Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych

Podsumowanie

Prezentujemy techniki izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) uzyskanych z tkanki biopsji mięśni szkieletowych. hMPC uzyskane i scharakteryzowane za pomocą tych metod mogą być wykorzystane do późniejszego rozwiązywania problemów badawczych związanych z ludzką miogenezą i regeneracją mięśni szkieletowych.

Streszczenie

Wykorzystanie pierwotnych tkanek i komórek ludzkich jest idealne do badania procesów biologicznych i fizjologicznych, takich jak proces regeneracji mięśni szkieletowych. Istnieją rozpoznane wyzwania związane z pracą z ludzkimi pierwotnymi dorosłymi komórkami macierzystymi, w szczególności ludzkimi komórkami progenitorowymi mięśni (hMPC) pochodzącymi z biopsji mięśni szkieletowych, w tym niska wydajność komórek z pobranej tkanki i duży stopień niejednorodności parametrów wzrostu i śmierci dawcy między hodowlami. Podczas gdy włączenie heterogeniczności do projektu eksperymentalnego wymaga większej wielkości próby w celu wykrycia znaczących efektów, pozwala nam również zidentyfikować mechanizmy, które leżą u podstaw zmienności zdolności do ekspansji hMPC, a tym samym pozwala nam lepiej zrozumieć heterogeniczność w regeneracji mięśni szkieletowych. Nowe mechanizmy, które odróżniają zdolność kultur do ekspansji, mogą potencjalnie doprowadzić do opracowania terapii poprawiających regenerację mięśni szkieletowych.

Wprowadzenie

Mięśnie szkieletowe to największy układ narządów w ludzkim ciele, stanowiący 30−40% masy całego ciała¹. Oprócz dobrze rozpoznanej roli w lokomocji, mięśnie szkieletowe utrzymują temperaturę i postawę ciała oraz odgrywają kluczową rolę w homeostazie składników odżywczych całego organizmu. Badania z udziałem ludzi, zwierząt i modeli kultur komórkowych są cenne dla odpowiedzi na pytania dotyczące biologii i regeneracji mięśni szkieletowych. Izolacja i hodowla ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) zapewnia solidny model, który pozwala na zastosowanie technik hodowli komórkowych i manipulacji do próbek ludzkich. Zaletą stosowania hMPC jest to, że zachowują one fenotyp genetyczny i metaboliczny od każdego dawcy^2,3. Utrzymanie fenotypu dawcy pozwala naukowcom na zbadanie międzyosobniczej zmienności w procesie miogennym. Na przykład, zastosowaliśmy naszą metodę charakterystyki hMPC, aby zidentyfikować związane z wiekiem i płcią różnice w zdolności ekspansji populacji hMPC⁴.

Celem tego protokołu jest szczegółowe opisanie technik izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania hMPC od tkanki biopsji mięśni szkieletowych. Opierając się na wcześniejszych pracach, które opisywały hMPC i identyfikowały potencjalnych producentów powierzchni komórek do izolacji hMPC^5,6, protokół ten wypełnia krytyczną lukę w wiedzy, łącząc izolację z charakterystyką hMPC. Co więcej, szczegółowe instrukcje krok po kroku zawarte w tym protokole sprawiają, że izolacja i charakterystyka hMPC jest dostępna dla szerokiej publiczności naukowej, w tym dla osób o ograniczonym wcześniejszym doświadczeniu z hMPC. Nasz protokół jest jednym z pierwszych, który opisuje użycie cytometru obrazującego do śledzenia populacji komórek. Nowo zaprojektowane cytometry obrazujące są najnowocześniejsze, wysokowydajne i oparte na mikropłytkach, umożliwiając obrazowanie żywych komórek, zliczanie komórek i wielokanałową analizę fluorescencyjną wszystkich komórek w każdym dołku naczynia hodowlanego w ciągu kilku minut. System ten pozwala na szybką kwantyfikację dynamicznych zmian w proliferacji i żywotności całej populacji komórek przy minimalnym zakłóceniu hodowli. Na przykład, jesteśmy w stanie wykonać obiektywne pomiary konfluencji w kolejnych dniach in vitro, aby określić kinetykę wzrostu każdej kultury pochodzącej od różnych dawców. Wiele protokołów w literaturze, szczególnie te dotyczące różnicowania MPC, wymaga, aby komórki osiągnęły określony poziom konfluencji przed zainicjowaniem różnicowania lub leczenia⁷. Nasza metoda pozwala na obiektywne określenie zbiegu każdego dołka w naczyniu hodowlanym, co pozwala badaczom na rozpoczęcie leczenia w bezstronny, niesubiektywny sposób.

W przeszłości głównym ograniczeniem korzystania z podstawowych hMPC były niskie plony, które ograniczały liczbę komórek dostępnych do eksperymentów. My i inni wykazaliśmy, że wydajność MPC z tkanki biopsji mięśni szkieletowych wynosi 1−15 MPC na miligram tkanki (ryc. 1)⁸. Ponieważ nasz protokół pozwala na cztery przejścia komórek przed oczyszczeniem za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), nasze wyniki kriokonserwowanych hMPC, pochodzące z niewielkich ilości tkanki biopsyjnej (50-100 mg), są wystarczające do osiągnięcia celów badawczych, w których wymagane są liczne eksperymenty. Nasz protokół FACS wytwarza ~80% czystej (dodatniej Pax7) populacji MPC, dzięki czemu nasz protokół jest zoptymalizowany zarówno pod kątem wydajności, jak i czystości.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Institutional Review Board na Uniwersytecie Cornella. Wszyscy uczestnicy zostali przebadani pod kątem podstawowych schorzeń i wyrazili świadomą zgodę.

1. Pozyskiwanie ludzkiej tkanki mięśniowej za pomocą biopsji mięśni szkieletowych

1. Zidentyfikuj mięsień obszerny boczny za pomocą badania palpacyjnego, anatomicznych punktów orientacyjnych i aktywnego skurczu mięśnia.
2. Zbadaj palpacyjnie obszerny boczny, zmuszając uczestnika do naprężenia mięśnia czworogłowego uda i znalezienia brzucha mięśnia, około 1/3 drogi od rzepki do biodra i tylko brzuszno-bocznego do kości udowej.
3. Użyj papierowej taśmy mierniczej, aby zaznaczyć obszar markerem chirurgicznym około 4-6 cali od górnej części rzepki reprezentującej brzuch mięśnia.
4. Ogol włosy w pobliżu zaznaczonego obszaru, a następnie oczyść je środkiem antyseptycznym klasy chirurgicznej, który stosuje się przed zabiegami medycznymi (na przykład: 2% glukonianu chlorheksydyny (CHG) / 70% alkoholu izopropylowego (IPA)) .
5. Znieczulić miejsce biopsji 1% lidokainą.
   nuta: Należy unikać wstrzykiwania lidokainy do mięśni szkieletowych.
6. Wykonaj ścieżkę nacięcia 4−5 mm w zaznaczonym miejscu.
7. Po znieczuleniu obszaru wbij igłę Bergstroma z trokarem przez powięź do brzucha mięśnia (około 2-3 cm).
8. Wciągnąć tkankę mięśniową do igły Bergstroma, wycofując trokar tnący na 2−3 cm, podczas gdy asystent stosuje ssanie, wycofując dołączony tłok strzykawki o pojemności 60 ml.
9. Zamknij komorę cięcia.
10. Obrócić podstawę igły do biopsji o ćwierć obrotu i powtórzyć sekwencję otwierania igły, odsysania i zamykania igły.
    nuta: Za każdym razem, gdy igła jest zamykana, należy uzyskać nacięcie tkanki mięśniowej wewnątrz igły Bergstrom. Podczas pobierania próbki igła pozostanie w udzie w tej samej pozycji pionowej, podczas gdy będzie obracana wzdłużnie o 360°, aby uzyskać każdą próbkę. Tę sekwencję można powtórzyć 3−4 razy.
11. Pobraną tkankę z biopsji należy usunąć z igły do sterylnej, nieprzylegającej podkładki opatrunkowej.
12. Zbadaj tkankę i usuń wszelkie widoczne tkanki tłuszczowe i zwłóknieniowe za pomocą sterylnych ostrzy skalpela lub pęsety.
13. Umieść porcję (50-100 mg) tkanki w sterylnej probówce zawierającej pożywkę niezależną od CO₂ (np. Hibernate A).
    nuta: Masę tkanki określa się w następujący sposób. Najpierw umieść zakrytą probówkę zawierającą pożywkę na wadze i taruj. Następnie umieść tkankę w probówce, ponownie zakryj probówkę, a następnie zważyj probówkę zawierającą tkankę w pożywce.
14. Przechowywać probówkę zawierającą tkankę i pożywkę w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.
    nuta: Tkanka pobrana z biopsji powinna zostać przetworzona w ciągu 48 godzin od pobrania.

2. Izolowanie komórek progenitorowych ludzkich mięśni z tkanki biopsji

1. Zmiel tkankę do biopsji.
   1. Przenieś tkankę mięśniową z pożywki na sterylną szalkę Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub podobnym sterylnym miejscu pracy.
   2. Użyj sterylnych ostrzy skalpela, aby zmielić tkankę na ~1 mm³ kawałki.
2. Umyj zmieloną tkankę biopsyjną, aby usunąć resztki zanieczyszczeń.
   1. Przenieś tkankę mięśniową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i pozwól tkance osiąść grawitacyjnie.
   2. Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć tkanki mięśniowej.
   3. Dodaj 10 ml PBS do umytej tkanki i pozwól tkance mięśniowej przemieścić się grawitacyjnie.
   4. Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć tkanki mięśniowej.
   5. Dodaj 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o niskim poziomie glukozy i pozwól tkance przemieścić się grawitacyjnie.
   6. Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć tkanki mięśniowej.
3. Inkubować tkankę w pożywce trawiennej.
   1. Zawiesić tkankę mięśniową w 3 ml pożywki trawiennej (2 mg/ml kolagenazy D w DMEM o niskiej stężeniu glukozy).
      UWAGA: Roztwory podstawowe kolagenazy D można przygotować w dawce 20 mg/ml w DMEM o niskiej zawartości glukozy i przechowywać w temperaturze -80 °C, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:10 w DMEM o niskiej stężeniu glukozy w momencie użycia.
   2. Inkubować probówkę zawierającą tkankę mięśniową w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
   3. Zawiesinę tkanki mięśniowej należy rozcierać co 10 minut za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml lub pipety o szerokim otworze.
   4. Dodać 83 μl dodatkowej pożywki trawiącej i 24 μl roztworu dypazy (0,76 mM octanu wapnia, 1,39 mM octanu sodu, 13,91 mg/ml dyspazy II w DMEM o niskiej stężeniu glukozy). Zawiesinę umieścić z powrotem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   5. Zawiesinę tkanki mięśniowej należy rozcierać co 5-10 minut za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze.
   6. Kontynuuj rozcieranie aż do uzyskania jednolitej zawiesiny i nie dłużej niż 1,5 godziny, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu.
      nuta: Wystarczające rozdrobnienie tkanki i aktywność enzymatyczna kolagenazy i dypazy mogą wpływać na trawienie próbki. Jednolita zawiesina powinna być w stanie przejść przez normalną końcówkę pipety z minimalną okluzją po 1,5 godziny. Jeżeli po upływie 1,5 godziny nie uzyska się jednolitej zawiesiny, należy dokładnie sprawdzić, czy rozdrobnienie tkanek jest wystarczające, a tkanka jest rozdrobniona do odpowiedniej wielkości (etap 2.1.2). Dodatkowo, aktywność enzymów powinna być badana, ponieważ występuje zmienność aktywności enzymatycznej między partiami.
4. Komórki osadkowe i zamrażanie w pożywkach regeneracyjnych.
   1. Dodać 6 ml pożywki wzrostowej (GM; 79% F12 szynki, 20% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny, 5 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów [bFGF], pH 7,4, przepuszczonych przez filtr 0,22 μm) do gnojowicy mięśniowej.
   2. Odpipetować zawiesinę przez sitko o pojemności 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Opłucz sitko dodatkowymi 4 ml GM.
      nuta: Próbkę można przenieść z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, co ułatwia wizualizację granulki. Można użyć większej objętości prania, jeśli wydajność kolejnych komórek jest niska.
   3. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   4. Odessać supernatant, upewniając się, że nie zakłóci to osadu. Przesuń rurkę, aby ponownie zawiesić osad w pozostałym podłożu. Jeśli komórki nie będą hodowane natychmiast, przejdź do kroku 2.4.5, aby uzyskać instrukcje dotyczące długotrwałego przechowywania, w przeciwnym razie przejdź do kroku 3.1.6.
      nuta: Jeśli pożądany jest natychmiastowy posiew, GMO w płytkach do hodowli komórkowych należy wstępnie inkubować (etapy 3.1.1 i 3.1.2) przed rozpoczęciem biopsji.
   5. Dodać 1,5 ml pożywki do zamrażania kultur komórkowych (tabela materiałów) do odzyskanego osadu.
   6. Przenieś gnojowicę do kriowialu. Umieścić kriowial w chłodziarce o kontrolowanej szybkości izopropanolu na noc w temperaturze -80 °C. Przechowywać kriowial w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowy do hodowli.
      nuta: Kriowiale zawierające gnojowicę mogą być przechowywane w ciekłym azocie do długotrwałego przechowywania (dłużej niż 1 miesiąc). Zastosowanie schładzacza o kontrolowanej szybkości izopropanolu pozwala na powtarzalne zamrażanie komórek z szybkością 1 °C/min, co skutkuje optymalnymi wskaźnikami odzysku komórek, o czym świadczy żywotność po zamrożeniu i zwiększone prawdopodobieństwo przyłączenia do naczyń do hodowli komórkowych⁹. Alternatywnie można użyć zlewki zawierającej izopropanol RT, umieszczonej w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

3. Hodowla komórek progenitorowych ludzkich mięśni

1. Rozmrozić zawiesinę mięśni.
   1. Przed rozmrożeniem i wysiewem hMPC należy wstępnie zrównoważyć płytki do hodowli komórkowych w GM. Dodaj 250 μl GM do 4 dołków pokrytej kolagenem (kolagen I), 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Napełnij pozostałe studzienki 500 μl sterylnego podłoża bazowego (tj. F12), aby zapobiec parowaniu podczas długotrwałej hodowli.
      nuta: W przypadku biopsji od 50 g do 100 g odpowiednie są cztery studzienki na płytce 24-dołkowej. Jeśli tkanka biopsyjna jest mniejsza niż 50 g, bardziej odpowiednie mogą być dwie studzienki. Szczątkowe szczątki i niska liczba komórek uniemożliwiają zastosowanie techniki liczenia komórek na tym etapie; Dlatego dokładna gęstość wysiewu nie jest określona i różni się nieznacznie w zależności od biopsji.
   2. Inkubować naczynia do hodowli komórkowych z GMO w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 1 godzinę przed siewem.
   3. Wyjąć kriowiale z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; płyn w probówce powinien być całkowicie zanurzony w wodzie.
   4. Gdy rozmrażanie jest prawie zakończone (~5 min), przenieś kriowial do sterylnego okapu z przepływem laminarnym. Przenieść zawiesinę mięśniową z probówki kriowialnej i dodać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 6 ml wstępnie podgrzanego GM w ilości 1 ml / min.
   5. Odwirować gnojowicę mięśniową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze RT.
      nuta: Wahadłowa wirówka kubełkowa może ułatwić wizualizację małych granulek na tym etapie, ale nie jest niezbędna.
   6. Odessać supernatant, upewniając się, że nie zakłóci to osadu. Przesuń probówkę, aby ponownie zawiesić osad w pozostałym podłożu i ponownie zawiesić w 1 ml GM.
   7. Przenieść 250 μl zawieszonego osadu (obecnie uważanego za zawiesinę hMPC) do każdego z 4 dołków wstępnie inkubowanej 24-dołkowej płytki do hodowli komórek.
2. Hodowla i pasaż hMPC.
   1. Utrzymanie kultur hMPC w GM w temperaturze 37 °C w 5% CO₂,
      nuta: Zapasy genetycznie zmodyfikowanych organizmów bez bFGF (tj. F12, antybiotyków, FBS) są przygotowywane partiami i przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. bFGF dodaje się do GM w dniu stosowania. Pożywki zawierające bFGF można przechowywać przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.
   2. Dwadzieścia cztery godziny po izolacji odessać GM, delikatnie umyć naczynie hodowlane 2x wstępnie podgrzanym GM i dodać świeże GM.
      UWAGA: 24 godziny powinny zapewnić hMPC odpowiedni czas na dołączenie; po umyciu nie należy usuwać żadnych hMPC. Ten krok usunie również pozostałe zanieczyszczenia, które powstały podczas zbierania komórek, dzięki czemu naczynie będzie bardziej podatne na dokładne skanowanie konfluencji za pomocą cytometru obrazującego (sekcja 5 poniżej). Po tej początkowej zmianie podłoża GM jest zmieniany co 48 godzin.
   3. Pasaż hMPC po osiągnięciu 70% konfluencji lub gdy pozostały na tej samej szalce hodowlanej przez 10 dni, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
      UWAGA: 70% konfluencja to około 55 000 komórek/cm².
   4. Aby przejść, dodaj 250 μl wstępnie podgrzanej trypsyny do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i inkubuj przez ~ 5 min.
   5. Postukaj w naczynie do hodowli komórkowej o twardą powierzchnię, aby odłączyć hMPC. Mikroskop świetlny może być użyty do sprawdzenia, czy hMPC odłączyły się.
   6. Przenieść zawiesiny trypsyny/hMPC do 5 ml GM w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
   7. Odwirować zawiesinę hMPC o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Usunąć zawiesiny hMPC z wirówki i umieścić na lodzie w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
      nuta: Utrzymywanie hMPC na lodzie podczas przechodzenia powoduje mniejszą agregację komórek.
   9. Odessać supernatant z hMPC i delikatnie zawiesić osad w 1 ml GM.
   10. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
       nuta: Rozcieńczenie zawiesiny komórkowej do buforu zliczającego komórki w stosunku 1:5 jest ogólnie właściwe.
   11. Wysiewaj hMPC na pokrytych kolagenem szalkach hodowlanych zawierających wstępnie podgrzane GMO o gęstości 3,500 komórek na^cm2. Idealne jest połączenie płytek 10 cm i płytek 24-dołkowych. 24-dołkowe płytki mogą być skanowane codziennie za pomocą cytometru obrazującego w celu monitorowania wzrostu.
   12. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą (zaczynając od kroku 3.2.4.) dla kolejnych fragmentów.
       nuta: Zdrowie i czystość komórek można monitorować we wszystkich kanałach za pomocą markera starzenia się komórek (np. β-galaktozydazy) i barwienia immunologicznego dla Pax7.
3. Kriokonserwacja hMPC.
   1. Kriokonserwuj nadmiar komórek do późniejszego wykorzystania, aby objętość hodowli była łatwiejsza do opanowania.
   2. W celu krioprezerwacji postępuj zgodnie z procedurą trypsynizacji opisaną w krokach 3.2.4.-3.2.9.
   3. Podczas wirowania zawiesiny komórkowej przygotuj mieszaninę 20% (np. 200 μL) dimetylosulfotlenku (DMSO) i 80% (np. 800 μL) GM. Pipetę w górę i w dół 20x, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie. Pozostaw mieszaninę na lodzie.
   4. Na podstawie liczby komórek rozcieńczyć zawiesinę hMPC do 2 x 10⁶/ml w GM.
   5. Połącz zawiesinę hMPC i 20% sterylną mieszaninę DMSO/80% GM 50/50. Końcowa pożywka do kriokonserwacji to połączenie DMSO (10%) i GM (90%) zawierające 1 x 10⁶ hMPCs/ml.
   6. Umieścić 1 ml zawiesiny hMPC przygotowanej w kroku 3.3.5 w tylu kriowialach, na ile pozwala początkowa liczba komórek. Następnie umieścić na noc podany hMPC w chłodziarce o kontrolowanej szybkości izopropanolu w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
      nuta: Na tym etapie zwykle uzyskuje się od 5 do 15 milionów komórek, z których 30-60% jest identyfikowanych przez FACS jako hMPC.

