Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59446

⸱

23 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

W tym artykule

Podsumowanie

Fizjologicznie, receptory zapachowe są aktywowane przez cząsteczki odorantu wdychane w fazie gazowej. Jednak większość systemów in vitro wykorzystuje stymulację odorantem w fazie ciekłej. W tym artykule przedstawiamy metodę, która pozwala na monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego po stymulacji odoranta w fazie gazowej.

Streszczenie

Percepcja węchowa zaczyna się od interakcji substancji zapachowych z receptorami zapachowymi (OR) wyrażonymi przez węchowe neurony czuciowe (OSN). Rozpoznawanie zapachu odbywa się zgodnie ze schematem kodowania kombinatorycznego, w którym jeden OR może być aktywowany przez zestaw substancji zapachowych, a jeden środek zapachowy może aktywować kombinację OR. Dzięki takiemu kodowaniu kombinatorycznemu organizmy mogą wykrywać i rozróżniać niezliczone cząsteczki lotnego zapachu. W ten sposób zapach w danym stężeniu można opisać za pomocą wzorca aktywacji OR, który jest specyficzny dla każdego zapachu. W tym sensie złamanie mechanizmów, których mózg używa do postrzegania zapachu, wymaga zrozumienia interakcji odorant-OR. Właśnie dlatego społeczność węchowa jest zaangażowana w "de-sieroceństwo" tych receptorów. Konwencjonalne systemy in vitro stosowane do identyfikacji interakcji nawaniacz-OR wykorzystywały inkubację pożywki komórkowej z nawaniaczem, co różni się od naturalnego wykrywania zapachów poprzez rozpuszczanie par w błonie śluzowej nosa przed interakcją z OR. W tym miejscu opisujemy nową metodę, która pozwala na monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji sali operacyjnej za pomocą środków nawaniających w fazie gazowej. Nasza metoda polega na pomiarze uwalniania cAMP przez luminescencję za pomocą testu Glosensor. Wypełnia on obecne luki między podejściami in vivo i in vitro oraz stanowi podstawę dla biomimetycznego czujnika substancji lotnych.

Wprowadzenie

Zmysł węchu pozwala zwierzętom lądowym na interakcję z ich zmiennym środowiskiem chemicznym w celu kierowania zachowaniami i emocjami. Zasadniczo proces wykrywania zapachu rozpoczyna się od pierwszej interakcji cząsteczek odorantu z układem węchowym, na poziomie receptorów zapachowych (OR)1. U ssaków OR są indywidualnie wyrażane w węchowych neuronach czuciowych (OSN) zlokalizowanych w nabłonku węchowym2. Należą one do rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), a dokładniej do podrodziny rodopsynopodobnej (zwanej również klasą A). OR łączą się ze stymulującym białkiem GG olf, którego aktywacja prowadzi do produkcji cAMP, a następnie do otwarcia cyklicznych kanałów bramkowanych nukleotydami i wytworzenia potencjałów czynnościowych. Przyjmuje się, że percepcja zapachu opiera się na określonym wzorcu aktywowanych ORs3,4, a zatem rozpoznawanie zapachu odbywa się zgodnie ze schematem kodowania kombinatorycznego, w którym jeden OR może być aktywowany przez zestaw substancji zapachowych, a jeden środek zapachowy może aktywować kombinację OR. Poprzez takie kodowanie kombinatoryczne postuluje się, że organizmy mogą wykrywać i rozróżniać niezliczone cząsteczki lotnych zapachów. Jednym z kluczy do zrozumienia, w jaki sposób odbierane są zapachy, jest zrozumienie, w jaki sposób i które sale operacyjne są aktywowane przez dany zapach.

