Artykuł metodologiczny

Lipidomika i transkryptomika w chorobach neurologicznych

DOI:

10.3791/59423

⸱

18 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia modułowy protokół dla lipidomiki tkankowej i transkryptomiki oraz lipidomiki osocza w mysich modelach chorób neurologicznych ukierunkowanych na lipidy leżące u podstaw stanu zapalnego i aktywności neuronalnej, lipidy błonowe, dalsze przekaźniki oraz enzymy/receptory kodujące mRNA leżące u podstaw funkcji lipidów. Przedstawiono procedury pobierania próbek, przetwarzania próbek, ekstrakcji i kwantyfikacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipidy służą jako główny interfejs do zniewag mózgu lub bodźców prowadzących do chorób neurologicznych i są rezerwuarem do syntezy lipidów o różnych funkcjach sygnalizacyjnych lub ligandowych, które mogą podkreślać początek i postęp chorób. Często zmieniające się na poziomie przedobjawowym, lipidy są nowym źródłem celów leków i biomarkerów. Wiele chorób neurologicznych wykazuje zapalenie nerwów, neurodegenerację i pobudliwość neuronów jako wspólne cechy charakterystyczne, częściowo modulowane przez specyficzne lipidowe systemy sygnalizacyjne. Współzależność i wzajemne powiązania syntezy różnych lipidów skłaniają do analizy multilipidowej, wieloenzymatycznej i wieloreceptorowej w celu uzyskania podobieństw i specyfiki kontekstów neurologicznych oraz przyspieszenia rozwikłania mechanistycznych aspektów początku i postępu choroby. Przypisywanie ról lipidów różnym obszarom mózgu naprzód określenie fenotypu i morfologii molekularnej lipidów związanych z chorobą neurologiczną.

Prezentowany tutaj jest modułowy protokół odpowiedni do analizy lipidów błonowych i dalszych sygnałów lipidowych wraz z mRNA enzymów i mediatorów leżących u podstaw ich funkcjonalności, wyodrębnionych z dyskretnych obszarów mózgu, które są istotne dla konkretnej choroby neurologicznej i/lub stanu. Aby zapewnić dokładne porównawcze profilowanie lipidomiczne, przepływy pracy i kryteria operacyjne zostały zoptymalizowane i ustandaryzowane dla: i) pobierania próbek z mózgu i sekcji obszarów zainteresowania, ii) koekstrakcji wielu sygnałów lipidowych i lipidów błonowych, iii) podwójnej ekstrakcji lipidów/mRNA, iv) kwantyfikacji za pomocą chromatografii cieczowej z monitorowaniem wielu reakcji (LC/MRM) oraz v) standardowego profilowania mRNA. Ten przepływ pracy jest przystosowany do niewielkich ilości tkanek uzyskanych przez pobieranie próbek funkcjonalnie dyskretnych podregionów mózgu (tj. przez uderzanie w mózg), zapobiegając w ten sposób stronniczości w analizie wielocząsteczkowej z powodu niejednorodności tkanek i/lub zmienności zwierząt. W celu ujawnienia obwodowych konsekwencji chorób neurologicznych i ustalenia translacyjnych odczytów molekularnych stanów chorobowych, prowadzone są również badania i analiza lipidomiczna narządów obwodowych, przetwarzanie i późniejsza analiza lipidomiczna, a także lipidomika osocza. Protokół jest demonstrowany na mysim modelu ostrej padaczki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie postępy w funkcji lipidów i ich roli w powstawaniu i postępie chorób neurologicznych otwierają nowe możliwości badań i rozwoju nowych celów terapeutycznych i wyjaśnienia mechanizmu choroby1. Udokumentowane różnice w składzie lipidów w różnych regionach mózgu, podkreślone przez nowoczesne techniki obrazowania molekularnego, takie jak obrazowanie spektrometrią mas i zaawansowane profilowanie spektrometrii mas, przesuwają paradygmat badania lipidów z całego mózgu w kierunku funkcjonalnie odrębnych i dyskretnych regionów mózgu. Fakt, że skład lipidów różni się w różnych regionach mózgu, skłania do nowej konceptualizacji zarówno wrażliwości lipidów błony, jak i dalszej sygnalizacji lipidowej w odpowiedzi na obrazę mózgu lub bodźce w funkcjonalnie odrębnych obszarach mózgu. W związku z tym protokoły lipidowe wymagają nowych rozwiązań, aby sprostać wyzwaniu, jakim jest niska ilość tkanek w celu wykrywania i kwantyfikacji w wyższej rozdzielczości przestrzennej, a jednocześnie analizy wielu składników lipidowych błon komórkowych i szlaków sygnałowych. Ponadto określenie enzymów, ligandów lipidowych i receptorów zaangażowanych w regulację ich poziomów i funkcji ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia szlaków sygnałowych dotkniętych chorobą neurologiczną i ukierunkowania nowych badań mechanistycznych w kontekście patofizjologicznym.

