Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Podsumowanie

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Streszczenie

Rak płuc (LC) jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem na całym świecie. Podobnie jak w przypadku innych komórek nowotworowych, podstawową cechą komórek LC jest nieuregulowana proliferacja i podział komórek. Wykazano, że hamowanie proliferacji poprzez zatrzymanie progresji cyklu komórkowego jest obiecującym podejściem do leczenia raka, w tym LC.

terapia miRNA stała się ważnym regulatorem genów potranskrypcyjnych i jest coraz częściej badana pod kątem zastosowania w leczeniu raka. W ostatnich pracach wykorzystaliśmy dwa miRNA, miR-143 i miR-506, do regulacji progresji cyklu komórkowego. Komórki niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) A549 zostały przetransfekowane, przeanalizowano zmiany ekspresji genów, a ostatecznie przeanalizowano aktywność apoptozy spowodowaną leczeniem. Wykryto regulację w dół kinaz zależnych od cyklin (CDK) (tj. CDK1, CDK4 i CDK6), a cykl komórkowy zatrzymał się na przejściach fazowych G1/S i G2/M. Analiza szlaku wykazała potencjalną aktywność antyangiogenną leczenia, która nadaje temu podejściu wieloaspektową aktywność. W tym miejscu opisano metodologie stosowane do identyfikacji aktywności miRNA w odniesieniu do hamowania cyklu komórkowego, indukcji apoptozy oraz wpływu leczenia na komórki śródbłonka poprzez hamowanie angiogenezy. Oczekuje się, że przedstawione tu metody wesprą przyszłe badania nad terapiami miRNA i ich aktywnością, a reprezentatywne dane posłużą innym badaczom podczas analiz eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Cykl komórkowy to kombinacja wielu zdarzeń regulacyjnych, które umożliwiają duplikację DNA i proliferację komórek w procesie mitotycznym¹. Kinazy zależne od cyklin (CDK) regulują i promują cykl komórkowy². Wśród nich mitotyczne CDK (CDK1) i międzyfazowe CDK (CDK2, CDK4 i CDK6) odgrywają kluczową rolę w progresji cyklu komórkowego³. Białko siatkówczaka (Rb) jest fosforylowane przez kompleks CDK4/CDK6, aby umożliwić progresję cyklu komórkowego⁴, a aktywacja CDK1 jest niezbędna do pomyślnego podziału komórki⁵. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano i oceniono liczne inhibitory CDK w badaniach klinicznych, co wskazuje na potencjał celowania w CDK w leczeniu raka. W rzeczywistości trzy inhibitory CDK zostały ostatnio zatwierdzone do leczenia raka piersi^6,7,8,9,10. Tak więc CDK, a w szczególności CDK1 i CDK4/6, są bardzo interesujące w regulacji progresji komórek rakowych.

miRNAs (miR) to małe, niekodujące RNA i posttranskrypcyjne regulatory ekspresji genów, regulujące około 30% wszystkich ludzkich genów¹¹. Ich aktywność opiera się na translacyjnej represji lub degradacji informacyjnych RNA (mRNA)¹². Ilustrując ich znaczenie biologiczne, zidentyfikowano ponad 5 000 miRNA, a pojedyncza cząsteczka miRNA może regulować wiele genów^11,13. Co ważniejsze, ekspresja miRNA jest związana z różnymi chorobami i statusami chorobowymi, w tym z rakiem¹³. W rzeczywistości miRNA zostały scharakteryzowane jako onkogenne lub supresory nowotworów, zdolne do promowania lub hamowania rozwoju i progresji guza^14,15. Względna ekspresja miRNA w chorych tkankach może regulować postęp choroby; w związku z tym egzogenne dostarczanie miRNA ma potencjał terapeutyczny.

