Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59561

⸱

10 lipca 2019

 ,  , 
1Center for Neuroscience and Regenerative Medicine, Uniformed Services University, 2Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, Uniformed Services University, 3Graduate Program in Neuroscience, Uniformed Services University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje metodologie dla mysiego modelu urazowego mózgu z otwartą czaszką i przeszczepu hodowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do miejsca urazu. W skrócie opisano również testy behawioralne i histologiczne wyników tych procedur.

Streszczenie

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Patologia choroby spowodowana TBI postępuje od pierwotnego mechanicznego uszkodzenia do wtórnych procesów urazowych, w tym apoptozy i stanu zapalnego. Modelowanie na zwierzętach okazało się cenne w poszukiwaniach mających na celu rozwikłanie mechanizmów urazów i ocenę potencjalnych terapii neuroprotekcyjnych. Protokół ten opisuje model kontrolowanego wpływu korowego (CCI) ogniskowego TBI z otwartą głową. W szczególności opisano parametry powodujące łagodne jednostronne uszkodzenie kory mózgowej. Behawioralne konsekwencje CCI są analizowane za pomocą testu obustronnej integracji sensomotorycznej z taśmą klejącą. Jeśli chodzi o eksperymentalną terapię patologii TBI, protokół ten ilustruje również proces przeszczepiania hodowanych komórek do mózgu. Hodowle komórek nerwowych pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) zostały wybrane ze względu na ich potencjał do wykazywania lepszej odbudowy funkcjonalnej u pacjentów z TBI. Przewlekłe przeżycie hiPSC w tkance mózgowej myszy gospodarza wykrywa się za pomocą zmodyfikowanego procesu immunohistochemicznego DAB.

Wprowadzenie

1,2. W raporcie Centers for Disease Control and Prevention z 2017 r. oszacowano, że w 2013 r. w Stanach Zjednoczonych odnotowano łącznie 2,8 miliona wizyt w szpitalu i zgonów z powodu TBI3. Wiele łagodniejszych TBI nie jest zgłaszanych każdego roku. Poważne TBI może prowadzić do upośledzenia funkcji poznawczych, funkcji motorycznych i ogólnej jakości życia przez całe życie. Konsekwencje łagodnego TBI, zwłaszcza powtarzającego się TBI związanego ze sportem, dopiero niedawno zostały docenione ze względu na ich podstępne skutki zdrowotne4,5.  

Modelowanie przedkliniczne jest kluczowym elementem rozwoju nowych mechanistycznych spostrzeżeń i potencjalnej terapii naprawczej dla TBI. Model kontrolowanego uderzenia korowego (CCI) TBI jest modelem mechanicznego uszkodzenia kory mózgowej z otwartą głową. Parametry uderzenia mogą być modyfikowane w celu uzyskania obrażeń CCI, które wahają się od łagodnych do ciężkich6. Urazy CCI są ogniskowe, a nie rozlane, jak widać w przypadku innych modeli TBI z zamkniętą głową. CCI można wykonać w celu wywołania jednostronnego urazu, tak aby kora przeciwległa mogła służyć jako wewnętrzny komparator. Protokół ten demonstruje cechy łagodnego CCI dla części kory mózgowej, która obejmuje podstawowe regiony somatosensoryczne i motoryczne. Ten obszar kory mózgowej został wybrany ze względu na jego udział w zachowaniach sensomotorycznych, dla których liczne testy behawioralne mogą wykryć deficyty wywołane urazami7. Można również wykryć poprawę zachowania dzięki interwencjom terapeutycznym w TBI.

Cechą charakterystyczną TBI jest powszechna dysfunkcja neuronów w uszkodzonym obszarze. Uszkodzone neurony ulegają śmierci komórkowej, a łączność sieci neuronalnej zostaje zakłócona8,9. TBI zaburza rekrutację endogennych komórek macierzystych, co prowadzi do dalszych deficytów zachowań10,11. Przeszczep nerwowych komórek macierzystych i komórek pochodzących z komórek macierzystych został zbadany jako możliwość przywrócenia funkcji w uszkodzonym mózgu. Oprócz potencjału do przywrócenia uszkodzonych obwodów neuronalnych, przeszczepione komórki wywierają efekty parakrynne, które sprzyjają przetrwaniu neuronów i funkcjonalnemu odzyskiwaniu po TBI12. Różne typy komórek zostały przeszczepione przedklinicznie w celu oceny ich potencjału regeneracyjnego w modelach zaburzeń neurologicznych13,14,15. Niedawna popularyzacja technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych16 ułatwiła rozwój wielu linii ludzkich komórek macierzystych do użytku eksperymentalnego. Badania przedkliniczne z wykorzystaniem komórek pochodzących z hiPSC są ważnym pierwszym krokiem do scharakteryzowania potencjalnej skuteczności terapeutycznej danej linii komórkowej przeciwko chorobom u ludzi. To laboratorium opracowało protokoły różnicowania hiPSC do fenotypów neuronalnych17 w poszukiwaniu komórek nadających się do przeszczepu, aby wspomóc powrót do zdrowia po urazowym uszkodzeniu mózgu.

Eksperymenty w tym protokole wykorzystują jednostronny CCI do indukowania TBI do lewej kory somatosensorycznej i ruchowej dorosłych myszy. Łagodny uraz CCI powoduje utrzymujący się deficyt funkcjonalny prawej przedniej łapy, który służy do śledzenia wpływu wszczepienia komórek nerwowych pochodzących z hiPSC na powrót do sprawności. Testy sensomotoryczne przedniej łapy w tym protokole zostały zaadaptowane z metodologii ustalonej przez Boueta i współpracowników18 i zademonstrowanej wcześniej przez Fleminga i współpracowników19. Protokół ten przedstawia kompletny przepływ pracy dla przeprowadzenia eksperymentalnego uszkodzenia mózgu, terapeutycznego przeszczepu komórek hiPS oraz behawioralnej i histologicznej analizy eksperymentalnych miar wyników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty opisane w tym protokole zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Służb Mundurowych.

1. Kraniektomia i kontrolowane oddziaływanie na korę mózgową

  1. Przygotowanie urządzenia do kontrolowanego uderzenia kory mózgowej i materiałów chirurgicznych.
    1. Załadować strzykawkę o pojemności 1 ml z końcówką ślizgową z 0,5 ml sterylnego soli fizjologicznej do irygacji ran. Podłączyć igłę 25 G do strzykawki, aby kontrolować irygację.
    2. Przygotować rozcieńczony roztwór CsA w DMSO do końcowego stężenia 1 mg/ml. Załadować drugą strzykawkę o pojemności 1 ml z końcówką ślizgową z 0,5 ml roztworu cyklosporyny A (CsA) w celu immunosupresji. Do strzykawki CsA przymocować igłę o długości 25 G lub większą.
    3. Przymocuj sterowany korowy tłok uderzeniowy do ramienia na ramie stereotaktycznej i ustaw pod kątem 15°. Przymocować sondę udarową 3 mm do tłoka.
    4. Ustaw prędkość uderzenia na 1,5 m/s, a czas trwania uderzenia na 0,1 s, aby spowodować łagodne uszkodzenie kory mózgowej.
  2. Wykonaj jednostronną kraniektomię
    1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia podłączonej do parownika izofluranu ze źródłem sprężonego tlenu. Wywołaj znieczulenie ~3% izofluranem o stężeniu tlenu ~0,7 l/min. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca.
    2. Ogol skórę głowy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia i zetrzyj luźne futro.
    3. Umieść mysz w stereotaktycznej ramce z dołączonym stożkiem znieczulającym do nosa.
      1. Umieść podkładkę rozgrzewającą ustawioną na 37 °C na ramce stereotaktycznej pod myszą, aby utrzymać temperaturę ciała w znieczuleniu. Przymocuj głowę na miejscu za pomocą nauszników i pręta do gryzienia i ustaw głowę tak, aby kość czołowa czaszki była pozioma. Utrzymuj znieczulenie na poziomie ~1,5%-2% izofluranu przez cały czas trwania zabiegu.
    4. Aby przeprowadzić opiekę przedoperacyjną i aseptyczne przygotowanie chirurgiczne, nałóż antybiotykową maść okulistyczną na oczy za pomocą sterylnego wacika. Nałóż roztwór na bazie jodu na ogoloną skórę głowy. Usuń to za pomocą 70% etanolu. Przykryj zwierzę zasłoną chirurgiczną z fenestracją tak, aby czubek głowy był widoczny, ale oczy były zakryte.
    5. Wykonaj nacięcie w linii środkowej (1,5-2 cm) na skórze głowy za pomocą skalpela lub nożyczek. Użyj sterylnych bawełnianych wacików, aby oczyścić ranę i oczyścić powięź po lewej stronie linii środkowej w bregma.
    6. Użyj sondy impaktorowej, aby zidentyfikować miejsce kraniektomii.
      1. Ustaw stereotaktyczny punkt odniesienia (X = 0, Y = 0) na bregma. Ustaw sondę w bok do 2 mm na lewo od linii środkowej. Obrysuj okrąg o średnicy 5 mm wokół sondy za pomocą markera chirurgicznie bezpiecznego z cienką końcówką. Podnieś i obróć impaktor z pozycji.
    7. Użyj narzędzia ręcznego z zestawem mikrosilnika obrotowego o dużej prędkości, aby wykonać otwarty otwór w czaszce za pomocą wiertła do zadziorów o średnicy 0,6 mm lub 0,8 mm z okrągłą końcówką przy maksymalnej prędkości ~70%-80%. Lekko dociśnij czaszkę, wiercąc wzdłuż obrysu 5 mm, aby rozrzedzić tę granicę.
      1. Nie wywieraj nadmiernego nacisku podczas wiercenia. Może to spowodować uszkodzenie kory mózgowej z powodu wibracji, ucisku lub przypadkowej penetracji. Pozwól, aby prędkość wiertła wykonała pracę.
      2. Nie wiercić w żadnym miejscu zbyt długo, aby uniknąć nadmiernego nagrzewania się czaszki w wyniku tarcia. Od czasu do czasu należy przepłukać kraniektomię sterylną solą fizjologiczną, aby usunąć zanieczyszczenia i zmniejszyć nagrzewanie się narzędzia obrotowego.
      3. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wiercenia nad linią szwu koronalnego, ponieważ punkty te są podatne na krwotok.
    8. Użyj cienkiej pęsety, aby usunąć płat czaszki, gdy kontur kraniektomii jest wystarczająco cienki. Chwyć klapkę przyśrodkowo i delikatnie podnieś i pociągnij na boki ruchem promieniowym.
      1. Nie należy uszkadzać opony twardej podczas podnoszenia klapki; może to spowodować poważne obrażenia i krwotok.
  3. Wykonaj łagodne, kontrolowane uderzenie w korę mózgową
    1. Wyczyść sondę impaktora sterylnym wacikiem nasączonym alkoholem. Przesuń sondę impaktora z powrotem na miejsce nad odsłoniętą korą. Opuść sondę, aż dotknie powierzchni opony twardej. Oznacz tę pozycję jako Z = 0.
    2. Wycofaj tłok i przesuń do Z = -1,0 mm. Rozładuj tłok, aby uderzyć w korę.
    3. Szybko podnieś tłok i przesuń ramię z pozycji. Zastosuj duże ilości soli fizjologicznej, aby przepłukać korę po urazie. W razie potrzeby spłucz miejsce operacji solą fizjologiczną i zszyj nacięcie skóry głowy za pomocą prostych przerywanych szwów z jedwabnym szwem 5.0.  
  4. Wykonaj opiekę pooperacyjną na myszy
    1. Przerwij znieczulenie. Podać CsA we wstrzyknięciu podskórnym w kark w dawce 10 mg/kg mc. Umieść mysz w czystej i wstępnie ogrzanej klatce pooperacyjnej.
    2. Podać przeciwbólowy paracetamol w wodzie do picia w ilości 1,0 mg/ml.
      UWAGA: Zapewnić analgezję zgodnie z odpowiednią standardową procedurą operacyjną IACUC i z uwzględnieniem zmiennych wyników eksperymentalnych (np. sedacja, zapalenie nerwów).
    3. Zapewnij zwilżony pokarm w rozgrzanej klatce regeneracyjnej, aby pomóc w nawodnieniu i regeneracji.
  5. Postępuj zgodnie z sekcją 2 do sekcji 4 powyżej podczas wykonywania kontroli tylko z kraniektomią (pozorowanej).

2. Stereotaktyczny przeszczep zawiesiny komórkowej

  1. Procedurę przeszczepu komórek należy rozpocząć około 24 godziny po kraniektomii.
  2. Przygotowanie sprzętu do przeszczepu komórek i materiałów chirurgicznych
    1. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej do irygacji ran. Podłączyć igłę 25 G do strzykawki, aby kontrolować irygację.
    2. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem CsA do immunosupresji. Do strzykawki CsA przymocować igłę o długości 25 G lub większą. W razie potrzeby należy uzupełnić strzykawkę CsA między operacjami.
    3. Przygotować szklane igły z pipet kapilarnych ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,0 mm przy użyciu standardowych metod.
    4. Użyj cienkiej pęsety, aby złamać końcówki igieł do średnicy około 200 μm. Upewnij się, że cylindryczny trzon igły nie jest dłuższy niż 2,5 cm.
  3. Skalibruj pompę strzykawkową do użytku ze strzykawką o pojemności 10 μl. Wprowadź natężenie przepływu 0,2 μl/min, aby uzyskać całkowitą objętość 2,0 μl.
  4. Przygotować zawiesinę ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC).
    1. Całą obsługę komórek w kapturze BSL-2 do hodowli komórkowej należy wykonywać przy użyciu standardowych sterylnych technik obchodzenia się.
    2. Przygotować hodowle komórkowe z wyprzedzeniem zgodnie ze standardowymi warunkami określonymi dla danego typu komórki. Zapoznaj się z Lischka et al.17 jako przykład.
      UWAGA: W eksperymentach pokazanych w tej demonstracji wykorzystano różne komórki fenotypu nerwowego pochodzące z hiPSC.
    3. Delikatnie zdysocjuj komórki w zawiesinę jednokomórkową za pomocą roztworu do odrywania komórek lub innych preferowanych środków enzymatycznych lub chemicznych.
    4. Policz komórki w zawiesinie, a następnie rozcieńcz zawiesinę do 5 x 104 komórek/μl w minimalnej pożywce do hodowli komórkowej (np. DMEM) w probówce z klapką o pojemności 1,7 ml.
    5. Przestrzegaj następujących wskazówek dotyczących przeszczepu:
      1. Utrzymywać komórki w zawiesinie w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania zabiegów.
      2. Strzykawkę należy ładować tylko bezpośrednio przed wykonaniem wstrzyknięcia śródmiąższowego (krok 4.5 poniżej).
        UWAGA: Grawitacja może spowodować osiadanie zawiesiny komórek lub przyleganie do boku strzykawki, jeśli jest ona ułożona na boku. Prowadzi to do nieprawidłowości w liczbie wstrzykiwanych komórek.
      3. Przydziel ~ 5 x 105 komórek (zawiesina 10 μL) na mysz w przypadku wykonywania zabiegów przeszczepu wielu komórek w ciągu jednego dnia.
  5. Wykonaj operację przeszczepu stereotaktycznego
    1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia podłączonej do parownika izofluranu ze źródłem sprężonego tlenu. Wywołaj znieczulenie ~3% izofluranem o stężeniu tlenu ~0,7 l/min.
    2. Umieść mysz w stereotaktycznej ramce z dołączonym stożkiem znieczulającym na nos.
      1. Przymocuj głowę na miejscu za pomocą nauszników i pręta do gryzienia i ustaw głowę tak, aby kość czołowa czaszki była pozioma. Utrzymuj znieczulenie na poziomie ~1,5%-2% izofluranu przez cały czas trwania zabiegu.
    3. Wykonaj pielęgnację przedoperacyjną i przygotowanie aseptyczne
      1. Nałóż nawilżającą maść okulistyczną zawierającą antybiotyk na oczy za pomocą bawełnianego wacika.
      2. Przepłukać miejsce nacięcia sterylną solą fizjologiczną, aby oczyścić miejsce i poluzować szwy. Delikatnie nałóż 70% etanolu za pomocą bawełnianego wacika, aby wysterylizować miejsce nacięcia.
    4. Usuń szwy za pomocą cienkiej pęsety i nożyczek okulistycznych. Przepłukać miejsce operacji i kraniektomię dużą ilością sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
      1. Rozważ wykluczenie zwierzęcia, jeśli kora wykazuje cechy dyskwalifikujące, w tym nadmierną przepuklinę, przebarwienia, zaburzone unaczynienie lub krwotok.
    5. Załadować strzykawkę do przeszczepu komórek
      1. Przenieść zawiesinę komórek z inkubatora o temperaturze 37 °C do kaptura bezpieczeństwa biologicznego do hodowli komórkowych. Delikatnie zakręć lub postukaj w rurkę, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek.
      2. Użyj mikropipetora, aby załadować ~7,5 μl zawiesiny komórek do strzykawki Hamilton przez końcówkę tłoka.
        1. Trzymać strzykawkę pod kątem ~120° z końcem tłoka skierowanym w dół. Włożyć tłok, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyka powietrza między zawieszenie a końcówkę tłoka.
      3. Przymocować zespół uszczelki do igły do pipety, a następnie przymocować igłę do strzykawki.
      4. Wcisnąć tłok, aby przesunąć zawiesinę komórek do igły do pipety. Jeśli występuje opór przed odpływem zawiesiny, użyj cienkiej pęsety, aby złamać końcówkę igły, aby zwiększyć średnicę.
    6. Podłączyć strzykawkę do stereotaktycznej pompy strzykawkowej. Przesunąć tłok, aby upewnić się, że zespół pompy strzykawkowej działa prawidłowo.
    7. Przesunąć igłę do współrzędnych do wstrzyknięcia.
      1. Wyrównać końcówkę igły z bregmą. Ustaw współrzędne X i Y na 0. Następnie przesunąć końcówkę igły nad kraniektomią do 2,0 mm bocznie i -1,0 mm do tyłu do bregmy. Przyłóż końcówkę igły do powierzchni opony twardej i ustaw współrzędną stereotaktyczną na Z = 0.
      2. Nacisnąć tłok, aby upewnić się, że zawiesina komórek przepływa prawidłowo, zanim wprowadzi się igłę do mózgu.
      3. Wprowadzić igłę do mózgu na głębokość Z = -1,4 mm. Te stereotaktyczne współrzędne umieszczają przeszczep na granicy istoty szarej i białej kory głębokiej20.
    8. Uruchomić pompę strzykawkową, aby wprowadzić zawiesinę komórek. Ustaw timer na stole laboratoryjnym na 15 minut i uruchom timer. Użyj mikroskopu o dużej odległości roboczej, aby monitorować odpływ zawiesiny komórek.
      1. Podczas wstrzyknięcia należy przepłukać miejsce operacji sterylną solą fizjologiczną, aby utrzymać nawodnienie tkanek.
      2. Po 15 minutach powoli wyjmij igłę do przeszczepu. Przepłukać miejsce operacji solą fizjologiczną i zamknąć nacięcie szwami.
    9. Wykonaj opiekę pooperacyjną
      1. Przerwij znieczulenie. Podać CsA we wstrzyknięciu podskórnym w kark w dawce 10 mg/kg mc. Umieść mysz w czystej i wstępnie ogrzanej klatce pooperacyjnej.
      2. Podać przeciwbólowy paracetamol w wodzie do picia w ilości 1,0 mg/ml.
        UWAGA: Zapewnić analgezję zgodnie z odpowiednim standardowym protokołem operacyjnym IACUC (SOP) i z uwzględnieniem zmiennych wyników eksperymentalnych.
      3. Zapewnij wilgotną klatkę do odzyskiwania żywności, aby pomóc w nawodnieniu i regeneracji.
  6. Kontynuować codzienne wstrzyknięcia CsA w dawce 10 mg/kg mc. przez cały okres przeżycia myszy.

3. Test usuwania taśmy klejącej integracji sensomotorycznej

  1. Pokrój taśmę izolacyjną na paski o wymiarach 3 mm x 5 mm za pomocą małego noża do golenia przed wykonaniem testu zachowania. Do cięcia pasków samoprzylepnych użyj gładkiej szklanej powierzchni.
    UWAGA: Użyj żółtej i czerwonej taśmy, ponieważ myszy mają trudności z rozróżnieniem tych kolorów21.
    1. Wybierz małe lusterko, które dobrze mieści się w przezroczystym plastikowym pudełku.
      1. Zamocuj lustro pod kątem około 45° za pomocą plasteliny lub taśmy klejącej, aby zobaczyć zachowanie zwierząt od dołu.
    2. Umieść zestaw pudełka i lustra na stole w cichym, dedykowanym pomieszczeniu do testowania zachowania. Ułóż cylinder na plastikowym pudełku nad lustrem.
    3. Ułóż ściereczkę do obsługi, pęsetę i paski samoprzylepne na stole obok pudełka do testowania zachowania.
    4. Wyczyść pudełko i cylinder 70% etanolem i ręcznikami papierowymi. Pozostaw powierzchnie do całkowitego wyschnięcia.
    5. Przynieś myszy do pokoju do testowania zachowania. Pozwól myszom zaaklimatyzować się w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut przed testami behawioralnymi.  
    6. Usuń dopływ wody z klatek, aby zminimalizować zdarzenia związane z oddawaniem moczu podczas testowania, co może zakłócać wydajną wydajność testu.
  2. Wykonaj test usuwania kleju
    UWAGA: Ten test zachowania najlepiej jest przeprowadzić przez dwóch do trzech badaczy: jednego do obsługi stopera i jednego lub dwóch do obsługi myszy i obserwowania zachowania.
    1. Użyj każdej pęsety, aby odkleić jeden pasek kleju każdego koloru.
      1. Wybierz kolor paska odpowiadający której przedniej łapie i pozostań spójny przez cały czas trwania próby.
    2. Użyj ściereczki do obsługi, aby przytrzymać mysz za kark i grzbiet tak, aby mysz trzymała przednie łapy z dala od ciała i głowy.
    3. Użyj pęsety, aby umieścić pasek kleju na podeszwowej powierzchni każdej przedniej łapy. Używaj delikatnego i stałego nacisku palcami, aby przymocować paski do łap
      4. .
    4. Szybko umieść mysz w plastikowym cylindrze. Uruchom dwa stopery, gdy mysz ma wszystkie cztery łapy na plastikowym pudełku.
    5. Użyj dwóch stoperów, aby zarejestrować opóźnienia dla następujących czterech zdarzeń: powiadomienie o lewej łapie, usunięcie lewej łapy, powiadomienie o prawej łapie, usunięcie prawej łapy.
      1. Nagraj zdarzenie powiadomienia, gdy zwierzę jednoznacznie rozpoznaje pasek samoprzylepny, potrząsając lub wzdrygając się łapą lub gryząc pasek.
      2. Nagraj zdarzenie usuwania, gdy zwierzę skutecznie usunie pasek z powierzchni podeszwowej przedniej łapy.
        UWAGA: Zdarzenie usunięcia nie jest dyskwalifikowane przez gotowość paska lub jeśli pasek przylega do bocznej powierzchni przedniej łapy.
      3. Zatrzymaj timer na 120 s, jeśli odpowiedni pasek nie został usunięty.
      4. Zapisz czasy, które upłynęły dla czterech zdarzeń w arkuszu danych.
    6. Wykonaj drugą próbę na każdej myszy
      1. Pozwól, aby między próbami upłynęło co najmniej 5 minut, aby pojedyncza mysz mogła zmniejszyć stres, który może zakłócać efektywne działanie w teście.
      2. Wyczyść aparat ręcznikami papierowymi między testowanymi myszami, aby usunąć odpady podczas testowania wielu myszy z jednej klatki.
        1. Dokładnie wyczyść aparat 70% etanolem i ręcznikami papierowymi podczas testowania myszy z wielu klatek.
      3. Odwróć kolejność umieszczania łap kolorowych w drugiej próbie sesji, aby losowo wybrać dowolny efekt koloru.
    7. Oblicz średnie opóźnienie każdego zdarzenia między dwiema próbami na sesję dzienną dla każdego zwierzęcia.
  3. Dokładnie wyczyść urządzenie i szmatkę do obsługi wodą, wymień zapasy wody w klatce i zwróć myszy do ich pomieszczenia
    4. .
  4. Powtórz kroki 3.1-3.2 dla kolejnych eksperymentalnych punktów czasowych dla projektu badania z powtarzanymi pomiarami.
    UWAGA: Kroki 3.2.1-3.2.5.3 należy powtarzać codziennie przez 5 dni przed zebraniem danych, aby przyzwyczaić zwierzęta do zadania. Zaleca się zebranie danych wyjściowych przed operacją.

4. Analiza immunohistochemiczna diaminobenzydyny (DAB) dotycząca przeżycia przeszczepu i patologii urazów

  1. Poddaj zwierzęta eutanazji i wykonaj perfuzję przezsercową.
    1. Przygotować roztwory 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS. Zrównoważyć pH obu roztworów do 7,4.
    2. Umieścić oba roztwory na lodzie w dygestorium. Umieść pompę perystaltyczną w dygestorii i uruchom pompę, aby napełnić rurkę PBS. Ustawić natężenie przepływu pompy na ~7 ml/min. Podłączyć igłę 25 G do rurki odpływowej pompy.
    3. Umieść tacę drenażową z miękkim podłożem w okapie. Podnieś jeden koniec tacki pod niewielkim kątem, aby płyny perfuzyjne spłynęły do dolnego końca.
    4. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia. Napełnij komorę 4% izofluranem przy użyciu sprężonego 100% tlenu w pojeździe.
    5. Przenieś znieczuloną mysz z komory do stożka znieczulającego na nos. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 2%.
    6. Wykonaj torakotomię, aby odsłonić serce. Przerwij znieczulenie, ponieważ torakotomia powoduje eutanazję.
    7. Ostrożnie umieścić igłę odpływową pompy perfuzyjnej w lewej komorze wzdłuż długiej osi serca. Nie należy przekłuwać przegrody serca, ponieważ spowoduje to słabą perfuzję.
    8. Użyj małych nożyczek, aby przeciąć prawy przedsionek, a następnie natychmiast włącz pompę perystaltyczną.
    9. Kontynuuj przepływ PBS, aż płyn opuszczający prawy przedsionek oczyści się z krwi.
      1. Wyłącz pompę. Przesuń rurkę wlotową pompy do pojemnika PFA. Uruchom ponownie pompę. Kontynuuj perfuzję PFA do momentu, gdy zwierzę będzie wystarczająco sztywne lub do momentu, gdy zostanie przepompowana objętość 20 ml.
      2. Wyłącz pompę. Usunąć igłę odpływową z serca. Przenieś rurkę wlotową z PFA do PBS i dokładnie wypłucz PFA z rurki.
  2. Usuń mózg z czaszki przez staranną sekcję. Umieść mózg w małym pojemniku wypełnionym 4% paraformaldehydem i pozwól mózgowi utrwalić się przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. Następnego dnia po utrwaleniu należy zastąpić P PBS i 0,1% azydkiem sodu. Mózgi należy przechowywać w tym roztworze do czasu przygotowania do przeprowadzenia sekcji histologicznej.
  4. Zbierz skrawki 40-50 μm tkanki mózgowej utrwalonej formaldehydem za pomocą mikrotomu do zamrażania lub wibratomu o temperaturze pokojowej.
  5. Wstępnie potraktuj tkanki 0,3% nadtlenkiem wodoru w wodzie, aby dezaktywować endogenne peroksydazy, które mogą powodować niespecyficzne barwienie.
  6. Pobieranie antygenu należy przeprowadzić za pomocą buforu kwasu cytrynowego (10 mM cytrynian sodu, 0,05% polisorbat-20, pH 6,0) w temperaturze 60 °C przez 30 minut.
  7. Wykonaj znakowanie przeciwciał standardowymi metodami. Patrz Lundell i wsp.'s report22 z tego laboratorium, aby uzyskać więcej informacji.
    1. Użyj mysiego zestawu do neutralizacji IgG (patrz tabela materiałów), aby zmniejszyć reaktywność krzyżową z endogennymi przeciwciałami. Inkubować tkanki w buforze neutralizacyjnym IgG przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT), postępując zgodnie ze wskazówkami producenta.
    2. Użyj mysiego przeciwciała pierwotnego przeciwko ludzkiemu antygenowi jądrowemu (hNA; rozcieńczenie 1:500) podczas przeszczepiania ludzkich komórek pochodzących z iPSC, aby zlokalizować przeszczepione komórki. Inkubować tkanki z pierwotnym przeciwciałem w temperaturze 4 °C przez 48-72 godziny, delikatnie mieszając.
    3. Po wypłukaniu roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, inkubować tkanki z sprzężonym z HRP drugorzędowym przeciwciałem anty-mysim w rozcieńczeniu 1:250 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    4. Przeprowadź reakcję chromogenową DAB standardowymi metodami, aby ujawnić znakowanie immunologiczne. Pozwól, aby reakcja DAB rozwinęła się przez 5 do 10 minut przy suchej smołce.
  8. Przymocuj poplamione chusteczki do szkiełek podstawowych i nałóż szkiełka nakrywkowe standardowymi metodami.
  9. Określ ilościowo liczbę oznaczonych komórek za pomocą bezstronnej stereologii, jak opisano wcześniej23,24. Wykonaj analizę przy użyciu przekrojów optycznych 20 μm i odstępu między sekcjami wynoszącego trzy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Operacja kraniektomii umożliwia eksperymentalne uszkodzenie mózgu i terapeutyczną transplantację komórek: model kontrolowanego uderzenia w korę (CCI) w celu wywołania uszkodzenia mózgu oraz następująca po nim terapia transplantacją komórek wymagają starannego usunięcia nadkładającej się czaszki. Kraniektomię można przeprowadzić na dowolnej grzbietowej powierzchni czaszki, aby umożliwić manipulacje w interesującym regionie mózgu. Schemat na Rysunku 1 przedstawia kraniektomię ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Łagodne CCI jako modelowy system do testowania eksperymentalnej terapii regeneracyjnej
Model CCI jest cennym narzędziem do badania mechanizmów dysfunkcji tkanek po mechanicznym urazie kory mózgowej. Atrakcyjną cechą tego modelu jest możliwość dostrajania parametrów urazu. Zmiana głębokości uderzenia Z, prędkości lub czasu przebywania może zwiększyć lub zmniejszyć dotkliwość urazu, zgodnie z życzeniem badacza10,25. Łagodny model CCI stłuczone...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem z Centrum Neuronauki i Medycyny Regeneracyjnej (CNRM, numer grantu G170244014). Doceniamy pomoc Mahimy Dewan i Clary Selbrede w badaniach pilotażowych dotyczących usuwania kleju. Kryslaine Radomski przeprowadziła wstępne operacje uszkodzenia mózgu i przeszczepu komórek. Amanda Fu i Laura Tucker z głównego laboratorium badań przedklinicznych USU CNRM udzieliły cennych porad na temat operacji na zwierzętach i testowania zachowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawki 1 mlBecton Dickinson (BD) 
1,7 ml probówki z klapkąDenvilleC2170
10 mikrolitrów strzykawkaHamilton7635-01
25G Igły do strzykawek Precision GlideBecton Dickinson (BD) 
70% etanoluProdukt do wyboru; różni się w zależności od regionu
Zawiesina doustna paracetamoluTylenol (dla dzieci)Rozcieńczyć do 1 mg/ml w parowniku
znieczulającymVetland521-11-22
ściereczkaZakup w domu towarowym
BetadinePurdue ProduktyNDC-67618-151-32
sprężony tlenProdukt do wyboru; różni się w zależności od regionu
cyklosporyna ASigma-Aldrich30024-100mg
DABVector LaboratoriesSK-4100
dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418-500ml
DMEMInvitrogen (ThermoFisher)A14430-01
przeciwciało IgG przeciwko mysim osiołkom, sprzężone z HRPJackson ImmunoResearch715-035-151
taśma izolacyjna3M CorporationZakup w domu towarowym
drobna pęsetaKleszcze Fine Science Tools11254-20
Fine Science Tools91106-12
, średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna0,58 mmWorld Precision Instruments1B100F-3
Zestaw mikrosilnika obrotowego o dużej prędkościForedom Electric Co. K.1070 - K.107018
Idealny zestaw frezów do mikrowiertła z 5punktami ogniwowymi Naukowy 60-1000
Impact One Stereotaxic Impactor dla CCI Leica Biosystems39463920
isofluranBaxterNDC-10019-360-60
zegary laboratoryjneFisher Scientific14-649-17
Ściągacz do mikropipetMicroData Instruments, Inc.PMP-102Wystarczy dowolny ściągacz
Szkiełka nasadkowe mikroskopuFisherbrand12-545-E Medium
do montażu szkiełek mikroskopowychProdukt do wyboru
lustraZakup w domu towarowym
mysz przeciwciało antyludzkiego antygenu jądrowegoMilliporeMAB1281
Zestaw do blokowania myszy na myszyWektor LaboratoriaBMK-2202
uchwyt na igłę hemostatFine Science Tools12002-12
maść okulistycznaFalcon PharmaceuticalsNDC-61314-631-36
okulistyczne nożyczki sprężynoweFine Science Tools15018-10
plastikowe pudełkoZakup w plastikowym
cylindrzeZakup w domu towarowym
Pompa strzykawkowa z napędem QSIStoelting53311
Wyjmowana złączka uciskowa igłaHamilton55750-01
mała rama stereotaktyczna dla gryzoniStoelting51925
Fine Science Tools14060-09
StemPro AccutaseInvitrogen (ThermoFisher)
Sterylne waciki nasączone alkoholemFisherbrand06-669-62
sterylne waciki bawełniane/końcówki Q KendallTyco Healthcare540500
Sterylna sól fizjologicznaHospiraNDC-0409-1966-07
Stopery (2)Fisher Scientific06-662-56
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus GoldFisherbrand15-188-48
szwy - 5.0 jedwab z zakrzywioną igłąOasisMV-682
309659305122 wodę do obsługi zwierząt Zestaw do barwienia Szklane pipety kapilarne domu towarowego Małe nożyczki A1110501

Bibliografia

  1. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
  2. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
  3. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
  4. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
  5. Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
  6. Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781(2014).
  7. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  8. Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280(2014).
  9. Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
  10. Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142(2013).
  11. Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
  12. Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
  13. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
  14. Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
  15. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  17. Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
  18. Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
  19. Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303(2013).
  20. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
  21. Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
  22. Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
  23. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
  24. Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
  25. Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
  26. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
  27. Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
  28. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232(2014).
  29. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
  30. Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
  31. Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
  32. Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
  33. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7, 825-826 (2010).
  34. Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
  35. Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
  36. Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
  37. Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Urazowe uszkodzenie m zguludzkie indukowane pluripotencjalne kom rki macierzystetransplantacja kom rek neuronalnychchirurgia stereotaktycznatest usuwania ta my klej cejanaliza immunohistochemicznaprocedura kraniektomiibezpiecze stwo biologiczne kultur kom rkowychopieka pooperacyjna
Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.