Oprócz zwiększonej rozdzielczości przestrzennej mózgu, istnieją dwie główne trudności, które utrudniają rozwój nowych podejść neurolipidomicznych. Po pierwsze, cząsteczki sygnalizacji lipidowej mają zazwyczaj bardzo niską liczebność w porównaniu z lipidami konstytuującymi błonę. Po drugie, lipidom wykazuje wysoką niejednorodność strukturalną, trudną do zbadania przy użyciu jednego podejścia analitycznego. W związku z tym metody ekstrakcji i analizy są dostosowane do różnych kategorii lipidów i powszechnie wykonywane w różnych próbkach tkanek 2. Metody lipidomiczne typu shotgun3 są doskonałymi narzędziami do szybkiego ujawnienia szerokiego profilu lipidów błonowych, podczas gdy zwiększona czułość i selektywność zapewniana przez ukierunkowane metody spektrometrii mas odkrywania i kwantyfikacji są wykorzystywane do badania nisko obfitych lipidów sygnałowych, w tym: i) lipidów zapalnych i ii) lipidów biorących udział w modulacji aktywności neuronalnej, takich jak endokannabinoidy (eCBs), Lipidy związane z aminokwasami itp.4,5. Aby objąć zmiany lipidowe zarówno na błonie komórkowej, jak i na poziomie sygnalizacji występujące w obszarach mózgu modeli chorób neurologicznych, zazwyczaj ekstrakcję i analizę lipidów przeprowadza się w odrębnych próbkach tkanek, uzyskanych z różnych partii zwierząt lub z różnych półkul, lub poprzez rozcięcie większego obszaru tkanki na wiele części. Gdy interesujące są również poziomy mRNA receptorów enzymatycznych, ich badanie zwykle wymaga pobrania odrębnej próbki tkanki. Na przykład badanie lipidów błonowych, endogennych kannabinoidów i mRNA wymagałoby trzech różnych próbek tkanek (np. dwóch próbek dla dwóch metod ekstrakcji lipidów - lipidów błonowych i lipidów sygnałowych - a następnie dwóch metod analizy lipidów - i jednej próbki do analizy mRNA). Badanie lipidów zapalnych i endogennych kannabinoidów wymaga odpowiednio dwóch odrębnych próbek tkanek, metod ekstrakcji i metod analizy. Innym przykładem jest badanie mRNA i dowolnej kategorii lipidów w próbce z dziurkacza mózgu lub mikrodysekcji laserowej, co w konsekwencji wymaga od dwóch różnych zwierząt pobrania dwóch próbek na (pod)region mózgu. W takich przypadkach często występuje znaczny zakres zmienności i/lub słaba odtwarzalność wyników, wynikająca ze zmienności biologicznej i/lub niejednorodności tkanek. Kierując się tymi praktycznymi ograniczeniami analizy wielocząsteczkowej, zachodzącymi szczególnie w wysokiej rozdzielczości przestrzennej w mózgu, zaprojektowano trzymodułowy protokół neurolipidomiki obejmujący: 1) koekstrakcję i koanalizę za pomocą LC/MRM lipidów zapalnych (np. eikozanoidów (eiCs)) i lipidów zaangażowanych w modulację aktywności neuronalnej, takich jak eCBs2; 2) koekstrakcja fosfolipidów (PL) i eCB z późniejszym multiscanem LC/MRM i analizą strat prekursorowych/neutralnych2; oraz 3) podwójna ekstrakcja błonowych (fosfo)lipidów i eCB, a także mRNA, z późniejszą analizą sekwencjonowania LC/MRM i qPCR lub RNA6. W zależności od kwestii biologicznej, którą należy się zająć w chorobie neurologicznej i obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania, kombinację pierwszego i drugiego protokołu lub pierwszego i trzeciego protokołu można zastosować do tej samej próbki tkanki w przypadku tkanek o masie około 4 mg. Pierwszy i trzeci protokół mogą być niezależnie stosowane dla tkanek około 2 mg. Drugi protokół można zastosować do tkanek o masie zaledwie 0,5 mg. Niezależnie od wybranego modułu protokołu neurolipidomicznego, pobieranie próbek tkanek i przetwarzanie przedanalityczne, izolacja mózgu i sekcja regionu, a także procedura poświęcania modelu zwierzęcego są ustandaryzowane i identyczne dla wszystkich trzech modułów protokołu. W naszych badaniach nad chorobami neurologicznymi narządy obwodowe, które są istotne dla patologicznych konsekwencji choroby, są zawsze również zbierane i analizowane przy użyciu tych modułowych protokołów. Ponadto regularnie pobierane są próbki krwi do lipidomiki osocza, która służy jako narzędzie do odczytu chorób neurologicznych w celu uzyskania potencjalnych zastosowań translacyjnych. Przedstawiony tutaj modułowy protokół lipidomiczny jest bardzo wszechstronny: można go skalować do większych ilości tkanek i łatwo zastosować do praktycznie każdego typu tkanki i choroby. Do zastosowania protokołu modułowego (ryc. 1) w chorobach neurologicznych możliwy jest dowolny standaryzowany model wystąpienia i progresji zaburzeń neurologicznych u gryzoni, takich jak urazowe uszkodzenie mózgu, choroba Parkinsona, choroba Alzheimera lub padaczka.

Te protokoły były szeroko stosowane do badania zmian w lipidomie tkankowym i/lub transkryptomie w ostrej fazie epilepsji w mysim modelu padaczki wywołanym kwasem kainowym (KA)2,7, model szeroko stosowany w badaniach przedklinicznych ze względu na podobieństwo do ludzkiej padaczki skroniowej (TLE)8,9,10,11. Korzystając z tych protokołów, w tym samym mysim modelu padaczki oceniono potencjał terapeutyczny leków takich jak Palmitoiloetanoloamid (PEA)12,13 w tym samym mysim modelu padaczki. W badaniu zidentyfikowano zmiany lipidów i mRNA w wysokiej i niskiej rozdzielczości przestrzennej w mózgu i na obrzeżach, w punkcie czasowym maksymalnej intensywności napadów ostrych (przy 60 minutach indukcji po napadzie) oraz po podprzewlekłym i ostrym leczeniu PEA w czterech różnych punktach czasowych (20, 60, 120 i 180 min) po indukcji napadu KA, oknie czasowym obejmującym ostrą fazę padaczki. Osocze, mózgi i narządy obwodowe myszy nieleczonych wstrzykniętym KA, myszy z ostrym i podprzewlekłym PEA, a także myszy kontrolnych z nośnikiem i nośnikiem PEA, zostały zebrane w każdym punkcie czasowym12,13, i zbadane za pomocą tej analizy molekularnej. Dane molekularne skorelowano z fenotypami behawioralnymi uzyskanymi za pomocą oceny napadów, a także z danymi immunohistochemicznymi dotyczącymi procesów neurodegeneracyjnych, w celu wyjaśnienia progresji fazy ostrej padaczki i potencjału PEA do jej złagodzenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj procedury eksperymentalne są zgodne z Dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej z 22 września 2010 roku (2010/63UE) i zostały zatwierdzone przez lokalny komitet ds. zwierząt w kraju związkowym Nadrenia-Palatynat, Niemcy (nr referencyjny: 23 177-07/G16-1-075).