Rak płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem, a ponad 60% wszystkich nowotworów płuc to niedrobnokomórkowe nowotwory płuc^16,17, z 5-letnim wskaźnikiem przeżycia mniejszym niż 20%¹⁸. Zastosowanie miR-143-3p i miR-506-3p zostało niedawno ocenione pod kątem celowania w cykle komórkowe w komórkach raka płuc¹¹. miR-143 i miR-506 mają sekwencje, które są komplementarne do CDK1 i CDK4 / CDK6, a wpływ tych dwóch miR na komórki A549 przeanalizowano. Szczegóły eksperymentu zostały przedstawione i omówione w niniejszym artykule. Ekspresję genów, progresję cyklu komórkowego i apoptozę oceniano przy użyciu różnych projektów eksperymentalnych i punktów czasowych po transfekcji. Użyliśmy metod ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) wraz z analizą mikromacierzy w celu zmierzenia ekspresji określonych genów, a sekwencjonowanie RNA nowej generacji zostało wykorzystane do określenia globalnej dysregulacji genów¹¹. Ta ostatnia metoda identyfikuje względną obfitość transkryptu każdego genu z wysoką czułością i odtwarzalnością, podczas gdy tysiące genów można przeanalizować z jednej analizy eksperymentalnej. Dodatkowo przeprowadzono analizę apoptotyczną spowodowaną leczeniem miRNA, która została opisana tutaj. Analizę szlaków uzupełniła bioinformatyka. Przedstawiono protokoły wykorzystywane do analizy potencjału terapeutycznego kombinatorycznych miR-143 i miR-506.

Głównym celem tego protokołu jest identyfikacja efektów działania miRNA w komórkach, ze szczególnym uwzględnieniem cyklu komórkowego. Różnorodność prezentowanych tu technik rozciąga się od analizy ekspresji genów przed translacją (przy użyciu qPCR) po skomplikowane i nowatorskie techniki analizy genów na poziomie białka, takie jak analiza mikromacierzy. Mamy nadzieję, że ten raport będzie pomocny dla badaczy zainteresowanych pracą z miRNA. Dodatkowo przedstawiono metodykę analizy cyklu komórkowego metodą cytometrii przepływowej i apoptozy komórek.

Protokół

1. transfekcja miR-143 i miR-506

UWAGA: Używaj lateksowych rękawiczek, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego podczas wykonywania opisanych eksperymentów. W razie potrzeby należy używać komory bezpieczeństwa biologicznego z włączonym wentylatorem szafy, nie blokując dróg oddechowych ani nie zakłócając laminarnego przepływu powietrza. Zawsze ustawiaj szybę ochronną na odpowiedniej wysokości, zgodnie z opisem producenta.

1. Nasiona komórek NSCLC A549 w kolbie T25 cm2/płytce 6/96 dołków w pożywce DMEM/F12K uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (pożywka hodowlana) w kapturze do hodowli tkankowej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w inkubatorze do hodowli tkankowych.
2. Zawiesić miR-143 i/lub miR-506 naśladowcy lub zamieszać siRNA ze środkiem transfekcyjnym (2,4 μg miR zmieszano z 14 μl środka transfekcyjnego; patrz tabela materiałów) w 500 μl pożywki do transfekcji i 1,5 ml surowicy i pożywki DMEM/F12K wolnej od antybiotyków przy końcowym stężeniu miRNA 100 nM. Ilość miRNA może wymagać optymalizacji na różnych komórkach i stężeniach. Odpowiednie podejścia obejmują transfekcję komórek o rosnącym stężeniu miRNA (tj. 50-200 nM) oraz ocenę regulacji w dół ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania.
3. Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby/płytki i przemyć raz 1x PBS.
4. Dodać kompleksy miRNA/czynnika transfekcyjno-mieszającego i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 6 godzin (wielkość kolby określa dodaną objętość inkubacji).
5. Zastąp pożywkę 4 ml pożywką hodowlaną i inkubuj komórki przez 24 godziny i/lub 48 godzin.
6. Zebrać transfekowane komórki przez trypsynizację, dodając 1 ml trypsyny-EDTA do każdej kolby T25 cm², inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C i dodać 3 ml pożywki hodowlanej w celu zebrania komórek. Umieścić zawartość każdej kolby w oddzielnej, oznaczonej probówce o pojemności 15 ml. Praca w kapturze do hodowli tkankowej.
7. Wirować przy 751 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
   UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas usuwania supernatantu, ponieważ mieszanie probówki może spowodować utratę komórek.
8. Dodaj 2 ml 1x PBS i wiruj przez 5 minut przy 751 x g.
9. Powtórz kroki 7 i 8 raz, aby usunąć wszelkie ślady podłoża i supernatantu.
   UWAGA: Na tym etapie probówki z próbkami mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub mogą być natychmiast zużyte.

