Techniczny aspekt automatycznej syntezy i oceny kinetycznej w czasie rzeczywistym [11C]SNAP-7941

Podsumowanie

Tutaj reprezentujemy protokół do w pełni zautomatyzowanego znakowania radioaktywnego [¹¹C]SNAP-7941 i analizy kinetyki w czasie rzeczywistym tego znacznika PET na komórkach wykazujących ekspresję i nieeksprymujących P-gp.

Streszczenie

Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) jest podstawową techniką obrazowania molekularnego, dostarczającą wglądu w szlaki i wykorzystującą specyficzne radioligandy do badań in vivo. W ramach tego protokołu opisano solidną i niezawodną, zdalnie sterowaną radiosyntezę [¹¹C]SNAP-7941, antagonisty receptora hormonu koncentrującego melaninę 1. Radiosynteza rozpoczyna się od cyklotronu wytworzonego przez [¹¹C]CO₂ , który jest następnie dalej reagowany poprzez przejście w fazie gazowej do [¹¹C]CH₃OTf. Następnie ten reaktywny produkt pośredni jest wprowadzany do roztworu prekursora i tworzy odpowiedni radioznacznik. Czystość chemiczną i radiochemiczną określa się za pomocą RP-HPLC, rutynowo wdrażanej w procesie kontroli jakości radiofarmaceutyków. Dodatkowo obliczana jest aktywność molowa, ponieważ jest ona niezbędna do następujących badań kinetycznych w czasie rzeczywistym. Ponadto [¹¹C] SNAP-7941 stosuje się do komórek MDCKII-WT i MDCKII-hMDR1 w celu oceny wpływu ekspresji glikoproteiny P (P-gp) na akumulację komórek. Z tego powodu linia komórkowa z ekspresją P-gp (MDCKII-hMDR1) jest stosowana bez lub z blokadą przed eksperymentami za pomocą substratu P-gp (±)-werapamilu, a wyniki są porównywane z wynikami obserwowanymi dla komórek typu dzikiego. Ogólne podejście eksperymentalne pokazuje, jak ważne jest precyzyjne zarządzanie czasem, które jest niezbędne w każdym badaniu przedklinicznym i klinicznym z wykorzystaniem znaczników PET znakowanych radioaktywnie krótkożyciowymi nuklidami, takimi jak węgiel-11 (okres półtrwania: 20 min).

Wprowadzenie

[¹¹C]SNAP-7941 został opracowany jako pierwszy znacznik pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) ukierunkowany na receptor hormonu koncentracji melaniny 1 (MCHR1) - receptor głównie zaangażowany w centralną regulację apetytu i przyjmowania pokarmu¹. Oznaczenie węglem-11 SNAP-7941, dobrze scharakteryzowanego antagonisty MCHR1, dało autentyczny znacznik PET^2,3,4,5. Jednak w pełni zautomatyzowana radiosynteza jest bardzo trudna pod względem skuteczności czasowej i odtwarzalności, ponieważ krótkożyciowy radionuklid węgiel-11 oferuje okres półtrwania wynoszący 20 min⁶. Całkowity czas syntezy powinien być ograniczony do minimum i z reguły nie powinien przekraczać 2-3 okresów półtrwania (tj. około 40-60 minut dla węgla-11)⁷. W szczególności procedury syntezy radioznaczników ukierunkowanych na systemy receptorowe o niskiej gęstości ekspresji muszą być znacznie zoptymalizowane, aby uzyskać wystarczającą wydajność, a co za tym idzie wysoką aktywność molową⁸. Strategia syntezy często następuje po produkcji radionuklidów w cyklotronie i uwolnieniu [¹¹C]CO₂ do syntezatora. Tam [¹¹C]CO₂ jest najpierw redukowany do [¹¹C]CH₄, a następnie reagowany z jodem, aby uzyskać [¹¹C]CH₃I metodą fazy gazowej^9,10. Dalsza obróbka triflatem srebra daje [¹¹C]_CH3OTf bezpośrednio on-line. Następnie ten reaktywny produkt pośredni znakowany węglem-11 wprowadza się do roztworu zawierającego cząsteczkę prekursora. Zautomatyzowana radiosynteza obejmuje dodatkowo proces oczyszczania za pomocą półpreparatywnego RP-HPLC, a następnie formułowanie produktu odpowiedniego do badań przedklinicznych i klinicznych.

Niezależnie od okresu półtrwania radionuklidu i czasu potrzebnego na radiosyntezę, farmakokinetyka radiofarmaceutyku jest najbardziej krytycznym elementem do oceny podczas opracowywania znacznika PET. Jeśli chodzi o neuroobrazowanie, głównym warunkiem wstępnym jest wejście do mózgu znacznika PET. Jednak bariera krew-mózg (BBB), "granica bezpieczeństwa" mózgu, wykazuje wysoką ekspresję transporterów wypływu, które mogą rozładowywać małe cząsteczki (np. znaczniki PET) i skutecznie utrudniać ich zastosowanie.

Ogromnym mankamentem podczas oceny przedklinicznej są nieoczekiwane interakcje z tymi transporterami wypływu, które często nie są rozpoznawane w eksperymentach in vitro i prowadzą do niepowodzenia znacznika PET in vivo, jak zaobserwowano dla [¹¹C]SNAP-7941. Obrazowanie μPET u szczurów wykazało niską akumulację w mózgu, która znacznie wzrosła po podaniu inhibitora P-gp tariquidar¹¹. Dane te sugerowały, że [¹¹C]SNAP-7941 jest substratem tego systemu transportera wypływu, utrudniającym wiązanie liganda z centralnym MCHR1. Niestety, nadal brakuje odpowiednich modeli in vitro umożliwiających przewidywanie penetracji BBB we wczesnym etapie rozwoju znacznika.

