Ten protokół ilustruje metodę enkapsulacji komórek poprzez szybkie fizyczne żelowanie alginianu w celu unieruchomienia komórek. Uzyskane mikrogranulki umożliwiają kontrolowane i trwałe wydzielanie β amyloidu w czasie i mogą być wykorzystywane do badania skutków wydzielania β amyloidu w modelach in vitro i in vivo.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie mikrogranulek alginianu wydzielających β amyloid do wykorzystania w modelowaniu choroby Alzheimera
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zgodnie z hipotezą kaskady amyloidowej, najwcześniejszym czynnikiem powodującym rozwój choroby Alzheimera (AD) jest nagromadzenie toksycznych fragmentów β amyloidu (Aβ), co ostatecznie prowadzi do klasycznych cech choroby: blaszek amyloidowych, splątków neurofibrylarnych oraz utraty synaps i neuronów. Brak odpowiednich nietransgenicznych modeli przedklinicznych odzwierciedlających postęp choroby jest jednym z głównych czynników utrudniających odkrycie skutecznych terapii farmakologicznych. W tym celu opracowaliśmy protokół wytwarzania mikrogranulek alginianowych zawierających komórki wydzielające amyloid, przydatny do badania skutków przewlekłej produkcji Aβ.
Komórki jajnika chomika chińskiego, wcześniej transfekowane ludzkim genem APP, wydzielające Aβ (tj. komórki 7PA2), zostały użyte w tym badaniu. Trójwymiarowy (3D) model in vitro do przedłużonego uwalniania Aβ został wytworzony poprzez enkapsulację komórek 7PA2 w alginianie. Proces został zoptymalizowany pod kątem średnicy kulki 500-600 μm na potrzeby dalszych badań in vivo. Przeprowadzono optymalizację enkapsulacji komórek 7PA2 w alginianach, zmieniając parametry wytwarzania, np. stężenie alginianu, szybkość przepływu żelu, potencjał elektrostatyczny, częstotliwość drgań głowicy, roztwór żelujący. Poziomy wydzielanego Aβ analizowano w czasie i porównywano między kulkami alginianowymi a standardowymi metodami hodowli komórkowych (do 96 godzin).
Stwierdzono, że stężenie 1,5 x 106 komórek 7PA2/ml i stężenie alginianu 2% (w/v) buforowane HEPES i następnie żelowanie w 0,5 M chlorku wapnia przez 5 minut wytwarzają najbardziej stabilne mikrogranulki. Wytworzone mikrokulki były 1) o jednakowej wielkości, 2) o średniej średnicy 550 μm, 3) zawierały około 100-150 komórek na mikrokulkę i 4) były zdolne do wydzielania Aβ.
Podsumowując, nasza zoptymalizowana metoda produkcji stabilnych mikrogranulek alginianowych zawierających komórki 7PA2 wytwarzające amyloid może umożliwić modelowanie ważnych aspektów choroby Alzheimera zarówno in vitro, jak i in vivo.
Wprowadzenie
Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych jest trudne ze względu na złożoną i skomplikowaną naturę mózgu. W chorobie Alzheimera (AD) uważa się, że postępująca utrata funkcji synaptycznych i śmierć neuronów są efektem wtórnym stałej nadprodukcji i akumulacji peptydów amyloid beta (Aβ) w wyniku nieprawidłowego przetwarzania białka prekursorowego amyloidu (APP), zgodnie z hipotezą kaskady amyloidowej1.
Aby zrozumieć mechanizmy tej patologii indukowanej przez amyloid oraz pomóc w identyfikacji nowych celów terapeutycznych, naukowcy opracowali różne przedkliniczne modele in vivo. Jedna kategoria modeli wykorzystuje bolusowe wstrzyknięcie syntetycznego peptydu Aβ do mózgu szczura2,3,4. Głównym ograniczeniem takich modeli jest to, że opierają się one na jednorazowym lub powtarzanym podaniu wysokich stężeń peptydów Aβ zdeponowanych za jednym razem. Jest to niezgodne z chronicznym, ciągłym charakterem uwalniania Aβ w przebiegu choroby5. Inną kategorią modeli in vivo są transgeniczne modele zwierzęce wykazujące jedną lub więcej mutacji genetycznych powiązanych z rodzinnymi wariantami choroby6,7,8,9,10. Jednak ponieważ rodzinna postać AD odpowiada za mniej niż 5% wszystkich przypadków choroby Alzheimera1, zasadność stosowania tych modeli w odniesieniu do sporadycznej postaci AD u ludzi jest dyskusyjna12. Kolejną wadą podejścia transgenicznego jest przyspieszone tworzenie się Aβ od momentu narodzin, co przekłada się na deficyty funkcji poznawczych i zmiany patologiczne zachodzące zbyt szybko i agresywnie, by przypominać progresję choroby w sporadycznej AD u pacjentów12. Na przykład model 5x FAD generuje blaszki już po 1,5 miesiąca13.
Co ciekawe, obie te kategorie prowadzą do zmian w funkcjach poznawczych istotnych dla badań nad AD2,3,4,5,6, a czasami towarzyszy im pojawienie się patologicznych cech charakterystycznych dla tej choroby, takich jak blaszki amyloidowe6,8, fosforylacja białka tau6,7 oraz/lub utrata synaptyczna i neuronalna7,9,14. Jednak podczas gdy tego typu modele mogą dostarczyć informacji na temat skutków wysokiego poziomu amyloidu w mózgu, które często wiążą się z późniejszymi etapami AD, nie odzwierciedlają one wcześniejszych zmian występujących w odpowiedzi na chroniczną i długotrwałą ekspozycję na peptyd Aβ12, takich jak zmieniona ekspresja markerów synaptycznych15 i składników macierzy zewnątrzkomórkowej16. W związku z tym nadal istnieje potrzeba stworzenia modelu chronicznego, który dokładniej ilustruje wpływ długotrwałej sekrecji Aβ na funkcje poznawcze in vivo oraz obrazuje zmiany w patologii.
W tym celu opracowaliśmy system umożliwiający stałą, długotrwałą sekrecję Aβ w sposób kontrolowany poprzez unieruchomienie komórek wydzielających amyloid w mikrokulkach hydrożelowych, które mogą być następnie implantowane do mózgu dorosłego szczura w celu modelowania aspektów sporadycznej postaci AD.
Jako biomateriał wybrano alginian, ponieważ jest on biokompatybilny i nie wywołuje żadnych niepożądanych reakcji po implantacji in vivo17. Enkapsulacja komórek w hydrożelach alginianowych jest dobrze udokumentowana w ciągu ostatnich czterech dekad. Pierwszy przykład zastosowania tej metody w klinice odnotowano w leczeniu cukrzycy typu 117. Najwcześniejszy raport o udanej enkapsulacji wysepek Langerhansa pochodzi z 1980 roku. Transplantacja mikrokulek zawierających komórki wydzielające insulinę zrewolucjonizowała możliwości leczenia pacjentów z cukrzycą, ponieważ przywróciła funkcję trzustki, eliminując konieczność insulinoterapii poprzez iniekcje18. Prace te wskazują, w jaki sposób enkapsulacja komórek może chronić je przed czynnikami stresowymi zewnątrz, zarówno mechanicznymi, jak i chemicznymi. W rzeczywistości kulki alginianowe pełnią rolę bariery i izolują komórki od otoczenia, zachowując ich fenotyp, jednocześnie zapewniając wystarczający dostęp do składników odżywczych z medium oraz usuwanie produktów przemiany materii komórek19. Ponadto zastosowanie alginianu pozwala na dopasowanie właściwości mechanicznych do tkanek miękkich20. Sztywność hydrożeli alginianowych można regulować w zakresie 1-30 kPa poprzez prostą zmianę stężenia alginianu i gęstości sieciowania20,21. Jest to kluczowy aspekt nie tylko dla utrzymania ekspresji fenotypowej enkapsulowanych komórek in vitro, ale także w celu uniknięcia efektów zapalnych po wszczepieniu in vivo2.
W niniejszym protokole zastosowano komórki 7PA2 – linię komórkową jajnika chomika chińskiego, stabilnie przetransfekowaną zmutowanym ludzkim genem APP V717F23. Komórki te stale produkują produkty katalityczne APP, w tym Aβ1-4224,25, i były wykorzystywane do generowania Aβ jako alternatywa dla produkcji syntetycznej w przedklinicznych, ostrych badaniach in vivo26. Opisujemy metodę wytwarzania służącą do unieruchomienia komórek 7PA2 w „miękkich” alginianowych mikrokulkach, zaprojektowanych w celu umożliwienia ciągłej sekrecji biomolekuł. Jako dowód koncepcji przedstawiamy raport z uwalniania peptydy Aβ1-42 w czasie. Wykorzystany alginian jest alginianem o niskiej lepkości, o masie cząsteczkowej 120 0-190 0 g/mol i stosunku kwasu mannuronowego do guluronowego wynoszącym 1,56 (M/G).
W dalszych badaniach mikrokule te mogą być bezpiecznie przeszczepiane do obszarów mózgu szczura istotnych dla AD (np. do hipokampu), aby badać wpływ przewlekłej sekrecji Aβ na zachowanie in vivo oraz patologię ex vivo. Dodatkowo system ten może być wykorzystywany do badania efektów przewlekłego uwalniania Aβ w zastosowaniach in vitro i ex vivo. Na przykład alginianowe mikrokule zawierające 7PA2 mogą być współhodowane in vitro z kulturami neuronów lub astrocytów w celu oceny wpływu przewlekłej ekspozycji na Aβ na mechanizmy komórkowe związane z AD. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do zbadania związku między przewlekłą produkcją Aβ a długotrwałym wzmocnieniem synaptycznym w elektrofizjologii ex vivo.
Kluczowym elementem niniejszego protokołu jest modułowość i elastyczność metody wytwarzania, która umożliwia otrzymanie kulek alginianowych o określonych wymiarach poprzez precyzyjne dostrojenie parametrów procesu. W zależności od zastosowania protokół można dostosować w celu uzyskania celowych parametrów w zakresie rozmiaru mikrokulek, gęstości enkapsulowanych komórek oraz sztywności mikrokulek. Protokół ten może być wykorzystany do enkapsulacji różnych typów komórek, co pozwala na opracowanie bardziej istotnych trójwymiarowych (3D) modeli in vitro do badania różnych jednostek chorobowych. Niedawno donosiliśmy o tym, jak komórki enkapsulowane w alginianie mogą być wykorzystane do modelowania wczesnych etapów progresji nowotworowej20.
Koncepcja procesu enkapsulacji opiera się na ekstruzji laminarnego strumienia komórek zawieszonych w roztworze alginianu przez dyszę. Głowica wibrująca przerywa strumień z kontrolowaną częstotliwością, co prowadzi do powstania kropli na bazie alginianu o jednakowym rozmiarze. Zewnętrzne pole elektryczne umożliwia rozdzielenie utworzonych kropli alginianowych, które po kontakcie z roztworem wzbogaconym w jony dwuwartościowe, takie jak jony wapnia, mogą szybko ulec sieciowaniu, zachowując swój sferyczny kształt. Inkubacja w roztworze żelującym pozwala na utworzenie sferycznych mikrokulek zawierających komórki wewnątrz jednorodnego hydrożelu fizycznego.27Docelowy rozmiar mikrokulek i hydrożeli alginianowych umożliwia dostarczanie składników odżywczychs oraz wymiana tlenu z pożywką do hodowli komórkowej przez długi czas (tygodnie). Rysunek 1A przedstaw schematyczny rysunek zastosowanego aparatu do enkapsulacji (Rysunek 1B).
Rysunek 1System enkapsulacji. (A) Schematyczny przedstawienie systemu enkapsulacji. Zawiesina alginianu z komórkami jest wprowadzana do strzykawki (2) i podawana przez zbiornik z prędkością ekstruzji ustawioną na pompie strzykawkowej (1). W zbiorniku głowica wibracyjna (3) wibruje z częstotliwością ustawioną przez generator przebiegów (4), aby przerywać strumień w równych odstępach czasu, tworząc krople o jednakowej wielkości. W miarę gdy roztwór jest podawany przez dyszę (5) i powstają krople, na elektrodę (7) przyłożony jest potencjał elektrostatyczny ustawiony przez generator napięcia (6), co lekko ładuje powierzchnię kropel, pozwalając strumieniowi rozprzestrzenić się w wyniku odpychających sił elektrostatycznych. Gdy krople trafiają do kąpieli żelującej (8), Ca2+Wymuszone sieciowanie alginianu prowadzi do powstania sferycznych mikrokulek.B) Zdjęcie urządzenia do enkapsulacji przed wytworzeniem alginianowych mikrokulek. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rozmiar mikrokulek można zmieniać w zależności od zamierzonego zastosowania. Aby kontrolować rozmiar mikrokulek, odpowiednio dostosowuje się poszczególne parametry przedstawione na Rysunku 1A oraz w protokole. Wewnętrzna średnica zastosowanej dyszy ma istotny wpływ na rozmiar kropel; kluczem do uzyskania spójnego rozkładu wielkości jest dalsza regulacja parametrów enkapsulacji, a mianowicie prędkości ekstruzji, częstotliwości drgań oraz napięcia. W Tabeli 1 opisano, w jaki sposób poszczególne parametry mogą wpływać na rozmiar mikrokulek uzyskiwanych w tym systemie.
| Parametr | Rozmiar dyszy | Częstotliwość drgań | Szybkość przepływu | Napięcie elektrody |
 | | | | |
| Wielkość kulek | |  | | – |
Tabela 1: Parametry wytwarzania i ich wpływ na rozmiar mikrokulek. Tabela przedstawia, w jaki sposób każdy parametr może wpływać na końcowy rozmiar wytworzonych mikrokulek, niezależnie od rodzaju dyszy i lepkości zastosowanego roztworu.
Protokół
1. Przygotowania
- Przygotować 100 ml ~4% (w/v) roztworu podstawowego alginianu.
- Odważyć 4,4 g soli sodowej alginianu i dodać suchy proszek do 100 ml soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) ze 150 mM NaCl (0,877 g) w wodzie dejonizowanej, umożliwiając nawodnienie.
- Użyj mieszadła magnetycznego z prędkością ~500 obrotów na minutę (rpm) i podgrzej do 50 °C, aby umożliwić pełne uwodnienie alginianów.
UWAGA: Alginian może potrzebować jednej lub dwóch godzin, aby zostać całkowicie nawodniony. Aby zaoszczędzić czas, roztwór alginianu można przygotować dzień przed protokołem enkapsulacji i przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego dnia. Gdy alginian jest przechowywany w lodówce, delikatnie podgrzać do temperatury 37 °C za pomocą łaźni wodnej lub płyty grzejnej i wymieszać mieszadłem magnetycznym bezpośrednio przed użyciem. - Przed użyciem sterylnie przefiltrować roztwór alginianu za pomocą filtra polieterosulfonowego (PES) o porach 0,22 μm. Zaleca się filtrowanie w temperaturze 37 °C, aby umożliwić łatwy przepływ alginianu. Lepkość wzrośnie, jeśli temperatura spadnie.
- Przygotować 1,000 ml 0,5 M CaCl2.
- Odważyć 55,49 g bezwodnego CaCl2 i rozpuścić w 1 000 ml HBS (20 mM HEPES i 150 mM NaCl w 1 000 ml wody dejonizowanej).
- Sterylny filtr wykorzystujący filtr PES o porach 0,22 μm.
- Przygotować 100 ml mieszaniny do rozpuszczania.
- Przygotować 100 mM roztworu HEPES (23,83 g) i 500 mM dwuwodnego cytrynianu trisodowego (147,05 g) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami.
- Dostosuj do pH 7,4 za pomocą NaOH lub HCl.
2. Konfiguracja systemu enkapsulacji
- Wyczyść okap z przepływem laminarnym.
- Wysterylizuj okap z przepływem laminarnym zawierający enkapsulator za pomocą ekspozycji na promieniowanie UV, a następnie spryskaj 70% v/v roztworem etanolu.
- Przepłucz system enkapsulacyjny 10 ml 70% roztworu etanolu v/v, a następnie 10 ml sterylnej wody dejonizowanej.
- Zamocuj dyszę 300 μm i powtórz krok 2.1.2.
- Spryskaj butelkę zawierającą przefiltrowany roztwór alginianu, butelkę zawierającą przefiltrowany roztwór chlorku wapnia oraz wszelkie narzędzia, sprzęt i puste płytki hodowlane, które będą używane, roztworem etanolu o stężeniu 70% v/v i umieść je w okapie z przepływem laminarnym. Przed użyciem ponownie włącz lampę UV na 30 minut, aby dokładnie wysterylizować.
- Przygotować zlewkę na odpady wypełnioną biologicznym roztworem dezynfekującym i umieścić zlewkę w pokrywie.
- Napełnij zlewkę 100 ml sterylnego roztworu CaCl2 (wodnego) i dodaj mieszadło magnetyczne. Ustaw prędkość mieszania na 100 obr./min. Umieść zlewkę na platformie magnetycznej na wysokości 18 cm od końcówki dyszy. Ta zlewka będzie używana do zbierania kulek alginianowych i umożliwienia ich żelowania.
- Przygotuj komórki do enkapsulacji.
- Usunąć komórki z inkubatora i odłączyć od kolby prawie zlewającej się, używając 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
- Wyizolować próbkę w celu oszacowania gęstości komórek, a następnie odwirować pozostałe komórki z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.
- Ponownie zawiesić osad w HBS (20 mM HEPES i 150 mM NaCl), aby podwoić końcowe pożądane stężenie komórek (np. dla końcowego stężenia 1,5 x 106 komórek/ml, ponownie zawiesić komórki w HBS, aby osiągnąć stężenie 3 x 106 komórek/ml).
- W probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wymieszaj zawiesinę komórek w stosunku 1:1 z ~4% (m/v) roztworem alginianu, aby uzyskać końcową zawiesinę zawierającą pożądane stężenie komórek (np. 1,5 x 106 komórek/ml) w ~2% (m/v) roztworze alginianu.
- Ustaw parametry hermetyzacji.
- Ustaw prędkość maszyny do enkapsulacji na maksymalną prędkość wytłaczania (8,9 ml/min), napięcie na 1,0 kV, a częstotliwość na 5,500 Hz.
UWAGA: Parametry te zostały wcześniej zoptymalizowane w celu uzyskania mikrokulek o średnicy 550 μm.
- Ustaw prędkość maszyny do enkapsulacji na maksymalną prędkość wytłaczania (8,9 ml/min), napięcie na 1,0 kV, a częstotliwość na 5,500 Hz.
3. Produkcja
- Wytwarzaj mikrogranulki.
- Do strzykawki o pojemności 20 ml należy wlać 5 ml zawiesiny alginianu komórkowego i podłączyć strzykawkę do kapsułki.
- Uruchom enkapsulator, aktywując przepływ, który przepchnie zawiesinę alginianu komórkowego przez podajnik. Strumień kropel zostanie wytłoczony przez dyszę.
- Zebrać pierwszy 1 ml do zlewki na odpady, aby usunąć początkowy niejednorodny strumień.
- Kontynuuj przepuszczanie pozostałych 4 ml, pozwalając, aby kropelki wpadły do kąpieli żelującej CaCl2. Każdy mililitr może być uruchamiany osobno (ale kolejno) i w razie potrzeby zbierany w czterech różnych kąpielach żelujących.
UWAGA: W kontakcie z kąpielą żelacyjną alginian w kropelkach natychmiast sieciuje się z jonami wapnia w kąpieli żelowej i tworzy kuliste mikrokulki. - Po jednej minucie wyjmij zlewkę żelującą z platformy magnetycznej i pozostaw mikrogranulki na kolejne 4 minuty bez mieszania (czas niezbędny do całkowitego przeżelowania mikrokulek w temperaturze pokojowej).
- Odzyskaj mikrogranulki.
- Usuń wszelkie duże zanieczyszczenia lub artefakty alginianowe za pomocą sterylnej pęsety, a następnie użyj sterylnej plastikowej pipety, aby przenieść do filtra siatkowego 74 μm w celu pobrania mikrogranulek z kąpieli żelującej.
- Przenieść mikrogranulki do probówki wirówkowej przy użyciu odpowiedniej pożywki hodowlanej i pozostawić do zrównoważenia przez 5 minut w pożywce do hodowli komórkowej.
- Przenieść do kolby, płytki lub płytki Petriego w celu inkubacji i dalszych doświadczeń.
UWAGA: Kąpiel żelująca nie powinna być ponownie używana.
4. Testowanie i stosowanie mikrogranulek
- Przetestuj jakość mikrogranulek.
- Aby ocenić żywotność komórek (lub inne odczyty biologiczne) po enkapsulacji i hodowli, delikatnie rozerwij mikrogranulki, aby uwolnić zamknięte komórki za pomocą mieszaniny rozpuszczania.
UWAGA: Wymagana objętość mieszaniny do rozpuszczania zależy od liczby mikrogranulek użytych w badaniu. Sugerowana dawka to 4 ml mieszaniny do rozpuszczania na każdy 1 ml zamkniętych komórek. Ten krok należy wykonać tylko na jednej próbce z każdej populacji mikrogranulek. - Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych uzupełnionym 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
- Oszacuj żywotność komórek znajdujących się teraz w roztworze, jak zwykle, barwiąc komórki błękitem trypanowym i używając komory hemocytometru.
UWAGA: W przypadku korzystania z automatycznych liczników komórek do szacowania żywotności komórek, należy zachować ostrożność, aby artefakty alginianowe nie zakłócały zliczania. W takich przypadkach zaleca się liczenie komórek krwionośnych. - Aby ocenić stabilność mikrogranulek, zmierz średnią średnicę próbki z każdej populacji mikrogranulek w czasie za pomocą mikroskopu i oprogramowania do obrazowania. Dramatyczne późniejsze zmiany średnicy mogą wskazywać na degradację alginianów.
- Aby ocenić żywotność komórek (lub inne odczyty biologiczne) po enkapsulacji i hodowli, delikatnie rozerwij mikrogranulki, aby uwolnić zamknięte komórki za pomocą mieszaniny rozpuszczania.
- Używaj mikrogranulek do wykrywania wydzielanego Aβ.
- Pobrać próbkę pożywki do hodowli komórkowych z komórek 7PA2 hodowanych w warunkach standardowych (2D) w odstępach 24 godzin i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.
- Pobrać próbkę pożywki do hodowli komórkowych z zamkniętych w kapsułkach komórek 7PA2 hodowanych w warunkach standardowych (3D) w odstępach 24 godzin i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.
- Wykryj wydzielanie Aβ z komórek 7PA2 do zebranych kondycjonowanych pożywek za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) (Figura 4).
- Użyj mikrogranulek do dalszych badań w odpowiednich zastosowaniach.
UWAGA: Kapsułkowane komórki 7PA2 mogą być używane do oceny skutków długotrwałego wydzielania Aβ w dowolnym modelu.- W celu wszczepienia mikrogranulek w hipokampie szczura w mózgu, wygeneruj przekroje koronalne mózgu szczura o grubości 1 mm i użyj narzędzi chirurgicznych, aby wprowadzić mikrogranulki w żądany obszar (Rysunek 5).
- Kapsułkować różne typy komórek w mikrogranulkach alginianowych zgodnie z opisanymi protokołami, aby ocenić trwałe uwalnianie interesujących biomolekuł. Odpowiednie systemy in vitro i in vivo mogą być dalej modelowane.
- Wykrywanie ekspresji markerów związanych z błoną w zamkniętych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej i/lub immunofluorescencji.
UWAGA: Przykład zastosowania podobnej metody do wytwarzania mikrogranulek modelujących wczesne etapy wzrostu masy guza i ekspresji biomarkerów jest opisany przez Rios 20.
Wyniki
Komórki 7PA2 zostały pomyślnie zamknięte w alginianowych mikrokuleczkach
Po przygotowaniu, zgodnie z niniejszym protokołem, uzyskano jednorodne i sferyczne alginianowe mikrokuleczki. Zdjęcia na Rysunku 2A poniżej prezentują przykład tego, jak zmiana jednego z parametrów (tj. napięcia) wpływa na przepływ i rozproszenie strumienia kropel alginianu. Rysunek 2B przedstawia przykład uzyskanych kuleczek alginianowych bezpośrednio po procesie żelowania.
Rycina 2Optymalizacja metody wytwarzania. (A) Fotografie przedstawiające zmiany w dyspersji strumienia. (B) Obraz w jasnym polu przedstawiający sferyczne mikrokule alginianowe bezpośrednio po wytworzeniu. (C) Przykład etapu optymalizacji: dostrajanie wybranych parametrów wytwarzania w celu uzyskania docelowego rozmiaru mikrokulek. Wybrane wykresy ilustrujące zależność między poszczególnymi parametrami a rozmiarem otrzymanych mikrokulek (rozkład rozmiarów dla co najmniej n = 100 mikrokulek). Należy zwrócić uwagę, że na rozmiar wytworzonych kulek może również wpływać średnica wewnętrzna dyszy, lepkość wyrzucanego roztworu oraz warunki żelowania. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (S.D.). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Opisany protokół jest elastyczny i pozwala na wytwarzanie mikrokulek na bazie alginianu o różnych rozmiarach, z composition różnicującą się w zależności od zastosowania. Na Ryc. 2C przedstawiamy wpływ szybkości przepływu alginianu, napięcia i częstotliwości na rozmiar mikrokulek, przy użyciu 2% (w/v) roztworu alginianu w HEPES (pH 7.2) ekstrudowanego przez dyszę o średnicy 30 μm.
Ponieważ celem niniejszego badania była produkcja mikrokulek, które mogą zostać osadzone w mózgu szczura, dostosowaliśmy parametry wytwarzania tak, aby uzyskać średnią średnicę mikrokulek w zakresie 50-60 μm. W celu kontroli jakości metoda została zoptymalizowana tak, aby uzyskać minimalną zmienność w populacji wytworzonych kulek (tj. wąski rozkład wielkości). Należy zauważyć, że (1) wyprodukowane kulki mogą być wstrzykiwane do mózgu szczura za pomocą strzykawki Hamiltona wyposażonej w igłę 20G oraz (2) jedna półkula mózgu szczura może pomieścić do dwóch lub trzech kulek tej wielkości.
Po optymalizacji, enkapsulacja komórek 7PA2 w stężeniu 1,5 x 106 komórek/mL zawieszonych w 2% (w/v) roztworze alginianu buforowanego HEPES i naniesienie ich kroplowo do 0,5 M kąpieli żelującej z chlorkiem wapnia pozwoliło uzyskać pożądane mikrokuleczki. Poniższa Rycina 3A przedstawia enkapsulowane komórki 7PA2 równomiernie rozmieszczone w mikrokuleczkach po jednym dniu w standardowych warunkach hodowli komórkowej. Proliferację komórek 7PA2 badano za pomocą testu MTS zgodnie z protokołem producenta. Nie stwierdzono istotnych różnic w zachowaniu komórek 7PA2 hodowanych z alginianem i bez niego w okresie siedmiu dni (Rycina 3B). Podczas inkubacji enkapsulowanych komórek w standardowych warunkach hodowli oczekuje się, że komórki będą nadal proliferować przez cały czas trwania eksperymentu, co może skutkować niewielkim stopniem ucieczki komórek, jak opisano w innych pracach28. Efekty tego zjawiska można złagodzić poprzez enkapsulację przy mniejszej gęstości komórek lub zmniejszenie stężenia surowicy, w której inkubowane są mikrokuleczki.
Rysunek 3Enkapsulowane komórki 7PA2. (A) Obraz w jasnym polu zamkniętych w kapsułkach komórek 7PA2, wykazujący równomierny rozkład komórek w całej alginianowej mikrokulce. Parametry wytwarzania ustawiono tak, aby uzyskać ok. 150 komórek 7PA2 na kulkę. W ciągu 7 dni hodowli nie zaobserwowano istotnych różnic w kulkach alginianowych. (BNie zaobserwowano różnic w ogólnym poziomie proliferacji komórek 7PA2 inkubowanych z alginianem w porównaniu z komórkami inkubowanymi bez alginianu. Komórki 7PA2 rosną i migrują w całej objętości kulek alginianowych; w celu spowolnienia wzrostu komórek można rozważyć zmniejszenie stężenia surowicy. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (S.D.). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Mikrokulki alginianowe enkapsulujące komórki 7PA2 są stabilne w czasie
W celu zbadania rozmiaru i kształtu otrzymanych mikrokulek alginianowych, po etapie wytwarzania i żelowania przeprowadzono analizę mikroskopową. Średnica mikrokulek uzyskanych zgodnie z wybranym protokołem wynosi 50 ± 2 μm.
Teoretycznie, liczbę komórek spodziewanych w mikrokulce o średnicy 50 μm można obliczyć w następujący sposób:
gdzie V = objętość, a r = promień. Objętość pojedynczego mikrokuleczki wynosi V = 8.8 x 10-5 mL; zatem liczba komórek na mikrokuleczkę w momencie enkapsulacji = (1.5 × 106) x (8.8 x 10-5) ≈ 130 komórek.
W ramach doświadczenia policzono liczbę enkapsulowanych komórek bezpośrednio po ich wytworzeniu. Kule alginianowe delikatnie rozpuszczono przy użyciu mieszaniny rozpuszczającej, a komórki zabarwiono roztworem błękitu trypanowego. Ocenę żywotności i liczenie komórek przeprowadzono za pomocą komory countingowej (hemocytometru); uzyskane wyniki wykazały średnio 16 ± 17 żywych komórek na jedną mikrokulkę (n = 5, dane nieraportowane). Zgodnie z oczekiwaniami, bezpośrednio po enkapsulacji zaobserwowano niewielką różnicę między teoretyczną a eksperymentalną liczbą komórek. W niektórych zastosowaniach, a w szczególności w celu określenia ilości uwalnianego Aβ w czasie, istotne jest przewidzenie liczby komórek enkapsulowanych w każdej kuli alginianowej.
Co ciekawe, proces enkapsulacji nie ma znaczącego wpływu na żywotność komórek. Wyniki zostały przedstawione w poprzedniej pracy, w której komórki raka jelita grubego (tj. HCT-16) poddano enkapsulacji przy użyciu podobnej metody, nie stwierdzając różnic w żywotności komórek w alginianowych mikrokulkach w porównaniu z kontrolą 2D20.
W celu pomiaru stabilności alginianu wykorzystanego w procesie enkapsulacji zmierzono średnice mikrokulek w okresie 14 dni (n = 10). Nie zaobserwowano zmian w średniej średnicy 14 dni po enkapsulacji w porównaniu z pomiarem wykonanym bezpośrednio po enkapsulacji (dane nie zostały przedstawione).
Enkapsulowane komórki 7PA2 uwalniają Aβ w czasie
Analiza mediów kondycjonowanych z kultur 2D i 3D komórek 7PA2 wykazuje stały wzrost poziomów Aβ1-42. Próbki mediów hodowlanych pobierano co 24 h przez okres do czterech dni, a następnie analizowano za pomocą testu ELISA. Nasze dane pokazują, że profil szybkości uwalniania Aβ1-42 z mikrokulek (3D) jest zbliżony do profilu uwalniania z kultury 2D (Rysunek 4).
Rysunek 4Szybkość Aβ1-42 sekrecja z komórek 7PA2. (AUwalnianie Aβ (% znormalizowane po 4 dniach) z modeli in vitro 2D i 3D wykazuje podobny profil. W obu modelach obserwuje się stały wzrost poziomu Aβ w ciągu czterech dni i, zgodnie z oczekiwaniami, nie osiągnięto stałego stężenia.B) Stężenie Aβ1-42 znormalizowane do początkowej liczby komórek, wykazujące podobną sekrecję Aβ1-42 z czasem, niezależnie od zastosowanych metod hodowli. Ani obecność alginianu, ani proces enkapsulacji (model 3D in vitro) nie zmieniają sekrecji Aβ1-42Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe (S.D.). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Potencjalne zastosowanie enkapsulowanych komórek 7PA2
Wykazujemy, że komórki 7PA2 zamknięte w alginianowych mikykuleczkach mogą być skutecznie wykorzystane do przedłużonego uwalniania Aβ1-42, a tym samym do badania wpływu chronicznej sekrecji Aβ w dowolnym modelu przedklinicznym. Na poniższej Rysunku 5 przedstawiamy zalety stosowania alginianowych mikykuleczek, które mogą być łatwo wstrzyknięte i umieszczone w mózgu szczura. Przekroje ex vivo zostały tutaj wykorzystane w celu ilustracyjnym, aby porównać milimetrową kuleczkę alginianową z wytworzonymi alginianowymi mikykuleczkami.
Rycina 5Wykorzystanie mikrokulek w istotnych zastosowaniach przedklinicznych. Mikrokulki do wszczepiania do mózgu szczura muszą być na tyle małe, aby można było je wprowadzić bez tworzenia zmiany zbyt dużej, co pozwoli uniknąć uszkodzenia miąższu mózgu i negatywnego wpływu na prawidłowe funkcje mózgu. Obraz (A) przedstawia zestawienie wielkości kulek o skali milimetrowej i mikrometrycznej obok siebie. (B) Implantacja koralika o rozmiarach milimetrowych do mózgu w celach in vivo nie byłaby skuteczna. Obraz (C) przedstawia mikrokulkę wykonaną zgodnie z niniejszym protokołem. Jej rozmiar jest odpowiedni do wprowadzenia do hipokampa szczura bez wywierania szkodliwego wpływu na prawidłową fizjologię. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Powyższe obrazy podkreślają znaczenie kontrolowania rozmiaru mikrokulek w tego typu badaniach. W niniejszej pracy demonstrujemy zaletę stosowania mikrokulek o średnicach poniżej 60 µm. Pozwala to na zastosowanie małoinwazyjnej iniekcji (np. strzykawką Hamiltona), aby lepiej kontrolować lokalizację wstrzykniętych kulek w mózgu.
Podsumowując, enkapsulacja komórek 7PA2 pozwala na kontrolę rozmiaru mikrokulek, liczby enkapsulowanych komórek oraz przewidywanie ilości wydzielanego z mikrokulek Aβ (np. stężenia, profilu uwalniania). Kontrola rozmiaru mikrokulek jest istotna z dwóch powodów: 1) umożliwia precyzyjne sterowanie stężeniem uwalnianego Aβ oraz 2) pozwala na implantację w określonym obszarze mózgu szczura. Uzyskane tutaj wyniki opisują łatwe dostrajanie mikrokulek alginianowych i wskazują na potencjalne zastosowania w dalszych badaniach.
Dyskusja
Metoda opisana w niniejszym artykule jest użyteczna do enkapsulacji komórek, pozwalając na uzyskanie wąskiego rozkładu wielkości alginianowych mikrokulek27. Zapewnia ona również korzyść w postaci hodowli komórek w środowisku immunoizolowanym17,19, co chroni je przed zewnętrznym stresem. Ponadto enkapsulacja komórek w alginianie bardziej wiernie naśladuje warunki fizjologiczne, szczególnie w odniesieniu do interakcji międzykomórkowych i sztywności macierzy20. Czynniki te są szczególnie istotne w późniejszych zastosowaniach, takich jak wszczepienie in vivo, zapobiegając potencjalnym reakcjom immunologicznym w otaczającej tkance17. Co więcej, główną zaletą tego protokołu jest łatwość dostosowania go do konkretnej aplikacji: możliwe jest zmodyfikowanie protokołu i optymalizacja parametrów w celu wytworzenia kulek większych lub mniejszych, a także miększych lub sztywniejszych. Opisana metoda jest wykorzystywana do wytwarzania kulek na tyle małych, aby można było je podać za pomocą metod małoinwazyjnych, oraz wystarczająco dużych, by pomieścić określoną liczbę komórek i zapewnić odpowiednie uwalnianie Aβ, co skutkuje obserwowalnymi efektami behawioralnymi i patologicznymi po wstrzyknięciu do modeli zwierzęcych.
Powodzenie tego protokołu zależy od szeregu krytycznych etapów. Staranna obsługa komórek oraz optymalne techniki hodowli komórkowej są istotne dla zachowania ich żywotności i funkcji20,28. Stosowanie standardowych warunków hodowli zapewnia zachowanie normalnych funkcji komórek 7PA2, zgodnie z obserwacjami. Pozwala to na uzyskanie profilu uwalniania Aβ1-42 z enkapsulowanych komórek podobnego do tego w hodowlach 2D. Ponadto, aby protokół działał optymalnie, zastosowanie roztworu alginianu o niskiej lepkości gwarantuje lepsze wyniki w porównaniu z roztworem o wysokiej lepkości. Zapewnia to wytrysk jednorodnego strumienia laminarnego przez dyszę oraz równomierny rozkład komórek wewnątrz macierzy wytworzonych kulek27. Materiały używane do enkapsulacji komórek muszą charakteryzować się bardzo szybkim mechanizmem żelowania, co pozwala na zachowanie kształtu.
Kolejnym krytycznym krokiem w tym protokole jest postępowanie z wytworzonymi mikrokulkami po żelowaniu. W tej części pokazujemy odzyskiwanie mikrokulek przy użyciu plastikowej pipety o dużym otworze do ich przeniesienia. Alternatywnie, do odzyskiwania kulek można zastosować wlewanie roztworu chlorku wapnia zawierającego mikrokulki przez filtr siatkowy. Zamiast wlewania można użyć dużej (5, 10 lub 25 mL) pipety serologicznej do zassania mikrokulek, a następnie przepłukania ich przez filtr siatkowy. Zaletą tej metody jest większa pewność co do sterylności procedury w porównaniu do wlewania. Jednak jednym z ograniczeń jest możliwość odkształcenia niektórych kulek w wyniku uciśnięcia ich przez pipetę, a także ryzyko niższej wydajności, jeśli znaczna część mikrokulek nie zostanie odzyskana.
Podejście to było wykorzystywane do enkapsulacji różnych linii komórkowych w celu modelowania i badania różnych chorób (np. uwalniania insuliny z enkapsulowanych wysepek trzustkowych). Nowością w naszym podejściu jest wszczepienie mikrokulek wytworzonych zgodnie z tym protokołem jako przydatna metoda modelowania istotnych aspektów choroby Alzheimera in vivo. Porównując profil uwalniania Aβ z komórek enkapsulowanych (Rycina 4) z poziomami Aβ generowanymi przez wstrzyknięcie bolusa (takimi, jakie zgłoszono w innych badaniach3,26), można spodziewać się bardziej chronicznego i przedłużonego uwalniania Aβ. Rycina 6 ilustruje przewidywaną tendencję, którą można osiągnąć. Wykorzystanie tego systemu do modelowania in vivo jest bardziej adekwatne do sposobu postępu choroby i może być bardziej użyteczne w odkrywaniu i opracowywaniu leków.
Rysunek 6Przewidywany profil uwalniania Aβ1-42 z enkapsulowanych komórek 7PA2 w porównaniu z wtryskiem bolusowym. Profil uwalniania Aβ z wszczepionych mikrokulek zawierających 7PA2 umożliwia badanie efektów chronicznej i długotrwałej obecności Aβ w modelu zwierzęcym istotnym dla choroby Alzheimera. Z kolei iniekcja bolusowa spowodowałaby gwałtowny wzrost poziomu Aβ w krótkim czasie, po którym nastąpiłoby szybkie usunięcie Aβ z mózgu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Panom Kajenowi Suresparanowi, Dr Jonathanowi Wubetu, Panu Dominikowi Grudzińskiemu, Pani Chen Zhao i Dr Thierry'emu Pilotowi za pomoc w optymalizacji produkcji mikrogranulek alginianowych, hodowli komórkowej i wykrywania Aβ oraz za użyteczne dyskusje naukowe.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| &mikro; Oprogramowanie menedżerskie | Vale Lab, UCSF, USA | v.1.46 | |
| 0,22 um Filtr PES | Merck, Wielka Brytania | SLGP033RS | |
| 15mm Wkład Netwell Filtr siatkowy 74 um | Constar, usa | #3477 | |
| Kwas alginowy sól sodowa z alg brunatnych | Sigma-Aldrich,uk | A0682 | |
| Chlorek wapnia | Sigma-Aldrich,uk | C1016 | |
| Miano komórki96 Test proliferacji komórek AQueous One Solution | Promega, USA | G3580 | |
| Encapsulator | Inotech | IE-50 | nr seryjny 05.002.01-2005 |
| HEPES | Sigma-Aldrich, uk | H4024 | |
| Hu Aβ 1-42 ELISA | ThermoFisher, Wielka Brytania | KHB3441 | |
| Oprogramowanie ImageJ | ImageJ v1.49p | ||
| Mikroskop światła odwróconego | Mikroskop Olympus | CKX41 | |
| Leica | Leica microsystems, Wielka Brytania | DMI6000B | |
| Kamera Neo sCMOS | Ander, Wielka Brytania | 5.5 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Sigma-Aldrich, wielka brytania | D1408 | |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich, wielka brytania | 433209 | |
| Dwuwodny cytrynian trispdu | Sigma-Aldrich, Wielka Brytania | W302600-K | |
| Roztwór trypsyny-EDTA | Sigma-Aldrich, uk | T4049 |
Bibliografia
- Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
- Karthick, C., et al. Time-dependent effect of oligomeric amyloid-β (1-42)-induced hippocampal neurodegeneration in rat model of Alzheimer's disease. Neurological Research. 41 (2), 139-150 (2018).
- Watremez, W., et al. Stabilized Low-n Amyloid-β Oligomers Induce Robust Novel Object Recognition Deficits Associated with Inflammatory, Synaptic, and GABAergic Dysfunction in the Rat. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (1), 213-226 (2018).
- Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-β1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. Journal of Neurosciences. 32 (23), 7852-7861 (2012).
- Solana, C., Tarazona, R., Solana, R. Immunosenescence of Natural Killer Cells, Inflammation, and Alzheimer's Disease. International Journal of Alzheimer's Disease. , 3128758(2018).
- Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (24), 13287-13292 (1997).
- Tomiyama, T., et al. A mouse model of amyloid beta oligomers: their contribution to synaptic alteration, abnormal tau phosphorylation, glial activation, and neuronal loss in vivo. Journal of Neurosciences. 30 (14), 4845-4856 (2010).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neurosciences. 17 (5), 661-663 (2014).
- Oddo, S., et al. Triple-Transgenic Model of Alzheimer's Disease with Plaques and Tangles: Intracellular A and Synaptic Dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Leon, W. C., et al. A Novel Transgenic Rat Model with a Full Alzheimer's-Like Amyloid Pathology Displays Pre-Plaque Intracellular Amyloid-β-Associated Cognitive Impairment. Journal of Alzheimer's Disease. 20 (1), 113-126 (2010).
- Prince, M., et al. Dementia UK: Second Edition - Overview. Alzheimer's Society. , 61(2007).
- Cavanaugh, S. E., Pippin, J. J., Barnard, N. D. Animal models of Alzheimer disease: historical pitfalls and a path forward. Alternatives to animal experimentation. 31 (3), 279-302 (2014).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal β-Amyloid Aggregates, Neurodegeneration, and Neuron Loss in Transgenic Mice with Five Familial Alzheimer's Disease Mutations: Potential Factors in Amyloid Plaque Formation. The Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Forny-Germano, L., et al. Alzheimer's Disease-Like Pathology Induced by Amyloid-β Oligomers in Nonhuman Primates. Journal of Neuroscience. 34 (41), 13629-13643 (2014).
- Masliah, E., et al. Altered expression of synaptic proteins occurs early during progression of Alzheimer's disease. Neurology. 56 (1), 127-129 (2001).
- Lepelletier, F. X., Mann, D. M. A., Robinson, A. C., Pinteaux, E., Boutin, H. Early changes in extracellular matrix in Alzheimer's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (2), 167-182 (2017).
- Calafiore, R., Basta, G. Clinical application of microencapsulated islets: Actual prospectives on progress and challenges. Advanced Drug Delivery Reviews. 67-68, 84-92 (2014).
- Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210 (4472), 908-910 (1980).
- Tran, N. M., et al. Alginate hydrogel protects encapsulated hepatic HuH-7 cells against hepatitis C virus and other viral infections. PLoS One. 9 (10), 109969(2014).
- Rios de la Rosa, J. M., Wubetu, J., Tirelli, N., Tirella, A. Colorectal tumor 3D in vitro models: advantages of biofabrication for the recapitulation of early stages of tumour development. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (4), 045010(2018).
- Tirella, A., Orsini, A., Vozzi, G., Ahluwalia, A. A phase diagram for microfabrication of geometrically controlled hydrogel scaffolds. Biofabrication. 1 (4), 045002(2009).
- Smalley, K. S. M., Lioni, M., Herlyn, M. Life ins't flat: Taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 42 (8-9), 242-247 (2006).
- Podlisny, M. B., et al. Aggregation of secreted amyloid beta-protein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture. Journal of Biological Chemistry. 270 (16), 9564-9570 (1995).
- Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of amyloid-β species in the 7PA2 cell model of Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (1), 85-93 (2013).
- Welzel, A. T., et al. Secreted amyloid β-proteins in a cell culture model include N-terminally extended peptides that impair synaptic plasticity. Biochemistry. 53 (24), 3908-3921 (2014).
- O'Hare, E., et al. Orally bioavailable small molecule drug protects memory in Alzheimer's disease models. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1116-1125 (2013).
- Nedović, V., Willaert, R. Fundamentals of Cell Immobilisation Biotechnology. Methods and Technologies for Cell Immobilisation/Encapsulation. , Focus on Biotechnology book series, Springer Link (FOBI, volume 8A) 185-204 (2004).
- Omer, A., et al. Long-term Normoglycemia in Rats Receiving Transplants with Encapsulated Islets. Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).
Przedruki i uprawnienia
