Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59460

⸱

30 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Streszczenie

Rak płuc (LC) jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem na całym świecie. Podobnie jak w przypadku innych komórek nowotworowych, podstawową cechą komórek LC jest nieuregulowana proliferacja i podział komórek. Wykazano, że hamowanie proliferacji poprzez zatrzymanie progresji cyklu komórkowego jest obiecującym podejściem do leczenia raka, w tym LC.

terapia miRNA stała się ważnym regulatorem genów potranskrypcyjnych i jest coraz częściej badana pod kątem zastosowania w leczeniu raka. W ostatnich pracach wykorzystaliśmy dwa miRNA, miR-143 i miR-506, do regulacji progresji cyklu komórkowego. Komórki niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) A549 zostały przetransfekowane, przeanalizowano zmiany ekspresji genów, a ostatecznie przeanalizowano aktywność apoptozy spowodowaną leczeniem. Wykryto regulację w dół kinaz zależnych od cyklin (CDK) (tj. CDK1, CDK4 i CDK6), a cykl komórkowy zatrzymał się na przejściach fazowych G1/S i G2/M. Analiza szlaku wykazała potencjalną aktywność antyangiogenną leczenia, która nadaje temu podejściu wieloaspektową aktywność. W tym miejscu opisano metodologie stosowane do identyfikacji aktywności miRNA w odniesieniu do hamowania cyklu komórkowego, indukcji apoptozy oraz wpływu leczenia na komórki śródbłonka poprzez hamowanie angiogenezy. Oczekuje się, że przedstawione tu metody wesprą przyszłe badania nad terapiami miRNA i ich aktywnością, a reprezentatywne dane posłużą innym badaczom podczas analiz eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Cykl komórkowy to kombinacja wielu zdarzeń regulacyjnych, które umożliwiają duplikację DNA i proliferację komórek w procesie mitotycznym1. Kinazy zależne od cyklin (CDK) regulują i promują cykl komórkowy2. Wśród nich mitotyczne CDK (CDK1) i międzyfazowe CDK (CDK2, CDK4 i CDK6) odgrywają kluczową rolę w progresji cyklu komórkowego3. Białko siatkówczaka (Rb) jest fosforylowane przez kompleks CDK4/CDK6, aby umożliwić progresję cyklu komórkowego4, a aktywacja CDK1 jest niezbędna do pomyślnego podziału komórki5. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano i oceniono liczne inhibitory CDK w badaniach klinicznych, co wskazuje na potencjał celowania w CDK w leczeniu raka. W rzeczywistości trzy inhibitory CDK zostały ostatnio zatwierdzone do leczenia raka piersi6,7,8,9,10. Tak więc CDK, a w szczególności CDK1 i CDK4/6, są bardzo interesujące w regulacji progresji komórek rakowych.

miRNAs (miR) to małe, niekodujące RNA i posttranskrypcyjne regulatory ekspresji genów, regulujące około 30% wszystkich ludzkich genów11. Ich aktywność opiera się na translacyjnej represji lub degradacji informacyjnych RNA (mRNA)12. Ilustrując ich znaczenie biologiczne, zidentyfikowano ponad 5 000 miRNA, a pojedyncza cząsteczka miRNA może regulować wiele genów11,13. Co ważniejsze, ekspresja miRNA jest związana z różnymi chorobami i statusami chorobowymi, w tym z rakiem13. W rzeczywistości miRNA zostały scharakteryzowane jako onkogenne lub supresory nowotworów, zdolne do promowania lub hamowania rozwoju i progresji guza14,15. Względna ekspresja miRNA w chorych tkankach może regulować postęp choroby; w związku z tym egzogenne dostarczanie miRNA ma potencjał terapeutyczny.