W próbie wyjaśnienia interakcji między odorantem a OR, testy funkcjonalne in vitro odegrały istotną rolę. Identyfikacja agonistycznych ligandów zapachowych dla sierocych OR (de-sierotyzacja) była bardzo aktywną dziedziną przez ostatnie dwadzieścia lat, dzięki zastosowaniu różnych testów funkcjonalnych in vitro, ex vivo i in vivo5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Systemy testów in vitro najlepiej nadają się do szczegółowej charakterystyki funkcjonalnej OR, w tym do identyfikacji domen funkcjonalnych i krytycznych reszt OR, a także do potencjalnych zastosowań inżynieryjnych. Jednak dalszy rozwój cennych systemów in vitro dla OR był wyzwaniem, częściowo ze względu na trudności z hodowlą OSN i funkcjonalną ekspresją OR w komórkach heterologicznych. Pierwszym wyzwaniem było opracowanie protokołów, które pozwoliłyby na ekspresję funkcjonalnych OR na powierzchni komórki w mapowaniu interakcji odorant-OR. Wiele niezależnych grup stosowało różne podejścia5,6,7,8,9,10,11,12,14,18,19,20. Jedno z najwcześniejszych osiągnięć zostało dokonane przez Krautwurst i wsp., którzy oznaczyli N-koniec OR skróconą sekwencją rodopsyny (Rho-tag) i zaobserwowali poprawę ekspresji powierzchniowej w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK)13. Wariacje wprowadzone do znacznika dołączonego do sekwencji OR to nadal badana ścieżka w celu ulepszenia wyrażenia i funkcjonalności OR19,21. Następnie Saito i wsp. zidentyfikowali białko transportujące receptor 1 (RTP1) i RTP2, które ułatwiają transport OR. 22 Krótsza wersja RTP1, zwana RTP1S, również okazała się jeszcze bardziej skuteczna niż oryginalna białko23. Opracowanie linii komórkowej (Hana3A), która stabilnie eksprymuje Golf, REEP1, RTP1 i RTP2 24, w połączeniu z zastosowaniem cyklicznych reporterów monofosforanu adenozyny (cAMP), umożliwiło identyfikację interakcji odorant-OR. Mechanizm, za pomocą którego rodzina białek RTP promuje ekspresję OR na powierzchni komórki, pozostaje do ustalenia.

Jednym z zastrzeżeń tych uznanych metod jest to, że polegają one na stymulacji odorantów w fazie ciekłej, co oznacza, że substancje zapachowe są wstępnie rozpuszczone w pożywce stymulującej i stymulują komórki poprzez wymianę pożywki. Jest to bardzo odmienne od warunków fizjologicznych, w których cząsteczki zapachu docierają do nabłonka węchowego w fazie gazowej i aktywują OR poprzez rozpuszczenie w błonie śluzowej nosa. Aby bardziej zbliżyć się do fizjologicznie istotnej ekspozycji na bodziec, Sanz i in.20 zaproponowali test oparty na stymulacji parą poprzez zastosowanie kropli roztworu odorantu, która miała zostać zawieszona pod wewnętrzną powierzchnią folii z tworzywa sztucznego umieszczonej na górze studzienek komórkowych. Rejestrowali reakcje wapnia, monitorując intensywność fluorescencji. Metoda ta była pierwszą, w której zastosowano stymulację nawaniacza w fazie powietrznej, ale nie pozwalała na duże badanie przesiewowe aktywacji OR.

Tutaj opracowaliśmy nową metodę, która umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji OR in vitro poprzez stymulację odorantu fazy gazowej za pomocą testu Glosensor (Rysunek 1). Ten test był wcześniej używany w kontekście stymulacji płynnymi nazapachami18,19,25,26,27,28,29,30,31. Komora monitorująca luminometru jest najpierw równoważona z odparowanym naodorantem przed odczytem tabliczki (Rysunek 1A). Cząsteczki odorantu są następnie solwatowane w buforze, kąpiąc komórki Hana3A wyrażające interesujący nas OR, RTP1S i białka Glosensor (Rysunek 1B). Jeśli substancja zapachowa jest agonistą OR, sala operacyjna przełączy się na aktywowaną konformację i zwiąże Golf, aktywując cyklazę adenylową (AC), co ostatecznie spowoduje wzrost poziomu cAMP. Ten rosnący cAMP zwiąże się i aktywuje białko Glosensor, aby wytworzyć luminescencję katalizującą lucyferynę. Ta luminescencja jest następnie rejestrowana przez luminometr i umożliwia monitorowanie aktywacji sali operacyjnej. Metoda ta cieszy się dużym zainteresowaniem w kontekście desierotyzacji sali operacyjnej, ponieważ zbliża systemy in vitro do naturalnej percepcji zapachów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek Hana3A