1. Zwierzęcy model ostrej i profilaktycznie leczonej padaczki wywołanej przez KA

  1. Wykonaj indukcję napadów, leczenie i ocenę behawioralną.
    1. Oddziel myszy (minimum n = 6 myszy na grupę) w pojedynczych klatkach.
    2. Przygotować roztwór do wstrzykiwań indukujących drgawki i odpowiadający mu nośnik (patrz tabela 1), a także roztwór do wstrzykiwań leczniczych i odpowiadający mu nośnik (patrz tabela 2).
    3. Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo (i.p.) (10 ml / kg masy ciała myszy) bez znieczulenia zgodnie z ich tożsamością grupową: choroba, leczona lub leczona nośnikiem (tj. KA, KA leczona PEA i dwie grupy nośników). Zobacz Rysunek 2, Tabela 1 i Tabela 2.
    4. Monitoruj i oceniaj zachowanie zgodnie z następującą znormalizowaną skalą intensywności napadów: 0 = brak reakcji; 1 = bezruch i wpatrywanie się; 2 = wyprost kończyn przednich i/lub ogona, sztywna postawa; 3 = powtarzające się ruchy, głową; 4 = podnoszenie i upadek; 5 = ciągłe podnoszenie i upadek; 6 = ciężkie napady kloniczno-toniczne; 7 = śmierć14,15 (Rysunek 3).
  2. Wykonaj procedurę poświęcenia dla analizy lipidomicznej i transkryptomicznej.
    1. W czterech punktach czasowych (tj. odpowiednio 20, 60, 120 i 180 minut po wstrzyknięciu KA lub nośnika) należy uśmiercać sześć myszy z każdej z następujących grup: leczonych PEA, nieleczonych PEA nośnika padaczkowego 1 i nośnika 2, zgodnie z zatwierdzonymi przez IACUC protokołami.
    2. Dziesięć sekund po osiągnięciu każdego punktu czasowego znieczulij myszy za pomocą chusteczki nasączonej izofluranem w szklanej komorze. Znieczulenie potwierdzić utratą odruchu prostującego, co objawia się niemożnością poruszania się podczas powolnego przewracania szklanej komory. Odetnij głowy myszom za pomocą nożyczek chirurgicznych i zbierz osocze, mózg i narządy obwodowe (patrz kroki 2.2.2−2.2.4).
      UWAGA: Przepisy etyczne dotyczące procedur składania ofiar różnią się w zależności od lokalnych komitetów ds. zwierząt. Upewnij się, że sprawdziłeś i przestrzegałeś przepisów wydanych przez lokalny komitet ds. zwierząt.
  3. Postępuj zgodnie z procedurą poświęcania dla analizy immunohistochemicznej.
    1. W przypadku barwienia immunohistochemicznego13, behawioralnie oceń trzy myszy z każdej z następujących grup: padaczka leczona PEA, padaczka nieleczona PEA i grupy nośników, przez cały czas trwania (180 min).
    2. Poświęć i przelej myszy 5 dni później. Głęboko znieczulić myszy (patrz krok 1.3.1 dla grup myszy) poprzez wstrzyknięcie ip pentobarbitalu (100 mg / kg) i buprenorfiny (0,1 mg / kg) jako leków odurzających. Potwierdź głębokie znieczulenie przez utratę odruchu między palcami.
    3. Zamocuj mysz na płytce styropianowej i natychmiast otwórz klatkę piersiową za pomocą drobnych nożyczek i standardowych kleszczy. Ustaw motyla w lewej komorze serca i przetnij prawy przedsionek za pomocą cienkich nożyczek.
    4. Dostosuj prędkość i ciśnienie pompy do stałego przepływu perystaltycznego z szybkością 2−3 ml/min. Perfować lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez ~5 min. W razie potrzeby wymień motyla.
      UWAGA: Przy prawidłowej perfuzji narządy wewnętrzne (z wyjątkiem śledziony) zaczynają blaknąć w ciągu 1-2 minut.
    5. Zmienić perfuzję na lodowaty 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) na ~5 min. Wyizolować całe mózgi zgodnie z opisem w kroku 2.2.2 i utrwalić na 24 godziny w 4% roztworze PFA w temperaturze 4 °C.
    6. Inkubować mózgi w 30% roztworze sacharozy przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. Usunąć resztki sacharozy suchą bibułką i zamrozić mózgi na metalowej płytce (-80 °C). Przechowuj mózgi w temperaturze -80 °C do procedur barwienia13.

