terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Rak płuc (LC) jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem na całym świecie. Podobnie jak w przypadku innych komórek nowotworowych, podstawową cechą komórek LC jest nieuregulowana proliferacja i podział komórek. Wykazano, że hamowanie proliferacji poprzez zatrzymanie progresji cyklu komórkowego jest obiecującym podejściem do leczenia raka, w tym LC.
terapia miRNA stała się ważnym regulatorem genów potranskrypcyjnych i jest coraz częściej badana pod kątem zastosowania w leczeniu raka. W ostatnich pracach wykorzystaliśmy dwa miRNA, miR-143 i miR-506, do regulacji progresji cyklu komórkowego. Komórki niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) A549 zostały przetransfekowane, przeanalizowano zmiany ekspresji genów, a ostatecznie przeanalizowano aktywność apoptozy spowodowaną leczeniem. Wykryto regulację w dół kinaz zależnych od cyklin (CDK) (tj. CDK1, CDK4 i CDK6), a cykl komórkowy zatrzymał się na przejściach fazowych G1/S i G2/M. Analiza szlaku wykazała potencjalną aktywność antyangiogenną leczenia, która nadaje temu podejściu wieloaspektową aktywność. W tym miejscu opisano metodologie stosowane do identyfikacji aktywności miRNA w odniesieniu do hamowania cyklu komórkowego, indukcji apoptozy oraz wpływu leczenia na komórki śródbłonka poprzez hamowanie angiogenezy. Oczekuje się, że przedstawione tu metody wesprą przyszłe badania nad terapiami miRNA i ich aktywnością, a reprezentatywne dane posłużą innym badaczom podczas analiz eksperymentalnych.
Wprowadzenie
Cykl komórkowy to kombinacja wielu zdarzeń regulacyjnych, które umożliwiają duplikację DNA i proliferację komórek w procesie mitotycznym1. Kinazy zależne od cyklin (CDK) regulują i promują cykl komórkowy2. Wśród nich mitotyczne CDK (CDK1) i międzyfazowe CDK (CDK2, CDK4 i CDK6) odgrywają kluczową rolę w progresji cyklu komórkowego3. Białko siatkówczaka (Rb) jest fosforylowane przez kompleks CDK4/CDK6, aby umożliwić progresję cyklu komórkowego4, a aktywacja CDK1 jest niezbędna do pomyślnego podziału komórki5. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano i ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. transfekcja miR-143 i miR-506
UWAGA: Używaj lateksowych rękawiczek, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego podczas wykonywania opisanych eksperymentów. W razie potrzeby należy używać komory bezpieczeństwa biologicznego z włączonym wentylatorem szafy, nie blokując dróg oddechowych ani nie zakłócając laminarnego przepływu powietrza. Zawsze ustawiaj szybę ochronną na odpowiedniej wysokości, zgodnie z opisem producenta.
- Nasiona komórek NSCLC A549 w kolbie T25 cm2/płytce 6/96 dołków w pożywce DMEM/F12K uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (pożywka hodowlana) w kapturze do hodowli tkankowej i inkubo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Analiza ekspresji genów za pomocą RT-qPCR i elektroforezy żelowej
Analiza różnicowej ekspresji genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR wykazała istotną downregulację docelowych genów CDK1, CDK4 oraz CDK6. Wykazano, że CDK1 oraz CDK4/6 odgrywają kluczową rolę odpowiednio w przejściach G2/M i G1/S. Przeprowadzona analiza pozwoliła na bezpośrednie porównanie aktywności poszczególnych miRs oraz aktywności kombinacyj.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
miRNA mogą działać jako terapie celowane w leczeniu raka, rozpoznając rozregulowanie poziomów ekspresji w chorych i normalnych tkankach. Badanie to miało na celu określenie miRNA, które potencjalnie zatrzymują postęp cyklu komórkowego na wielu etapach. Stwierdzono, że miR-143 i miR-506 zatrzymują cykl komórkowy komórek nowotworowych, a przedstawione protokoły miały na celu zrozumienie aktywności tego skojarzonego leczenia miRNA.
