dostarczana z 10-krotnym buforem (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7,9 przy 25 ° C) i 100x BSA (10 mg / ml)
NaHCO3JT Baker3506-01
Normalny królik IgGMillipore Sigma12-370
RURYMillipore SigmaP6757
ProteinazaK Millipore Sigma3115887001
System PCR w czasie rzeczywistymBio-RadCFX96, C1000
RNA pol II CTD przeciwciało phospho Ser5Aktywny motyw39749
SDSBoehringer Mannheim100155klasy elektroferezy
Millipore SigmaS5636
Sonikator wyposażony w sondę mikrokońcówkowąQSONICAQ700Każdy rodzaj sonikatorów, które są kompatybilne z probówką 1,5 ml, jest w porządku.
UltraPure Phenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1, v/v)Thermo Scientific15593031pH 8,05
Produkt badawczy Octan sodu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
  2. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
  5. Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
  6. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  7. Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).
  8. Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
  9. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  10. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  11. Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
  12. Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
  13. Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
  14. Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949(2018).
  15. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
  16. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  17. Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
  18. Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
  19. Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

nukleaza mikrokokowaanaliza ChIPmodyfikacje histon woddzia ywania bia ko DNAfragmentacja chromatynytrawienie MNazlizy kom rkowaoczyszczanie DNA

Powiązane artykuły