  1. Przygotować M10 (minimalna niezbędna pożywka (MEM) plus 10 % v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) i M10PSF (M10 plus 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny i 1,25 μg/ml amfoterycyny B).
  2. Hodować komórki w 10 ml M10PSF w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm w inkubatorze ustawionym w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2 %).
  3. Dziel komórki co 2 dni w stosunku 20%: gdy zaobserwuje się 100% zbieżność komórek (około 1,1 x 107 komórek) pod mikroskopem z kontrastem fazowym, zaaspiruj pożywkę i delikatnie umyj komórki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  4. Odessać PBS i dodać 3 ml 0,05% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 0,48 mM). Pozostaw na około 1 minutę, aż komórki oddzielą się od płytki.
  5. Dodać 5 ml M10, aby dezaktywować trypsynę i ostatecznie odłączyć komórki nadal przyczepione do płytki, pipetując w górę iw dół.
  6. Przenieść objętość (8 ml) do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml M10PSF, pipetując w górę i w dół, aby rozbić dowolną masę komórkową. Unikaj tworzenia bąbelków w tubie.
  7. Przenieść 1 ml roztworu zawieszonych komórek do nowego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm i dodać 9 ml świeżego M10PSF. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

2. Przygotowanie komórek do transfekcji

  1. Oceń konfluencję lub liczbę komórek, obserwując je pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Na jedną płytkę potrzebna jest co najmniej 10% konfluencja (około 1,1 x 106 komórek).
  2. Odessać pożywkę i delikatnie przemyć komórki 10 ml PBS. Odessać PBS i dodać 3 ml EDTA. Pozostaw na około 1 minutę w temperaturze pokojowej, aż komórki oddzielą się od płytki.
  3. Dodać 5 ml M10, aby dezaktywować trypsynę i ostatecznie odłączyć komórki nadal przyczepione do płytki, pipetując w górę iw dół. Przenieść objętość (8 ml) do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
  4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml M10PSF, pipetując w górę iw dół, aby rozbić dowolną masę komórkową. Unikaj tworzenia bąbelków w tubie.
  5. W zależności od liczby płytek do transfekcji, należy przenieść odpowiednią ilość komórek do zbiornika o odpowiedniej objętości M10PSF. Jedną 96-dołkową płytkę należy posiać 1/10 1/10 100% zlewającej się płytki o średnicy 100 mm (około 1,1 x 106 komórek) rozcieńczonej w M10PSF, aby osiągnąć całkowitą objętość 6 ml. Na jedną 96-dołkową płytkę, zaczynając od 100% zbieżności 100 mm, dodaj 500 μl z 5 ml zawieszonych komórek do 5,5 ml świeżego M10PSF. Wymieszaj ogniwa i M10PSF bez generowania pęcherzyków powietrza.
  6. Odpipetować 50 μl zawieszonych komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 .

3. Transfekcja plazmidu

  1. Obserwuj 96-dołkową płytkę pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić zbieżność komórek między 30% a 50%.
  2. Przygotować pierwszą mieszankę transfekcyjną, która zawiera plazmidy wspólne dla całej płytki (RTP1S, OR i białko Glosensor, patrz tabela materiałów) zgodnie z objętościami w tabeli 1. Zwróć uwagę, że ilość OR oznaczonych Rho powinna być podzielona przez liczbę OR, jeśli kilka ORs.
    nuta: Zdecydowanie zalecamy dodanie do planu eksperymentu kontroli ujemnej z pustym wektorem (tutaj Rho-pCI) i dowolnej kontroli pozytywnej (LUB znanej z reakcji na badany zapach).
  3. Przygotować drugą mieszaninę do transfekcji zawierającą 500 μl MEM i 20 μl odczynnika Lipofectamine 2000 (ważne dla jednej płytki 96-dołkowej, patrz tabela materiałów). Dodaj drugą mieszankę do pierwszej i delikatnie mieszaj, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 5 ml M10 i delikatnie wymieszaj.
  4. Zastąp M10PSF w poprzednio platerowanej płytce 96-dołkowej 50 μl końcowego podłoża do transfekcji. Inkubować w inkubatorze nastawionym na temperaturę 37 °C i 5% CO2 i odkurzać komorę luminometru przez noc, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 6.