2. Procedury pobierania próbek do analizy lipidomicznej/transkryptomicznej

  1. Przygotuj się do pobierania próbek.
    1. Wstępnie schłodzić probówki EDTA do pobierania próbek plazmy do temperatury 4 °C. Wstępnie schłodzić wirówkę i aparat wirowy do temperatury 4 °C. Wstępnie schłodzić metalową płytkę pokrytą folią aluminiową (w celu zatrzaśnięcia zamrożonego mózgu i/lub innych tkanek będących przedmiotem zainteresowania) na suchym lodzie (-80 °C). Wstępnie schłodzić oznakowane probówki o pojemności 2 ml i 5 ml na suchym lodzie (-80 °C) w celu pobrania odpowiednio porcji osocza, zamrożonej tkanki i mózgu. Używaj bursztynowych probówek do ochrony cząsteczek wrażliwych na światło, takich jak eiC.
    2. Wyczyść sprzęt do pobierania próbek i izolacji tkanek (nożyczki chirurgiczne, proste, ostre, cienkie nożyczki, proste, gładkie, standardowe szczypce, cienkie kleszcze z lustrzanym wykończeniem, zakrzywione kleszcze i szpatułka, płytka z pianki polistyrenowej i igły do mocowania) środkiem dezynfekującym (np. 70% etanolem).
  2. Protokoły pobierania próbek
    1. Określ kolejność pobierania próbek.
      1. Krew należy pobrać natychmiast po dekapitacji do wstępnie schłodzonych probówek EDTA o pojemności 1 ml (patrz krok 2.2.3).
      2. Usuń cały mózg i zatrzaskowo zamroź natychmiast po usunięciu. Ten krok zajmie 1-2 minuty. Zamrożone mózgi przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego przetwarzania (patrz krok 2.2.2).
      3. W ciągu 5 minut po usunięciu mózgu należy usunąć narządy obwodowe będące przedmiotem zainteresowania (np. płuca, serce, wątrobę), a następnie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego przetwarzania (patrz krok 2.2.4).
    2. Usuń mózg do zabiegów preparacji lub dziurkowania. Ta procedura trwa 1-2 minuty / mózg.
      1. Po dekapitacji (patrz krok 1.2) zacznij wykonywać nacięcie w linii środkowej skóry za pomocą cienkich nożyczek. Uwolnij czaszkę, odwracając skórę na oczy. Dotrzyj do szczytu czaszki i wykonaj małe nacięcie ogonowe, zaczynając od poziomu kości śródciemieniowej. Unikaj przecinania mózgu.
      2. Przeciąć mocno najbardziej przednią część czaszki między oczami, aby ułatwić usunięcie mózgu. Przechyl jedną stronę kości ciemieniowej za pomocą zakrzywionych kleszczy o wąskim wzorze i oderwij. Powtórz ostatni krok dla drugiej strony.
      3. Usuń opony mózgowe. Wsuń szpatułkę pod przednią część mózgu (tj. Opuszkę węchową) i delikatnie przechyl mózg do góry. Wsuń szpatułkę głębiej w dół, aby złamać nerwy wzrokowe i inne nerwy czaszkowe.
      4. Wyjąć mózg z czaszki i natychmiast zamrozić cały mózg na wstępnie schłodzonej (-80 °C) metalowej płytce ze stroną brzuszną skierowaną w stronę metalowej płytki (grzbietowo do góry).
      5. Pozostawić mózgi do całkowitego zamrożenia i przeniesienia do wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu rozbioru obszarów mózgu lub procedury wykrawania (patrz kroki 3.1 i 3.2).
    3. Wykonaj pobieranie próbek osocza.
      1. Wstępnie schłodzone probówki EDTA należy nasycić 10 μl świeżo przygotowanego rozcieńczenia indometacyny do docelowego stężenia 10 μM.
      2. Natychmiast po ścięciu głowy należy pobrać krew z tułowia poprzez delikatne wyciśnięcie ciała do wstępnie schłodzonych probówek EDTA do maksymalnej objętości krwi 1 ml.
        UWAGA: W przypadku prawidłowego ciśnienia krwi wyciskanie nie jest wymagane. Jeśli objętość krwi jest mniejsza niż 1 ml, skróć czas inkubacji izofluranu, aby umożliwić prawidłowy przepływ krwi.
      3. Natychmiast odwirować probówki z krwią o stężeniu 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Usunąć powstałą górną fazę osocza i do celów analizy multilipidowej podzielić określoną objętość osocza we wstępnie schłodzonych probówkach o pojemności 2 ml w następujący sposób: 50 μl do analizy eCB/eiC, 30 μl do analizy PLs, a pozostałą objętość osocza jako próbkę zapasową lub do innych rodzajów analizy.
      5. Przechowywać próbki osocza w temperaturze -80 °C w celu dalszej ekstrakcji (patrz kroki 4.1.2 i 4.1.4).
    4. Pobieranie próbek z narządów obwodowych.
      UWAGA: Skorzystaj z odniesień do anatomii myszy 16 oraz dokumentacji dostarczonej na obowiązkowe kursy (FELASA), w których uczestniczą badacze zwierząt, aby zidentyfikować poszczególne narządy, ich tkanki łączne i/lub naczynia krwionośne.
      1. Unieruchomić tułów myszy, aby ułatwić usuwanie narządów za pomocą igieł. Wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej za pomocą prostych, ostrych nożyczek na wysokości kości łonowej. Użyj standardowych kleszczy, aby przymocować ścianę brzucha podczas cięcia, aby otworzyć jamę brzuszną.
      2. Unieruchomić skórę, aby umożliwić usunięcie narządów jamy brzusznej za pomocą kleszczy. W celu usunięcia serca lub płuc kontynuuj cięcie przyśrodkowe w kierunku jaskini piersiowej. Usunąć płuco i/lub serce za pomocą cienkich kleszczy.
      3. Ostrożnie otwórz jamę piersi, aby uniknąć krwawienia. Przeciąć tkanki łączne i naczynia krwionośne zakotwiczające odpowiedni narząd bez przecinania narządu.