Tutaj opisujemy automatyczną syntezę [¹¹C]SNAP-7941 przy użyciu syntezatora do metylacji węgla-11. Nacisk kładziony jest na przedstawienie przeglądu tego, jak zorganizować kolejne podejście eksperymentalne, w tym automatyczną syntezę, kontrolę jakości, a także sukcesywną ocenę in vitro z bardzo krótkożyciowym nuklidem węgla-11.

Po pierwsze, opisane są kluczowe kroki do udanej radiosyntezy przy minimalnym nakładzie czasu i maksymalnej wydajności. Następnie ustalana jest wiarygodna procedura kontroli jakości, dzięki której radioznacznik jest dostępny do potencjalnych badań klinicznych i spełnia kryteria Farmakopei Europejskiej¹². Kwantyfikacja stężenia molowego i obliczenie odpowiedniej aktywności molowej jest podstawowym wymogiem dla kolejnych pomiarów kinetycznych.

Na koniec, przedstawiono nową i prostą metodę in vitro oceniającą interakcje [¹¹C]SNAP-7941 z transporterem wypływu, P-gp (hMDR1). Proponowany model kinetyczny wykorzystuje łatwe w obsłudze urządzenie, które umożliwia natychmiastową interpretację danych i wymaga minimalnego wysiłku związanego z hodowlą komórkową¹³.

Protokół

UWAGA: W poniższym protokole znajduje się wiele etapów, które wymagają obsługi i manipulacji radioaktywnością. Ważne jest, aby każdy krok był zgodny z Departamentem Bezpieczeństwa Radiologicznego instytutu i odpowiednim ustawodawstwem krajowym. Obowiązkowe jest zminimalizowanie narażenia na promieniowanie jonizujące dla zaangażowanych operatorów zgodnie z zasadą ALARA ("Tak niskie, jak rozsądnie osiągalne").

1. Zarządzanie czasem i planowanie eksperymentu

UWAGA: Krótki okres połowicznego rozpadu węgla-11 wymaga dokładnego zarządzania czasem, aby zminimalizować utratę radioaktywności (Rysunek 1). Ważne jest, aby każda zaangażowana osoba znała swój obszar odpowiedzialności i punkt czasowy danego działania. Do przeprowadzenia eksperymentu kinetycznego w czasie rzeczywistym [¹¹C]SNAP-7941, do sprawnego przebiegu procesu potrzebne są około cztery osoby.

1. Zorganizuj producenta dla [¹¹C]SNAP-7941.
2. Poinformuj operatora kontroli jakości przeprowadzającego ocenę specyfikacji, obliczanie stężenia masowego i aktywności molowej w czasie rozpoczęcia syntezy.
3. Trzymaj eksperymentator kinetyczny w czasie rzeczywistym w gotowości do obliczenia rozcieńczenia i przeprowadzenia eksperymentu.
4. Poinstruuj biegacza, aby przeniósł radioaktywność do odpowiedniego miejsca w odpowiednim punkcie czasowym.