4. Inkubacja substratu

  1. Obserwuj 96-dołkową płytkę pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić zbieżność komórek między 60% a 100%. Przygotować roztwór stymulacyjny Zbilansowanego Roztworu Soli Hanka (HBSS) zawierający 10 mM kwasu hydroksyetylopiperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 5 mM D-glukozy.
  2. Rozcieńczyć 75 μl roztworu odczynnika cAMP (patrz tabela materiałów) do 2,75 ml roztworu stymulującego. Usunąć pożywkę transfekcyjną z płytki 96-dołkowej i umyć komórki, dodając 50 μl świeżego roztworu stymulacyjnego do każdego dołka.
  3. Usunąć roztwór stymulujący i dodać 25 μl roztworu odczynnika cAMP przygotowanego w kroku 4.2 do każdego dołka. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej w ciemnym i wolnym od zapachów środowisku (na przykład w czystej, pustej szufladzie z dala od chemikaliów lub źródeł nawania) przez 2 godziny.

5. Stymulacja odorantem

  1. Najpierw zrównoważ komorę luminometru lotnymi cząsteczkami zapachu. Rozcieńczyć środek zapachowy do pożądanego stężenia w 10 ml oleju mineralnego ( Rysunek 2A). Przed końcem czasu inkubacji odczynnika cAMP dodać 25 μl roztworu nawaniacza do nowej 96-dołkowej płytki (nie tej, na której znajdują się komórki). Inkubuj tę płytkę nawaniającą w temperaturze pokojowej w komorze luminometru przez 5 minut (Rysunek 2B) (tutaj nie jest wymagany zapis luminometru).
  2. Ustaw luminometr tak, aby rejestrował luminescencję z 0 s opóźnienia podczas 20 cykli pomiaru płytki przez 90 s z 0,7 s przerwy między cyklami.
  3. Tuż przed odczytaniem tabliczki wyjmij płytkę nawaniającą z komory. Dodaj 25 μl środka zapachowego między studzienki 96-dołkowej płytki zawierającej komórki (nie dodawaj środka nawaniającego do studzienek zawierających komórki) i szybko rozpocznij pomiar luminescencji wszystkich studzienek przez 20 cykli w ciągu 30 minut (Rysunek 2C).

6. Usuwanie resztek substancji zapachowej wewnątrz luminometru

  1. Otwórz drzwiczki luminometru. Włóż rurkę podłączoną do pompy próżniowej.
  2. Odkurzanie substancji zapachowych w komorze odczytu w dużym stopniu (co najmniej 2 godziny, najlepiej przez noc) między dwoma nawaniaczami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego lotnych zapachów z jednego eksperymentu do drugiego. Wymień na świeże powietrze, wysyłając sprężone powietrze przez 5 minut przed inkubacją następnego środka zapachowego.

7. Analiza danych

  1. Eksportuj dane z oprogramowania luminometru.
  2. Uśrednij powtórzenia tego samego operatora operacyjnego dla każdego czasu nagrywania. Oblicz znormalizowaną odpowiedź OR na dowolną ewentualną kontrolę (np. Pusty wektor, Rysunek 3A i sekcja wyników reprezentatywnych), dzieląc uśrednioną wartość kontrolną na wartość uśrednioną OR przy każdym czasie rejestracji (Rysunek 3B i sekcja wyników reprezentatywnych).
  3. Znormalizuj odpowiedź każdego OR na ich podstawową aktywność, dzieląc uśrednioną odpowiedź OR po 0 s na każdą odpowiedź w czasie rejestracji (patrz Rysunek 3C i sekcja reprezentatywnych wyników).
  4. Oblicz pole pod krzywą każdego OR, aby uzyskać pojedynczą wartość odpowiedzi OR. Aby to zrobić, zsumuj wszystkie wartości luminescencji każdego czasu nagrywania dla każdego OR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadzono screening odpowiedzi trzech mysich receptorów węchowych (OR), Olfr746, Olfr124 i Olfr1093, wykorzystując stymulację oparami cynamaldehydu (Rysunek 3). Jednocześnie zastosowano kontrolę z pustym wektorem (Rho-pCI), aby upewnić się, że aktywności indukowane odorantem w testowanych receptorach OR były specyficzne (Rysunek 3A). Aktywację receptorów OR w czasie rzeczywistym po stymulacji oparami odoranta monitorowano przez 20 cykli pom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Percepcja zapachu jest zasadniczo zależna od aktywacji OR. W związku z tym zrozumienie ich funkcjonalności jest konieczne, aby złamać złożone mechanizmy, których mózg używa do postrzegania swojego niestabilnego środowiska chemicznego. Zrozumienie tego procesu było jednak utrudnione ze względu na trudności w ustaleniu solidnej metody badania przesiewowego repertuaru sali operacyjnej pod kątem funkcjonalności pod kątem obecności substancji zapachowych in vitro. Powierzchnia komórki i heterologiczna ekspresja OR zo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