      4. Kawałki chusteczki należy natychmiast przenieść na wstępnie schłodzone metalowe płytki (-80 °C) i pozostawić do całkowitego zamrożenia. Przenieść kawałki tkanek do wstępnie schłodzonych probówek i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego przetwarzania (patrz krok 4.1).

3. Przetwarzanie materiału biologicznego

UWAGA: Do jednoczesnej ekstrakcji eCB/eiC użyj bursztynowych probówek o pojemności 2 ml jako probówek ekstrakcyjnych i dodaj do każdej probówki siedem wstępnie schłodzonych stalowych kulek. Do koekstrakcji PL/eCB oraz do podwójnej koekstrakcji lipidów i RNA należy użyć 2 ml probówek ekstrakcyjnych wolnych od RNAzy z dodatkiem kulek ceramicznych (tabela materiałów).

  1. Wykonaj sekcję mózgu i przetwarzanie narządów obwodowych.
    UWAGA: Użyj lamp powiększających, aby zwiększyć widoczność mózgu do sekcji.
    1. Wyczyść narzędzia chirurgiczne, w tym kleszcze bardzo cienkimi końcówkami, 2x 70% etanolem.
    2. Przenieść zamrożone mózgi z temperatury -80 °C na szalkę Petriego zawierającą wstępnie schłodzony bufor fizjologiczny (pH 5,5) Upewnij się, że szalka Petriego ma temperaturę 4 °C. Pozwól mózgom całkowicie się rozmrozić, aby umożliwić rozbiórkę. Przetestuj dokładnie za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Nie trzymaj mózgów w temperaturze 4 °C dłużej niż jest to wymagane do rozmrożenia.
    3. Wstępnie schłodzić metalową płytkę na lodzie (4 °C) i przykryć ją mokrymi chusteczkami nasączonymi lodowatym buforem fizjologicznym (pH 5,5) i ostrożnie przenieść mózg brzuszną stroną do góry na wstępnie schłodzoną (4 °C) metalową płytkę na lodzie. Przykryj go mokrymi chusteczkami nasączonymi lodowatym buforem fizjologicznym (pH 5,5).
    4. Wypreparuj obszary mózgu w ciągu maksymalnie 5 minut za pomocą bardzo cienkich kleszczy. Zacznij od podwzgórza (HYP) i obróć grzbietową stronę do góry, aby przejść do prawej strony. Wyizoluj hipokamp (HCr), korę przedczołową (PFCr), prążkowie (STRr) i korę mózgową (cCTXr). Następnie przeanalizuj lewą stronę. Wyizoluj hipokamp (HCl), korę przedczołową (PFCl), prążkowie (STRl) i korę mózgową (cCTXl). Rozetnij móżdżek i obszar wzgórza. Użyj opublikowanych odniesień anatomicznych 16,17 do identyfikacji obszaru mózgu.
    5. Przenieś każdy wypreparowany kawałek bezpośrednio na pokrytą folią aluminiową, wstępnie schłodzoną metalową płytkę (-80 °C). Pozostawić do zamrożenia i przenieść izolowane obszary mózgu do oznakowanych, wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 2 ml.
    6. Sproszkować fragmenty tkanki za pomocą rozdrabniacza do tkanek (w temperaturze -80 °C), unikając rozmrażania tkanki. W komorze chłodniczej porcjować sproszkowaną tkankę w oznakowanych, wstępnie schłodzonych probówkach ekstrakcyjnych zawierających kulki ceramiczne lub kulki stalowe. W przypadku podwójnej analizy lipidomicznej/transkryptomicznej należy zważyć podwielokrotności proszku tkankowego w chłodni. W przypadku analizy wyłącznie lipidomicznej należy wybrać między normalizacją masy tkanki a zawartością białka. W tym drugim przypadku postępuj dalej bez ważenia tkanki.
    7. Pociąć tkanki narządów obwodowych na kawałki o maksymalnej wadze 20 mg. Przystąpić do proszkowania tkanek jak w kroku 3.1.6.
    8. Przystąpić do ekstrakcji próbek tkanek (patrz kroki 4.1.1, 4.1.3 lub 4.1.5) lub przechowywać probówki w temperaturze -80 °C do późniejszej ekstrakcji.
      UWAGA: Macierz mózgowa może być również wykorzystana, jeśli pozwala na to projekt badania. Jednak metoda ta jest bardziej odpowiednia dla dyskretnej i ograniczonej liczby regionów mózgu, a preparowanie i izolowanie wszystkich wyżej wymienionych regionów mózgu w ustalonym czasie nie jest praktyczne.
  2. Wykonaj uderzanie w mózg.
    1. Zamontuj całe, zamrożone mózgi na systemie mocowania (Tabela Materiałów) w kriostacie. Ustaw grubość na 50 μm i pokrój w trybie przycinania blisko interesującego Cię obszaru.
    2. Zabarwić wycinek mózgu (18−20 μm) przy użyciu błękitu toluidynowego (0,1%−1%) jako odniesienia do lokalizacji podregionu zainteresowania. Sprawdź poplamione plastry za pomocą mikroskopu, aby zidentyfikować obszary zainteresowania do wykrawania. Użyj atlasu myszy jako odniesienia, aby znaleźć odpowiednie obszary anatomiczne mózgu16. Stemple o średnicy 0,8−1,0 mm należy pobrać za pomocą rdzeni do próbek we wstępnie schłodzonych rurkach.
    3. Zważyć zamrożone stemple w chłodni w oznakowanych, wstępnie schłodzonych probówkach ekstrakcyjnych o pojemności 2 ml zawierających kulki ceramiczne lub kulki stalowe. Używaj bursztynowych probówek do koekstrakcji eCB i eiC.
    4. Rozpocznij ekstrakcję (patrz kroki 4.1.1, 4.1.3 lub 4.1.5) lub przechowuj probówki w temperaturze -80 °C do dalszej ekstrakcji.
  3. Wykonaj obróbkę plazmową.
    1. Umieść zamrożone próbki osocza na lodzie (4 °C) i pozwól im się rozmrozić (~20 min).
    2. Upewnij się, że osocze jest całkowicie odmrożone przed rozpoczęciem ekstrakcji.
    3. Kontynuuj procedurę ekstrakcji plazmowej (patrz kroki 4.1.2 lub 4.1.4).
      UWAGA: Próbki osocza powinny pozostać w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji. Unikaj cykli rozmrażania i ponownego zamrażania.

4. Procedury ekstrakcji

  1. Przeprowadzić protokoły koekstrakcji lipidów ciecz-ciecz (LLE).
    1. Wykonaj jednoczesną ekstrakcję eCB i eiC z kawałków mózgu, stempli lub próbek proszku tkankowego.
      UWAGA: Przez cały czas trwania procedury wymagane jest dokładne pipetowanie.
      1. Umieścić probówki ekstrakcyjne zawierające próbki tkanek i siedem stalowych kulek na lodzie (4 °C). Dodać 600 μl lodowatego MTBE i 50 μl ACN/H2O (1:1; v/v) zawierających wzorce wewnętrzne. Docelowe stężenie wzorców wewnętrznych w końcowej objętości do analizy (50 μl) jest następujące: 1 ng/ml AEA-d4, 125 ng/ml 2-AG-d5, 3 000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/ml 1-AG-d5, 2,5 ng/ml PGF2α-d4 i 5 ng/ml dla PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 i TXB2-d4, odpowiednio.
      2. Dodać 400 μl 0,1 M kwasu mrówkowego i homogenizować lizerem tkankowym (30 s-1 min). Odwirować homogenat przez 15 minut w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C. Pozostawić dolną fazę wodną do zamrożenia przez 10 minut w temperaturze -80 °C, aby ułatwić przenoszenie górnej fazy organicznej.
      3. Przenieś fazę organiczną w nowych probówkach. Odparować w delikatnym strumieniu N2 w temperaturze 37 °C i rozpuścić w 50 μl ACN/H2O (1:1; v/v) do dalszej analizy.
      4. Przechowywać fazę wodną w temperaturze -20 °C lub -80 °C do dalszej analizy zawartości białka.
    2. Wykonaj koekstrakcję eCB i eiC z próbek osocza.
      1. Rozmrozić podwielokrotności osocza w temperaturze 4 °C. Dodać 800 μl MTBE i 50 μl ACN/H2O (1:1; v/v) zawierających wzorce wewnętrzne (analogiczne do tych stosowanych do analizy tkanek, patrz krok 5.1.1). Zoptymalizuj stężenie wzorca wewnętrznego do wzbogacania przy użyciu referencyjnych próbek osocza.
      2. Dodać 600 μl 0,1 M kwasu mrówkowego i wirować próbki w temperaturze 4 °C przez 2 minuty. Odwirować próbki w temperaturze 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      3. Przenieść fazę organiczną do nowych probówek, odparować pod delikatnym strumieniemN2 w temperaturze 37 °C i rozpuścić w 50 μl ACN/H2O (1:1; v/v) do analizy LC/MRM.
        UWAGA: Jeśli to możliwe, należy unikać przechowywania wysuszonych ekstraktów eiC i natychmiast przystąpić do analizy LC/MRM. Jeśli nie można uniknąć przechowywania, należy stosować krótkotrwałe przechowywanie tylko przez 2-3 dni w temperaturze 4°C z próbkami w rozpuszczalniku do wstrzykiwań LC.
    3. Wykonaj jednoczesną ekstrakcję PL i eCB z obszarów mózgu, stempli lub innych próbek proszku tkankowego.
      1. Umieścić probówki ekstrakcyjne zawierające próbki tkanek i kulki ceramiczne na lodzie (4 °C). Dodać 800 μl MTBE/MeOH (10:3; v/v) i 10 μl MeOH zawierających wzorce wewnętrzne. Docelowe stężenie wzorców wewnętrznych w końcowej objętości do analizy (100 μl) jest następujące: 150 ng/ml dla PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/ml PG 17:0/14:1; Ps 17,0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: odpowiednio 0,1 ng/ml AEA-d4, 60 ng/ml 2-AG-d5, 4,000 ng/ml AA-d8, 2 ng/ml OEA-d2 i 3 ng/ml PEA-d4.
      2. Dodać 200 μl 0,1% kwasu mrówkowego zawierającego 25 μM tetrahydrolipstatyny/URB597 i 50 μg/ml BHT. Homogenizować za pomocą homogenizatora tkankowego (tabela materiałów) i odwirowywać w temperaturze 5 000 x g i 4 °C przez 15 minut.
      3. Odzyskać górną fazę organiczną w nowych probówkach i odparować pod delikatnym strumieniemN2 w temperaturze 37 °C. Rozpuść w 90 μl MeOH i przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C lub przejść do następnego etapu.
      4. Dodać 10%H2Odo podwielokrotności ekstraktu lipidowego (4.1.3.3) i wstrzyknąć 10 μl do LC/MS do analizy PLs. W celu dalszej analizy eCB należy postępować zgodnie z krokiem 4.3.5.
      5. Pobrać podwielokrotność ekstraktu (4.1.3.3), odparować do sucha i rozpuścić w ACN/H2O (1:1; v/v). Użyj 20 μl do wstrzykiwania LC/MS do analizy eCB.
    4. Wykonaj koekstrakcję PL i eCB z próbek osocza.
      1. Rozmrozić podwielokrotności osocza w temperaturze 4 °C, dodać 1 000 μl MTBE/metanolu (10:3; v/v) i 10 μl MeOH zawierającego wzorce wewnętrzne (analogicznie do kroku 4.1.3) i wirować w temperaturze 4 °C przez 1 min.
      2. Dodać 250 μlH2Oi wirować przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbki przez 15 minut przy 5 000 x g i 4 °C. Odzyskać górną fazę organiczną, odparować pod delikatnym strumieniem N2 w temperaturze 37 °C i ponownie rozpuścić w 90 μl metanolu do dalszej analizy LC/MS. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C lub przejść do następnego kroku.
      3. Do analizy PLs dodać 10% wody do podwielokrotności ekstraktu lipidowego (4.1.2.2).
      4. Do analizy eCB dodać 10% wody do podwielokrotności ekstraktu lipidowego (patrz 4.1.4.3), odparować do sucha i rozpuścić w 50% ACN/H2O (1:1; v/v).
    5. Wykonaj podwójną ekstrakcję RNA i lipidów (koekstrakcja PL i eCB) z próbek tkanek.
      UWAGA: Upewnij się, że pracujesz w warunkach wolnych od RNA, aby uniknąć degradacji RNA.
      1. Rozmrozić podwielokrotności lub pęczki mózgu w proszku (w temperaturze 4 °C) i dodać 600 μl buforu RLT zawierającego 5 μM THL/URB597, 10 μg/ml BHT i 1% β-merkaptoetanolu (procentowa zawartość końcowej objętości buforu homogenizacyjnego, patrz krok 4.1) wraz z 200 μl chloroformu do probówek ekstrakcyjnych zawierających zamrożone stemple mózgowe i kulki ceramiczne.
      2. Próbki kolców należy nakłuć 10 μl mieszaniny wzorca wewnętrznego do koekstrakcji PL i eCB (patrz krok 4.1.3) i homogenizować za pomocą homogenizatora tkankowego (wysoka prędkość, 20 s).
      3. Przenieść lizaty do nowych probówek wirówkowych i wirować przez 5 minut z pełną prędkością i w temperaturze 4 °C, aby umożliwić separację faz.
      4. Odzyskaj i użyj górnej fazy do ekstrakcji RNA przy użyciu standardowych zestawów procedur ekstrakcji RNA (tabela materiałów). Eluować RNA w całkowitej objętości 50 μl wody wolnej od RNaz i przechowywać w temperaturze -80 °C.
        UWAGA: Próbka z kroku 4.1.5.4 nadaje się zarówno do sekwencjonowania RNA, jak i qPCR przy użyciu odpowiednich metod i oprzyrządowania.
      5. Do ekstrakcji lipidów należy użyć dolnej fazy zawierającej chloroform. Dodać 800 μl MTBE/metanolu (10:3; v/v) i 200 μl 0,1% kwasu mrówkowego i wirować przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Odzyskać górną fazę organiczną i odparować pod delikatnym strumieniem N2 w temperaturze 37 °C.
      6. Rozpuść w 90 μl metanolu do dalszej analizy LC/MS. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C lub przejść do kroku 5.
      7. Dodać 10%H2Odo podwielokrotności ekstraktu lipidowego (patrz krok 4.1.5.6 powyżej) i wstrzyknąć 10 μl do LC/MS w celu analizy PLs. W celu przeprowadzenia dalszej analizy eCB należy przejść do kroku 5.7.
      8. Pobrać podwielokrotność ekstraktu (patrz powyższy krok 4.1.5.6), odparować do sucha i ponownie rozpuścić w ACN/H2O (1:1; v/v). Użyć 20 μl do wstrzykiwania LC/MS do analizy eCB (analogicznie do kroku 4.3.5).