2. Ekstrakcja RNA

1. Oczyść obszar roboczy, spryskując 70% alkoholem izopropylowym i roztworem do odkażania RNAzy.
2. Ekstrakcję RNA należy przeprowadzić przy użyciu odpowiedniego zestawu RNA (patrz Tabela materiałów).
3. Usunąć probówki z temperatury -80 °C i pozostawić do rozmrożenia. Dodaj 300 μl buforu do lizy i pipetuj w górę iw dół, aby przerwać błonę komórkową.
4. Dodaj równą objętość 100% ultraczystego etanolu.
5. Dobrze wymieszaj i umieść w kolumnie oddzielającej.
6. Wirować od 11 do 16 x g przez 30 s i usunąć przepływ.
7. Dodać 400 μl buforu płuczącego i odwirować w celu usunięcia buforu.
8. Dodać 5 μl DNAzy I z 75 μl buforu do trawienia DNA do każdej próbki i inkubować przez 15 minut.
9. Przepłukać próbkę 400 μl buforu przygotowawczego RNA.
10. Przemyć 2x buforem do przemywania RNA.
11. Dodaj wodę wolną od nukleaz do kolumny, odwiruj, a następnie zbierz RNA.
12. Zmierz całkowite stężenie RNA za pomocą spektrofotometru UV.

3. RT-qPCR

1. Przed RT-qPCR należy zsyntetyzować cDNA. Po ilościowym określeniu stężenia RNA umieść 1 μg RNA w końcowej objętości reakcji o objętości 20 μl, aby przygotować cDNA w probówce PCR. Zawsze pracuj na czystej ławce.
2. Wszystkie inne niezbędne składniki są zawarte w tabeli 1.

składniki	Ilość (μL)/próbkę (20 μL)
5-krotny miks cDNA Master	4
Serwery dNTP	cyfra arabska
Losowe heksamery	1
Wzmacniacz RT	1
Mieszanka enzymów Verso	1
Woda wolna od DNaz i RNaz	Wymagana ilość po dodaniu RNA do uzyskania 20 μL

Tabela 1: Materiały do syntezy cDNA z próbek RNA.Wymagane ilości odpowiednich składników do przygotowania mieszanki wzorcowej dla jednej próbki do syntezy cDNA.

3. Inkubować w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowych: 42 °C przez 30 minut, 95 °C przez 2 minuty, 4 °C aż do pobrania próbek.
4. Zużyć natychmiast w zwykłym PCR lub qPCR lub przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C.
5. Przygotować roztwory podkładowe do przodu i do tyłu z wodą wolną od DNaz/RNaz o stężeniu 10 μM z podstawowego roztworu startera.
6. Przygotować oddzielne mieszanki wzorcowe dla każdego genu, który ma zostać wykryty, w zależności od liczby próbek. Dla każdej próbki cDNA (studzienka qPCR) ilość reakcji przygotowuje się zgodnie z tabelą 2.

składniki	Ilość (μL)/próbkę (20 μL)
Miks główny SYBR	10
Podkład do przodu - 10 μM	cyfra arabska
Podkład odwrotny - 10 μM	cyfra arabska
Woda wolna od DNaz i RNaz	3
Próbka cDNA	3

Tabela 2: Materiały do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym z próbek cDNA.Ilość składników wymagana do przygotowania mieszanki wzorcowej dla jednej próbki do qPCR.

7. Umieść każdą próbkę w odpowiednich studzienkach.
8. Zaprojektuj układ próbki dla 96-dołkowej płytki qPCR. Dla każdej próbki i analizowanego genu przeprowadź reakcję w trzech egzemplarzach lub przynajmniej w duplikatach.
9. Uszczelnij płytkę 96-dołkową optycznie przezroczystą osłoną samoprzylepną.
10. Szybko obróć płytkę, aby mieszanina reakcyjna dotarła do dna każdej studzienki.
11. Uruchom RT-qPCR zgodnie z następującym gradientem termicznym:
    1) 50 °C przez 2 min
    2) 95 °C przez 2 min
    3) 95 °C dla 15 s
    4) Weź czytanie
    5) 60 °C przez 1,5 min
    6) Powtórz krok 3 39 razy
12. Uruchom następujący gradient termiczny w kontynuacji powyższego, aby wyznaczyć krzywą topnienia, która wskazuje amplifikację pojedynczego produktu.
    7) 65 °C przez 0,31 min
    8) +0,5 °C / cykl
    9) Tabliczka
    10) Powtórz krok 8 60 razy, aż osiągniesz 95 °C
    11) 72 °C przez 2 min

4. Elektroforeza w żelu agarozowym w celu potwierdzenia amplifikacji pojedynczego genu

1. Przygotować 1% żel agarozowy w 1x bufor TBE.
2. Dodać bromek etydyny (EtBr) w ciepłym (~50 °C) żelu, aż do uzyskania końcowego stężenia około 0,2-0,5 μg/ml. EtBR wiąże się z DNA i umożliwia jego wizualizację w świetle UV w obrazie żelowym.
3. Wlej ciepły żel do tacki na żel dostarczonej z pudełkiem na żel do elektroforezy. Przymocuj mocno dostarczony grzebień, aby uzyskać jednolite dołki.
4. Pozostaw żel do odpoczynku i ostygnięcia do temperatury pokojowej (RT) przez ~30 min.
5. Gdy żel zestali, umieść żel i tackę w pudełku na żel
.
6. Napełnij pojemnik z żelem 1x buforem TBE, aż żel zostanie całkowicie pokryty.
7. Zmierzyć stężenie DNA z procesu amplifikacji PCR za pomocą spektrometru UV.
8. Weź ~15 ng DNA do małej probówki PCR, dodaj 5 μl barwnika i dodaj wymaganą ilość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 15 μl.
9. Załaduj drabinkę DNA i próbki do studzienek.
10. Uruchom żel pod napięciem 100 V, aż linia barwnika znajdzie się w około 75%-80% w dół żelu.
    UWAGA: Upewnij się, że żel przechodzi od ładunku ujemnego do dodatniego.
11. Usuń żel i umieść go w obrazie żelu, aby uwidocznić DNA.

5. Analiza cyklu komórkowego

1. Wysiać 5 x 10⁵ komórek dla każdej próbki w kolbie T25 cm² i przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, kroki 1-5.
2. Po 24 godzinach i 48 godzinach zbierz komórki przez trypsynizację.
3. Przenieś zawiesiny komórek do sterylnych probówek o pojemności 15 ml i odpowiednio je oznacz.
4. Odwirować próbki o masie 751 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
5. Dodać 2 ml lodowatego 1x PBS, wirować i wirować w temperaturze 751 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
6. Powtórz etap mycia z 1x PBS, aby usunąć resztki mediów.
7. Ponownie zawiesić i rozbić osad, dodając 200 μl lodowatego 1x PBS przez pipetowanie.
8. Napraw komórki, dodając kroplami 2 ml 70% lodowatego etanolu do probówki, delikatnie wirując.
9. Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej i umieszczać probówki w temperaturze 4 °C na 1 godzinę.
10. Wyjąć probówki z 4 °C i odwirować przy 751 x g przez 5 minut.
11. Dodać 2 ml lodowatego 1x PBS, wirować i wirować w temperaturze 751 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
12. Dodaj 500 μL 1x PBS z jodkiem propidyny (50 μg/ml) i rybonukleazą A (200 μg/ml)
13. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem.
14. Pozyskaj dane z cytometru przepływowego. Użyj rozproszenia do przodu i z boku (FSC vs. SSC), aby wybrać główną populację komórek, z wyłączeniem zanieczyszczeń w lewym dolnym rogu wykresu gęstości FSC i SSC oraz klastrów komórek od góry do prawego górnego rogu wykresu gęstości FSC i SSC.
15. Analizuj dane w celu identyfikacji populacji komórek na poszczególnych etapach cyklu komórkowego za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