W dniu 27 października 2016 r. Y.F., H. K. i H.M. dokonali zgłoszenia patentowego dotyczącego tej pracy.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z NIH (DC014423 i DC016224) oraz Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych Obrony RealNose Project. YF pozostał na Uniwersytecie Duke'a dzięki wsparciu finansowemu z JSPS Program for Advancing Strategic International Networks to Accelerate the Circulation of Talented Researchers (R2801). Dziękujemy Sahar Kaleem za redakcję rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05 % trypsyna-EDTAGibco25300-0540,05% Trypsyna - EDTA (1x), czerwień fenolowa - przechowywać w temperaturze 4°
Naczynie do hodowli komórkowych C 100 mm Naczynie do353003100 mm x 20 mm 
Probówka 15 mlBD Falcon352099Probówki stożkowe 17 mm x 120 mm
Płytka 96-dołkowaCorning384396 dołk, z pokrywką LE biała z przezroczystym dnem Polistyren pokryty poli-D-lizyną
AmfoterycynaGibco15290-018Amfoterycyna B 250 &mikro; g/ml - przechowywać w temperaturze 4 & st.;
WirówkaJouanC312Wirówka z wahliwym wirnikiem kubełkowym do 15 ml
Klasa II Typ A / B3 dymuNUAIRENU-407-500dymu do hodowli komórek
FBSGibco16000-044Płodowa surowica bydlęca - przechowywać w temperaturze -20 ° C
GloSensor cAMP OdczynnikPromegaE1290GloSensor cAMP Odczynnik luminescencyjny białkowy substrat - przechowywać w temperaturze -20 ° C
Inkubator 37 ° C; 5 % CO2Fisher Scientific11-676-604Inkubator do hodowli komórkowych
Odczynnik Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Lipofectamina 2000 Odczynnik do transfekcji 1 mg/ml - przechowywać w temperaturze 4 & st.;
C Luminometr POLARstar OPTIMABMG LABTECHwycofany z produkcji96-dołkowy czytnik płytek luminescencyjnych
Olej mineralnySigmaM8410Rozpuszczalnik do nawaniaczy - przechowywać w temperaturze pokojowej
Minimum Essential Medium (MEM)Corning cellgro10-010-CVMinimum Essential Medium Orzeł z Earle' s sole & L-glutamina - przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Penicylina/StreptomycynaSigma AldrichP4333Roztwór penicyliny-streptomycyny stabilizowany 10 000 j. penicyliny i 10 mg streptomycyny - przechowywać w temperaturze -20 &; C
pGlosensorPromegaE2301pGloSensor-22F plazmid białka luminescencyjnego cAMP - przechowywać w temperaturze 4 stopni;
C Mikroskop kontrastu fazowegoLeica090-131.001mikroskop kontrastowy fazowy z obiektywami x4, x10, x20
RTP1SH. Matsunamilab-100 ng / µ Plazmid L - przechowywać w temperaturze 4 & deg; Z
hodowli komórkowych BD Falcon C

Bibliografia

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432(2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446(2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455(2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81(2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758(2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402(2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831(2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556(2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821(2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114(2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865(2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127(2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468(2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Substancje zapachowe w fazie gazowejmonitorowanie w czasie rzeczywistymtest Glosensorpomiar uwalniania cAMPwęchowe neurony sensorycznestymulacja acetofenonemanaliza luminometrycznaprotokół hodowli komórkowejprocedura transfekcji
Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.