5. Profilowanie jakościowe i ilościowe LC/MRM

  1. Przygotuj systemy rozpuszczalników LC, roztwory kalibracyjne i próbki kontroli jakości.
    1. Dla PL należy przygotować fazę ruchomą A: metanol/woda (1:1; v/v) zawierająca 7,5 mM mrówczanu amonu i 0,1% herbaty. Przygotować ruchomą fazę B: metanol/izopropanol (2:8; v/v) zawierający 7,5 mM mrówczanu amonu i 0,1% herbaty. Rozpuszczalniki należy przechowywać w butelkach LC.
    2. Do separacji eCB i eiC należy przygotować następujące rozpuszczalniki LC: 0,1% kwas mrówkowy jako ruchoma faza A i 100% ACN zawierający 0,1% kwas mrówkowy jako ruchoma faza B. Rozpuszczalniki należy przechowywać w butelkach LC.
    3. Przygotowanie kontroli jakości z wykorzystaniem wzorców kalibracyjnych i wzorców wewnętrznych (tabela 3) w stężeniu równomolowym lub zdefiniowanym przez użytkownika.
    4. Przygotować krzywe kalibracyjne z siedmioma punktami stężenia. Użyj tej samej partii wzorca wewnętrznego do zwiększenia stężenia roztworu krzywej kalibracyjnej i próbek, które mają być analizowane.
  2. Metodę LC-MRM należy stosować do jakościowego i ilościowego profilowania lipidów.
    1. Otwórz zakładkę Build Acquisition Method w oprogramowaniu komercyjnym (np. Analyst) i wybierz tryb LC/MRM z przełączaniem polaryzacji. Ustawić w metodzie przemiany jonowe (jak podano w tabeli 3) do profilowania ilościowego. Ustaw czas ustalania na 50 ms.
    2. W przypadku profilowania PLs należy ustawić następujące parametry źródła jonów: gaz kurtynowy = 40 psi; temperatura grzałki źródła = 550 °C; napięcie rozpylania jonów = -4 500 V w trybie jonów ujemnych i = +5 200 V w trybie jonów dodatnich.
    3. Do koanalizy eCB i eiC należy ustawić następujące parametry: gaz kurtynowy = 40 psi; temperatura grzałki = 550 °C; napięcie rozpylania jonów = -4 500 V w trybie jonów ujemnych i = +4 500 V w trybie jonów dodatnich.
    4. W przypadku analizy PL należy ustawić ogrzewanie kolumny na 45 °C i natężenie przepływu na 200 μL/min i ustawić następujący gradient: min 0 = 40% B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B i min 52 = 40% B. Ustaw objętość wtrysku na 10 μL.
    5. W przypadku analizy eCB i eiC należy ustawić temperaturę kolumny na temperaturę pokojową i ustawić następujący gradient: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Ustaw objętość wtrysku na 20 μL.
      UWAGA: Warunki MRM mogą się różnić w zależności od platformy instrumentalnej, dlatego warunki fragmentacji i MRM muszą być wywnioskowane eksperymentalnie, a parametry jonizacji powinny być testowane i dostosowywane w razie potrzeby, aby uzyskać maksymalną czułość i selektywność.
  3. Wykonaj analizę wsadową.
    1. Otwórz partię Build Acquisition i wypełnij wymagane parametry dla opisu próbki, lokalizacji w stojaku na próbki autosamplera i metody pozyskiwania (ustaw jak krok 5.2).
    2. Zawsze uwzględniaj kontrole jakości na początku i na końcu analizy oraz w obrębie partii. Po każdych 25-30 próbkach należy uwzględnić co najmniej trzy krzywe kalibracyjne w partii i uwzględnić etap przemywania wybranym rozpuszczalnikiem po każdej próbce kontroli jakości, krzywej kalibracyjnej i na końcu partii próbki.
    3. Próbki otrzymane na etapie 4 przenieść do fiolek LC/MS. Umieść próbki w stojakach załadowczych automatycznego podajnika próbek LC zgodnie z pozycją zdefiniowaną w partii i załaduj stojak na próbki do automatycznego podajnika próbek LC.
    4. Prześlij analizę wsadową i rozpocznij kolejkę.
  4. Kwantyfikacja lipidów
    1. Korzystaj z oprogramowania komercyjnego (np. Analyst) i wbudowanego modułu kwantyfikacji do kwantyfikacji eCB i eiC oraz oprogramowania komercyjnego (np. Multiquant) do kwantyfikacji PLs.
      UWAGA: Drugie oprogramowanie może być również używane do eCB i eiC, szczególnie gdy do ilościowego oznaczania wielu analitów używany jest jeden wzorzec wewnętrzny.
    2. Otwórz metodę kwantyfikacji Build i wypełnij parametry dla analitów, wzorców wewnętrznych, przejść MRM i przypisz wzorce wewnętrzne do analitów, które mają być oznaczone ilościowo (Tabela 3). Ustaw minimalną wysokość szczytu na 500 znaków na sekundę.
    3. Stosować następujące kryteria lub ich kombinację w celu przypisania tożsamości lipidów i późniejszej kwantyfikacji6: dopasowanie czasu retencji endogennych analitów lipidowych do wzorców kalibracyjnych i/lub deuterowanych wzorców wewnętrznych, jeśli są dostępne; dopasowanie jonów fragmentacyjnych przez fragmentację w trybie jonów dodatnich i ujemnych dla danego m/z analitów lipidowych, dla których nie określono wzorców; Wnioskowane z literatury zachowanie elucyjne lipidów w podobnie stosowanych warunkach LC do analizy struktur izomerycznych i / lub izobarycznych; oraz, jeśli to możliwe, analiza LC/MS i MS/MS ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, przy użyciu podobnych warunków LC, jak w przypadku analizy ukierunkowanej (przy użyciu LC/MRM), w celu dokładnego określenia tożsamości i zachowania elucji endogennych lipidów będących przedmiotem zainteresowania18,19.
    4. Do walidacji analizy serii należy stosować następujące kryteria: dokładność kwantyfikacji ≤ ±20%; współczynnik regresji ≥0,97 (najlepiej ≥0,99).
      UWAGA: Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opracowywania i walidacji metod bioanalitycznych, aby zapewnić wiarygodną, powtarzalną analizę cząsteczek docelowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zestaw opisanych protokołów może być łączony na różnych poziomach w sposób określony dla celu, taki jak wybór modelu zwierzęcego, trasa pobierania próbek, metoda ekstrakcji i profilowania (Rysunek 1).

W celu określenia zmian poziomu lipidów w mózgu i na peryferiach w czasie ostrego napadu padaczkowego oraz rozwikłania potencjalnego efektu przeciwpadaczkowego13 PEA i jego wpły...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metodologia neurolipidomiczna i transkryptomiczna jest realnym środkiem do badania każdej choroby lub zdrowego rozwoju w wysokiej i niskiej rozdzielczości przestrzennej w mózgu i narządach obwodowych. Ze względu na zoptymalizowane procedury pobierania próbek osocza i postępowania z nim, analiza lipidomiczna osocza może być również przeprowadzana od tych samych zwierząt, które zostały poświęcone w celu lipidomiki tkankowej i transkryptomiki, poprawiając w ten sposób wiarygodność korelatów molekularnych krwi ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dedykujemy ten artykuł dr Ermelinda Lomazzo. W trakcie finalizacji tego manuskryptu zmarła dr Ermelinda Lomazzo. Jest uosobieniem pasji do nauki i bezinteresownego zaangażowania w pracę zespołową, aby zrealizować znaczący cel badawczy. Zawsze marzyła o tym, aby w znaczący sposób przyczynić się do większego dobrobytu ludzi. Jej dobroduszna natura nigdy nie została zagrożona przez trudne drogi nauki i życia. Ona pozostanie bezcenna i na zawsze w naszych sercach.

Julia M. Post została sfinansowana przez Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) w University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz i jest obecnie finansowana przez projekt SPP-2225 EXIT dla LB. Raissa Lerner była częściowo finansowana przez DZHK project 81X2600250 dla LB i Lipidomics Core Facility. Częściowe finansowanie tych badań zostało zapewnione przez Lipidomics Core Facility, Instytut Chemii Fizjologicznej oraz fundusze stacjonarne (do LB) z Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Uniwersytetu Jana Gutenberga w Moguncji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12(S)-HETEBiomolCay10007248-25Lipid Std
12(S)-HETE-d8BiomolCay334570-25Lipid Std
1200 series LC SystemOprzyrządowanie Agilent/LCMS
2100 BioanalyzerOprzyrządowanieAgilent
qPCR 5(S)-HETE-d8BiomolCay 334230Lipid Std
ABI 7300 Cykler do PCR w czasie rzeczywistymOprzyrządowanie Biosystems/qPCR
Acetonitryl LC-MS Chroma SolvHoneywell9814920Solvent/LCMS
bursztynowe probówki eppendorfEppendorf Przygotowanie próbekEppendorf
Analyst 1.6.2 OprogramowanieAB SCIEX, DarmstadtSoftware
Waga analitycznaMettler ToledoOprzyrządowanie/Przygotowanie próbek.
Kwas arachidonowy-d8 MS StandardBiomolCay-10007277Lipid Std
Bessmann Tissue PulverizerSpectrum Laboratories, Inc. (Breda, Holandia)Oprzyrządowanie/Przygotowanie próbki.
BinoZeissMikroskopia
Rozszczepione przeciwciało kaspazy 3Sygnalizacja komórkowa9661SMikroskopia
Kriostat, Leica CM3050 SLeica BiosystemsOprzyrządowanie/Przygotowanie próbki.
CTC HTC PAL autosamplerCTC Analytics AGOprzyrządowanie/LCMS
Dumont Zakrzywione kleszcze Dumoxel #7FST11271-30Narzędzia chirurgiczne
Kleszcze Dumont Super cienka końcówka #5SF (x2)FST11252-00Narzędzia chirurgiczne
EDTA 1000 A Rö hrchenKabe Labortechnik078001Przygotowanie próbki.
EP-1 EconoPumpBioRAD700BR07757Oprzyrządowanie/Przygotowanie próbki.
Drobne kleszcze Lustrzane wykończenieFST11412-11Narzędzia chirurgiczne
Nożyczki z drobną tęczówką Proste, ostreFST14094-11Narzędzia chirurgiczne
Cienkie nożyczki Węglik wolframu prostyFST14568-09Narzędzia chirurgiczne
Szpatułki do tęczówkiFST10094-13Narzędzia chirurgiczne
Kwas KainowyAbcamab120100Lek na padaczkę
Lipid View oprogramowanieAB SCIEX, DarmstadtSoftware
LPC 17:0Avanis Polaris855676PLipid Std
LPC 18:0Avanis Polaris855775PLipid Std
Luna 2,5µ m C18(2)- HAST 100A LC kolumnaPhenomenex00D-4446-B0Oprzyrządowanie/LCMS
Lampa powiększającaMaul GmbHOprzyrządowanie/Przygotowanie próbki.
Metanol LC-MS Chroma Solv 99,9%Honeywell9814920Solvent/LCMS
Motic CamaraMoticMikroskopia
MTBEHoneywell34875-1LSolvent/LCMS
MultiQuant 3.0 Pakiet oprogramowania do oznaczania ilościowegoAB SCIEX, Darmstadt
Spektrofotometr NanoDrop 2000cThermo ScientificOprzyrządowanie/qPCR
PA 16:0-18:1Avanis Polaris840857PLipid Std
PA 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1404Lipid Std
Palmitoyl EtanoloamidBiomolCay90350-100Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5BiomolCay9000573-5Lipid Std
PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457PLipidy Std
PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457PLipid Std
PC 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1004Lipid Std
PE 16:0-18:1Avanis Polaris850757PLipid Std
PE 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1104Lipid Std
PG 16:0-18:1Avanis Polaris840457PLipid Std
PG 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1204Lipid Std
PI 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1504Lipid Std
Precelleys 24PeqlabOprzyrządowanie/Przygotowanie próbki.
Precellys Keramik-Kü gelchenPeqlab91-pcs-ck14pPrzygotowanie próbki.
Precellys Stahlkugeln 2,8mmPeqlab91-PCS-MK28PPrzygotowanie próbki.
Precellys-keramik-kit 1,4 mmVWR91-PCS-CK14Przygotowanie próbki.
Prostaglandyna D2BiomolCay 12010Lipid Std
Prostaglandyna D2-d4BiomolCay 312010Lipid Std
Prostaglandyna E2BiomolCay10007211-1Lipid Std
Prostaglandyna E2-d9BiomolCay10581-50Lipid Std
PS 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1304Lipid Std
Q Trap 5500 Potrójna kwadrupolowa liniowa pułapka jonowa MSAB SCIEXOprzyrządowanie/LCMS
Real Time PCRSystem Appliert BiosystemInstrumentation/qPCR
Resolvin D1BiomolCay10012554-11Lipid Std
Rneasy Mini Kit - Zestaw DNazy bez RNAaz (50)Qiagen79254Przygotowanie próbki.
Ochroniarz kolumnawstępna PhenomenexInstrumentation/LCMS
Osłony ShandonThermo Fisher72110017Microscopy
Stojak na slajdy i pokrywka ShandonThermo Fisher73310017Microscopy
SM 18:0Avanis Polaris860586PLipid Std
SM d18:1/12:0Avanis PolarisLM-2312Lipid Std
Standardowe kleszcze proste GładkieFST11016-17Narzędzia chirurgiczne
Nożyczki chirurgiczne ToughCut Standardowy wzórFST14130-17Narzędzia chirurgiczne
T3000 TermocyklerBiometraOprzyrządowanie / qPCR
Tromboksan B2BiomolCay19030-5Tromboksan lipidowy Std
B2-d4BiomolCay319030-25Lipidy Std
Tissue Lyser IIQiagen/ Retsch12120240804Oprzyrządowanie/Przygotowanie próbki.
Tissue TekSakura Finetek4583Mikroskopia
ToluidinblauRoth0300.2Mikroskopia
VapothermBarkey4004734Oprzyrządowanie/Przygotowanie próbki.
Wasser LC-MS Chroma SolvVWR9814920Rozpuszczalnik/LCMS
/. AU111609004

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
  2. Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
  3. Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  4. Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
  5. Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
  6. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
  7. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
  8. Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
  9. Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. Microglia-Neuron Communication in Epilepsy. Glia. 65 (1), 5-18 (2017).
  10. Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079(2011).
  11. Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
  12. Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527(2019).
  13. Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
  14. Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
  15. Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
  16. Konsman, J. P. The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
  17. Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).
  18. Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
  19. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  20. Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
  21. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja m zguanaliza LC MRMpodw jna ekstrakcja RNA i lipid wanaliza endokannabinoid wprofilowanie fosfolipid wpobieranie wycink w m zgumysi model epilepsji

Powiązane artykuły