6. Test apoptozy

1. Wysiać 5 x 10⁵ komórek dla każdej próbki w kolbie T25 cm² i przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, kroki 1-5.
2. Po 24 godzinach i 48 godzinach zbierz komórki przez trypsynizację.
3. Przenieś zawiesiny komórek do sterylnych probówek o pojemności 15 ml i odpowiednio je oznacz.
4. Odwirować przy 751 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
5. Dodać 2 ml lodowatego 1x PBS, wirować i wirować w temperaturze 751 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
6. Powtórz etap mycia z 1x PBS, aby usunąć resztki mediów.
7. Rozcieńczyć 10x bufor wiążący Aneksynę V do 1x z lodowatym dH₂O.
8. Dodać 1 ml 1x buforu wiążącego Annexin V do każdej probówki z próbką i delikatnie zawiesić.
9. Umieścić 96 μl zawiesiny komórek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
10. Dodać 1 μl koniugatu aneksyny V-FITC i 12,5 μl jodku propidyny (PI) do probówki zawierającej zawiesinę komórkową.
11. Inkubować zawiesinę komórkową przez 10 minut na lodzie w ciemności.
12. Dodać 250 μl lodowatego buforu wiążącego 1x Aneksyna V do każdej probówki z próbką w celu rozcieńczenia.
13. Natychmiast przeanalizować próbki za pomocą cytometru przepływowego.

7. Ekspresja białka za pomocą mikromacierzy cyklu komórkowego przeciwciała

1. Wysiewać 5 x 10⁵ komórek dla każdej próbki w kolbach T25 cm² i przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, kroki 1-5.
2. Po 24 godzinach i 48 godzinach zbierz komórki przez trypsynizację.
3. Przenieś zawiesiny komórek do probówek o pojemności 15 ml i odpowiednio je oznacz.
4. Odwirować przy 751 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
5. Dodać 2 ml lodowatego 1x PBS, wirować i wirować w temperaturze 751 x g przez 5 min. Wyrzucić supernatant.
6. Powtórz etap prania z 1x PBS.
7. Dodać 150 μl buforu do lizy uzupełnionego inhibitorami proteazy. Delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby przerwać błony komórkowe.
8. Aby zapobiec wszelkim zakłóceniom buforu do lizy, należy przeprowadzić wymianę buforu w celu zastąpienia buforu do lizy buforem etykietującym, korzystając z kolumn do wymiany rozpuszczalników producenta.
9. Określ ilościowo całkowite białko za pomocą testu BCA.
10. Pobrać 70 μg próbki białka i dodać bufor do znakowania, aby uzyskać końcową objętość 75 μl.
11. Dodać 100 μl dimetyloformamidu (DMF) do 1 mg odczynnika biotyny (biotyna/DMF).
12. Dodać 3 μl biotyny/DMF do każdej próbki białka (biotynylowanej próbki białka) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
13. Dodać 35 μl odczynnika stop i wymieszać przez wirowanie.
14. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
15. Przed użyciem wyjmij szkiełka z mikromacierzy z lodówki, aby ogrzały się do temperatury pokojowej przez 1 godzinę.
16. Przeprowadzić blokowanie niespecyficznego wiązania poprzez inkubację szkiełek z 3% roztworem mleka w proszku (w odczynniku blokującym dostarczonym przez producenta) na szalce Petriego z ciągłym wytrząsaniem przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
17. Umyć szkiełka wodą_{ddH 2}O (o ile nie określono inaczej, mycie odbywa się przy użyciu ddH₂O).
18. Powtórz krok mycia ~10x, aby całkowicie usunąć roztwór blokujący z powierzchni szkiełka. Jest to ważne, aby uzyskać jednolite i niskie tło.
19. Usuń nadmiar wody z powierzchni zjeżdżalni i przejdź do następnego kroku, nie dopuszczając do wyschnięcia szkiełek.
20. Przygotować roztwór sprzęgający, rozpuszczając 3% mleka w proszku w odczynniku sprzęgającym.
21. Dodać 6 ml roztworu sprzęgającego i do pełnej ilości uprzednio przygotowanej próbki białka biotynylowanego z kroku 7.12.
22. Umieść jedno szkiełko w jednym dołku komory sprzęgającej dostarczonej przez dostawcę i dodaj do niego ~6 ml mieszanki sprzęgającej białka.
    UWAGA: Upewnij się, że szkiełko jest całkowicie zanurzone w roztworze mieszanki sprzęgającej białka.
23. Przykryć komorę sprzęgającą i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z ciągłym mieszaniem w wytrząsarce orbitalnej.
24. Przenieś szkiełka na szalkę Petriego i dodaj 30 ml 1x buforu do mycia. Umieść szalkę Petriego w wytrząsarce orbitalnej, potrząsaj przez 10 minut i wyrzuć roztwór.
25. Powtórz krok 7.24 2x.
26. Dokładnie spłukać szkiełka wodą ddH₂O, jak opisano w krokach 7.17 i 7.18, a następnie natychmiast przejść do następnego kroku, aby uniknąć wysuszenia.
27. Dodać 30 μl Cy3-streptawidyny (0,5 mg/ml) do 30 ml buforu detekcyjnego.
28. Umieścić szkiełko na szalce Petriego i dodać 30 ml buforu detekcyjnego zawierającego Cy3-streptawidynę.
29. Inkubować w wytrząsarce orbitalnej przez 20 minut z ciągłym wytrząsaniem chronionym przed światłem.
    UWAGA: Cy-3 jest barwnikiem fluorescencyjnym. Przykryj folią aluminiową lub pracuj w ciemnych warunkach, aby utrzymać intensywność fluorescencji.
30. Wykonaj kroki 7.24-7.26 i pozostaw szkiełko do wyschnięcia, używając delikatnego strumienia powietrza lub umieszczając szkiełko w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i wiruj przy 1300 x g przez 5-10 minut.
31. Umieść szkiełko w uchwycie na suwak i przykryj folią aluminiową.
32. Zeskanuj szkiełko w skanerze mikromacierzowym o odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji. W przypadku Cy3 szczyt długości fali wzbudzenia przypada na ~550 nm, a pik emisji na ~570 nm.
33. Przeanalizuj dane (patrz tabela materiałów) dla używanego oprogramowania).

8. Sekwencjonowanie RNA

1. Wysiewać 5 x 10⁵ komórek dla każdej próbki w kolbach T25 cm² i przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, kroki 1-5.
2. Po 24 godzinach i 48 godzinach zbierz komórki przez trypsynizację.
3. Przenieść zawiesiny komórek do probówek o pojemności 15 ml i odpowiednio je oznaczyć.
4. Wyodrębnij RNA zgodnie z sekcją 2, kroki 1-6.
5. Sprawdź jakość RNA, a także stężenie za pomocą bioanalizatora. Do potwierdzenia jakości RNA niezbędna jest ocena integralności RNA (RIN) powyżej ośmiu i odpowiednie histogramy.
6. Z całkowitego RNA użyj ~2 μg próbki do sekwencjonowania RNA (informacyjny RNA z całkowitego RNA)
7. Sekwencja przy użyciu sekwencera nowej generacji¹¹.
8. Uruchom wysokiej jakości przycinanie i mapowanie z genomem referencyjnym z plików FASTQ wygenerowanych przez maszynę do sekwencjonowania RNA¹¹.
9. Prześlij pliki FASTQ i surowo odczytaj dane zliczania do Genebanku, postępując zgodnie z instrukcjami na stronie internetowej .
   UWAGA: Zobacz numer dostępu SRP133420 dla poprzednich wyników.

