Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis

Summary

Białka receptora germinantu skupiają się w 'germinosomach' w wewnętrznej błonie zarodników Bacillus subtilis. Opisujemy protokół wykorzystujący mikroskopię super rozdzielczości i fluorescencyjne białka reporterowe do wizualizacji germinosomów. Protokół identyfikuje również wewnętrzne domeny błony zarodnikowej, które są preferencyjnie barwione barwnikiem błonowym FM4-64.

Abstract

Mały rozmiar zarodników i stosunkowo niska obfitość białek kiełkujących, powodują trudności w ich mikroskopowych analizach przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej. Trójwymiarowa mikroskopia oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości (3D-SIM) jest obiecującym narzędziem do pokonania tej przeszkody i ujawnienia molekularnych szczegółów procesu kiełkowania zarodników Bacillus subtilis (B. subtilis). W tym miejscu opisujemy zastosowanie zmodyfikowanego procesu obrazowania 3D z asystentem SIMcheck (ImageJ) i fluorescencyjnych białek reporterowych do mikroskopii SIM germinosomów zarodników B. subtilis, klastra (skupiska) białek kiełkowania. Przedstawiamy również (standardową) procedurę obrazowania 3D-SIM do barwienia błon przetrwalnikowych B. subtilis za pomocą FM4-64. Stosując te procedury, uzyskaliśmy niezrównaną rozdzielczość lokalizacji germinosomów i wykazaliśmy, że >80% uśpionych zarodników B. subtilis KGB80 uzyskanych po zarodnikowaniu na określonym minimalnym pożywce MOPS ma jedno lub dwa ogniska GerD-GFP i GerKB-mCherry. Jasne ogniska zaobserwowano również na obrazach 3D-SIM zarodników barwionych FM4-64, co sugeruje, że prawdopodobnie istnieją domeny lipidowe błony wewnętrznej o różnej płynności. Możliwe są dalsze badania, w których wykorzystuje się procedury podwójnego znakowania barwnikami błonowymi i germinosomowymi białkami reporterowymi w celu oceny kolokalizacji, a tym samym uzyskania optymalnego przeglądu organizacji białek kiełkowania Bacillus w wewnętrznej błonie przetrwalników.

Introduction

Zarodniki z rzędów Bacillales i Clostridiales są metabolicznie uśpione i niezwykle odporne na surowe reżimy dekontaminacji, ale jeśli nie wykiełkują, nie mogą powodować szkodliwych skutków u ludzi¹. W przypadku kiełkowania zarodników Bacillus subtilis (B. subtilis) wywołanego przez kiełkowanie składników odżywczych zdarzeniem inicjującym jest wiązanie kiełkowania z receptorami kiełkowania (GR) znajdującymi się w wewnętrznej błonie zarodnika (IM). Następnie GR transdukują sygnały do białka kanału SpoVA znajdującego się również w IM. Powoduje to początek wymiany rdzenia zarodników kwasu pirydyno-2,6-dikarboksylowego (kwas dipikolinowy; DPA; składający się w 20% z suchego rdzenia zarodników) do wody przez kanał SpoVA. Następnie uwolnienie DPA wyzwala aktywację hydrolizy peptydoglikanu w korze mózgowej, a po tym następuje dodatkowy pobór wody^2,3,4. Zdarzenia te prowadzą do naprężeń mechanicznych warstw powłoki, jej późniejszego zerwania, początku wzrostu i wreszcie wzrostu wegetatywnego. Jednak dokładne szczegóły molekularne procesu kiełkowania są nadal dalekie od wyjaśnienia.