2. Automatyczna synteza [¹¹C]SNAP-7941 do użytku przedklinicznego

1. Przygotowanie syntezatora (rysunek 2).
   1. Włącz syntezator, wymagane gazy techniczne (hel i wodór) oraz oprogramowanie sterujące syntezatorem Tracerlab. Wybierz odpowiedni skok sekwencji syntezy.
   2. Przemyć V1-V3 raz wodą i dwukrotnie acetonem przez reaktor i zawór HPLC przy obciążeniu lub w pozycji wtrysku do butelki na odpady z pętlą.
   3. Osuszyć wszystkie powiązane przewody do i z reaktora przez zawór wtryskowy przy ciągłym przepływie helu aktywowanym przez V18.
   4. Ogrzewać pułapkę [¹¹C]_CH3I oraz pułapkę [¹¹C]CH3 OTf podstrumieniem helu o stężeniu 100 ml·^min-1 do 200 °C przez V24, V25, V29, V15, V9, V17 i V32/V33 z odłączonym dławikiem.
   5. Sprawdź tę samą ścieżkę pod kątem wycieków (z podłączonym reaktorem) przy przepływie helu 100 ml·^min-1. Szczelność jest gwarantowana, gdy przepływ spadnie poniżej 4 ml·^min-1.
   6. Włączyć pompę HPLC (5-10 ml·^min-1) i umyć przewody HPLC i zawór wtryskowy acetonitrylem/wodą (50/50, v/v), a także przewody HPLC rozpuszczalnikiem HPLC przez V14 do bańki.
   7. Opróżnij żarówkę przez V11 i V12 do butelki na odpady ze strumieniem helu przez V19. Ponownie umyć odpowiednie przewody wodą z V6 przez V11 i V12 strumieniem helu przez V18.
   8. Przemyć V5 etanolem i V4 wodą przez V11 i V12 do fiolki do pobierania produktu (PCV) za pomocą strumienia helu przez V18, a następnie opróżnić PCV przez V13 do butelki na odpady ze strumieniem helu przez V20.
   9. Wyłączyć pompę HPLC, przełączyć na rozpuszczalnik do syntezy ((wodny roztwór octanu amonu (2,5 g·^L-1)/kwas octowy 97,5/2,5 v/v; pH 3,5)/acetonitryl 75/25 v/v), dołączyć półpreparatywną kolumnę HPLC i zrównoważyć kolumnę (przepływ 5 ml·^min-1).
   10. Uzupełnij odczynniki do syntezy i oczyszczania: 1,5 ml wody (V2), 4,5 ml 0,9% NaCl (V4), 0,5 ml 96% etanolu (V5), 10 ml wody (V6) i 90 ml wody (bańka).
   11. Dołączyć nową fiolkę z odpadami pętelkowymi; fiolkę z produktem (oznakowaną i wyposażoną w igłę napowietrzającą) do V13 i ciekłego azotu.
   12. Przygotuj wkład SPE (ekstrakcja do fazy stałej) z 10 ml 96% etanolu i 20 ml wody i podłącz go między V11 a V12.
   13. Rozpocznij sekwencję wstępną na 20 minut przed rozpoczęciem syntezy, składającą się z podgrzania pułapki [¹¹C]CO₂ do temperatury 400 °C i przepłukania pułapki strumieniem helu o stężeniu 50 ml·^min-1 przez V27 (2 min). Następnie wstępnie przepłukać pułapkę [¹¹C] CO₂ przez 3 minuty wodorem gazowym (120 ml ·^min-1) i na koniec schłodzić do temperatury poniżej 40 °C.
   14. Rozpuścić 1 mg prekursora w 400 μl acetonitrylu (do syntezy DNA < 10 H₂O), przenieść roztwór do reakcji i dodać 5,5 μl TBAH (264 mg·^mL-1 w metanolu). Przymocuj reaktor do odpowiedniej pozycji.
   15. Zamknij gorącą komórkę i włącz podciśnienie gorącej komórki.
   16. Potwierdzić rozpoczęcie procesu chłodzenia pułapki CH₄ ciekłym azotem do temperatury -75 °C.
   17. Uwolnij radioaktywność, gdy temperatura zostanie osiągnięta.
2. Cyklotronowa produkcja [¹¹C]CO₂
   UWAGA: Kroki 2.2.1-2.2.4 są prowadzone równolegle z przygotowaniem modułu radiosyntezy (patrz również Rysunek 1).
   1. Włącz magnes cyklotronu.
   2. Wybierz cel ¹¹C-CO₂ i uruchom wiązkę 65 μA.
   3. Potwierdzić rozpoczęcie naświetlania, naciskając przycisk Rozpocznij naświetlanie
   4. Zatrzymaj wiązkę i potwierdź uwolnienie radioaktywności do syntezatora, naciskając przycisk Dostarczanie, po osiągnięciu pożądanej ilości radioaktywności (ok. 120 GBq po 30 minutach).
3. Przeprowadzenie w pełni zautomatyzowanej radiosyntezy
   1. Potwierdzić, że system jest gotowy do przyjęcia radioaktywności i rozpocząć zautomatyzowany proces
   2. Monitorowanie następującego zautomatyzowanego procesu.
      1. Sprawdzić, czy [¹¹C]CO₂ jest automatycznie przenoszony z cyklotronu do jednostki syntezy przez V26 (ok. 4 min) i czy [¹¹C]CO₂ jest uwięziony na sicie molekularnym nasączonym niklem jako katalizatorem (pułapka [¹¹C]CO₂) w temperaturze pokojowej.
      2. Śledź, czy pułapka [¹¹C]CO₂ jest automatycznie przepłukiwana najpierw helem (50 ml ·^min-1), a następnie wodorem gazowym (120 ml ·^min-1). Następnie należy zaobserwować, że V27 i V25 są zamknięte, a uwięziony [¹¹C]CO₂ wraz z wodorem gazowym jest podgrzewany do 400 °C, a powstały [¹¹C]CH₄ jest dalej transportowany do wstępnie schłodzonego [¹¹C]_CH4 i tam uwięziony.
      3. Monitorować, czy V10 jest zamknięty, V9 otwarty (w kierunku kolumny jodu) i [¹¹C]CH₄ jest ponownie uwalniany poprzez powolne podgrzewanie pułapki [¹¹C]CH₄ do 80 °C i transportowany do jednostki cyrkulacyjnej ze strumieniem helu przez V10 (wyjście spalin). I dalej sprawdź, czy [¹¹C]CH₄ jest przekształcany w [¹¹C]CH₃I w jednostce cyrkulacyjnej, co trwa ok. 3 min, a uformowany [¹¹C]CH₃I jest stale uwięziony w pułapce [¹¹C]CH₃I.
      4. Upewnij się, że zawór wydechowy V16 jest otwarty, a syfon [¹¹C]CH₃I jest podgrzany do 90 °C strumieniem helu (20 ml·^min-1) przez V24. W ten sposób ewentualne produkty uboczne są usuwane, a następnie V16 jest zamykany.
   3. Upewnij się, że [¹¹C]CH₃I jest gotowy do uwolnienia do reaktora.
   4. Monitoruj następujący zautomatyzowany proces: Sprawdź, czy pułapka [¹¹C]_CH3I jest podgrzewana do 190 °C, a uformowana [¹¹C]CH3I jest uwalniana do reaktora przez pułapkę [¹¹C]_CH3OTf (V32 i V33, nadal w temperaturze 200 °C), V7 i V8 pod ciągłym strumieniem helu (10-25 ml·^min-1, V24). Podczas tego procesu V21 i V23 (wyjście spalinowe) muszą być otwarte.
   5. Potwierdź, że radioaktywność dotarła do reaktora, gdy ilość radioaktywności w reaktorze przestanie rosnąć.
   6. Monitorowanie następującego zautomatyzowanego procesu i przygotowanie do ręcznej interwencji, jeśli to konieczne
      1. Sprawdź, czy V23, V21 i V8 są automatycznie zamykane, a mieszanina reakcyjna jest podgrzewana do 75 °C. Po 3 minutach należy obserwować, czy reaktor jest chłodzony ciekłym azotem, aż temperatura spadnie poniżej 35 °C. Następnie upewnij się, że mieszanina reakcyjna jest schładzona 1,5 ml wody przez V2. Podczas tego procesu V21 i V23 (wyjście spalinowe) muszą być otwarte.
      2. Śledzić, czy V21 i V23 są zamknięte, a mieszanina reakcyjna jest przenoszona do zaworu iniekcyjnego HPLC, przechodząc przez detektor płynu do pętli HPLC (5 ml). Śledź, czy mieszanina reakcyjna jest automatycznie wstrzykiwana do kolumny HPLC.
   7. Obserwować chromatogram i ręcznie odciąć pik produktu za pomocą przycisku Peak start. Naciśnij koniec szczytu, gdy sygnał szczytowy produktu spadnie poniżej około 400 cps po czasie retencji około 8-10 minut (przepływ: 5 ml · ^min-1, Rysunek 3).
   8. Włącz dodatkowy strumień helu, aby przyspieszyć opróżnianie żarówki.
   9. Monitoruj, czy żarówka się opróżnia i obserwuj butelkę na odpady: Sprawdź, czy żarówka została opróżniona za pomocą V11, wkładu SPE i V12 do odpływu za pomocą strumienia helu przez V19 i dodatkowego przewodu helowego oraz czy produkt pozostaje na kartridżu SPE.
   10. Upewnij się, że żarówka jest całkowicie pusta.
   11. Monitorowanie zautomatyzowanego procesu oczyszczania SPE i transferu produktu
       1. Sprawdź, czy wkład SPE został przemyty 10 ml wody przez V6, V11 i V12 do odpadu i czy etanol uwalnia produkt do PCV przez V5, V11 i V12. Na koniec należy obserwować, czy 0,9% NaCl jest dodawane do PCV przez V4, V11 i V12 w celu rozcieńczenia produktu.
       2. Upewnić się, że roztwór produktu jest przenoszony przez V13 i sterylny filtr do fiolki z produktem końcowym ze strumieniem helu przez V20.
   12. Upewnij się, że produkt został całkowicie przeniesiony.

3. Kontrola jakości (QC)

UWAGA: Kontrola jakości radiofarmaceutyków obejmuje pomiar następujących parametrów:

• Czystość radiochemiczna i aktywność molowa (RP-HPLC)
• Pozostałości rozpuszczalników (chromatografia gazowa, GC)
• Osmolalność (osmometr ciśnienia pary)
• pH (pH-metr)
• γ widmo/czystość radionuklidów (spektrometr γ)
• Okres półtrwania/czystość radionuklidów (kalibrator dawki)

Wszystkie parametry fizykochemiczne są określane przed wydaniem produktu i muszą mieścić się w zdefiniowanym zakresie parametrów jakości.

1. Przygotowanie sprzętu do kontroli jakości
   1. Przygotowanie należy rozpocząć 30 minut przed zakończeniem syntezy.
   2. Przygotować stożkową fiolkę w osłoniętym pojemniku i osłoniętą strzykawkę o pojemności 1 ml z dołączoną igłą.
   3. Przygotować referencyjny roztwór wzorcowy SNAP-7941 (10 μg·^mL-1) w wodzie do HPLC.
   4. Włączyć pH-metr, chromatograf gazowy i używane gazy, osmometr i wszystkie elementy HPLC.
   5. Włącz oprogramowanie sterujące HPLC i wybierz dedykowaną kolumnę oraz odpowiednią metodę dla [¹¹C]SNAP-7941 (faza ruchoma: (woda/kwas octowy 97,5 / 2,5 v / v; 2,5 ^g.L-1 octan amonu; pH 3,5) / acetonitryl 70/30 v / v; przepływ: 1 ml · ^min-1) i napisz listę próbek z dwoma pomiarami (wzorzec i produkt). Uruchom metodę kondycjonowania kolumny.
   6. Po 10 minutach kondycjonowania wstrzyknąć 20 μl roztworu referencyjnego SNAP-7941 za pomocą strzykawki Hamiltona i rozpocząć analizę.
   7. Po wstrzyknięciu umyć strzykawkę Hamilton dwa razy acetonitrylem i wodą.
   8. Uruchom oprogramowanie sterujące GC i napisz przykładową listę.
2. Przeprowadzanie kontroli jakości
   1. Zmierzyć bezwzględną wydajność promieniotwórczą produktu po zakończeniu syntezy i przenieść 100 μl produktu do fiolki reakcyjnej za pomocą przygotowanej strzykawki z ekranem ołowiowym w celu kontroli jakości.
      UWAGA: Wszystkie dane uzyskane z kontroli jakości muszą być udokumentowane zgodnie z przepisami krajowymi.
   2. Analityczna HPLC: Zmierzyć czystość radiochemiczną i czystość chemiczną oraz niezwłocznie poinformować osobę odpowiedzialną za eksperymenty z hodowlą komórkową o wynikach.
      1. Pobrać 40 μl próbki kontroli jakości i wstrzyknąć do HPLC. Rozpocznij bieg, przesuwając ramię zaworu wtryskowego z obciążenia do wtrysku (Rysunek 3).
         UWAGA: Podczas biegu (8 min) można wykonać inne pomiary protokołu, aby uniknąć jak największego zaniku.
      2. Otwórz chromatogram i zintegruj wszystkie piki w kanale promieniotwórczej. Porównaj czas retencji produktu (5,0-7,0 min) z czasem retencji wzorca odniesienia. Porównaj obszar pod krzywą w procentach wszystkich zintegrowanych pików. Pik produktu musi wynosić więcej niż 95% (czystość radiochemiczna) wszystkich zintegrowanych obszarów (kanał radiowy).
      3. Zintegruj sygnał w kanale UV, aby określić czystość chemiczną. Głównym zanieczyszczeniem jest zwykle prekursor kwasu SNAP po 2,8-3,5 min. Stężenie [^natC]SNAP-7941 oblicza się na podstawie krzywej kalibracyjnej po całkowaniu. Obliczyć stężenie SNAP-7941 w μmol·^mL-1 i określić aktywność molową za pomocą następującego równania:
         
   3. W przypadku chromatografii gazowej przenieść 20 μl próbki kontroli jakości do specjalnej szklanej fiolki. Umieść go w podajniku próbek i rozpocznij pomiar. Po zakończeniu pomiaru otwórz chromatogram i zapisz liczbę automatycznie zintegrowanych pików. Próbka nie powinna zawierać więcej niż 410 ppm acetonitrylu i 10% etanolu.
   4. Osmolalność: Umieść papierowy krążek z próbką na dedykowanym wgłębieniu i nałóż 10 μl próbki. Naciśnij przycisk Zamknij, aby zmierzyć osmolalność. Po 3 minutach urządzenie wyświetla osmolaliczność, która musi mieścić się w zakresie 190-500 m·^kg-1.
   5. pH: Umyj elektrodę wodą. Zmierz pH, umieszczając elektrodę w próbce. pH musi mieścić się w zakresie 5,0-8,5. Po pomiarze ponownie umyj elektrodę i umieść ją w referencyjnym roztworze pH.
   6. γ-spektrum: Umieść próbkę QC w spektrometrze γ, otwórz oprogramowanie sterujące i rozpocznij pomiar. Przerwij pomiar i zapisz zmierzoną energię, która musi wynosić 511 keV (zakres 420-520 keV). Otwórz menu pliku i zabezpiecz plik odpowiednim numerem partii. Przywołaj zapisane widmo w dedykowanym oprogramowaniu i wydrukuj widmo.
   7. Okres półtrwania: Zmierz dwukrotnie aktywność próbki kontroli jakości za pomocą kalibratora dawki. Zapisz odpowiednie czasy i oblicz okres półtrwania wykładniczego.
3. zwolnić
   1. Po przetestowaniu wszystkich parametrów i uzyskaniu wyników zgodnych z wytycznymi władz austriackich, należy zwolnić radioznacznik. Operator musi podpisać poprawność danych.

4. Ocena interakcji w stosunku do transportera P-gp

1. Hodowla komórkowa
   1. Uruchom laminarny przepływ powietrza (LAF) stołu warsztatowego i wyczyść stół co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem pracy.
   2. Wymieszać pożywkę do hodowli komórkowych w sterylnych warunkach w LAF z 10% FCS (50 ml) i 0,5% antybiotyków (2,5 ml) za pomocą sterylnej pipety miarowej przy użyciu automatycznego przyrządu do pipetowania.
   3. Rozmrozić komórki MDCKII-hMDR1 i MDCKII-WT i hodować w kolbie do hodowli komórek T75 lub T175 10-14 dni przed eksperymentami w warunkach aseptycznych (LAF).
   4. Zmień pożywkę następnego dnia, aby usunąć wszystkie nieprzylegające i apoptotyczne komórki.
   5. Co trzy dni wymieniać pożywkę na świeżą (odpowiednio 12 ml dla T75 i 23 ml dla kolby do hodowli komórkowych T175).
   6. Podziel komórki zgodnie z harmonogramem eksperymentów na świeże kolby lub na szalki do hodowli komórkowych po zbiegu 80%, aby uniknąć wzrostu dwuwarstwowego.
2. Przygotowanie komórek do eksperymentów
   1. Podziel komórki na dwa dni przed eksperymentami i wysiewaj w stężeniu 2,5 x 10⁵ komórek na 2 ml w ukośnej płaszczyźnie szalki do hodowli komórkowej (Ryc. 4). Za pomocą automatycznego licznika komórek lub komory liczącej Neubauera należy policzyć komórki i obliczyć odpowiedni współczynnik podziału.
   2. Usuń pożywkę na dzień przed eksperymentami, umyj komórki na szalce hodowlanej 4 ml DPBS i dodaj świeże 5 ml pożywki do hodowli komórkowych. Umieść naczynie poziomo w inkubatorze.
   3. Przemyć komórki DPBS co najmniej 0,5 godziny przed eksperymentami i zastąpić 2 ml wolnego podłoża FBS. Zbadaj konfluencję i morfologię komórek pod mikroskopem.
3. Przeprowadzanie eksperymentów w trzech różnych konfiguracjach.
   1. Użyć szalki Petriego do eksperymentów opisanych w ppkt 4.2.3.
   2. Traktuj komórki przez 0,5 godziny przed eksperymentami chlorowodorkiem 10 μM (±)-werapamilu.
   3. Dodać 0,98 μl roztworu podstawowego werapamilu (20,4 mM (±)-chlorowodorku werapamilu w DMSO). Ostateczna zawartość DMSO wynosi ≤0,05% podczas zabiegu.
   4. Inkubować komórki przez 0,5 godziny za pomocą układu kontrolnego (DMSO). Użyj tej samej objętości, która jest używana w leczeniu farmakologicznym.
4. Eksperymenty testu w czasie rzeczywistym (dla wszystkich trzech konfiguracji)
   1. Włącz urządzenie, komputer i upewnij się, że są prawidłowo podłączone, a następnie otwórz oprogramowanie sterujące.
   2. Wybierz opcję Jeden cel, odblokuj szablon i dostosuj następujące ustawienie:
      Liczba pozycji: 2 (dwa)
      Czas wykrywania (s): 3 (trzy)
      Czas opóźnienia detekcji (s): 2 (dwa)
      Nazwa pierwszego etapu: poziom bazowy
   3. Włóż naczynie do hodowli komórkowych do pochyłego wspornika urządzenia, upewniając się, że biegun komórek znajduje się na spodzie i jest pokryty pożywką do hodowli komórkowych.
   4. Rozpocznij bieg za pomocą przycisku Start. System prosi o zapisanie pliku. Wybierz nazwę pliku i ścieżkę zapisu. Pojawia się centrum sterowania i rozpoczyna się pomiar bazowy (podpora szalki do hodowli komórkowej zaczyna się obracać).
   5. Wybierz w obszarze Inne opcje:
      Skala czasu: minuty
      Korekcja nuklidów: węgiel-11
   6. Zaznacz wszystkie pola w obszarze Krzywe na wykresie (tło (czerwone), cel (niebieski) i cel minus tło (czarne)).
   7. Uzyskać parametry kontroli jakości: aktywność molową [GBq.μmol-1] i stężenie aktywności [^MBq.mL-1] na końcu syntezy.
   8. Obliczyć odpowiednią objętość znacznika dla 15 nM [^natC]SNAP-7941 w objętości testu 2 mL.
      
      
   9. Przygotować pipetę do odpowiedniej objętości i porcji produktu [¹¹C]SNAP-7941 w osłonie ołowianej.
   10. Kliknij Wstrzymaj uruchamianie w oknie centrum sterowania. Poczekaj, aż obrót anteny się zatrzyma i pojawi się pasek boczny z tytułem Pauza i następna faza.
   11. Otwórz pokrywę urządzenia kinetycznego działającego w czasie rzeczywistym. Obróć wspornik naczynia hodowlanego o 90° w lewo. Dodaj obliczoną objętość znacznika i wróć do pozycji wyjściowej. Następnie zamknij pokrywę urządzenia. Natychmiast naciśnij przycisk Kontynuuj, aby rozpocząć eksperyment.
   12. Zakończ eksperyment po 20 minutach, wybierając opcję pauza, a następnie zakończ przebieg (naciśnij Zakończ przebieg na pasku bocznym).
5. Analiza i przetwarzanie danych za pomocą oprogramowania statystycznego
   1. Otwórz oprogramowanie sterujące w czasie rzeczywistym. Kliknij Otwórz pliki, aby przypomnieć sobie wymaganą kinetykę. Kinetyka jest zilustrowana w oknie centrum sterowania.
   2. Wybierz opcję, klikając prawym przyciskiem myszy bezpośrednio na kinetyce Eksportuj krzywe. Zapisz plik tekstowy zawierający nieprzetworzone dane. Otwórz program statystyczny i wklej plik nieprzetworzonych danych z eksperymentów w czasie rzeczywistym.
   3. Zacznij od czasu (oś x) od dodania radioznacznika (z wyłączeniem pomiaru tła) i znormalizuj do procentu sygnału maksymalnego CPS (zliczenia na sekundę).
   4. Załaduj wszystkie znormalizowane dane do nowego pliku GraphPad Prism.
   5. Oblicz wartości średnie i odchylenie standardowe.
   6. Zilustruj uzyskane dane w postaci wykresu przedstawiającego odchylenie (tempo wzrostu) wychwytu znacznika we wszystkich trzech zestawach.

Wyniki

W pełni zautomatyzowana radiosynteza [¹¹C]SNAP-7941 dała 5,7 ± 2,5 GBq (4,6 ± 2,0% przy EOB, 14,9 ± 5,9% w oparciu o [¹¹C]CH₃OTf; n = 10) sformułowanego produktu. Cała synteza trwała około 40 minut, z czego 15 minut było potrzebnych do przygotowania [¹¹C]_CH3OTf metodą fazy gazowej, kolejne 5 minut było potrzebne do znakowania radioizotopem prekursora, następnie 10 minut półpreparatywnego oczyszczania RP-HPLC i 10 minut do ekstrakcji i formulacji wkładu C18. Następnie niewielka porcja (ok. 100-200 μL) została dostarczona do osoby odpowiedzialnej za kontrolę jakości, natomiast oryginalna fiolka z produktem zawierająca gotowy do użycia znacznik została przekazana eksperymentatorowi analizy kinetycznej w czasie rzeczywistym.

Kontrola jakości została zakończona w ciągu 10 minut po zakończeniu syntezy. Aktywność molowa mieściła się w zakresie od 72 ± 41 GBq/μmol (n = 10), a czystość radiochemiczna zawsze wynosiła > 95%. Wszystkie pozostałe parametry (pH, osmolaliczność, pozostałości rozpuszczalników) spełniały kryteria zwolnienia. Do testu kinetycznego w czasie rzeczywistym wybrano trzy różne konfiguracje eksperymentalne: (A) leczone i nietraktowane (nośnik) komórki MDCKII-WT, (B) nietraktowane lub traktowane komórkami nośnika MDCKII-hMDR1 oraz (C) ostatnia linia komórkowa z blokowaniem przed testem kinetycznym transportera w czasie rzeczywistym przy użyciu (±)-werapamilu. Zastosowanie [¹¹C] SNAP-7941 do linii komórkowej typu dzikiego MDCKII-WT (P-gp bez ekspresji) i MDCKII-hMDR1 (ekspresja P-gp) wykazuje inne zachowanie kinetyczne, ponieważ następuje szybka akumulacja do linii komórkowej typu dzikiego, podczas gdy nie zaobserwowano akumulacji dla komórek MDCKII-hMDR1. Jednak zablokowanie transportera wypływu P-gp w komórkach MDCKII-hMDR1 za pomocą (±)-werapamilu doprowadziło do porównywalnej kinetyki w czasie rzeczywistym, jak to już zaobserwowano dla linii komórkowej typu dzikiego (Figura 5).

Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy. Przebieg pracy radiosyntezy, kontrola jakości i wydajność pomiaru kinetycznego w czasie rzeczywistym [¹¹C]SNAP-7941. Czarne strzałki wskazują drogę transportu promieniotwórczości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat radiosyntezy automatycznego syntezatora. Obwód przełączający automatycznego syntezatora, rozpoczynający się od jednostki cyrkulacyjnej do produkcji [¹¹C]CH₃I/[¹¹C]CH₃OTf, reaktora do wprowadzania aktywności do roztworu prekursora i oczyszczania SPE (SPE = ekstrakcja do fazy stałej; PCV = fiolka do pobierania produktów). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne chromatogramy w pełni zautomatyzowanej radiosyntezy [¹¹C]SNAP-7841. Półpreparatywny chromatogram RP-HPLC jest zilustrowany na górze, a chromatogram analityczny po oczyszczeniu na dole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przygotowanie naczynia do hodowli komórkowej do eksperymentów w czasie rzeczywistym. Krok 1 obejmuje wysiew od 2,5 x 10⁵ do 1 x 10⁶ w zależności od typu komórek i ich tempa wzrostu. Następnie naczynie hodowlane umieszcza się w płaszczyźnie ukośnej (około 30-45°). W związku z tym w inkubatorze można użyć dostarczonego metalowego aparatu lub pokrywy naczynia do hodowli komórkowych w celu ustabilizowania pochyłej pozycji naczynia. Następnego dnia (24 h) naczynie ustawia się poziomo i dodaje świeżą pożywkę do hodowli komórkowych, aby całkowicie pokryć powierzchnię komórek. W dniu eksperymentu badana jest żywotność i konfluencja komórek. Zgodnie z protokołem eksperymentalnym, komórki przemywa się DPBS, pożywkę zastępuje się pożywką wolną od surowicy (2 ml), a naczynie hodowlane ustawia się w pozycji ukośnej do czasu rozpoczęcia eksperymentów. Odtąd komórki mogą być leczone inhibitorem lub nośnikiem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Pomiary kinetyczne w czasie rzeczywistym [¹¹C]SNAP-7941. Reprezentatywna kinetyka w czasie rzeczywistym [¹¹C]SNAP-7941 jest pokazana w trzech różnych konfiguracjach: przy użyciu ogniw MDCKII-WT; Komórki MDCKII-hMDR1 wstępnie zablokowane (±)-werapamilem jako inhibitorem P-gp i komórkami MDCKII-hMDR1 bez blokady. Oś y ilustruje tempo wzrostu wstępnie zablokowanych komórek MDCKII-hMDR1 i WT w porównaniu z wynikami odpowiednio komórek MDCKII-MDR1 nieleczonych lub traktowanych nośnikiem (brak wychwytu, 0%). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Radiosynteza [¹¹C]SNAP-7941 została ustanowiona na komercyjnym module syntezy. Dzięki możliwości pełnej automatyzacji procesu przygotowania, radiosynteza okazała się niezawodna, a także osiągnięto poprawę w zakresie ochrony radiologicznej operatora. Przygotowanie syntezatora ma ogromny wpływ na jakość radioznacznika, szczególnie w zakresie aktywności molowej. W związku z tym niezbędna jest ciągła praca w warunkach obojętnych (np. atmosfera helu) oraz przepłukiwanie wszystkich przewodów znajdujących się przed zbiornikiem reakcyjnym (linia docelowa, cykl produkcyjny [¹¹C]CH₃I i reaktor (patrz rysunek 2)). Ponadto podgrzanie odpowiednich pułapek i pieców przed rozpoczęciem syntezy w celu usunięcia wilgoci i węgla atmosferycznego korzystnie zwiększa aktywność molową. Szczególnie kolumna AgOTf, impregnowana grafityzowanym węglem, jest niezwykle wrażliwa na wilgoć. Nawet niewielkie ilości jakiegokolwiek źródła wilgoci zakłócają przemianę [¹¹C]CH₃I w [¹¹C]CH₃OTf. Przed rozpoczęciem syntezy, pułapka [¹¹C]CO₂ i pułapka [¹¹C]CH₃I muszą zostać ponownie schłodzone do temperatury pokojowej, aby umożliwić późniejsze wychwytywanie. Ponadto zaleca się rozpuszczenie prekursora na krótko przed rozpoczęciem syntezy i dodanie zasady bezpośrednio do roztworu prekursora.

Kontrola jakości radioznaczników węgla-11 musi być racjonalnie zaprojektowana, aby zapewnić ciągły i szybki przebieg pracy. Jednak najważniejszymi parametrami w badaniach hodowli komórkowych są czystość radiochemiczna i aktywność molowa w celu uzyskania prawidłowych wyników. Prawidłowa ocena aktywności molowej wymaga solidnej analitycznej metody HPLC, a krzywa kalibracyjna musi obejmować zakres stężeń produktu końcowego. Wyzwaniem dla radioznaczników jest osiągnięcie stężenia powyżej granicy oznaczalności (LOQ) ze względu na niewielkie ilości, które są wytwarzane podczas radiosyntezy. W związku z tym sztuka polega na znalezieniu równowagi między wysoką aktywnością molową, aby uniknąć nasycenia receptorów, a wystarczająco wysokimi stężeniami, aby nadal być w stanie określić ilościowo sygnał nieradioaktywny.

[¹¹kategorii]Potwierdzono, że SNAP-7941 jest silnym substratem ludzkiego transportera P-gp, ponieważ nie zaobserwowano akumulacji w nieleczonych lub traktowanych nośnikiem komórkach MDCKII-hMDR1 z powodu szybkiego wypływu. W przeciwieństwie do tego, oba zestawy eksperymentalne (MDCKII-WT lub wstępnie zablokowane komórki MDCKII-hMDR1) dostarczyły podobnych wyników (akumulacja [¹¹C]SNAP-7941), co potwierdza wszechstronność tego testu in vitro. Komórki MDCKII-hMDR1 doskonale nadają się do eksperymentów LigandTracer ze względu na ich stabilną transfekcję, szybki wzrost i odporność na naprężenia ścinające spowodowane przez obracającą się miskę do hodowli komórek. Brak wychwytu [¹¹C]SNAP-7941 w mózgu szczura i myszy może zatem wystąpić spowodowany wypływem przez transporter P-gp. Ze względu na transfekcję komórek nerki psów ludzkim białkiem wielolekooporności 1 (hMDR-1, P-gp), wartość predykcyjna tej metody dla wiązania transportera wypływu u ludzi jest wysoka, co jest korzystne z punktu widzenia przyszłego zastosowania klinicznego. Jednak do tej pory selektywność w stosunku do innych transporterów wypływu nie została zweryfikowana. W związku z tym można wykorzystać inne linie komórkowe, wyrażające różne znaczące transportery wypływu, takie jak białko oporności na raka piersi (BCRP) lub białko oporności wielokrotnej-1 (MRP-1), w celu zbadania interakcji z tymi transporterami. Metoda jest w porównaniu z klasycznymi testami akumulacji lub transportu bardzo prosta i daje natychmiastowe wyniki jakościowe. Co więcej, największą zaletą jest to, że technologia ta umożliwia ocenę bezpośredniej interakcji znacznika PET z celem w czasie rzeczywistym, w przeciwieństwie do konwencjonalnego eksperymentu wykorzystującego pośrednią kwantyfikację (głównie przemieszczenie). Ponadto oprogramowanie do testów radioaktywnych w czasie rzeczywistym zapewnia elastyczność eksperymentalną (np. korekcja rozpadu nuklidów, pomiar czasu i pozycji itp.), a tym samym dużą swobodę dla użytkowników. Z drugiej strony, ograniczenia metody obejmują niską przepustowość próbki, ponieważ jednocześnie można zmierzyć tylko jedną szalkę komórkową. Ponadto należy wziąć pod uwagę kilka innych kwestii technicznych i eksploatacyjnych: opisywana technologia jest bardzo wrażliwa na promieniowanie tła; W związku z tym źródła promieniowania powinny być trzymane w pewnej odległości i należy położyć nacisk na pomiar tła przed eksperymentem. Inną kwestią dotyczącą eksperymentów w temperaturach wyższych niż temperatura pokojowa jest nagrzewanie się pochyłego podłoża: parowanie pożywki do hodowli komórkowej może mieć wpływ na detektor. Zamiast podgrzewać, całe urządzenie najlepiej umieścić w inkubatorze. Co więcej, metoda ogranicza się do przylegających linii komórkowych. Poprzez obracanie naczynia do hodowli komórkowej komórki wrażliwe na naprężenia ścinające mogą odłączyć się od naczynia, co może prowadzić do nieprawidłowych wyników.

Niemniej jednak, jeśli eksperymentator zwróci uwagę na te drobne wady, metoda dostarcza szybkich i wiarygodnych wyników do analizy zachowania kinetycznego przedklinicznych znaczników PET.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela 1: Wykaz materiałów i oprzyrządowania w pełni zautomatyzowanej radiosyntezy katalizatora [11C]SNAP-7941
Ni	Shimadzu, Kioto, Japonia		Szimalilt Ni zredukowany, 80/100 mesh
Jod	Merck, Darmstadt, Niemcy		1.04761.0100
Acetonitryl	Merck, Darmstadt, Niemcy		do syntezy DNA, < 10 ppm H2O
Acetonitryl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Octan amonu	HPLC Merck, Darmstadt, Niemcy
Kwas octowy	Merck, Darmstadt, Niemcy		Lodowaty
	Merck, Darmstadt, Niemcy		96%
NaCl	B. Braun, Melsungen, Niemcy		0,9%
Wodorotlenek tetrabutyloamonu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone
Metanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Kartridż SPE	Waters, Milford, MA, USA		SepPak C18plus
Półpreparatywna kolumna RP-HPLC	Merck, Darmstadt, Niemcy		Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Kolumna	wstępnaMerck, Darmstadt, Niemcy		Chromolith Guard RP-18e, 5-4,6 mm
Prekursor	Uniwersytet Wiedeński, Austria		Kwas SNAP
Związek referencyjny	Uniwersytet Wiedeński, Austria		SNAP-7941
Trifluorometanosulfonian srebra	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC	Alltech, Deerfield, IL, USA		80/100 mesh
PET ślad 860 cyklotron	GE Healthcare, Uppsala, Szwecja
[11C]CO2 wysokociśnieniowy cel	Air Liquide, Wiedeń, Austria
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare, Uppsala, Szwecja
N2 + 1% O2	Air Liquide, Wiedeń, Austria		Celowy gaz
Nazwa<	strong>Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Tabela 2: Wykaz materiałów i oprzyrządowania kontroli jakości [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH (Wiedeń, Austria)		Pompa HPLC
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokio, Japonia)		Detektor UV
NaI-radiodetektor	Raytest (Straubenhardt, Niemcy)		Radiodetektor NaI
Chromolith Performance RP-18e, 100-4,6 mm	Merck (Darmstadt, Niemcy)		Kolumna HPLC
430-GC	Bruker (Brema, Niemcy)		Chromatograf gazowy
Kolumna kapilarna ID-BP20; 12 mx0,22 mmx0,25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)		Kapilara gazowa
Wesco, osmometr Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (Wiedeń, Austria)		Osmometr
spektrometr			g
Oprogramowanie sterujące chromatografią gazową	VARIAN (Palo Alto, Kalifornia, USA)		Galaxie Wersja 1.9.302.952
Oprogramowanie sterujące spektrometrem gamma	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, USA)		Maestro dla systemu Windows Wersja 6.06
Oprogramowanie do przywoływania widma gamma	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, USA)		Winplots wersja 3.21
Oprogramowanie sterujące HPLC	Raytest (Straubenhardt, Niemcy)		Gina Star Wersja 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim, Niemcy)		pH-metr
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela 3: Wykaz materiałów i oprzyrządowania do oceny zachowania kinetycznego w czasie rzeczywistym [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Holandia)		Ekspresja ludzkiej glikoproteiny P (hMDR1)
Linia komórkowa Madin-Darby Canine Kidney (MDCKII-WT)	Holenderski Instytut Raka (NKI, Amsterdam, Holandia)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Wiedeń, Austria		Gibco 61965-026
Surowica cielęca płodu (FCS)	VWR International GmbH, Wiedeń, Austria		Gibco 10270-106
Penicylina/Streptomycyna	VWR International GmbH, Wiedeń, Austria		Gibco 15140
Naczynie do hodowli komórkowych	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Eksperymenty
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Wiedeń, Austria		Gibco 61965-026
(±)-Chlorowodorek werapamilu	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)		276855-100 mL
Naczynie do hodowli komórkowych	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterylne jednorazowe pipety plastikowe	VWR International GmbH, Wiedeń, Austria		Sterilin, 5 ml – 25 mL
Sterylne końcówki do pipet	VWR International GmbH, Wiedeń, Austria		Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 &mikro; L – 200 i mikro; L
Kolby do hodowli komórkowych	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy		Cellstar 250 mL, 75 cm2 czerwona nakrętka filtra, nr nr mfr.658175
Sterowanie LigandTracer Wersja 2.2.2	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Szwecja.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Szwecja.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Szwecja.
GraphPad Prism 6.0	Oprogramowanie GraphPad, Inc.
Ręczny automatyczny licznik komórek	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
Czujniki licznika komórek	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 i mikro; m (Cat.No. PHCC60050)