Rak płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem, a ponad 60% wszystkich nowotworów płuc to niedrobnokomórkowe nowotwory płuc16,17, z 5-letnim wskaźnikiem przeżycia mniejszym niż 20%18. Zastosowanie miR-143-3p i miR-506-3p zostało niedawno ocenione pod kątem celowania w cykle komórkowe w komórkach raka płuc11. miR-143 i miR-506 mają sekwencje, które są komplementarne do CDK1 i CDK4 / CDK6, a wpływ tych dwóch miR na komórki A549 przeanalizowano. Szczegóły eksperymentu zostały przedstawione i omówione w niniejszym artykule. Ekspresję genów, progresję cyklu komórkowego i apoptozę oceniano przy użyciu różnych projektów eksperymentalnych i punktów czasowych po transfekcji. Użyliśmy metod ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) wraz z analizą mikromacierzy w celu zmierzenia ekspresji określonych genów, a sekwencjonowanie RNA nowej generacji zostało wykorzystane do określenia globalnej dysregulacji genów11. Ta ostatnia metoda identyfikuje względną obfitość transkryptu każdego genu z wysoką czułością i odtwarzalnością, podczas gdy tysiące genów można przeanalizować z jednej analizy eksperymentalnej. Dodatkowo przeprowadzono analizę apoptotyczną spowodowaną leczeniem miRNA, która została opisana tutaj. Analizę szlaków uzupełniła bioinformatyka. Przedstawiono protokoły wykorzystywane do analizy potencjału terapeutycznego kombinatorycznych miR-143 i miR-506.

Głównym celem tego protokołu jest identyfikacja efektów działania miRNA w komórkach, ze szczególnym uwzględnieniem cyklu komórkowego. Różnorodność prezentowanych tu technik rozciąga się od analizy ekspresji genów przed translacją (przy użyciu qPCR) po skomplikowane i nowatorskie techniki analizy genów na poziomie białka, takie jak analiza mikromacierzy. Mamy nadzieję, że ten raport będzie pomocny dla badaczy zainteresowanych pracą z miRNA. Dodatkowo przedstawiono metodykę analizy cyklu komórkowego metodą cytometrii przepływowej i apoptozy komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. transfekcja miR-143 i miR-506

UWAGA: Używaj lateksowych rękawiczek, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego podczas wykonywania opisanych eksperymentów. W razie potrzeby należy używać komory bezpieczeństwa biologicznego z włączonym wentylatorem szafy, nie blokując dróg oddechowych ani nie zakłócając laminarnego przepływu powietrza. Zawsze ustawiaj szybę ochronną na odpowiedniej wysokości, zgodnie z opisem producenta.

  1. Nasiona komórek NSCLC A549 w kolbie T25 cm2/płytce 6/96 dołków w pożywce DMEM/F12K uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (pożywka hodowlana) w kapturze do hodowli tkankowej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli tkankowych.
  2. Zawiesić miR-143 i/lub miR-506 naśladowcy lub zamieszać siRNA ze środkiem transfekcyjnym (2,4 μg miR zmieszano z 14 μl środka transfekcyjnego; patrz tabela materiałów) w 500 μl pożywki do transfekcji i 1,5 ml surowicy i pożywki DMEM/F12K wolnej od antybiotyków przy końcowym stężeniu miRNA 100 nM. Ilość miRNA może wymagać optymalizacji na różnych komórkach i stężeniach. Odpowiednie podejścia obejmują transfekcję komórek o rosnącym stężeniu miRNA (tj. 50-200 nM) oraz ocenę regulacji w dół ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania.
  3. Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby/płytki i przemyć raz 1x PBS.
  4. Dodać kompleksy miRNA/czynnika transfekcyjno-mieszającego i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 6 godzin (wielkość kolby określa dodaną objętość inkubacji).
  5. Zastąp pożywkę 4 ml pożywką hodowlaną i inkubuj komórki przez 24 godziny i/lub 48 godzin.
  6. Zebrać transfekowane komórki przez trypsynizację, dodając 1 ml trypsyny-EDTA do każdej kolby T25 cm2, inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C i dodać 3 ml pożywki hodowlanej w celu zebrania komórek. Umieścić zawartość każdej kolby w oddzielnej, oznaczonej probówce o pojemności 15 ml. Praca w kapturze do hodowli tkankowej.
  7. Wirować przy 751 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas usuwania supernatantu, ponieważ mieszanie probówki może spowodować utratę komórek.
  8. Dodaj 2 ml 1x PBS i wiruj przez 5 minut przy 751 x g.
  9. Powtórz kroki 7 i 8 raz, aby usunąć wszelkie ślady podłoża i supernatantu.
    UWAGA: Na tym etapie probówki z próbkami mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub mogą być natychmiast zużyte.

2. Ekstrakcja RNA

  1. Oczyść obszar roboczy, spryskując 70% alkoholem izopropylowym i roztworem do odkażania RNAzy.
  2. Ekstrakcję RNA należy przeprowadzić przy użyciu odpowiedniego zestawu RNA (patrz Tabela materiałów).
  3. Usunąć probówki z temperatury -80 °C i pozostawić do rozmrożenia. Dodaj 300 μl buforu do lizy i pipetuj w górę iw dół, aby przerwać błonę komórkową.
  4. Dodaj równą objętość 100% ultraczystego etanolu.
  5. Dobrze wymieszaj i umieść w kolumnie oddzielającej.
  6. Wirować od 11 do 16 x g przez 30 s i usunąć przepływ.
  7. Dodać 400 μl buforu płuczącego i odwirować w celu usunięcia buforu.
  8. Dodać 5 μl DNAzy I z 75 μl buforu do trawienia DNA do każdej próbki i inkubować przez 15 minut.
  9. Przepłukać próbkę 400 μl buforu przygotowawczego RNA.
  10. Przemyć 2x buforem do przemywania RNA.
  11. Dodaj wodę wolną od nukleaz do kolumny, odwiruj, a następnie zbierz RNA.
  12. Zmierz całkowite stężenie RNA za pomocą spektrofotometru UV.

3. RT-qPCR

  1. Przed RT-qPCR należy zsyntetyzować cDNA. Po ilościowym określeniu stężenia RNA umieść 1 μg RNA w końcowej objętości reakcji o objętości 20 μl, aby przygotować cDNA w probówce PCR. Zawsze pracuj na czystej ławce.
  2. Wszystkie inne niezbędne składniki są zawarte w tabeli 1.
składnikiIlość (μL)/próbkę (20 μL)
5-krotny miks cDNA Master4
Serwery dNTPcyfra arabska
Losowe heksamery1
Wzmacniacz RT1
Mieszanka enzymów Verso1
Woda wolna od DNaz i RNazWymagana ilość po dodaniu RNA do uzyskania 20 μL

Tabela 1: Materiały do syntezy cDNA z próbek RNA.Wymagane ilości odpowiednich składników do przygotowania mieszanki wzorcowej dla jednej próbki do syntezy cDNA.

  1. Inkubować w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowych: 42 °C przez 30 minut, 95 °C przez 2 minuty, 4 °C aż do pobrania próbek.
  2. Zużyć natychmiast w zwykłym PCR lub qPCR lub przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotować roztwory podkładowe do przodu i do tyłu z wodą wolną od DNaz/RNaz o stężeniu 10 μM z podstawowego roztworu startera.
  4. Przygotować oddzielne mieszanki wzorcowe dla każdego genu, który ma zostać wykryty, w zależności od liczby próbek. Dla każdej próbki cDNA (studzienka qPCR) ilość reakcji przygotowuje się zgodnie z tabelą 2.
składnikiIlość (μL)/próbkę (20 μL)
Miks główny SYBR10
Podkład do przodu - 10 μMcyfra arabska
Podkład odwrotny - 10 μMcyfra arabska
Woda wolna od DNaz i RNaz3
Próbka cDNA3

Tabela 2: Materiały do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym z próbek cDNA.Ilość składników wymagana do przygotowania mieszanki wzorcowej dla jednej próbki do qPCR.

  1. Umieść każdą próbkę w odpowiednich studzienkach.
  2. Zaprojektuj układ próbki dla 96-dołkowej płytki qPCR. Dla każdej próbki i analizowanego genu przeprowadź reakcję w trzech egzemplarzach lub przynajmniej w duplikatach.
  3. Uszczelnij płytkę 96-dołkową optycznie przezroczystą osłoną samoprzylepną.
  4. Szybko obróć płytkę, aby mieszanina reakcyjna dotarła do dna każdej studzienki.
  5. Uruchom RT-qPCR zgodnie z następującym gradientem termicznym:
    1) 50 °C przez 2 min
    2) 95 °C przez 2 min
    3) 95 °C dla 15 s
    4) Weź czytanie
    5) 60 °C przez 1,5 min
    6) Powtórz krok 3 39 razy
  6. Uruchom następujący gradient termiczny w kontynuacji powyższego, aby wyznaczyć krzywą topnienia, która wskazuje amplifikację pojedynczego produktu.
    7) 65 °C przez 0,31 min
    8) +0,5 °C / cykl
    9) Tabliczka
    10) Powtórz krok 8 60 razy, aż osiągniesz 95 °C
    11) 72 °C przez 2 min

4. Elektroforeza w żelu agarozowym w celu potwierdzenia amplifikacji pojedynczego genu

  1. Przygotować 1% żel agarozowy w 1x bufor TBE.
  2. Dodać bromek etydyny (EtBr) w ciepłym (~50 °C) żelu, aż do uzyskania końcowego stężenia około 0,2-0,5 μg/ml. EtBR wiąże się z DNA i umożliwia jego wizualizację w świetle UV w obrazie żelowym.
  3. Wlej ciepły żel do tacki na żel dostarczonej z pudełkiem na żel do elektroforezy. Przymocuj mocno dostarczony grzebień, aby uzyskać jednolite dołki.
  4. Pozostaw żel do odpoczynku i ostygnięcia do temperatury pokojowej (RT) przez ~30 min.
  5. Gdy żel zestali, umieść żel i tackę w pudełku na żel
    6. .
  6. Napełnij pojemnik z żelem 1x buforem TBE, aż żel zostanie całkowicie pokryty.
  7. Zmierzyć stężenie DNA z procesu amplifikacji PCR za pomocą spektrometru UV.
  8. Weź ~15 ng DNA do małej probówki PCR, dodaj 5 μl barwnika i dodaj wymaganą ilość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 15 μl.
  9. Załaduj drabinkę DNA i próbki do studzienek.
  10. Uruchom żel pod napięciem 100 V, aż linia barwnika znajdzie się w około 75%-80% w dół żelu.
    UWAGA: Upewnij się, że żel przechodzi od ładunku ujemnego do dodatniego.
  11. Usuń żel i umieść go w obrazie żelu, aby uwidocznić DNA.

5. Analiza cyklu komórkowego

  1. Wysiać 5 x 105 komórek dla każdej próbki w kolbie T25 cm2 i przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, kroki 1-5.
  2. Po 24 godzinach i 48 godzinach zbierz komórki przez trypsynizację.
  3. Przenieś zawiesiny komórek do sterylnych probówek o pojemności 15 ml i odpowiednio je oznacz.
  4. Odwirować próbki o masie 751 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  5. Dodać 2 ml lodowatego 1x PBS, wirować i wirować w temperaturze 751 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
  6. Powtórz etap mycia z 1x PBS, aby usunąć resztki mediów.
  7. Ponownie zawiesić i rozbić osad, dodając 200 μl lodowatego 1x PBS przez pipetowanie.
  8. Napraw komórki, dodając kroplami 2 ml 70% lodowatego etanolu do probówki, delikatnie wirując.
  9. Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej i umieszczać probówki w temperaturze 4 °C na 1 godzinę.
  10. Wyjąć probówki z 4 °C i odwirować przy 751 x g przez 5 minut.
  11. Dodać 2 ml lodowatego 1x PBS, wirować i wirować w temperaturze 751 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
  12. Dodaj 500 μL 1x PBS z jodkiem propidyny (50 μg/ml) i rybonukleazą A (200 μg/ml)
  13. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem.
  14. Pozyskaj dane z cytometru przepływowego. Użyj rozproszenia do przodu i z boku (FSC vs. SSC), aby wybrać główną populację komórek, z wyłączeniem zanieczyszczeń w lewym dolnym rogu wykresu gęstości FSC i SSC oraz klastrów komórek od góry do prawego górnego rogu wykresu gęstości FSC i SSC.
  15. Analizuj dane w celu identyfikacji populacji komórek na poszczególnych etapach cyklu komórkowego za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

6. Test apoptozy

  1. Wysiać 5 x 105 komórek dla każdej próbki w kolbie T25 cm2 i przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, kroki 1-5.
  2. Po 24 godzinach i 48 godzinach zbierz komórki przez trypsynizację.
  3. Przenieś zawiesiny komórek do sterylnych probówek o pojemności 15 ml i odpowiednio je oznacz.
  4. Odwirować przy 751 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  5. Dodać 2 ml lodowatego 1x PBS, wirować i wirować w temperaturze 751 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
  6. Powtórz etap mycia z 1x PBS, aby usunąć resztki mediów.
  7. Rozcieńczyć 10x bufor wiążący Aneksynę V do 1x z lodowatym dH2O.
  8. Dodać 1 ml 1x buforu wiążącego Annexin V do każdej probówki z próbką i delikatnie zawiesić.
  9. Umieścić 96 μl zawiesiny komórek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  10. Dodać 1 μl koniugatu aneksyny V-FITC i 12,5 μl jodku propidyny (PI) do probówki zawierającej zawiesinę komórkową.
  11. Inkubować zawiesinę komórkową przez 10 minut na lodzie w ciemności.
  12. Dodać 250 μl lodowatego buforu wiążącego 1x Aneksyna V do każdej probówki z próbką w celu rozcieńczenia.
  13. Natychmiast przeanalizować próbki za pomocą cytometru przepływowego.