4. Izolowanie komórek progenitorowych ludzkich mięśni Pax7⁺ za pomocą cytometrii przepływowej

1. Aby przygotować hMPC z żywych kultur (krok 3.2.11), trypsynizuj wystarczającą ilość naczyń hodowlanych na 1 x 10⁶−2 x 10⁶ komórek. Przygotować zawiesiny komórek zgodnie z opisem w krokach 3.2.4−3.2.9.
2. Przygotować hMPC z kultur kriokonserwowanych (etap 2.4.6 lub 3.3.6).
   1. Wybierz 1−2 probówki zawierające ~1 x 10⁶ przejść cztery hMPC dla każdego dawcy.
      nuta: Użycie pasażu czterech hMPC pozwala na odpowiednią wydajność komórek przy jednoczesnym zachowaniu potencjału proliferacyjnego do przejścia szóstego (Rysunek 2).
   2. Szybko rozmrozić komórki, wyjmując je z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieszczając w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z płynem w rurce całkowicie zanurzonym.
   3. Gdy rozmrażanie jest prawie zakończone (~5 min), przenieś hMPC do sterylnego okapu z przepływem laminarnym i przenieś zawartość zawiesiny komórek do 6 ml wstępnie podgrzanego GM w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z szybkością 1 ml / min.
   4. Przygotować zawiesiny komórek zgodnie z opisem w krokach 3.2.7−3.2.9.
   5. Zawiesić każdą osadkę w 3 ml buforu FACS (500 ml PBS, 12,5 ml normalnej surowicy koziej, 2 ml 0,5 M EDTA, pH 7,4, przepuszczone przez filtr 0,22 μm).
   6. Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Odessać supernatant z hMPC i delikatnie zawiesić osad w 250 μl buforu FACS; umieścić na lodzie.
   8. Umieścić 100 μl komórek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml i pozostawić na lodzie do użycia jako żywe/martwe kontrole (krok 4.5.1).
      UWAGA: 100 ul komórek, które mają być użyte do kontroli żywych/martwych, może pochodzić z pobrania małej objętości (~20 ul) zawieszonych komórek od każdego dawcy, który ma być sortowany, lub z komórek z banków.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie pobierać więcej niż 20 ul zawieszonych komórek od jednego dawcy. Zwiększ objętość do 100 ul za pomocą bufora FACS, jeśli dostępne jest < 100 ul komórek.
3. Barwienie hMPC dla markerów powierzchni komórek.
   1. Przygotuj następujący koktajl przeciwciał (podane ilości dotyczą każdej kultury, odpowiednio zwiększyć): 5 μl CD56 (cząsteczka adhezyjna komórek nerwowych [NCAM]; PE-Cy7-sprzężony) i 5 μl CD29 (β1-integryna; AlexFluor488-sprzężony). Końcowe rozcieńczenie przeciwciał wynosi 1:50.
   2. Dodać 10 μl koktajlu przeciwciał do każdej zawiesiny hMPC i inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności.
   3. Dodać 10 ml buforu FACS do każdej mieszaniny koktajlu zawiesiny/przeciwciał.
   4. Odwirować każdą probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Zawiesić osad w 300 μl buforu FACS i przenieść do probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml z okrągłym dnem.
   6. Zawiesinę należy przechowywać na lodzie i chronić przed światłem.
4. Przygotuj koraliki kompensacyjne.
   UWAGA: Kontrole dodatnie dla każdego przeciwciała i kontrola ujemna (niebarwione kulki) powinny być przygotowane przy użyciu kulek kompensacyjnych. Przed sortowaniem próbek należy przeprowadzić kontrolę kulek kompensacyjnych na cytometrze przepływowym. Te kontrole pozwalają określić, ile fluorochromu z każdego przeciwciała można wykryć w kanale drugiego, aby można było zastosować kompensację.
   1. Koraliki kompensacji wirów.
   2. Do trzech probówek do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml dodaj jedną kroplę (50 μl) kulek kompensacyjnych.
   3. Dodać 1 μl każdego przeciwciała do odpowiedniej probówki lub nie dodać żadnego do kontroli ujemnej.
   4. Inkubować w ciemności przez 15 minut.
   5. Dodaj 1,5 ml buforu FACS do każdej probówki i odwiruj.
   6. Odwirować każdą probówkę o stężeniu 300 x g w wirówce stołowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl buforu FACS.
      nuta: Granulka może być bardzo trudna do wizualizacji; Należy zachować ostrożność podczas zasysania supernatantu.
   8. Umieść zawiesinę w probówce z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml, a następnie trzymaj probówkę na lodzie i chroń przed światłem.
5. Przygotuj żywe i martwe kontrole.
   1. Podzielić 100 μl hMPC z kroku 4.2.8 na dwie probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,7 ml (jedną dla kontroli pod napięciem i jedną dla kontroli martwej).
   2. Umieścić rurkę ograniczającą martwe chwile w bloku grzewczym podgrzanym do temperatury 70 °C na >10 min. W tym czasie utrzymuj kontrolę na żywo na lodzie.
   3. Odwirować każdą probówkę o stężeniu 300 x g w wirówce stołowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 150 μl buforu FACS.
   5. Połącz żywe/martwe elementy sterujące w jednej probówce z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml.
6. Wykonaj barwienie żywotności.
   1. Dodać 1 μl 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD) do wszystkich probówek zawierających komórki, które mają być sortowane, oraz żywą/martwą kontrolę.
   2. Dodać GM do pokrytych kolagenem płytek 24-dołkowych (250 μl/basenik) i 10 cm (8 ml/dołek) i pozostawić do zrównoważenia w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
7. Sortuj hMPC za pomocą cytometrii przepływowej.
   1. Sortować hMPC na cytometrze przepływowym z dyszą 100 μm pod ciśnieniem 20 psi. Określ żywe hMPCS na podstawie rozproszenia bocznego i przedniego, a także negatywności 7-AAD (parametry sortowania i sortowanie reprezentatywne można zobaczyć w Rysunek 3).
   2. Komórki dodatnie dla PE-Cy7 (780/60 nm) i AlexFluor488 (530/30 nm) reprezentują komórki CD56 ⁺ / CD29 ⁺, a zatem są komórkami Pax7 dodatnimi (hMPC). Sortować podwójnie dodatnie komórki do probówek zbiorczych zawierających 300 μl poduszki buforu FACS.
      nuta: Czystość posortowanych kultur można określić za pomocą barwienia immunologicznego dla Pax7, a następnie analizy cytometrii przepływowej (Rysunek 4).
   3. Odrzuć wszystkie inne komórki.
   4. Przenieś posortowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   5. Obracać zawiesinę hMPC o masie 300 x g przez 5 minut przy RT.
   6. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml GM.
   7. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
      nuta: Chociaż liczbę komórek można wywnioskować jako liczbę zdarzeń, które są pozytywnie posortowane, stwierdzono, że liczba ta zawyża liczbę komórek o 10-40% w porównaniu z tradycyjnymi metodami liczenia komórek.
   8. Zasiej hMPC zgodnie z opisem w kroku 3.2.11.
      nuta: Weryfikację czystości populacji hMPC można określić za pomocą barwienia immunologicznego dla Pax7 i analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

5. Charakterystyka hodowli ludzkich komórek progenitorowych mięśni (hMPC) za pomocą cytometru obrazującego

1. Użyj cytometru obrazującego (tabela materiałów), aby wykonać skany konfluencji.
   1. Wybierz opcję Utwórz nowy skan, a następnie wprowadź/wybierz kategorię blachy, profil blachy i identyfikator blachy. Cytometr obrazujący może pomieścić płytki 96-, 24- i 6-dołkowe.
   2. W obszarze Application (Aplikacja) wybierz pozycję Confluence > Confluence 1.
   3. Wybierz studnię do wyświetlenia za pomocą nawigatora po prawej stronie ekranu.
   4. Znajdź płaszczyznę ostrości, w której komórki wydają się białe w porównaniu z tłem i wybierz rejestr ręczny lub pozwól cytometrowi obrazującemu wybrać płaszczyznę ostrości, wybierając opcję zarejestruj automatycznie.
      nuta: Dla 96 płytek dołkowych sugerowanych w Tabeli Materiałów przybliżona pozycja wynosi 4,3 jednostki.
   5. Użyj myszki, aby podświetlić wszystkie studnie, które należy zeskanować. Cały obszar studni zostanie automatycznie przeskanowany. Wybierz opcję Rozpocznij skanowanie.
   6. Wybierz ustawienia analizy optymalne dla typu płytki i komórki.
      nuta: W przypadku hMPC optymalne są następujące ustawienia: intensywność = 6, intensywność nasycenia = 0, średnica = 8, minimalna grubość = 3, minimalny rozmiar klastra = 500 i precyzja = wysoka.
   7. Wybierz pozycję Start Analysis.
      nuta: Sprawdź wzrokowo obrazy, aby upewnić się, że użytkownik i cytometr obrazujący zgadzają się co do obwodu komórek. Jeśli występuje duża rozbieżność, należy ponownie zeskanować płytę, używając innej płaszczyzny ostrości lub innych ustawień analizy. Skanowanie konfluencji może być wykorzystywane do porównywania wzrostu między kulturami, czasu podawania leku lub do monitorowania komórek i decydowania, kiedy rozpocząć różnicowanie. Jeśli pożądane jest rozróżnienie, szczegółowe informacje znajdują się w punkcie 6.
2. Użyj cytometru do obrazowania, aby policzyć komórki.
   1. Przygotować roztwór barwiący zawierający 12 ml F12 szynki, 6 μl Hoechst 33342 i 24 μl jodku propidyny.
   2. Odessać pożywkę i zastąpić roztworem barwiącym, inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
   3. Odessać roztwór barwiący i zastąpić go Ham's F12.
      nuta: Ważne jest, aby używać podłoża o niskim poziomie czerwieni fenolowej, aby uzyskać wyraźne obrazy. Alternatywnie można użyć PBS.
   4. Załaduj płytkę do cytometru obrazowego i w obszarze Application (Zastosowanie) wybierz opcję Cell Viability (Żywotność komórek) > Live + Dead + Total (Żywe + Martwe) + Total. Kanał na żywo będzie obrazem jasnego pola, martwy kanał będzie jodkiem propidium, a całkowity kanał będzie Hoechst 33342.
   5. Ustaw kanał Live na jasne pole i kliknij opcję Register Auto (Zarejestruj auto) w obszarze Focus Setup (Ustawienia ostrości).
   6. W obszarze Łączna liczba kanałów ustaw kanał na niebieski. Użyj funkcji Znajdź ostrość, aby ustawić ostrość na jądrach, lub użyj strzałek w górę i w dół, aby ręcznie ustawić ostrość. Kliknij przycisk Ustaw przesunięcie, aby wybrać fokus.
   7. Pod kanałem Martwy ustaw kanał na czerwony. Użyj funkcji Znajdź fokus, aby ustawić ostrość martwych komórek, lub użyj strzałek w górę i w dół, aby ręcznie ustawić fokus. Kliknij przycisk Ustaw przesunięcie, aby wybrać fokus.
   8. Wybierz opcję Rozpocznij skanowanie, aby rozpocząć skanowanie.
   9. Wybierz parametry analizy, które są odpowiednie dla typu płyty i komórki. Wybierz opcję Rozpocznij analizę, aby rozpocząć analizę. Po zakończeniu analizy sprawdź wzrokowo, czy analiza prawidłowo zlicza komórki (np. dla całego kanału sprawdź, czy każde jądro jest rozpoznawane jako jądro i czy cytometr obrazujący nie liczy żadnych plam w tle jako jąder). Jeśli skan i analiza są zadowalające, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, w przeciwnym razie należy ponownie zeskanować lub zmodyfikować parametry analizy.

6. Różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni (hMPC) do Myotubes

1. Określ konfluencję hMPC za pomocą protokołu opisanego w sekcji 5.1. Aby zróżnicować hMPC w miotuby, idealnie jest, aby komórki były zlewające się w 80−85%, jak określono za pomocą funkcji konfluencji na cytometrze obrazowania (patrz sekcja 5). Jeśli używane są hMPC od więcej niż jednego unikalnego dawcy, skanowanie konfluencji pozwala komórkom od różnych dawców rozpocząć różnicowanie w momencie osiągnięcia konfluencji.
   nuta: Przy 80% konfluencji znajduje się około 66 000 komórek/^cm2.
2. Przemyj komórki 2x pożywką różnicującą (97% F12 Hama, 2% surowica końska, 1% penicylina/streptomycyna, pH 7,4, przepuszczone przez filtr 0,22 μm).
3. Utrzymuj komórki w pożywce różnicującej tak długo, jak wymaga tego eksperyment, codziennie zmieniając pożywkę.
4. Bezpośrednio oceniaj tworzenie miotub przez barwienie immunologiczne dla embrionalnego łańcucha ciężkiego miozyny, który jest zwykle wykrywalny po 7-10 dniach różnicowania.
   nuta: Czas potrzebny do wytworzenia miotub może się nieznacznie różnić w zależności od dawcy i liczby komórek w momencie zainicjowania różnicowania; Dlatego zaleca się indywidualne monitorowanie posiewów od każdego dawcy.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki cytometrii przepływowej izolacji hMPC z ludzkiej tkanki mięśniowej można zobaczyć w Rysunek 1. hMPC można zidentyfikować najpierw na podstawie zdarzeń bramkowania na podstawie rozproszenia bocznego i rozproszonego do przodu w celu wyeliminowania martwych komórek lub zanieczyszczeń, a następnie wybierając tylko te komórki, które są ujemne dla 7-AAD i dlatego są żywotne. Selekcja komórek dodatnich dla obu markerów powierzchniowych komórek...

Dyskusja

Pierwotne hMPC są ważnym modelem badawczym wykorzystywanym do zrozumienia biologii mięśni szkieletowych i procesu regeneracji. Dodatkowo, hMPC mają potencjał do wykorzystania w terapii. Istnieją jednak uznane wyzwania związane z wykorzystaniem pierwotnych hMPC zarówno do badań, jak i terapii, w tym ograniczone zrozumienie komórek pochodzących od ludzi¹⁰. Istnieje również duży stopień zróżnicowania zdolności do ekspansji między kulturami dawców, co ogranicza potencjał stosowania hMPC i może wpływać...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% trypsyna, 2,21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsyna służy do usuwania przylegających hMPC z naczyń do hodowli komórkowych
Płytka do hodowli komórkowej 10 cm	VWR	664160	Płytki do hodowli hMPC
15 ml probówka Falcon	Falcon	352196	stożkowe rurki 15 mL stosowane we wszystkich protokołach izolacji i hodowli hMPC
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	Grenier Bio-One	662 160	Płytki używane do hodowli hMPC
7-AAD Roztwór do barwienia żywotności	eBioscience	00-6993-50	Barwnik żywotności do identyfikacji żywych komórek podczas sortowania FACS
Alexa Fluor 488 anty-ludzki CD29, klon: TS2/16	BioLegend	303016	Sprzężone przeciwciało dla FACS
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	Grenier Bio-One	655079	96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej idealna do obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu Celigo S
Celigo S Cytometr	Nexcelcom Bioscience		Imaging służący do śledzenia hodowli hMPC
Sitko komórkowe	VWR	352350	Sitko do komórek do usuwania dużych kawałków zanieczyszczeń podczas przetwarzania biopsji mięśni
Kolagen typu I (Rat Ogon)	Corning	354236	Kolagen do powlekania płytek do hodowli komórkowych
Kolagenaza D	Roche	11 088 882 001	Stosowana do degradacji kolagenu i innej tkanki łącznej w tkance biopsji mięśni szkieletowych
Dimetylosulfotlenek	VWR	WN182	Stosowany do kriokonserwacji hMPC
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	Proteaza stosowana do enzymatycznego trawienia tkanki
biopsji mięśni szkieletowychDulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose Powder	Gibco	31600-034	Niskoglukozowy DMEM do przetwarzania biopsji mięśni
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco	Gibco	21600-010	PBS do przetwarzania biopsji mięśni
EDTA Sól disodowa Dihydrat	J.T. Baker	4040-01	Wymagane dla bufora FACS
Surowica bydlęca płodu	VWR	89510-186	Płodowa surowica bydlęca stosowana do pożywek wzrostowych hMPC
Ham's F12	Gibco	21700-026	Pożywka bazowa do hMPC
Inaktywowana termicznie surowica koni	Gibco	26-050-070	Surowica końska używana do produkcji pożywki różnicującej hMPC
Hemocytometr	iNCyto	DHC-N0105	Służy do liczenia komórek
Hibernacja A	Gibco	A1247501	Pożywka do konserwacji biopsji mięśni szkieletowych tkanka
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian	Life Technologies	H21492	Barwienie DNA do identyfikacji wszystkich komórek za pomocą Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Służy do kontrolowanego zamrażania hMPC
Bufor Moxi	Orflo	MXA006	Bufor do automatycznego licznika komórek
Kasety	Moxi Orflo	MXC002	Kasety do automatycznego licznika komórek
Moxi z Mini Automatyczny licznik komórek	Orflo		Automatyczny licznik komórek
Mr. Frosty Pojemnik do zamrażania	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Dostępny komercyjnie pojemnik do zamrażania komórek o kontrolowanej szybkości
Normalna surowica kozia (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Serum kozie stosowane w buforze FACS
PE-Cy7 Mysz anty-ludzka CD56 , klon: B159	BD Pharmingen	557747	Sprzężone przeciwciało dla FACS
Penicylina/Streptomycyna 100x Roztwór	Corning	30-002-CI	Antybiotyki dodawane do pożywek
hodowlanych Jodek propidyny	Thermo Fisher Scientific	P3566	Barwienie DNA do identyfikacji martwych komórek za pomocą
rekombinowanego ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów	Suplement Promega	G5071	w pożywce wzrostowej hMPC zapobiegający spontanicznemu różnicowaniu
Regeneracyjne podłoże do zamrażania kultur komórkowych	Gibco	12648-010	Pożywka używana do kriopevery zawiesin z biopsji mięśni
Wodorowęglan sodu	Fisher Scientific	S233-3	Dodany do
sterylnych probówek z okrągłym dnem 5 ml	VWR	60818-565	Probówki używane do FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Koraliki kompensacyjne do kalibracji przepływu Ustawienia FACS