9. Test tworzenia probówek

1. Oceń potencjał angiogenny ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej transfekowanych miRNA (HUVEC) 36 godzin po transfekcji, jak opisano w sekcji 1, kroki 1-5, przy użyciu komórek HUVEC zamiast komórek A549.
2. Głodź HUVEC pożywką głodową M199 przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
3. Usunąć matrycę membrany podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu z temperatury -80 °C i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc, umożliwiając stopniowe rozmrażanie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i polimeryzacji.
4. Ostrożnie i powoli pokryj studzienki 96-dołkowej płytki 0,04 ml matrycy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu, unikając tworzenia się pęcherzyków. Całą procedurę należy wykonać pod okapem z przepływem laminarnym.
5. Napełnij sąsiednie studzienki płytki 96-dołkowej 0,1 ml PBS, aby utrzymać wilgotność i temperaturę.
6. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 minut, aby uzyskać polimeryzację ekstraktu z błony podstawnej. Nie inkubować dłużej niż 1 godzinę.
7. Trypsynizować transfekowane HUVEC z każdej grupy i ponownie zamieszać w pożywce M199 w stężeniu 1 x 10⁵ komórek/ml.
8. Dodaj 0,1 ml każdej zawiesiny komórkowej do studzienek zawierających spolimeryzowaną matrycę błony podstawnej w płytce 96-dołkowej.
9. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 podczas} przygotowywania czynników wzrostu. Przygotowanie czynników wzrostu odbywa się również pod okapem z przepływem laminarnym.
10. Rozpuść czynniki wzrostu (VEGF) w 2x końcowym pożądanym stężeniu (stężenie 4 ng / ml dla 2 ng / ml stężenia końcowego) i dodaj 0,1 ml pożywki głodowej M199 zawierającej czynnik wzrostu na 0,1 ml pożywki głodowej M199 z komórkami. W przypadku studzienek bez VEGF dodaj 0,1 ml pożywki głodowej M199 na wierzch 0,1 ml pożywki głodowej M199 z komórkami.
11. Inkubować 96-dołkową płytkę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
12. Pod koniec okresu inkubacji uzyskaj obrazy każdej studzienki w 4-krotnym powiększeniu, używając mikroskopu jasnego pola połączonego z kamerą cyfrową.
13. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania wyposażonego w wtyczkę "analizator angiogenezy"¹⁹. Użyj trzech parametrów, liczby węzłów, liczby połączeń i całkowitej długości kiełków, aby porównać wpływ leczenia miRNA na angiogenezę.

Wyniki

Analiza ekspresji genów za pomocą RT-qPCR i elektroforezy żelowej

Różnicowa analiza ekspresji genów za pomocą RT-qPCR wykazała znaczną regulację w dół docelowych genów CDK1, CDK4 i CDK6. Wykazano, że CDK1 i CDK4/6 odgrywają kluczową rolę odpowiednio w przejściach G2/M i G1/S. Przeprowadzona analiza pozwoliła na bezpośrednie porównanie poszczególnych miR z kombinatoryczną aktywnością miR. Zastosowanie mieszania s...

Dyskusja

miRNA mogą działać jako terapie celowane w leczeniu raka, rozpoznając rozregulowanie poziomów ekspresji w chorych i normalnych tkankach. Badanie to miało na celu określenie miRNA, które potencjalnie zatrzymują postęp cyklu komórkowego na wielu etapach. Stwierdzono, że miR-143 i miR-506 zatrzymują cykl komórkowy komórek nowotworowych, a przedstawione protokoły miały na celu zrozumienie aktywności tego skojarzonego leczenia miRNA.

Opisane metodologie zapewniają nadrzędne zrozumienie funkcji miRN...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
-80 stopni Celsjusza; C Zamrażarka	VWR	VWR40086A
96-dołkowa płytka	CELLTREAT Scientific	50-607-511
96-dołkowe płytki mikrodołkowe	Thermo Scientific	12-556-008
A549 Komórki niedrobnokomórkowego raka płuc	ATCC	ATCC  CCL-185
Agaroza	VWR	0710-25G
Bioanalizator Agilent 2100	Agilent Technologies	G2938c
Tłumik Ambion Kontrola negatywna nr 1 siRNA	Ambion	AM4611
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)	Gibco	15240-062
Zestaw do oznaczania matrycy przeciwciał, 2 reakcje	Full Moon Bio	KAS02
Mikroskop jasnego pola	Mikroskoptyka	IV-900
Mikroskop jasnego pola	cyklu komórkowego Star Environment LLC
2 slajdy	Full Moon Bio	ACC058
Cell Logic+ Biosafety Cabinate	Labconco	342391100
Cellquest Pro	BD bioscience	Kroki 5.14; 6.13: Służy do obliczania rozkładu populacji według cyklu komórkowego  fazy i dla  obliczania rozkładu populacji do analizy apoptoza
System czasu rzeczywistego CFX96 Moduł		BioRad	CFX96
System obrazowania dotykowego Chemidoc System obrazowania		BioRad	Chemidoc
Inkubator CO2	Thermo Scientific	HERAcell 150i
wzrostu	Trevigen	3433-010-01
Aparat cyfrowy	AmScope	FMA050
DMEM 4,5 g/l glukozy, bez pirogronianu sodu, z L-glutaminą	VWR	VWRL0100-0500
DNAzyda I	Zymo Research	E1010
Suplement na wzrost komórek śródbłonka (EKGS)	BD Biosciences	356006
Eppendorf Zestawy do pipet Eppendrof		05-403-152
Etanol, absolutny (200 dowodów), molekularny Ocena z biologii,	Fisher BioReagents	BP2818500
Bromek etydyny	Alfa acar	L07462
F-12K Mieszanka składników odżywczych (mod. Kaighna) z L-glutaminą, Corning		Corning 45000-354
Cytometr przepływowy FACS	Becton Dickinson
Fetal Bydlęca surowica - Premium	Antlanta Biologicals	S11150
Płód Surowica bydlęca (FBS)	Fisher Scientific	10438026
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Basix ze standardowymi zatrzaskami	Fisherbrand Basix	02-682-002
Inkubator CO2 z płaszczem wodnym Forma Series II	Thermo Scientific
Roztwór heparyny (5000 U / ml)	Hospira	NDC#63739-920-11
System elektroforezy poziomej	Stołowy system laboratoryjny	BT102
has-miR-143-3p miRNA Mimic	ABM	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA Mimic	ABM	MCH02824
Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF)	Thermo Scientific	PHC9394
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)	Indywidualni dawcy	IRB# A15-3891
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem hyklonu (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Ingenuity Analiza szlaku	Qiagen	Wyniki: Używany do analizy
Invitrogen UltraPure Woda destylowana bez DNazy/RNaz	Invitrogen	10-977-015
Lipofektamina 2000	Invitrogen	11-668-027
Ładowanie barwnika 10X	nauka warda+	470024-814
Medium M199 (z Earle′ s sole, L-glutamina i wodorowęglan sodu)	Sigma Aldrich	M4530
Mikroskop Aparat cyfrowy	AmScope	Oprogramowanie MU130
Modfit LT	Verity	Krok 5.15: Alternatywne oprogramowanie do analizy rozkładu populacji cykli
Nanodrop	Thermo Scientific	NanoDrop one C
Opti-MEM	Gibco firmy life technologies	31985-070
Penicylina-streptomycyna 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
Zasilanie sybr green master mix	Applied Biosystems	A25780
Jodek propidium	MP Biochemicals LLC	IC19545825
Proscanarray HT Skaner mikromatrycowy	Perkin elmer	ASCNPHRG. Zastosowaliśmy falę lasera wzbudzającego o długości fali 543 nm.
q Optyczna osłona samoprzylepna PCR	Applied Biosystems	4360954
Zestawy Quick-RNA	Zymo Research	R1055
Rybonukleaza A z trzustki bydlęcej	Sigma	R6513-50MG
ScanArray Express	PerkinElmer	Krok 7.33: Oprogramowanie do
	Shaker Thermo Scientific	2314
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems
Probówki wirówkowe SpectraTube 15ml	VWR	470224-998
Probówki wirówkowe SpectraTube 50ml	VWR	470225-004
Bufor TBS, 20x płyn	VWR	10791-796
Wirówka z kontrolowaną temperaturą  matchine	Thermo Scientific	ST16R
Mikrowirówka z kontrolowaną temperaturą matchine	Eppendrof	5415R
Termo Scientific BioLite Kolby poddane hodowli komórkowej	Thermo Scientific	12-556-009
Thermo Scientific Test białka BCA	Pierce Thermo Scientific	PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Bufor	Thermo Scientific	PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-dołkowe płyty z pełnym fartuchem	Thermo Scientific	AB0800WL
Zestaw do syntezy cDNA Thermo Scientific Verso (100 przebiegów)	Thermo Scientific	AB1453B
Drabinka DNA Ultra Low Range	Invitrogen	10597012
Standardowa lodówka laboratoryjna VWR z pełnymi drzwiami VWR