Opisane metodologie zapewniają nadrzędne zrozumienie funkcji miRN.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy chcieliby podziękować Johnowi Caskeyowi z Uniwersytetu Stanowego Luizjany za jego pomoc w analizie ścieżki danych sekwencjonowania RNA oraz University of Texas Southwestern Medical Center, McDermott Center Next Generation Sequencing Core za przeprowadzenie sekwencjonowania RNA i analizy danych. Badania te były wspierane przez College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe w ramach finansowania start-upu oraz National Institutes of Health (NIH) za pośrednictwem National Institute of General Medical Science Grants 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.
Podziękowania
Nie deklaruje się konfliktu interesów.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| -80 stopni Celsjusza; C Zamrażarka | VWR | VWR40086A | |
| 96-dołkowa płytka | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-dołkowe płytki mikrodołkowe | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Komórki niedrobnokomórkowego raka płuc | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agaroza | VWR | 0710-25G | |
| Bioanalizator Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2938c | |
| Tłumik Ambion Kontrola negatywna nr 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Zestaw do oznaczania matrycy przeciwciał, 2 reakcje | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Mikroskop jasnego pola | Mikroskoptyka | IV-900 | |
| Mikroskop jasnego pola | cyklu komórkowego Star Environment LLC | ||
| 2 slajdy | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Kroki 5.14; 6.13: Służy do obliczania rozkładu populacji według cyklu komórkowego fazy i dla obliczania rozkładu populacji do analizy apoptoza | |
| System czasu rzeczywistego CFX96 Moduł | BioRad | CFX96 | |
| System obrazowania dotykowego Chemidoc System obrazowania | BioRad | Chemidoc | |
| Inkubator CO2 | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| wzrostu | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Aparat cyfrowy | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4,5 g/l glukozy, bez pirogronianu sodu, z L-glutaminą | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAzyda I | Zymo Research | E1010 | |
| Suplement na wzrost komórek śródbłonka (EKGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Zestawy do pipet Eppendrof | 05-403-152 | ||
| Etanol, absolutny (200 dowodów), molekularny Ocena z biologii, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Bromek etydyny | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Mieszanka składników odżywczych (mod. Kaighna) z L-glutaminą, Corning | Corning 45000-354 | ||
| Cytometr przepływowy FACS | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bydlęca surowica - Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Płód Surowica bydlęca (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Basix ze standardowymi zatrzaskami | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Inkubator CO2 z płaszczem wodnym Forma Series II | Thermo Scientific | ||
| Roztwór heparyny (5000 U / ml) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| System elektroforezy poziomej | Stołowy system laboratoryjny | BT102 | |
| has-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| has-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) | Indywidualni dawcy | IRB# A15-3891 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem hyklonu (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Analiza szlaku | Qiagen | Wyniki: Używany do analizy | |
| Invitrogen UltraPure Woda destylowana bez DNazy/RNaz | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofektamina 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Ładowanie barwnika 10X | nauka warda+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (z Earle′ s sole, L-glutamina i wodorowęglan sodu) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Mikroskop Aparat cyfrowy | AmScope | Oprogramowanie MU130 | |
| Modfit LT | Verity | Krok 5.15: Alternatywne oprogramowanie do analizy rozkładu populacji cykli | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco firmy life technologies | 31985-070 | |
| Penicylina-streptomycyna 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Zasilanie sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Jodek propidium | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Skaner mikromatrycowy | Perkin elmer | ASCNPHRG. Zastosowaliśmy falę lasera wzbudzającego o długości fali 543 nm. | |
| q Optyczna osłona samoprzylepna PCR | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Zestawy Quick-RNA | Zymo Research | R1055 | |
| Rybonukleaza A z trzustki bydlęcej | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Krok 7.33: Oprogramowanie do | |
| Shaker Thermo Scientific | 2314 | ||
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| Probówki wirówkowe SpectraTube 15ml | VWR | 470224-998 | |
| Probówki wirówkowe SpectraTube 50ml | VWR | 470225-004 | |
| Bufor TBS, 20x płyn | VWR | 10791-796 | |
| Wirówka z kontrolowaną temperaturą matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Mikrowirówka z kontrolowaną temperaturą matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Termo Scientific BioLite Kolby poddane hodowli komórkowej | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Test białka BCA | Pierce Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Bufor | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-dołkowe płyty z pełnym fartuchem | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Zestaw do syntezy cDNA Thermo Scientific Verso (100 przebiegów) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Drabinka DNA Ultra Low Range | Invitrogen | 10597012 | |
| Standardowa lodówka laboratoryjna VWR z pełnymi drzwiami VWR |
Bibliografia
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis
