Artykuł metodologiczny

Techniczny aspekt automatycznej syntezy i oceny kinetycznej w czasie rzeczywistym [11C]SNAP-7941

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59557

⸱

28 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Imaging and Image-guided Therapy, Division of Nuclear Medicine, Medical University of Vienna, 2Department for Pharmaceutical Technology and Biopharmaceutics, Faculty of Life Sciences, University of Vienna, 3Ludwig Boltzmann Institute Applied Diagnostics, 4CBmed GmbH - Center for Biomarker Research in Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj reprezentujemy protokół do w pełni zautomatyzowanego znakowania radioaktywnego [11C]SNAP-7941 i analizy kinetyki w czasie rzeczywistym tego znacznika PET na komórkach wykazujących ekspresję i nieeksprymujących P-gp.

Streszczenie

Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) jest podstawową techniką obrazowania molekularnego, dostarczającą wglądu w szlaki i wykorzystującą specyficzne radioligandy do badań in vivo. W ramach tego protokołu opisano solidną i niezawodną, zdalnie sterowaną radiosyntezę [11C]SNAP-7941, antagonisty receptora hormonu koncentrującego melaninę 1. Radiosynteza rozpoczyna się od cyklotronu wytworzonego przez [11C]CO2 , który jest następnie dalej reagowany poprzez przejście w fazie gazowej do [11C]CH3OTf. Następnie ten reaktywny produkt pośredni jest wprowadzany do roztworu prekursora i tworzy odpowiedni radioznacznik. Czystość chemiczną i radiochemiczną określa się za pomocą RP-HPLC, rutynowo wdrażanej w procesie kontroli jakości radiofarmaceutyków. Dodatkowo obliczana jest aktywność molowa, ponieważ jest ona niezbędna do następujących badań kinetycznych w czasie rzeczywistym. Ponadto [11C] SNAP-7941 stosuje się do komórek MDCKII-WT i MDCKII-hMDR1 w celu oceny wpływu ekspresji glikoproteiny P (P-gp) na akumulację komórek. Z tego powodu linia komórkowa z ekspresją P-gp (MDCKII-hMDR1) jest stosowana bez lub z blokadą przed eksperymentami za pomocą substratu P-gp (±)-werapamilu, a wyniki są porównywane z wynikami obserwowanymi dla komórek typu dzikiego. Ogólne podejście eksperymentalne pokazuje, jak ważne jest precyzyjne zarządzanie czasem, które jest niezbędne w każdym badaniu przedklinicznym i klinicznym z wykorzystaniem znaczników PET znakowanych radioaktywnie krótkożyciowymi nuklidami, takimi jak węgiel-11 (okres półtrwania: 20 min).

Wprowadzenie

[11C]SNAP-7941 został opracowany jako pierwszy znacznik pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) ukierunkowany na receptor hormonu koncentracji melaniny 1 (MCHR1) - receptor głównie zaangażowany w centralną regulację apetytu i przyjmowania pokarmu1. Oznaczenie węglem-11 SNAP-7941, dobrze scharakteryzowanego antagonisty MCHR1, dało autentyczny znacznik PET2,3,4,5. Jednak w pełni zautomatyzowana radiosynteza jest bardzo trudna pod względem skuteczności czasowej i odtwarzalności, ponieważ krótkożyciowy radionuklid węgiel-11 oferuje okres półtrwania wynoszący 20 min6. Całkowity czas syntezy powinien być ograniczony do minimum i z reguły nie powinien przekraczać 2-3 okresów półtrwania (tj. około 40-60 minut dla węgla-11)7. W szczególności procedury syntezy radioznaczników ukierunkowanych na systemy receptorowe o niskiej gęstości ekspresji muszą być znacznie zoptymalizowane, aby uzyskać wystarczającą wydajność, a co za tym idzie wysoką aktywność molową8. Strategia syntezy często następuje po produkcji radionuklidów w cyklotronie i uwolnieniu [11C]CO2 do syntezatora. Tam [11C]CO2 jest najpierw redukowany do [11C]CH4, a następnie reagowany z jodem, aby uzyskać [11C]CH3I metodą fazy gazowej9,10. Dalsza obróbka triflatem srebra daje [11C]CH3OTf bezpośrednio on-line. Następnie ten reaktywny produkt pośredni znakowany węglem-11 wprowadza się do roztworu zawierającego cząsteczkę prekursora. Zautomatyzowana radiosynteza obejmuje dodatkowo proces oczyszczania za pomocą półpreparatywnego RP-HPLC, a następnie formułowanie produktu odpowiedniego do badań przedklinicznych i klinicznych.

Niezależnie od okresu półtrwania radionuklidu i czasu potrzebnego na radiosyntezę, farmakokinetyka radiofarmaceutyku jest najbardziej krytycznym elementem do oceny podczas opracowywania znacznika PET. Jeśli chodzi o neuroobrazowanie, głównym warunkiem wstępnym jest wejście do mózgu znacznika PET. Jednak bariera krew-mózg (BBB), "granica bezpieczeństwa" mózgu, wykazuje wysoką ekspresję transporterów wypływu, które mogą rozładowywać małe cząsteczki (np. znaczniki PET) i skutecznie utrudniać ich zastosowanie.

Ogromnym mankamentem podczas oceny przedklinicznej są nieoczekiwane interakcje z tymi transporterami wypływu, które często nie są rozpoznawane w eksperymentach in vitro i prowadzą do niepowodzenia znacznika PET in vivo, jak zaobserwowano dla [11C]SNAP-7941. Obrazowanie μPET u szczurów wykazało niską akumulację w mózgu, która znacznie wzrosła po podaniu inhibitora P-gp tariquidar11. Dane te sugerowały, że [11C]SNAP-7941 jest substratem tego systemu transportera wypływu, utrudniającym wiązanie liganda z centralnym MCHR1. Niestety, nadal brakuje odpowiednich modeli in vitro umożliwiających przewidywanie penetracji BBB we wczesnym etapie rozwoju znacznika.

Tutaj opisujemy automatyczną syntezę [11C]SNAP-7941 przy użyciu syntezatora do metylacji węgla-11. Nacisk kładziony jest na przedstawienie przeglądu tego, jak zorganizować kolejne podejście eksperymentalne, w tym automatyczną syntezę, kontrolę jakości, a także sukcesywną ocenę in vitro z bardzo krótkożyciowym nuklidem węgla-11.

Po pierwsze, opisane są kluczowe kroki do udanej radiosyntezy przy minimalnym nakładzie czasu i maksymalnej wydajności. Następnie ustalana jest wiarygodna procedura kontroli jakości, dzięki której radioznacznik jest dostępny do potencjalnych badań klinicznych i spełnia kryteria Farmakopei Europejskiej12. Kwantyfikacja stężenia molowego i obliczenie odpowiedniej aktywności molowej jest podstawowym wymogiem dla kolejnych pomiarów kinetycznych.