7. Ekspresja białka za pomocą mikromacierzy cyklu komórkowego przeciwciała

  1. Wysiewać 5 x 105 komórek dla każdej próbki w kolbach T25 cm2 i przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, kroki 1-5.
  2. Po 24 godzinach i 48 godzinach zbierz komórki przez trypsynizację.
  3. Przenieś zawiesiny komórek do probówek o pojemności 15 ml i odpowiednio je oznacz.
  4. Odwirować przy 751 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  5. Dodać 2 ml lodowatego 1x PBS, wirować i wirować w temperaturze 751 x g przez 5 min. Wyrzucić supernatant.
  6. Powtórz etap prania z 1x PBS.
  7. Dodać 150 μl buforu do lizy uzupełnionego inhibitorami proteazy. Delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby przerwać błony komórkowe.
  8. Aby zapobiec wszelkim zakłóceniom buforu do lizy, należy przeprowadzić wymianę buforu w celu zastąpienia buforu do lizy buforem etykietującym, korzystając z kolumn do wymiany rozpuszczalników producenta.
  9. Określ ilościowo całkowite białko za pomocą testu BCA.
  10. Pobrać 70 μg próbki białka i dodać bufor do znakowania, aby uzyskać końcową objętość 75 μl.
  11. Dodać 100 μl dimetyloformamidu (DMF) do 1 mg odczynnika biotyny (biotyna/DMF).
  12. Dodać 3 μl biotyny/DMF do każdej próbki białka (biotynylowanej próbki białka) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  13. Dodać 35 μl odczynnika stop i wymieszać przez wirowanie.
  14. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  15. Przed użyciem wyjmij szkiełka z mikromacierzy z lodówki, aby ogrzały się do temperatury pokojowej przez 1 godzinę.
  16. Przeprowadzić blokowanie niespecyficznego wiązania poprzez inkubację szkiełek z 3% roztworem mleka w proszku (w odczynniku blokującym dostarczonym przez producenta) na szalce Petriego z ciągłym wytrząsaniem przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  17. Umyć szkiełka wodąddH 2O (o ile nie określono inaczej, mycie odbywa się przy użyciu ddH2O).
  18. Powtórz krok mycia ~10x, aby całkowicie usunąć roztwór blokujący z powierzchni szkiełka. Jest to ważne, aby uzyskać jednolite i niskie tło.
  19. Usuń nadmiar wody z powierzchni zjeżdżalni i przejdź do następnego kroku, nie dopuszczając do wyschnięcia szkiełek.
  20. Przygotować roztwór sprzęgający, rozpuszczając 3% mleka w proszku w odczynniku sprzęgającym.
  21. Dodać 6 ml roztworu sprzęgającego i do pełnej ilości uprzednio przygotowanej próbki białka biotynylowanego z kroku 7.12.
  22. Umieść jedno szkiełko w jednym dołku komory sprzęgającej dostarczonej przez dostawcę i dodaj do niego ~6 ml mieszanki sprzęgającej białka.
    UWAGA: Upewnij się, że szkiełko jest całkowicie zanurzone w roztworze mieszanki sprzęgającej białka.
  23. Przykryć komorę sprzęgającą i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z ciągłym mieszaniem w wytrząsarce orbitalnej.
  24. Przenieś szkiełka na szalkę Petriego i dodaj 30 ml 1x buforu do mycia. Umieść szalkę Petriego w wytrząsarce orbitalnej, potrząsaj przez 10 minut i wyrzuć roztwór.
  25. Powtórz krok 7.24 2x.
  26. Dokładnie spłukać szkiełka wodą ddH2O, jak opisano w krokach 7.17 i 7.18, a następnie natychmiast przejść do następnego kroku, aby uniknąć wysuszenia.
  27. Dodać 30 μl Cy3-streptawidyny (0,5 mg/ml) do 30 ml buforu detekcyjnego.
  28. Umieścić szkiełko na szalce Petriego i dodać 30 ml buforu detekcyjnego zawierającego Cy3-streptawidynę.
  29. Inkubować w wytrząsarce orbitalnej przez 20 minut z ciągłym wytrząsaniem chronionym przed światłem.
    UWAGA: Cy-3 jest barwnikiem fluorescencyjnym. Przykryj folią aluminiową lub pracuj w ciemnych warunkach, aby utrzymać intensywność fluorescencji.
  30. Wykonaj kroki 7.24-7.26 i pozostaw szkiełko do wyschnięcia, używając delikatnego strumienia powietrza lub umieszczając szkiełko w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i wiruj przy 1300 x g przez 5-10 minut.
  31. Umieść szkiełko w uchwycie na suwak i przykryj folią aluminiową.
  32. Zeskanuj szkiełko w skanerze mikromacierzowym o odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji. W przypadku Cy3 szczyt długości fali wzbudzenia przypada na ~550 nm, a pik emisji na ~570 nm.
  33. Przeanalizuj dane (patrz tabela materiałów) dla używanego oprogramowania).

8. Sekwencjonowanie RNA

  1. Wysiewać 5 x 105 komórek dla każdej próbki w kolbach T25 cm2 i przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, kroki 1-5.
  2. Po 24 godzinach i 48 godzinach zbierz komórki przez trypsynizację.
  3. Przenieść zawiesiny komórek do probówek o pojemności 15 ml i odpowiednio je oznaczyć.
  4. Wyodrębnij RNA zgodnie z sekcją 2, kroki 1-6.
  5. Sprawdź jakość RNA, a także stężenie za pomocą bioanalizatora. Do potwierdzenia jakości RNA niezbędna jest ocena integralności RNA (RIN) powyżej ośmiu i odpowiednie histogramy.
  6. Z całkowitego RNA użyj ~2 μg próbki do sekwencjonowania RNA (informacyjny RNA z całkowitego RNA)
  7. Sekwencja przy użyciu sekwencera nowej generacji11.
  8. Uruchom wysokiej jakości przycinanie i mapowanie z genomem referencyjnym z plików FASTQ wygenerowanych przez maszynę do sekwencjonowania RNA11.
  9. Prześlij pliki FASTQ i surowo odczytaj dane zliczania do Genebanku, postępując zgodnie z instrukcjami na stronie internetowej .
    UWAGA: Zobacz numer dostępu SRP133420 dla poprzednich wyników.

9. Test tworzenia probówek

  1. Oceń potencjał angiogenny ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej transfekowanych miRNA (HUVEC) 36 godzin po transfekcji, jak opisano w sekcji 1, kroki 1-5, przy użyciu komórek HUVEC zamiast komórek A549.
  2. Głodź HUVEC pożywką głodową M199 przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  3. Usunąć matrycę membrany podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu z temperatury -80 °C i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc, umożliwiając stopniowe rozmrażanie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i polimeryzacji.
  4. Ostrożnie i powoli pokryj studzienki 96-dołkowej płytki 0,04 ml matrycy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu, unikając tworzenia się pęcherzyków. Całą procedurę należy wykonać pod okapem z przepływem laminarnym.
  5. Napełnij sąsiednie studzienki płytki 96-dołkowej 0,1 ml PBS, aby utrzymać wilgotność i temperaturę.
  6. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 minut, aby uzyskać polimeryzację ekstraktu z błony podstawnej. Nie inkubować dłużej niż 1 godzinę.
  7. Trypsynizować transfekowane HUVEC z każdej grupy i ponownie zamieszać w pożywce M199 w stężeniu 1 x 105 komórek/ml.
  8. Dodaj 0,1 ml każdej zawiesiny komórkowej do studzienek zawierających spolimeryzowaną matrycę błony podstawnej w płytce 96-dołkowej.
  9. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 podczas przygotowywania czynników wzrostu. Przygotowanie czynników wzrostu odbywa się również pod okapem z przepływem laminarnym.
  10. Rozpuść czynniki wzrostu (VEGF) w 2x końcowym pożądanym stężeniu (stężenie 4 ng / ml dla 2 ng / ml stężenia końcowego) i dodaj 0,1 ml pożywki głodowej M199 zawierającej czynnik wzrostu na 0,1 ml pożywki głodowej M199 z komórkami. W przypadku studzienek bez VEGF dodaj 0,1 ml pożywki głodowej M199 na wierzch 0,1 ml pożywki głodowej M199 z komórkami.
  11. Inkubować 96-dołkową płytkę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  12. Pod koniec okresu inkubacji uzyskaj obrazy każdej studzienki w 4-krotnym powiększeniu, używając mikroskopu jasnego pola połączonego z kamerą cyfrową.
  13. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania wyposażonego w wtyczkę "analizator angiogenezy"19. Użyj trzech parametrów, liczby węzłów, liczby połączeń i całkowitej długości kiełków, aby porównać wpływ leczenia miRNA na angiogenezę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza ekspresji genów za pomocą RT-qPCR i elektroforezy żelowej

Analiza różnicowej ekspresji genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR wykazała istotną downregulację docelowych genów CDK1, CDK4 oraz CDK6. Wykazano, że CDK1 oraz CDK4/6 odgrywają kluczową rolę odpowiednio w przejściach G2/M i G1/S. Przeprowadzona analiza pozwoliła na bezpośrednie porównanie aktywności poszczególnych miRs oraz aktywności kombinacyj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

miRNA mogą działać jako terapie celowane w leczeniu raka, rozpoznając rozregulowanie poziomów ekspresji w chorych i normalnych tkankach. Badanie to miało na celu określenie miRNA, które potencjalnie zatrzymują postęp cyklu komórkowego na wielu etapach. Stwierdzono, że miR-143 i miR-506 zatrzymują cykl komórkowy komórek nowotworowych, a przedstawione protokoły miały na celu zrozumienie aktywności tego skojarzonego leczenia miRNA.

Opisane metodologie zapewniają nadrzędne zrozumienie funkcji miRN...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy chcieliby podziękować Johnowi Caskeyowi z Uniwersytetu Stanowego Luizjany za jego pomoc w analizie ścieżki danych sekwencjonowania RNA oraz University of Texas Southwestern Medical Center, McDermott Center Next Generation Sequencing Core za przeprowadzenie sekwencjonowania RNA i analizy danych. Badania te były wspierane przez College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe w ramach finansowania start-upu oraz National Institutes of Health (NIH) za pośrednictwem National Institute of General Medical Science Grants 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.

Podziękowania

Nie deklaruje się konfliktu interesów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
-80 stopni Celsjusza; C ZamrażarkaVWRVWR40086A
96-dołkowa płytkaCELLTREAT Scientific 50-607-511
96-dołkowe płytki mikrodołkowe   Thermo Scientific12-556-008
A549 Komórki niedrobnokomórkowego raka płucATCCATCC  CCL-185
AgarozaVWR0710-25G
Bioanalizator Agilent 2100Agilent TechnologiesG2938c
Tłumik Ambion Kontrola negatywna nr 1 siRNAAmbionAM4611
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)Gibco15240-062   
Zestaw do oznaczania matrycy przeciwciał, 2 reakcjeFull Moon BioKAS02
Mikroskop jasnego pola   Mikroskoptyka IV-900
Mikroskop jasnego pola   cyklu komórkowego Star Environment LLC
2 slajdyFull Moon BioACC058
Cell Logic+ Biosafety CabinateLabconco342391100
Cellquest ProBD bioscienceKroki 5.14; 6.13: Służy do obliczania rozkładu populacji według cyklu komórkowego  fazy i dla  obliczania rozkładu populacji do analizy apoptoza 
System czasu rzeczywistego CFX96 ModułBioRadCFX96
System obrazowania dotykowego Chemidoc System obrazowaniaBioRadChemidoc
Inkubator CO2Thermo ScientificHERAcell 150i
wzrostuTrevigen3433-010-01
Aparat cyfrowyAmScope FMA050
DMEM 4,5 g/l glukozy, bez pirogronianu sodu, z L-glutaminąVWRVWRL0100-0500
DNAzyda IZymo ResearchE1010
Suplement na wzrost komórek śródbłonka (EKGS)BD Biosciences356006
Eppendorf Zestawy do pipet Eppendrof05-403-152
Etanol, absolutny (200 dowodów), molekularny Ocena z biologii, Fisher BioReagentsBP2818500
Bromek etydynyAlfa acarL07462
F-12K Mieszanka składników odżywczych (mod. Kaighna) z L-glutaminą, CorningCorning 45000-354
Cytometr przepływowy FACSBecton Dickinson
Fetal Bydlęca surowica - PremiumAntlanta BiologicalsS11150
Płód Surowica bydlęca (FBS)Fisher Scientific10438026
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Basix ze standardowymi zatrzaskamiFisherbrand Basix02-682-002
Inkubator CO2 z płaszczem wodnym Forma Series IIThermo Scientific
Roztwór heparyny (5000 U / ml)HospiraNDC#63739-920-11
System elektroforezy poziomejStołowy system laboratoryjnyBT102
has-miR-143-3p miRNA MimicABMMCH01315
has-miR-506-3p miRNA MimicABMMCH02824
Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF)Thermo ScientificPHC9394   
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)Indywidualni dawcyIRB# A15-3891
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem hyklonu (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Ingenuity Analiza szlakuQiagenWyniki: Używany do analizy
Invitrogen UltraPure Woda destylowana bez DNazy/RNazInvitrogen10-977-015
Lipofektamina 2000 Invitrogen11-668-027
Ładowanie barwnika 10Xnauka warda+470024-814
Medium M199 (z Earle′ s sole, L-glutamina i wodorowęglan sodu)Sigma AldrichM4530
Mikroskop Aparat cyfrowyAmScope Oprogramowanie MU130
Modfit LTVerityKrok 5.15: Alternatywne oprogramowanie do analizy rozkładu populacji cykli
NanodropThermo ScientificNanoDrop one C
Opti-MEMGibco firmy life technologies31985-070
Penicylina-streptomycyna 10/10Antlanta BiologicalsB21210
Zasilanie sybr green master mixApplied BiosystemsA25780
Jodek propidiumMP Biochemicals LLCIC19545825
Proscanarray HT Skaner mikromatrycowyPerkin elmerASCNPHRG. Zastosowaliśmy falę lasera wzbudzającego o długości fali 543 nm.
q Optyczna osłona samoprzylepna PCRApplied Biosystems4360954
Zestawy Quick-RNAZymo ResearchR1055
Rybonukleaza A z trzustki bydlęcejSigmaR6513-50MG
ScanArray ExpressPerkinElmerKrok 7.33: Oprogramowanie do
Shaker Thermo Scientific2314
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems
Probówki wirówkowe SpectraTube 15mlVWR470224-998
Probówki wirówkowe SpectraTube 50mlVWR470225-004
Bufor TBS, 20x płynVWR10791-796
Wirówka z kontrolowaną temperaturą  matchineThermo ScientificST16R
Mikrowirówka z kontrolowaną temperaturą matchineEppendrof5415R
Termo Scientific BioLite Kolby poddane hodowli komórkowejThermo Scientific12-556-009
Thermo Scientific Test białka BCAPierce Thermo ScientificPI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA BuforThermo ScientificPI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-dołkowe płyty z pełnym fartuchemThermo ScientificAB0800WL
Zestaw do syntezy cDNA Thermo Scientific Verso (100 przebiegów)Thermo ScientificAB1453B
Drabinka DNA Ultra Low RangeInvitrogen10597012
Standardowa lodówka laboratoryjna VWR z pełnymi drzwiami VWR
Nowa matryca przeciwciał , optyczny dotykowego Cultrex Matryca membrany podstawnej o obniżonym współczynniku ścieżek bioinformatycznychkomórkowychanalizy mikromacierzy

Bibliografia

  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
  4. Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090(2016).
  5. Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769(2015).
  6. Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
  7. Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
  8. Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
  9. Mullard, A. FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229(2017).
  10. Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
  11. Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495(2018).
  12. Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
  13. Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
  14. Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
  15. Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004(2016).
  16. Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543(2017).
  17. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  18. Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078(2018).
  19. Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
  20. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  21. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  22. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312(2014).
  23. Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
  24. Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
  25. Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
  26. Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).
  27. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).
  28. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

Tagi

leczenie miRNAregulacja cyklu komórkowegohamowanie angiogenezykomórki raka płucaanaliza ekspresji genówcytometria przepływowaanaliza qPCRekstrakcja RNAprotokół transfekcjianaliza mikromacierzy
Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.