Główne pytanie dotyczące kiełkowania zarodników dotyczy biofizycznych właściwości lipidów otaczających białka kiełkowania IM, jak również białek kanału IM SpoVA. Ta w dużej mierze nieruchoma dwuwarstwa lipidowa IM jest główną barierą przepuszczalności dla wielu małych cząsteczek, w tym toksycznych chemicznych środków konserwujących, z których niektóre wywierają swoje działanie w rdzeniu zarodników lub cytoplazmie komórki wegetatywnej^5,6. Dwuwarstwa lipidowa IM jest prawdopodobnie w stanie żelowym, chociaż istnieje znaczna frakcja ruchomych lipidów w klasie IM5. IM zarodnika ma również potencjał do znacznego rozszerzenia⁵. W ten sposób powierzchnia IM zwiększa się 1,6-krotnie po wykiełkowaniu bez dodatkowej syntezy błony i towarzyszy jej utrata charakterystycznej dla tej błony niskiej przepuszczalności i bezruchu lipidów^5,6.

Podczas gdy szczegóły molekularne aktywacji białek kiełkujących i organizacji lipidów IM w zarodnikach są atrakcyjnymi tematami do badań, mały rozmiar zarodników B. subtilis i stosunkowo niska obfitość białek kiełkujących stanowią wyzwanie dla analiz mikroskopowych. Griffiths i in. przekonujące dowody z mikroskopu epifluorescencyjnego, wykorzystujące fluorescencyjne reportery połączone z białkami kiełkującymi, sugerują, że w zarodnikach B. subtilis białko rusztowania GerD organizuje trzy podjednostki GR (A, B i C) dla GR GerA, B i K, w klastrze⁷. Ukuli termin "germinosom" dla tego klastra białek kiełkujących i opisali struktury jako ~300 nm duże IM protein foci⁸. Po zainicjowaniu kiełkowania zarodników, fluorescencyjne ogniska germinosomów ostatecznie zmieniają się w większe rozproszone wzory fluorescencyjne, przy czym >75% populacji zarodników wykazuje ten wzór w zarodnikach kiełkujących przez 1 godzinę z L-waliną⁸. Zauważ, że wspomniany powyżej artykuł wykorzystał uśrednione obrazy z dziesiątek kolejnych obrazów fluorescencyjnych, aby uzyskać moc statystyczną i pokonać przeszkodę w postaci niskich sygnałów fluorescencyjnych obserwowanych podczas obrazowania. Ta wizualizacja tych struktur w zarodnikach bakteryjnych była na granicy tego, co jest technicznie wykonalne przy użyciu klasycznych narzędzi mikroskopowych i ani ocena ilości ognisk w pojedynczym zarodniku, ani ich bardziej szczegółowa lokalizacja subkomórkowa nie była możliwa przy tym podejściu.

Tutaj demonstrujemy użycie Mikroskopii Oświetlenia Strukturalnego (SIM) w celu uzyskania szczegółowej wizualizacji i kwantyfikacji germinosomu (zarodników) w zarodnikach B. subtilis, jak również ich domen lipidowych IM⁹. Protokół zawiera również instrukcje dotyczące zarodnikowania, przygotowania preparatów i analizy obrazu przez SIMcheck (v1.0, wtyczka imageJ), a także ImageJ^10,11,12.

Protocol

1. B. subtillis Sporulation (czas: 7 dni przed obserwacją mikroskopową)

1. Dzień 1
   1. Umieść kulturę bakteryjną na płytce agarowej Luria-Bertani Broth (LB) (1% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 1% NaCl, 1% agaru)¹³ i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C, aby uzyskać pojedyncze kolonie. Użyj szczepu B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKA gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) i jego macierzystego szczepu tła B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) zgodnie z wcześniejszym opisem⁷.
      nuta: Użycie zarodników z tłem ΔcotEΔgerE jest niezbędne w wizualizacji germinosomów, w celu zminimalizowania autofluorescencji warstw płaszcza zarodnikowego⁷.
   2. Wysterylizuj wszystkie media, probówki, pipety i inne materiały hodowlane, które mają być użyte, odpowiednimi metodami.
2. Dzień 2
   1. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 5 ml pożywki LB wcześnie rano i inkubować kulturę pod ciągłym mieszaniem w probówce z nakrętką z nakrętką przy 200 obr./min i temperaturze 37 °C, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,3-0,4 (około 7 godzin).
   2. Przygotować 500 ml pożywki MOPS (pH 7,5) zawierającej 3 nM (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 0,4 μM H₃BO₃, 30 nM CoCl₂·6H₂O, 10 nM CuSO₄·5H₂O, 10 nM ZnSO₄·7H₂O, 1,32 mM K₂HPO₄, 0,4 mM MgCl₂·6H₂O, 0,276 mM K₂SO₄, 0,01 mM FeSO₄·7H₂O, 0,14 mM CaCl₂·2H₂O, 80 mM MOPS, 4 mM Tricine, 0,1 mM MnCl₂·2H₂O, 10 mM D-glukoza jednowodna i 10 mM NH₄Cl.
   3. Przygotować w probówkach z nakrętką 10-1-10-7 seryjnych rozcieńczeń kultury LB w pożywce MOPS o pojemności 5 ml każda i inkubować kultury przez noc pod ciągłym mieszaniem przy 200 obr./min i temperaturze 37 °C.
      nuta: Przygotowane tutaj seryjne rozcieńczenia mają na celu uzyskanie rozcieńczenia we wczesnej fazie wykładniczej następnego ranka. Ten krok i następny krok są konieczne, aby umożliwić komórkom przystosowanie się do buforowanej pożywki wzrostowej MOPS.
3. Dzień 3
   1. Wybierz jedno z rozcieńczeń MOPS o średnicy zewnętrznej₆₀₀ 0,3-0,4. Zaszczepić 0,2 ml kultury do wstępnie ogrzanych (37 °C) 20 ml pożywki MOPS w stożkowej kolbie o pojemności 250 ml i inkubować w ciągłym mieszaniu, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,3-0,4 (~ 7 h).
   2. Zaszczepić pożywkę zarodnikową na bazie MOPS (250 ml) 1% (v/v) kultury wstępnej z kroku 1.3.1 i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C w stożkowej kolbie litrowej pod ciągłym mieszaniem. W przypadku barwienia zarodników PS4150 FM4-64 za pomocą FM4-64 należy dodać 2 μg/ml sondy FM4-64 (patrz Tabela materiałów) 1 lub 2 godziny po osiągnięciu szczytowej wartości OD₆₀₀ wzrostu wegetatywnego (zwykle około 2) i pozwolić kulturze na późniejsze zarodnikowanie, jednocześnie chroniąc ją przed światłem⁵.
4. Dzień 7: Zbieranie zarodników
   1. Określ wydajność zarodnikowania (zarodniki kontra komórki wegetatywne) za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego przy 100-krotnym powiększeniu, aby odróżnić jasne zarodniki fazowe od ciemnych komórek fazowych i ewentualnie niedojrzałych zarodników. Oczekuje się, że plon jasnych zarodników w fazie 90 %.
   2. Osadzaniki osadzać w temperaturze 4 270 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w probówkach wirówkowych z okrągłym dnem. Umyj osad zarodników 2-3 razy 40 ml sterylnej, ultraczystej demineralizowanej wody typu 1 w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml (patrz tabela materiałów). Odkręcać przy każdym praniu przy 4 270 x g przez 15 min (4 °C).
5. Dzień 7: Oczyszczanie zarodników
   1. Oczyszczanie zarodników: Zawiesić osad zarodników w 750 μl 20% pożywki o gradientowym poziomie gęstości niejonowej (patrz tabela materiałów) i załadować na 800 μl pożywki o gradionym gradiencie gęstości niejonowej 50% w wysterylizowanych probówkach do mikrowirówek. Wirować przez 60 minut przy 21 500 x g. Otrzymany osad zawiera wolne zarodniki. Zawiesić osad zarodników w 200 μl 20% pożywki o gradientzie gęstości niejonowej i załadować na 1 ml pożywki o gradiencie gęstości niejonowej 50% w probówce do mikrowirówki i wirować przez 15 minut przy 21 500 x g.
   2. Mycie końcowego przygotowania i przechowywania zarodników: Otrzymany osad zawiera oczyszczone uśpione zarodniki. Umyj osad zarodników 2-3 razy 1,5 ml sterylnej, ultraczystej wody typu 1 (patrz tabela materiałów) i odwiruj w międzyczasie w temperaturze 9 560 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Na koniec zawiesić osad w sterylnej, ultraczystej wodzie typu 1 do końcowego OD₆₀₀ około 30. Podwielokrotności zarodników mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez 8 tygodni¹⁴.

2. Usuwanie powłok

1. Zarodniki PS4150 należy traktować 0,1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% dodecylosiarczanu sodu (SDS)/0,1 M ditiotreitolu (DTT) w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę. Umyj zarodniki 10 razy wysterylizowaną ultraczystą wodą typu 1^15,16. W ten sposób każda zaadsorbowana sonda FM4-64 w zewnętrznej błonie zarodnika i zewnętrznych warstwach zostanie usunięta.

3. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych i preparatów¹¹ (czas: 1 h przed obserwacją)

1. Szkiełka nakrywkowe należy wstępnie oczyścić o wysokiej precyzji (patrz tabela materiałów) 1 M HCl przez 30 minut w delikatnie wstrząsającej kąpieli wodnej. Umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie w ultraczystej wodzie typu 1 i przechowuj je w 100% (vol/vol) EtOH. Pozwól im wyschnąć i sprawdź ich klarowność przed użyciem. Wstępnie wyczyść szkiełka w 70% EtOH. Pozwól im wyschnąć i sprawdź ich klarowność przed użyciem.

4. Pobieranie próbek fluorescencyjnych mikrosfer lub zarodników w ramce genu Slajd¹⁰ (Czas 15 min)

1. Wstępnie ogrzej dwa szkiełka szklane oczyszczone w 70% EtOH i wysuszone na powietrzu (patrz tabela materiałów) przez kilka sekund na bloku grzewczym o temperaturze 70 °C, upuść 65 μl sterylizowanej 2% agarozy utrzymywanej w temperaturze 70 °C na jedno szkiełko podstawowe i umieść drugie szklane szkiełko na wierzchu, aby rozprowadzić agarozę między szkiełkami. Plaster agarozy wyschnie w ciągu około 5 minut.
2. Pokrój plaster agarozowy na odcinek o wymiarach 1 x 1 cm po usunięciu jednego ze szkiełek podstawowych, dodaj 0,4 μl próbki (mikrosfery fluorescencyjne lub zarodniki ~10⁸/ml) i przenieś plaster na szkiełko nakrywkowe o wysokiej precyzji, umieszczając szkiełko nakrywkowe na plastrze i zsuwając je.
3. Na wysuszonym szkiełku przymocować ramkę genową (1,5 x 1,6 cm², 65 μl), na której umieszcza się szkiełko nakrywkowe, zamykając wszystkie rogi ramy, kończąc w ten sposób szkiełko do użytku w mikroskopii.

5. Obrazowanie^11,17(Czas: 1 godzina)

1. Uchwyć obrazy transmisyjne i fluorescencyjne zarodników, a także mieszaniny czerwonych i żółto-zielonych mikrosfer fluorescencyjnych modyfikowanych karboksylanem na mikroskopie oświetlenia strukturalnego (patrz tabela materiałów) wyposażonym w obiektyw olejowy 100x (apertura numeryczna = 1,49), kamerę CCD i oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Generuj wszystkie obrazy w temperaturze pokojowej bez zakłóceń światła otoczenia. Upewnij się, że zawsze czyścisz obiektyw 100x i szkiełko 75% etanolem przed obrazowaniem.
2. Skoncentruj się na mikrosferach fluorescencyjnych o średnicy 100 nm i zoptymalizuj funkcję rozproszenia punktowego (psf), regulując pierścień korekcyjny na obiektywie 100x, aż do uzyskania symetrycznego psf, minimalizując w ten sposób rozmycie obrazu. PSF to odpowiedź impulsowa lub odpowiedź systemu obrazowania na źródło punktowe lub obiekt punktowy.
3. Wybierz pole widzenia z około 10 okrągłymi mikrosferami fluorescencyjnymi. Zastosuj siatkową regulację ostrości zarówno dla długości fali wzbudzenia 561 nm, jak i 488 nm jako przewodnik dla oprogramowania do analizy obrazu.
4. Skoncentruj zarodniki w świetle transmisyjnym i uchwyć obraz światła transmisyjnego w trybie średniej 16× z ekspozycją 200 ms dla każdego obrazu.
5. Uchwyć surowe fluorescencyjne obrazy zarodników w 3D-SIM w trybie oświetlenia "3D-SIM", ustawieniach aparatu na tryb odczytu Wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów (EM) 10 MHz przy 14 bitach i wzmocnienie EM przy 175. Wzbudz sondę FM4-64 w zarodnikach PS4150 światłem laserowym o długości fali 561 nm przy 20% mocy lasera i czasie świecenia 400 ms.
6. Wzbudzić zarodniki GerKB-mCherry i GerD-GFP w KGB80 odpowiednio światłem laserowym o długości fali 561 nm przy 30% mocy lasera przez 1 s i światłem laserowym o długości fali 488 nm przy 60% mocy lasera przez 3 s. Ustawienia Z-Stack są w trybie od góry do dołu, 0,2 μm/krok, 7 kroków i 20 kroków dla analizy germinosomów i IM, odpowiednio.
   nuta: Te parametry lasera zostały zastosowane w celu zapewnienia maksymalnej wartości jasności okna histogramu wynoszącej około 4 000.

6. Zrekonstruuj surowe obrazy 3D-SIM zarodników poplamionych FM4-64 PS4150

1. Wykonaj rekonstrukcję N-SIM Slice dla surowych danych zarodników PS4150 barwionych FM4-64. Kliknij przycisk Param opcji Reconstruct Slice (Rekonstruuj plasterek) na karcie N-SIM pad tab (Karta karty N-SIM pad Reconstruction), aby otworzyć okno N-SIM Slice Reconstruction.
2. Ustaw parametry rekonstrukcji w oknie N-SIM Slice Reconstruction. Aby uzyskać idealnie zrekonstruowane obrazy, postępuj zgodnie z sugestią zawartą w instrukcjach N-SIM i kliknij odpowiednie elementy sterujące w oknie N-SIM Slice Reconstruction, aby ustawić kontrast modulacji oświetlenia (IMC) na Auto, tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości (HRNS) na 1,00 i Out of Focus Blur Suppression (OFBS) na 0,05 jako punkty początkowe.
3. Kliknij przycisk Reconstruct Slice (Rekonstruuj plasterek) w oknie N-SIM Slice Reconstruction, aby zrekonstruować obraz. Oceń jakość zrekonstruowanych obrazów za pomocą obrazów z szybką transformacją Fouriera (FFT) i wyniku rekonstrukcji, który jest wyświetlany po rekonstrukcji¹².
4. Dostosuj HRNS od 0,10 do 5,00 i OFBS od 0,01 do 0,50, klikając odpowiednie elementy sterujące w oknie N-SIM Slice Reconstruction, aż zostaną uzyskane najlepsze ustawienia parametrów.
5. Kliknij przycisk Apply (Zastosuj) w oknie N-SIM Slice Reconstruction, aby zastosować zmienione parametry. Kliknij przycisk Zamknij, aby zamknąć okno.
6. Uaktywnij surowy obraz zarodników PS4150 zabarwionych FM4-64 i kliknij przycisk Reconstruct Slice na arkuszu zakładek N-SIM Pad, aby wykonać Rekonstrukcję Slice. Zapisz zrekonstruowany obraz.