Na koniec, przedstawiono nową i prostą metodę in vitro oceniającą interakcje [11C]SNAP-7941 z transporterem wypływu, P-gp (hMDR1). Proponowany model kinetyczny wykorzystuje łatwe w obsłudze urządzenie, które umożliwia natychmiastową interpretację danych i wymaga minimalnego wysiłku związanego z hodowlą komórkową13.

Protokół

OSTRZEŻENIE: Poniższy protokół zawiera wiele etapów wymagających obchodzenia się z materiałami radioaktywnymi i manipulowania nimi. Istotne jest, aby każdy krok był zgodny z wytycznymi Wydziału Bezpieczeństwa Radiologicznego instytutu oraz odpowiednim prawodawstwem krajowym. Obowiązkowe jest minimalizowanie ekspozycji operatorów na promieniowanie jonizujące zgodnie z zasadą ALARA („tak nisko, jak jest to racjonalnie osiągalne”).

1. Zarządzanie czasem i planowanie eksperymentu

UWAGA: Krótki okres połowicznego rozpadu węgla-1 wymaga dokładnego zarządzania czasem w celu zminimalizowania utraty radioaktywności (Rycina 1). Ważne jest, aby każda osoba zaangażowana w proces znała swój obszar odpowiedzialności oraz moment czasowy wykonania poszczególnych czynności. Do przygotowania eksperymentu kinetycznego w czasie rzeczywistym z użyciem [1C]SNAP-7941 niezbędne jest około czterech osób, aby zapewnić sprawny przebieg procesu.

  1. Zorganizuj producenta dla [1C]SNAP-7941.
  2. Poinformuj operatora kontroli jakości wykonującego ocenę specyfikacji, obliczenia stężenia masowego oraz aktywności molowej o czasie rozpoczęcia syntezy.
  3. Przygotuj eksperymentatora od kinetyki w czasie rzeczywistym do obliczeń rozcieńczenia i przeprowadzenia eksperymentu.
  4. Przekaż instrukcje osobie odpowiedzialnej za transport w celu przeniesienia materiału radioaktywnego w odpowiednie miejsce w wyznaczonych punktach czasowych.

2. Zautomatyzowana synteza [11C]SNAP-7941 do zastosowań przedklinicznych

  1. Przygotowanie syntezatora (Rycina 2).
    1. Włącz syntezator, wymagane gazy techniczne (hel i wodór) oraz oprogramowanie sterujące syntezatorem Tracerlab. Wybierz odpowiednią sekwencję syntezy snap.
    2. Przemyj V1-V3 raz wodą i dwukrotnie acetonem poprzez reaktor i zawór HPLC w pozycji załadunku (load) lub wstrzykiwania (inject) do butelki na odpady pętli.
    3. Osusz wszystkie powiązane linie doprowadzające i odprowadzające z reaktora poprzez zawór wtryskowy, aktywując ciągły przepływ helu poprzez V18.
    4. Podgrzej pułapkę [1C]CH3I oraz pułapkę [1C]CH3OTf w strumieniu helu o natężeniu 10 mL·min-1 do 20 °C poprzez V24, V25, V29, V15, V9, V17 i V32/V3 przy odłączonym reaktorze.
    5. Sprawdź tę samą drogę pod kątem nieszczelności (z podłączonym reaktorem) przy przepływie helu 10 mL·min-1. Szczelność jest gwarantowana, gdy przepływ spadnie poniżej 4 mL·min-1.
    6. Włącz pompę HPLC (5-10 mL·min-1) i przemyj linie HPLC oraz zawór wtryskowy acetonitrylem/wodą (50/50, v/v), a także linie HPLC rozpuszczalnikiem HPLC poprzez V14 do kolby.
    7. Opróżnij kolbę poprzez V1 i V12 do butelki na odpady strumieniem helu poprzez V19. Ponownie przemyj odpowiednie linie wodą z V6 poprzez V1 i V12 strumieniem helu poprzez V18.
    8. Przemyj V5 etanolem i V4 wodą poprzez V1 i V12 do fiolki z produktem (PCV) za pomocą strumienia helu poprzez V18, a następnie opróżnij PCV poprzez V13 do butelki na odpady strumieniem helu poprzez V20.
    9. Wyłącz pompę HPLC, przełącz na rozpuszczalnik do syntezy ((wodny octan amonu (2,5 g·L-1)/kwas octowy 97,5/2,5 v/v; pH 3,5)/acetonitryl 75/25 v/v), podłącz półpreparatywną kolumnę HPLC i zrównoważ kolumnę (przepływ 5 mL·min-1).
    10. Napełnij odczynniki do syntezy i oczyszczania: 1,5 mL wody (V2), 4,5 mL 0,9% NaCl (V4), 0,5 mL 96% etanolu (V5), 10 mL wody (V6) i 90 mL wody (kolba).
    11. Podłącz nową fiolkę na odpady pętli; fiolkę na produkt (opisaną i wyposażoną w igłę napowietrzającą) do V13 oraz ciekły azot.
    12. Przygotuj wkład SPE (ekstrakcja do fazy stałej), przemywając go 10 mL 96% etanolu i 20 mL wody, a następnie podłącz go pomiędzy V1 i V12.
    13. Uruchom sekwencję wstępną na 20 min przed rozpoczęciem syntezy, polegającą na podgrzaniu pułapki [1C]CO2 do 400 °C i przepłukaniu pułapki strumieniem helu 50 mL·min-1 poprzez V27 (2 min). Następnie przeprowadź wstępne płukanie pułapki [1C]CO2 przez 3 min gazem wodorowym (120 mL·min-1) i na koniec schłodź do temperatury poniżej 40 °C.
    14. Rozpuść 1 mg prekursora w 40 µL acetonitrylu (dla syntezy DNA, < 10 H2O), przenieś roztwór do reaktora i dodaj 5,5 µL TBAH (264 mg·mL-1 w metanolu). Podłącz reaktor w odpowiedniej pozycji.
    15. Zamknij komorę gorącą i włącz podciśnienie w komorze gorącej.
    16. Potwierdź rozpoczęcie procesu chłodzenia pułapki CH4 ciekłym azotem do -75 °C.
    17. Uwolnij radioaktywność po osiągnięciu wymaganej temperatury.
  2. Produkcja [1C]CO2 w cyklotronie
    UWAGA: Kroki 2.2.1-2.2.4 są przeprowadzane równolegle z przygotowaniem modułu radiosyntezy (patrz również Rycina 1).
    1. Włącz magnes cyklotronu.
    2. Wybierz tarczę 1C-CO2 i uruchom wiązkę 65 µA.
    3. Potwierdź rozpoczęcie naświetlania, naciskając przycisk Start irradiation.
    4. Zatrzymaj wiązkę i potwierdź uwolnienie radioaktywności do syntezatora, naciskając przycisk Delivery, po osiągnięciu pożądanej aktywności (ok. 120 GBq po 30 min).
  3. Przeprowadzenie w pełni zautomatyzowanej radiosyntezy
    1. Potwierdź, że system jest gotowy do przyjęcia radioaktywności i uruchom zautomatyzowany proces.
    2. Monitorowanie następującego procesu automatycznego:
      1. Sprawdź, czy [1C]CO2 jest automatycznie przenoszony z cyklotronu do jednostki syntezy poprzez V26 (ok. 4 min) i czy [1C]CO2 jest wychwytywany w temperaturze pokojowej na sicie molekularnym impregnowanym niklem jako katalizatorze (pułapka [1C]CO2).
      2. Śledź, czy pułapka [1C]CO2 jest automatycznie płukana najpierw helu (50 mL·min-1), a następnie gazem wodorowym (120 mL·min-1). Następnie zaobserwuj, że V27 i V25 są zamknięte, a wychwycony [1C]CO2 wraz z gazem wodorowym jest podgrzewany do 40 °C i że powstały [1C]CH4 jest dalej transportowany do wstępnie schłodzonej pułapki [1C]CH4 i tam zatrzymywany.
      3. Monitoruj, czy V10 jest zamknięte, V9 otwarte (w kierunku kolumny jodowej) i czy [1C]CH4 jest ponownie uwalniany przez powolne podgrzewanie pułapki [1C]CH4 do 80 °C i transportowany do jednostki cyrkulacyjnej strumieniem helu poprzez V10 (wyjście odprowadzające). Następnie sprawdź, czy [1C]CH4 jest przekształcany w [1C]CH3I w jednostce cyrkulacyjnej (proces trwa ok. 3 min), a powstały [11C]CH3I jest stale wychwytywany w pułapce [1C]CH3I.
      4. Upewnij się, że zawór odpływowy V16 jest otwarty, a pułapka [1C]CH3I podgrzewana jest do 90 °C strumieniem helu (20 mL·min-1) poprzez V24. W ten sposób usuwane są ewentualne produkty uboczne, a następnie V16 zostaje zamknięte.
    3. Potwierdź, że [1C]CH3I jest gotowy do uwolnienia do reaktora.
    4. Monitoruj następujący proces automatyczny: Sprawdź, czy pułapka [1C]CH3I jest podgrzewana do 190 °C i czy powstały [1C]CH3I jest uwalniany do reaktora poprzez pułapkę [1C]CH3OTf (V32 i V3, nadal w 20 °C), V7 i V8 pod ciągłym strumieniem helu (10-25 mL·min-1, V24). Podczas tego procesu V21 i V23 (wyjście odprowadzające) muszą być otwarte.
    5. Potwierdź dotarcie radioaktywności do reaktora, gdy poziom radioaktywności w reaktorze przestanie wzrastać.
    6. Monitorowanie następującego procesu automatycznego i przygotowanie do ewentualnej interwencji ręcznej:
      1. Sprawdź, czy V23, V21 i V8 są automatycznie zamykane i czy mieszanina reakcyjna jest podgrzewana do 75 °C. Po 3 min zaobserwuj, czy reaktor jest chłodzony ciekłym azotem, aż temperatura spadnie poniżej 35 °C. Następnie upewnij się, że mieszanina reakcyjna zostaje zgaszona 1,5 mL wody poprzez V2. Podczas tego procesu V21 i V23 (wyjście odprowadzające) muszą być otwarte.
      2. Śledź, czy V21 i V23 są zamknięte i czy mieszanina reakcyjna jest przenoszona do zaworu wtryskowego HPLC, przechodząc przez detektor cieczy do pętli HPLC (5 mL). Sprawdź, czy mieszanina reakcyjna jest automatycznie wstrzykiwana na kolumnę HPLC.
    7. Obserwuj chromatogram i ręcznie odetnij pik produktu poprzez przycisk Peak start. Naciśnij Peak end, gdy sygnał piku produktu spadnie poniżej około 40 cps po czasie retencji wynoszącym około 8-10 min (przepływ: 5 mL·min-1, Rycina 3).
    8. Włącz dodatkowy strumień helu, aby przyspieszyć opróżnianie kolby.
    9. Monitoruj, czy kolba się opróżnia i obserwuj butelkę na odpady: Sprawdź, czy kolba jest opróżniana poprzez V1, wkład SPE i V12 do odpadów strumieniem helu poprzez V19 oraz dodatkową linię helu i czy produkt zostaje zatrzymany na wkładzie SPE.
    10. Potwierdź, że kolba jest całkowicie pusta.
    11. Monitorowanie automatycznego procesu oczyszczania SPE i przenoszenia produktu:
      1. Sprawdź, czy wkład SPE jest przemywany 10 mL wody poprzez V6, V11 i V12 do odpadów i czy etanol eluuje produkt do PCV poprzez V5, V1 i V12. Na koniec zaobserwuj, czy do PCV poprzez V4, V1 i V12 dodawany jest 0,9% NaCl w celu rozcieńczenia produktu.
      2. Upewnij się, że roztwór produktu jest przenoszony poprzez V13 i filtr sterylny do końcowej fiolki z produktem strumieniem helu poprzez V20.
    12. Potwierdź, że produkt został całkowicie przeniesiony.

3. Kontrola jakości (QC)

UWAGA: Kontrola jakości radiofarmaceutyków obejmuje pomiar następujących parametrów:

  • Czystość radiochemiczna i aktywność molowa (RP-HPLC)
  • Pozostałości rozpuszczalników (chromatografia gazowa, GC)
  • Osmolalność (osmometr ciśnieniowy)
  • pH (pH-metr)
  • Widmo γ/czystość radionuklidowa (spektrometr γ)
  • Okres połowicznego rozpadu/czystość radionuklidowa (kalibrator dawki)

Wszystkie parametry fizykochemiczne są określane przed zwolnieniem produktu, a ich wartości muszą mieścić się w zdefiniowanym zakresie parametrów jakościowych.

  1. Przygotowanie sprzętu do kontroli jakości
    1. Rozpocząć przygotowania na 30 minut przed zakończeniem syntezy.
    2. Przygotować probówkę stożkową w pojemniku z osłoną ołowianą oraz osłoniętą strzykawkę o objętości 1 ml z przymocowaną igłą.
    3. Przygotuj wzorcowy roztwór odniesienia SNAP-7941 (10 µgml-1) w wodzie do HPLC.
    4. Włącz pH-metr, chromatograf gazowy i używane gazy, osmometr oraz wszystkie komponenty układu HPLC.
    5. Uruchom oprogramowanie sterujące systemem HPLC, a następnie wybierz odpowiednią kolumnę oraz przypisaną do niej metodę dla [11C]SNAP-7941 (fazą ruchomą: (woda/kwas octowy 97,5/2,5 v/v; 2,5 g/L)-1 octan amonu; pH 3,5)/acetonitryl 70/30 v/v; przepływ: 1 ml·min-1-1) i sporządź przykładową listę z dwoma pomiarami (standard i produkt). Rozpocznij procedurę kondycjonowania kolumny.
    6. Wstrzyknąć 20 µL roztworu referencyjnego SNAP-7941 za pomocą strzykawki Hamiltona po 10-minutowym przygotowaniu układu, a następnie należy rozpocząć analizę.
    7. Po wtryskaniu należy dwukrotnie przepłukać strzykawkę Hamiltona acetonitrylem i wodą.
    8. Uruchom oprogramowanie sterujące chromatografem gazowym i wprowadź listę próbek.
  2. Wykonywanie kontroli jakości
    1. Zmierzyć bezwzględną wydajność promieniotwórczą produktu po zakończeniu syntezy i transferu 100 µL produktu do fiolki reakcyjnej za pomocą przygotowanej strzykawki z osłoną ołowianą w celu kontroli jakości.
      UWAGA: Wszystkie dane uzyskane z kontroli jakości muszą zostać udokumentowane zgodnie z przepisami krajowymi.
    2. Analityczna HPLC: zmierz czystość radiochemiczną oraz czystość chemiczną i niezwłocznie poinformuj o wynikach osobę odpowiedzialną za eksperymenty z kulturami komórkowymi.
      1. Rysuj 40 µL próbki kontroli jakości (QC) i wstrzyknąć do układu HPLC. Rozpocząć pomiar poprzez przełączenie ramienia zaworu wtryskowego z Naładuj Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Wstrzyknąć (Rycina 3).
        UWAGA: W trakcie przebiegu (8 min) można przeprowadzać inne pomiary przewidziane w protokole, aby w jak największym stopniu uniknąć rozpadu.
      2. Otwórz chromatogram i zintegruj wszystkie piki w kanale radioaktywności. Porównaj czas retencji produktu (5,0–7,0 min) z czasem retencji standardu odniesienia. Porównaj pole pod krzywą wszystkich zintegrowanych pików, wyrażając je w procentach. Pik produktu musi stanowić ponad 95% (czystość radiochemiczna) całkowitej sumy pól zintegrowanych (kanał radiacyjny).
      3. Zintegruj sygnał w kanale UV, aby określić czystość chemiczną. Główną zanieczyszczeniem jest zazwyczaj prekursor – kwas SNAP, pojawiający się w czasie 2,8–3,5 min. Stężenie [natStężenie SNAP-7941 oblicza się na podstawie krzywej kalibracyjnej po przeprowadzeniu całkowania. Oblicz stężenie SNAP-7941 w µmol·ml-1 i wyznaczyć aktywność molową za pomocą następującego równania:
        Wzór na obliczanie aktywności molowej; stężenie radioaktywne względem poziomów SNAP-7941 we wzorze.
    3. W przypadku chromatografii gazowej przenieść 20 µL próbki kontroli jakości w dedykowanej fiolce szklanej. Umieść ją w autoprobniku i rozpoczęcie pomiaru. Po zakończeniu pomiaru otwórz chromatogram i zapisz wartości automatycznie zintegrowanych pikúw. Próbka nie powinna zawierać więcej niż 410 ppm acetonitrylu i 10% etanolu.
    4. Osmolalność: Umieść papierowy dysk z próbką w odpowiednim wgłębieniu i nanieś 10 µL próbki. Naciśnij Zamknij przycisk do pomiaru osmolalności. Po 3 minutach urządzenie wyświetla osmolalność, która powinna mieścić się w zakresie 190–50 mosm·kg-1.
    5. pH: Przemyć elektrodę wodą. Zmierzyć pH, zanurzając elektrodę w próbce. Wartość pH musi mieścić się w zakresie 5,0–8,5. Po pomiarze ponownie przemyć elektrodę i umieścić ją w roztworze wzorcowym pH.
    6. Widmo γ: Umieść próbkę kontrolną (QC) w spektrometrze γ, uruchom oprogramowanie sterujące i rozpocznij pomiar. Zatrzymaj pomiar i zapisz zmierzoną energię, która powinna wynosić 51 keV (zakres 420–520 keV). Otwórz menu plików i zapisz plik z odpowiednim numerem serii. Wywołaj zapisane widmo w dedykowanym oprogramowaniu i wydrukuj widmo.
    7. Okres półtrwania: Pomierz dwukrotnie aktywność próbki kontrolnej (QC) za pomocą kalibratora dawki. Zapisz odpowiednie czasy i oblicz okres półtrwania wykładniczego.
  3. Uwolnienie
    1. Po przetestowaniu wszystkich parametrów i stwierdzeniu, że wyniki są zgodne z wytycznymi austriackich organów nadzorczych, należy dopuścić radiotracer do użycia. Operator musi potwierdzić własnym podpisem poprawność danych.

4. Ocena oddziakiwań wobec transportera P-gp

  1. Hodowla komórek
    1. Włącz nadmuch laminarny (LAF) w dygestorium i wyczyść blat co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem pracy.
    2. W warunkach sterylnych, w komorze LAF, wymieszaj pożywkę do hodowli komórkowej z 10% FCS (50 ml) oraz 0,5% antybiotyków (2,5 ml), używając sterylnej pipety pomiarowej z automatycznym pipetnikiem.
    3. Rozmrozić komórki MDCKII-hMDR1 oraz MDCKII-WT i hodować w kolbie do hodowli komórkowej T75 lub T175 na 10–14 dni przed rozpoczęciem doświadczeń w warunkach aseptycznych (w komorze z laminarnym przepływem powietrza – LAF).
    4. Następnego dnia należy wymienić pożywkę, aby usunąć wszystkie komórki nieprzylegające oraz apoptotyczne.
    5. Wymieniaj pożywkę na świeżą co trzy dni (odpowiednio 12 ml dla kolby do hodowli komórek T75 i 23 ml dla kolby T175).
    6. Przeszczepić komórki do nowych kolbek lub naczyń hodowlanych zgodnie z harmonogramem eksperymentów po osiągnięciu konfluencji na poziomie 80%, aby uniknąć wzrostu warstwowego.
  2. Przygotowanie komórek do eksperymentów
    1. Przesiać komórki na dwa dni przed rozpoczęciem eksperymentów i wysiać w stężeniu 2,5 x 105 komórek na 2 ml w płaszczyźnie ukośnej naczynia hodowlanego (Rycina 4). Należy użyć automatycznego licznika komórek lub komory licznej Neubauera, aby policzyć komórki i obliczyć odpowiedni stosunek pasażowania.
    2. Usunąć pożywkę dzień przed rozpoczęciem eksperymentów, przemyć komórki na płytce hodowlanej 4 ml DPBS i dodać 5 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowej. Umieścić płytkę poziomo w inkubatorze.
    3. Przemyć komórki DPBS co najmniej 0,5 h przed przeprowadzeniem doświadczeń i zastąpić medium bez FBS w ilości 2 ml. Ocenić stopień konfluencji oraz morfologię komórek pod mikroskopem.
  3. Przeprowadzenie eksperymentów w trzech różnych układach.
    1. Użyj szalki Petriego do przeprowadzenia eksperymentów zgodnie z opisem w punkcie 4.2.3.
    2. Przed rozpoczęciem eksperymentów inkubować komórki przez 0,5 h z 10 µM hydrochlorowodorek (±)-werapamilu.
    3. Dodaj 0.98 µL roztworu stokowego werapamilu (20,4 mM chlorowodorku (±)-werapamilu w DMSO). Końcowe stężenie DMSO podczas traktowania wynosi ≤0,05%.
    4. Inkubować komórki przez 0,5 h z kontrolą nośnika (DMSO). Należy użyć takiej samej objętości, jakiej użyto do obróbki lekiem.
  4. Eksperymenty z zastosowaniem analizy w czasie rzeczywistym (dla wszystkich trzech układów)
    1. Włącz urządzenie oraz komputer, upewnij się, że są one prawidłowo połączone, a następnie uruchom oprogramowanie sterujące.
    2. Wybierz Jeden cel opcja, odblokuj szablon i dostosuj następujące ustawienie:
      Liczba stanowisk: 2 (dwa)
      Czas detekcji (s): 3 (trzy)
      Czas opóźnienia detekcji (s): 2 (dwie)
      Nazwa pierwszej fazy: baseline
    3. Włóż naczynie hodowlane do skośnego uchwytu urządzenia, upewniając się, że warstwa komórek znajduje się po stronie dolnej i jest przykryta pożywką hodowlaną.
    4. Uruchom analizę za pomocą Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. przycisk. System prosi o zapisanie pliku. Wybierz nazwę pliku oraz ścieżkę zapisu. Pojawia się centrum sterowania i rozpoczyna się pomiar bazowy (podpora naczynia z hodowlą komórkową zaczyna się obracać).
    5. Wybierz poniżej Inne opcje:
      Skala czasowa: minuty
      Korekcja nuklidu: węgiel-1
    6. Zaznacz wszystkie pola poniżej Krzywe na wykresie (tło (czerwone), cel (niebieski) oraz cel minus tło (czarne)).
    7. Wyznaczyć parametry kontroli jakości: aktywność molowa [GBq.µmol-1] oraz aktywność właściwa [MBq/ml-1] na koniec syntezy.
    8. Oblicz odpowiednią objętość znacznika dla 15 nM [natSNAP-7941 w objętości analizy wynoszącej 2 ml.
      Równanie do obliczania objętości roztworu z uwzględnieniem stężenia, nmol, μL; analiza chemiczna.
      Równanie korekcji stężenia w próbce SNAP-7941; wzór na obliczenie y_correction.
    9. Ustaw pipetę na odpowiednią objętość i pobierz alikwot [11Produkt SNAP-7941 w osłonie ołowianej.
    10. Kliknij Wstrzymaj przebieg w oknie centrum sterowania. Należy poczekać, aż obrót szalki ustanie i pojawi się pasek boczny z tytułem Występuje przerwa i następna faza.
    11. Otwórz pokrywę urządzenia do kinetyki w czasie rzeczywistym. Obróć uchwyt naczynia hodowlanego 90° w lewo. Dodaj obliczoną objętość znacznika i powróć do pozycji początkowej. Następnie zamknij pokrywę urządzenia. Natychmiast naciśnij Kontynuuj przycisk do rozpoczęcia eksperymentu.
    12. Zakończ eksperyment po 20 min, wybierając opcję pauzy, a następnie przerwij pomiar (naciśnij Zakończenie analizy w pasku bocznym).
  5. Analiza i przetwarzanie danych z wykorzystaniem oprogramowania statystycznego
    1. Uruchom oprogramowanie do sterowania w czasie rzeczywistym. Kliknij w Otwórz pliki aby przypomnieć wymaganą kinetykę. Kinetyka jest przedstawiona w oknie centrum sterowania.
    2. Wybierz, klikając prawym przyciskiem myszy bezpośrednio na kinetyce Eksport krzywychZapisz plik tekstowy zawierający surowe dane. Otwórz program statystyczny i wklej plik z surowymi danymi z eksperymentów w czasie rzeczywistym.
    3. Rozpocznij odliczanie czasu (oś X) od momentu dodania radiotraceru (z pominięciem pomiaru tła) i znormalizuj dane do procentowego sygnału maksymalnego CPS (liczb przerzutów na sekundę).
    4. Wczytaj wszystkie znormalizowane dane do nowego pliku programu GraphPad Prism.
    5. Oblicz wartości średnie oraz odchylenie standardowe.
    6. Przedstaw uzyskane dane w formie wykresu obrazującego odchylenie (szybkość wzrostu) wychwytu znacznika dla wszystkich trzech układów.

Wyniki

W pełni zautomatyzowana radiosynteza [11C]SNAP-7941 pozwoliła uzyskać 5,7 ± 2,5 GBq (4,6 ± 2,0% w EOB, 14,9 ± 5,9% w odniesieniu do [11C]CH3OTf; n = 10) sformułowanego produktu. Całkowity czas syntezy wyniósł około 40 min, z czego 15 min wymaganych było na przygotowanie [1C]CH3OTf via metodą fazy gazowej, kolejne 5 min było koniecznych do radiomarkowania prekursora, po czym nastąpiły 10 min oczyszczania metodą półpreparatywnej RP-HPLC oraz 10 min ekstrakcji w fazie stałej na wkładzie C18 i formułowania. Następnie niewielka porcja (ok. 100-20 µL) została dostarczona osobie odpowiedzialnej za kontrolę jakości, natomiast oryginalna fiolka z gotowym do użycia znakownikiem przekazana została badaczowi przeprowadzającemu analizę kinetyczną w czasie rzeczywistym.

Kontrola jakości została przeprowadzona w ciągu 10 min po zakończeniu syntezy. Aktywność molowa mieściła się w zakresie 72 ± 41 GBq/µmol (n = 10), a czystość radiochemiczna zawsze wynosiła > 95%. Wszystkie pozostałe parametry (pH, osmolalność, pozostałości rozpuszczalników) spełniały kryteria zwolnienia. Do analizy kinetycznej w czasie rzeczywistym wybrano trzy różne układy doświadczalne: (A) komórki MDCKII-WT traktowane i nietraktowane (vehicle), (B) komórki MDCKII-hMDR1 nietraktowane lub traktowane vehicle oraz (C) tę drugą linię komórkową z blokowaniem przed analizą kinetyczną transportera w czasie rzeczywistym przy użyciu (±)-werapamilu. Zastosowanie [11C]SNAP-7941 do linii komórkowej dzikiej typu MDCKII-WT (niewyrażającej P-gp) oraz MDCKII-hMDR1 (wyrażającej P-gp) wykazuje różną charakterystykę kinetyczną, ponieważ w linii dzikiej typu obserwuje się szybką akumulację, podczas gdy w przypadku komórek MDCKII-hMDR1 nie stwierdzono akumulacji. Jednakże zablokowanie transportera efleksowego P-gp w komórkach MDCKII-hMDR1 za pomocą (±)-werapamilu doprowadziło do uzyskania kinetyki w czasie rzeczywistym porównywalnej z tą zaobserwowaną dla linii dzikiej typu (Rysunek 5).

Schemat procesu radiosyntezy; przedstawia etapy przygotowania syntezatora, naświetlania oraz oceny in vitro.
Rysunek 1: Przegląd schematu pracy. Schemat radiostyntezy, kontroli jakości oraz przeprowadzania pomiarów kinetycznych w czasie rzeczywistym [11C]SNAP-7941. Czarne strzałki wskazują drogę transportu radioaktywności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat Tracerlab FX2 C; konfiguracja syntezy radiow oznaczania z kolumną HPLC i wkładem SPE.
Rycina 2: Schemat radiosyntezy w zautomatyzowanym syntezatorze. Układ przełączający automatycznego syntezera, zaczynając od jednostki cyrkulacyjnej dla [11C]CH3I/[11C]CH3produkcja OTf, reaktor do wprowadzania aktywności do roztworu prekursora oraz oczyszczanie metodą SPE (SPE = ekstrakcja do fazy stałej; PCV = fiolka do zbierania produktu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Chromatogram HPLC wykazujący piki detekcji SNAP-7941; detektory UV i gamma; analiza związku.
Rycina 3: Reprezentatywne chromatogramy w pełni zautomatyzowanej radiosyntezy [11C]SNAP-7841. Na górze przedstawiono półpreparatywny chromatogram RP-HPLC, a na dole chromatogram analityczny po oczyszczaniu. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Metoda hodowli komórkowej, schemat wysiewania pod kątem i wymiany pożywki; ilustracja procesu inkubacji.
Rycina 4: Przygotowanie naczynia do hodowli komórkowej do eksperymentów w czasie rzeczywistym. Krok 1 obejmuje wysiew 2,5 x 105 do 1 x 106 w zależności od rodzaju komórek i tempa ich wzrostu. Następnie naczynie hodowlane umieszcza się pod kątem (około 30-45°). W związku z tym w inkubatorze można wykorzystać dołączoną aparaturę metalową lub pokrywkę naczynia do hodowli komórkowej, aby ustabilizować naczynie w pozycji skośnej. Następnego dnia (po 24 h) naczynie ustawia się poziomo i dodaje świeżą pożywkę do hodowli komórek, tak aby całkowicie pokryła powierzchnię komórek. W dniu eksperymentu bada się żywotność oraz konfluencję komórek. Zgodnie z protokołem eksperymentalnym komórki płucze się DPBS, pożywkę wymienia na pożywkę bezsurowiczą (2 ml), a naczynie do hodowli ponownie ustawia się w pozycji skośnej aż do rozpoczęcia doświadczeń. Następnie komórki można poddać działaniu inhibitora lub nośnika. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres wzrostu komórek MDCKII; czas vs. krotność przyrostu; WT, hMDR1, z blokowaniem wstępnym; analiza naukowa.
Rysunek 5: Kinetyczne pomiary w czasie rzeczywistym [11C]SNAP-7941. Reprezentatywna kinetyka w czasie rzeczywistym dla [11C]SNAP-7941 przedstawiono w trzech różnych konfiguracjach: przy użyciu komórek MDCKII-WT; komórek MDCKII-hMDR1 uprzednio zablokowanych (±)-werapamilem jako inhibitorem P-gp oraz komórek MDCKII-hMDR1 bez blokowania. Oś y przedstawia tempo wzrostu w przypadku zablokowanych komórek MDCKII-hMDR1 i komórek WT w porównaniu do wyników dla komórek MDCKII-MDR1 niepoddanych działaniu inhibitora lub leczonych nośnikiem, odpowiednio (brak poboru, 0%). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Radiosynteza [11C]SNAP-7941 została ustanowiona na komercyjnym module syntezy. Dzięki możliwości pełnej automatyzacji procesu przygotowania, radiosynteza okazała się niezawodna, a także osiągnięto poprawę w zakresie ochrony radiologicznej operatora. Przygotowanie syntezatora ma ogromny wpływ na jakość radioznacznika, szczególnie w zakresie aktywności molowej. W związku z tym niezbędna jest ciągła praca w warunkach obojętnych (np. atmosfera helu) oraz przepłukiwanie wszystkich przewodów znajdujących się przed zbiornikiem reakcyjnym (linia docelowa, cykl produkcyjny [11C]CH3I i reaktor (patrz rysunek 2)). Ponadto podgrzanie odpowiednich pułapek i pieców przed rozpoczęciem syntezy w celu usunięcia wilgoci i węgla atmosferycznego korzystnie zwiększa aktywność molową. Szczególnie kolumna AgOTf, impregnowana grafityzowanym węglem, jest niezwykle wrażliwa na wilgoć. Nawet niewielkie ilości jakiegokolwiek źródła wilgoci zakłócają przemianę [11C]CH3I w [11C]CH3OTf. Przed rozpoczęciem syntezy, pułapka [11C]CO2 i pułapka [11C]CH3I muszą zostać ponownie schłodzone do temperatury pokojowej, aby umożliwić późniejsze wychwytywanie. Ponadto zaleca się rozpuszczenie prekursora na krótko przed rozpoczęciem syntezy i dodanie zasady bezpośrednio do roztworu prekursora.

Kontrola jakości radioznaczników węgla-11 musi być racjonalnie zaprojektowana, aby zapewnić ciągły i szybki przebieg pracy. Jednak najważniejszymi parametrami w badaniach hodowli komórkowych są czystość radiochemiczna i aktywność molowa w celu uzyskania prawidłowych wyników. Prawidłowa ocena aktywności molowej wymaga solidnej analitycznej metody HPLC, a krzywa kalibracyjna musi obejmować zakres stężeń produktu końcowego. Wyzwaniem dla radioznaczników jest osiągnięcie stężenia powyżej granicy oznaczalności (LOQ) ze względu na niewielkie ilości, które są wytwarzane podczas radiosyntezy. W związku z tym sztuka polega na znalezieniu równowagi między wysoką aktywnością molową, aby uniknąć nasycenia receptorów, a wystarczająco wysokimi stężeniami, aby nadal być w stanie określić ilościowo sygnał nieradioaktywny.

[11kategorii]Potwierdzono, że SNAP-7941 jest silnym substratem ludzkiego transportera P-gp, ponieważ nie zaobserwowano akumulacji w nieleczonych lub traktowanych nośnikiem komórkach MDCKII-hMDR1 z powodu szybkiego wypływu. W przeciwieństwie do tego, oba zestawy eksperymentalne (MDCKII-WT lub wstępnie zablokowane komórki MDCKII-hMDR1) dostarczyły podobnych wyników (akumulacja [11C]SNAP-7941), co potwierdza wszechstronność tego testu in vitro. Komórki MDCKII-hMDR1 doskonale nadają się do eksperymentów LigandTracer ze względu na ich stabilną transfekcję, szybki wzrost i odporność na naprężenia ścinające spowodowane przez obracającą się miskę do hodowli komórek. Brak wychwytu [11C]SNAP-7941 w mózgu szczura i myszy może zatem wystąpić spowodowany wypływem przez transporter P-gp. Ze względu na transfekcję komórek nerki psów ludzkim białkiem wielolekooporności 1 (hMDR-1, P-gp), wartość predykcyjna tej metody dla wiązania transportera wypływu u ludzi jest wysoka, co jest korzystne z punktu widzenia przyszłego zastosowania klinicznego. Jednak do tej pory selektywność w stosunku do innych transporterów wypływu nie została zweryfikowana. W związku z tym można wykorzystać inne linie komórkowe, wyrażające różne znaczące transportery wypływu, takie jak białko oporności na raka piersi (BCRP) lub białko oporności wielokrotnej-1 (MRP-1), w celu zbadania interakcji z tymi transporterami. Metoda jest w porównaniu z klasycznymi testami akumulacji lub transportu bardzo prosta i daje natychmiastowe wyniki jakościowe. Co więcej, największą zaletą jest to, że technologia ta umożliwia ocenę bezpośredniej interakcji znacznika PET z celem w czasie rzeczywistym, w przeciwieństwie do konwencjonalnego eksperymentu wykorzystującego pośrednią kwantyfikację (głównie przemieszczenie). Ponadto oprogramowanie do testów radioaktywnych w czasie rzeczywistym zapewnia elastyczność eksperymentalną (np. korekcja rozpadu nuklidów, pomiar czasu i pozycji itp.), a tym samym dużą swobodę dla użytkowników. Z drugiej strony, ograniczenia metody obejmują niską przepustowość próbki, ponieważ jednocześnie można zmierzyć tylko jedną szalkę komórkową. Ponadto należy wziąć pod uwagę kilka innych kwestii technicznych i eksploatacyjnych: opisywana technologia jest bardzo wrażliwa na promieniowanie tła; W związku z tym źródła promieniowania powinny być trzymane w pewnej odległości i należy położyć nacisk na pomiar tła przed eksperymentem. Inną kwestią dotyczącą eksperymentów w temperaturach wyższych niż temperatura pokojowa jest nagrzewanie się pochyłego podłoża: parowanie pożywki do hodowli komórkowej może mieć wpływ na detektor. Zamiast podgrzewać, całe urządzenie najlepiej umieścić w inkubatorze. Co więcej, metoda ogranicza się do przylegających linii komórkowych. Poprzez obracanie naczynia do hodowli komórkowej komórki wrażliwe na naprężenia ścinające mogą odłączyć się od naczynia, co może prowadzić do nieprawidłowych wyników.

Niemniej jednak, jeśli eksperymentator zwróci uwagę na te drobne wady, metoda dostarcza szybkich i wiarygodnych wyników do analizy zachowania kinetycznego przedklinicznych znaczników PET.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). Jesteśmy wdzięczni za wsparcie techniczne T. Zenz i A. Krcal. Ponadto dziękujemy K. Pallitschowi za przygotowanie AgOTf i H. Spreitzerowi za dystrybucję prekursora.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tabela 1: Wykaz materiałów i oprzyrządowania w pełni zautomatyzowanej radiosyntezy katalizatora [11C]SNAP-7941
NiShimadzu, Kioto, JaponiaSzimalilt Ni zredukowany, 80/100 mesh
JodMerck, Darmstadt, Niemcy1.04761.0100
AcetonitrylMerck, Darmstadt, Niemcydo syntezy DNA, < 10 ppm H2O
AcetonitrylSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Octan amonuHPLC Merck, Darmstadt, Niemcy
Kwas octowyMerck, Darmstadt, NiemcyLodowaty
Merck, Darmstadt, Niemcy96%
NaClB. Braun, Melsungen, Niemcy0,9%
Wodorotlenek tetrabutyloamonuSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone
MetanolSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Kartridż SPEWaters, Milford, MA, USASepPak C18plus
Półpreparatywna kolumna RP-HPLCMerck, Darmstadt, NiemcyChromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
KolumnawstępnaMerck, Darmstadt, NiemcyChromolith Guard RP-18e, 5-4,6 mm
PrekursorUniwersytet Wiedeński, AustriaKwas SNAP
Związek referencyjnyUniwersytet Wiedeński, AustriaSNAP-7941
Trifluorometanosulfonian srebraSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GCAlltech, Deerfield, IL, USA80/100 mesh
PET ślad 860 cyklotronGE Healthcare, Uppsala, Szwecja
[11C]CO2 wysokociśnieniowy celAir Liquide, Wiedeń, Austria
TRACERlabFX2 CGE Healthcare, Uppsala, Szwecja
N2 + 1% O2Air Liquide, Wiedeń, AustriaCelowy gaz
Nazwa<strong>FirmaNumer katalogowyUwagi
Tabela 2: Wykaz materiałów i oprzyrządowania kontroli jakości [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100Hitachi Vantara Austria GmbH (Wiedeń, Austria)Pompa HPLC
Merck Hitachi, L7400Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokio, Japonia)Detektor UV
NaI-radiodetektorRaytest (Straubenhardt, Niemcy)Radiodetektor NaI
Chromolith Performance RP-18e, 100-4,6 mmMerck (Darmstadt, Niemcy)Kolumna HPLC
430-GCBruker (Brema, Niemcy)Chromatograf gazowy
Kolumna kapilarna ID-BP20; 12 mx0,22 mmx0,25 mmSGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)Kapilara gazowa
Wesco, osmometr Vapro 5600Sanoya Medical Systems (Wiedeń, Austria)Osmometr
spektrometrg
Oprogramowanie sterujące chromatografią gazowąVARIAN (Palo Alto, Kalifornia, USA)Galaxie Wersja 1.9.302.952
Oprogramowanie sterujące spektrometrem gammaORTEC (Oak Ridge, Tenessee, USA)Maestro dla systemu Windows Wersja 6.06
Oprogramowanie do przywoływania widma gammaORTEC (Oak Ridge, Tenessee, USA)Winplots wersja 3.21
Oprogramowanie sterujące HPLCRaytest (Straubenhardt, Niemcy)Gina Star Wersja 5.9
inolab 740WTW (Weilheim, Niemcy)pH-metr
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tabela 3: Wykaz materiałów i oprzyrządowania do oceny zachowania kinetycznego w czasie rzeczywistym [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Holandia)Ekspresja ludzkiej glikoproteiny P (hMDR1)
Linia komórkowa Madin-Darby Canine Kidney (MDCKII-WT)Holenderski Instytut Raka (NKI, Amsterdam, Holandia)Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAXVWR International GmbH, Wiedeń, AustriaGibco 61965-026
Surowica cielęca płodu (FCS)VWR International GmbH, Wiedeń, AustriaGibco 10270-106
Penicylina/StreptomycynaVWR International GmbH, Wiedeń, AustriaGibco 15140
Naczynie do hodowli komórkowychGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, NiemcyCellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Eksperymenty
DMEM GlutaMAXVWR International GmbH, Wiedeń, AustriaGibco 61965-026
(±)-Chlorowodorek werapamiluSigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSOSigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)276855-100 mL
Naczynie do hodowli komórkowychGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, NiemcyCellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterylne jednorazowe pipety plastikoweVWR International GmbH, Wiedeń, AustriaSterilin, 5 ml – 25 mL
Sterylne końcówki do pipetVWR International GmbH, Wiedeń, AustriaEppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 &mikro; L – 200 i mikro; L
Kolby do hodowli komórkowychGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, NiemcyCellstar 250 mL, 75 cm2 czerwona nakrętka filtra, nr nr mfr.658175
Sterowanie LigandTracer Wersja 2.2.2Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Szwecja.
LigandTracer YellowRidgeview Instruments AB, Uppsala, Szwecja.
LigandTracer WhiteRidgeview Instruments AB, Uppsala, Szwecja.
GraphPad Prism 6.0Oprogramowanie GraphPad, Inc.
Ręczny automatyczny licznik komórekMillipore Corporation Billerica MA01821Scepter (Cat.No. PHC00000)
Czujniki licznika komórekMillipore Corporation Billerica MA01821Scepter Sensor 60 i mikro; m (Cat.No. PHCC60050)
klasy etanol klasy HPLC in vitro

Bibliografia

  1. Saito, Y., Maruyama, K. Identification of melanin-concentrating hormone receptor and its impact on drug discovery. Journal of Experimental Zoology. 305, 761-768 (2006).
  2. Philippe, C., et al. Preclinical in vitro & in vivo evaluation of [11C]SNAP-7941 - the first PET tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1. Nuclear Medicine and Biology. 40, 919-925 (2013).
  3. Philippe, C., et al. Radiosynthesis of [ 11C]SNAP-7941-the first PET-tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1 (MCHR1). Applied. Radiation and Isotopes. 70, 2287-2294 (2012).
  4. Philippe, C., et al. SNAPshots of the MCHR1 : a Comparison Between the PET-Tracers [ 18 F ] FE @ SNAP and [ 11 C ] SNAP-7941. Molecular Imaging Biology. , 1-12 (2018).
  5. Schirmer, E., et al. Syntheses of precursors and reference compounds of the melanin- concentrating hormone receptor 1 (MCHR1) Tracers [11C]SNAP-7941 and [18F]FE@SNAP for positron emission tomography. Molecules. 18, 12119-12143 (2013).
  6. Miller, P. W., Long, N. J., Vilar, R., Gee, A. D. Synthese von 11C-, 18F-, 15O- und 13N-Radiotracern für die Positronenemissionstomographie. Angewandte Chemie. 120, 9136-9172 (2008).
  7. Pichler, V., et al. An overview on PET radiochemistry: part 1 - covalent labels - 18 F, 11 C, and 13 N. Journal of Nuclear Medicine. 59, 1350-1354 (2018).
  8. Pichler, V., et al. Molar activity - The keystone in 11C-radiochemistry: An explorative study using the gas phase method. Nuclear Medicine and Biology. 67, 21-26 (2018).
  9. Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane. Applied Radiation and Isotopes. 48, 153-157 (1997).
  10. Dahl, K., Halldin, C., Schou, M. New methodologies for the preparation of carbon-11 labeled radiopharmaceuticals. Clinical and Translational Imaging. 5, 275-289 (2017).
  11. Raaphorst, R. M., et al. Radiopharmaceuticals for assessing ABC transporters at the blood-brain barrier. Clinical. Pharmacollogy & Therapeutics. 97, 362-371 (2015).
  12. Nics, L., et al. Speed matters to raise molar radioactivity: Fast HPLC shortens the quality control of C-11 PET-tracers. Nuclear Medicine and Biology. 57, 28-33 (2018).
  13. Zeilinger, M., et al. New approaches for the reliable in vitro assessment of binding affinity based on high-resolution real-time data acquisition of radioligand-receptor binding kinetics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (Research). 7, 22(2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Radiomarkowanie w glowem 11automatyczna radiosyntezareceptor hormonu koncentruj cego melaninekspresja P glikoproteinyanaliza RP HPLCobliczanie aktywno ci w a ciwejtest akumulacji kom rkowejblokowanie werapamilemzasada ALARA
Techniczny aspekt automatycznej syntezy i oceny kinetycznej w czasie rzeczywistym [11C]SNAP-7941
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.