7. Analiza obrazu

1. Konwertuj obrazy pseudo-szerokokątne germinosomu KGB80
   1. Konwertuj surowe obrazy 3D-SIM KGB80 na obrazy Pseudo-Widefield, aktywując lewym przyciskiem myszy narzędzie ImageJ plugin SIMcheck Raw Data SI to Pseudo-Widefield¹². Pseudo-Widefield uśrednia obrazy z surowych danych SIM i zestawia, dla porównania, obraz odpowiadający konwencjonalnemu oświetleniu szerokokątnemu¹². Aby zapoznać się z samym ImageJ, zobacz https://imagej.net/Welcome. Losowo wybierz ~25 zarodników w każdym obrazie odwróconej transmisji do późniejszej analizy germinosomów na fluorescencyjnych obrazach Pseudo-Widefield.
   2. Wybierz w sumie około 350 (w tym przykładzie 346) zarodników KGB80 w 14 polach view z dwóch slajdów. Liczba ognisk fluorescencyjnych GerD-GFP i GerKB-mCherry w wybranych zarodnikach KGB80 powinna być policzona niezależnie przez dwóch badaczy. Badacz może odwołać się do surowych obrazów 3D-SIM w przypadku wątpliwości co do obecności oddzielnych fluorescencyjnych ognisk germinosomy w zarodnikach.
   3. Oceń maksymalną intensywność każdego ogniska GerD-GFP i GerKB-mCherry oraz zintegrowaną intensywność obrazu 3D każdego zarodnika KGB80 za pomocą ImageJ.
2. Analiza obrazów pseudoszerokokątnych germinosomu KGB80
   1. Użyj średniej zintegrowanej wartości intensywności 7 stosów jako zintegrowanej intensywności sygnału zarodnika KGB80. Określ intensywność tła, obrazując odkształcenie tła PS4150 przy użyciu identycznych ustawień. Plamki fluorescencyjne w poszczególnych zarodnikach KGB80 należy traktować jako ogniska germinosomowe, gdy są one wyraźnie odróżnialne od tła.
   2. Zastosuj jednoczynnikowe testy ANOVA do określania istotności za pomocą oprogramowania Origin 9.0, uznając wartości P <0,05 za statystycznie istotne. Użyj współczynnika korelacji rang Spearmana¹⁸, aby ocenić korelację liczby ognisk GerD-GFP i GerKB-mCherry oraz pomiary intensywności zintegrowanego sygnału.

Results

Obecny protokół przedstawia procedurę obrazowania zarodników bakterii za pomocą mikroskopu SIM. Procedury zarodnikowania i przygotowania preparatu zostały przeprowadzone tak, jak pokazano na Rysunek 1 przed obrazowaniem. Później procedury obrazowania i analizy zastosowano zarówno dla próbek zarodników dim (białka kiełkujące znakowane białkiem fluorescencyjnym), jak i jasnych (IM barwione sondą lipofilową), jak pokazano w poniższym tekście.

Discussion

Przedstawiony protokół zawiera standardową procedurę 3D-SIM do analizy zarodników B. subtilis barwionych FM4-64, która obejmuje procesy zarodnikowania, przygotowania szkiełek i obrazowania. Ponadto protokół opisuje zmodyfikowany proces obrazowania 3D wspomagany SIMcheck (ImageJ) do mikroskopii SIM germinosomów zarodników B. subtilis znakowanych fluorescencyjnymi reporterami. Ten ostatni zabieg pozwolił nam zaobserwować tę słabą strukturę podłoża ze zwiększonym kontrastem. Łącząc dwie procedury obrazowan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkiełka szklane suszone na powietrzu	Menzel Glä ser	630-2870
APO TIRF N20R8 100&razy; obiektyw olejowy (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 Δ gerE::spc, Δ cotE::tet)
Kolby Erlenmeyera 1 L	Kolby Sigma-Aldricha	Z567868
Kolby Erlenmeyera 250 ml		Sigma-Aldrich
FluoSpheres	Invitrogen, 0,1 μ m	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	F34653
Histodenz nonionic density gradient medium	Sigma-Aldrich	D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 Kamera CCD	Andor Technology		https://imagej.net/Welcome
LB Agar	Sigma-Aldrich	L2897
Probówki do mikrofug 1,5 ml	Thermo Fisher Scientific	3451PK
Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego	Nikon, Japonia	NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultraczysta woda demineryzowana	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Mikroskop
Butelka z polipropylenową nakrętką 180 ml	Thermo Fisher Scientific	75003800
Szkiełka nakrywkowe precyzyjne	Paul Marienfeld	117650
Probówki z okrągłym dnem 15 ml	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM
Probówki z nakrętką 50 ml	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM