Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
Poniżej opisano dwa podejścia do charakteryzacji zdarzeń polaryzacji komórkowej w limfocytach B podczas formowania IS. Pierwsze obejmuje ilościową analizę rekrutacji organelli i reorganizacji cytoszkieletu w błonie synaptycznej. Drugie to podejście biochemiczne, którego celem jest charakterystyka zmian w składzie centrosomy, która ulega polaryzacji w synapsie immunologicznej.
Rozpoznanie antygenów związanych z powierzchnią przez receptor komórek B (BCR) wyzwala powstanie synapsy odpornościowej (IS), gdzie zarówno sygnalizacja jak i przyjmowanie antygenu są skoordynowane. Powstawanie IS wymaga dynamicznej reorganizacji aktyny towarzyszącej spolaryzowanemu rekrutowaniu do błony synaptycznej centrum komórkowego i powiązanych organelli wewnątrzkomórkowych, takich jak lizozomy i aparat Golgiego. Wczesne etapy reorganizacji aktyny pozwalają komórkom B zwiększyć powierzchnię komórki i zmaksymalizować ilość kompleksów antygen-BCR gromadzonych w synapsie. W pewnych warunkach, gdy komórki B rozpoznają antygeny związane z sztywnymi powierzchniami, proces ten jest sprzężony z lokalnym rekrutowaniu i sekrecją lizozomów, które mogą ułatwić ekstrakcję antygenu. Przyjęte antygeny są internalizowane do specjalizowanych kompartmentów endo-lizosomalnych w celu przetworzenia na peptydy, które są ładowane na cząsteczki kompleksu głównej zgodności tkankowej II (MHC-II) do dalszej prezentacji limfocytom T pomocniczym. Dlatego badanie dynamiki organelli związanej z tworzeniem IS jest kluczowe dla zrozumienia, w jaki sposób aktywowane są komórki B. W niniejszym artykule omówimy zarówno obrazowanie, jak i technikę biochemiczną stosowaną do badania zmian w pozycji organelli wewnątrzkomórkowych i przemieszczenia cytoszkieletu, które są związane z tworzeniem IS w komórkach B.
Limfocyty B są istotnym elementem układu odpornościowego adaptacyjnego, odpowiedzialnym za produkcję przeciwciał przeciwko różnym zagrożeniom i najeżdżającym patogenom. Skuteczność produkcji przeciwciał zależy od zdolności komórek B do pozyskiwania, przetwarzania i prezentacji antygenów spotykanych w postaci rozpuszczalnej lub związanych na powierzchni1,2. Rozpoznanie antygenów związanych z powierzchnią komórki prezentującej przez receptor przeciwciałowy (BCR) prowadzi do powstania ścisłego kontaktu międzykomórkowego, zwanego interfejsem immunologicznym (IS)3,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
UWAGA: Następujące kroki zostały wykonane przy użyciu komórek B IIA1.6.
1. Aktywacja komórek B za pomocą koralików pokrytych antygenem
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Niniejszy artykuł pokazuje, jak komórki B można aktywować za pomocą unieruchomionego antygenu na kulkach lub pokrywach szkieletowych w celu wywołania formowania się IS. Przedstawiamy informacje o tym, jak zidentyfikować i określić liczbowo polaryzację różnych organelli za pomocą immunofluorescencji oraz jak scharakteryzować białka, które ulegają dynamicznym zmianom w ich skojarzeniu z centrosomom, które polaryzuje się do IS, stosując podejście biochemiczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Opisujemy kompleksową metodę badania, w jaki sposób limfocyty B reorganizują swoją wewnątrzkomórkową architekturę, aby wspierać tworzenie IS. Badanie to obejmuje zastosowanie technik obrazowania do ilościowego określenia dystrybucji organelli wewnątrz komórki, takich jak centrosomy, aparat Golgiego i lizosomy podczas aktywacji limfocytów B oraz ich polaryzacji do IS. Dodatkowo opisujemy biochemiczną metodę badania zmian w składzie centrosomy po aktywacji limfocytów B.
Aby wspierać tworzenie IS.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnięcia.
M.-I.Y. jest wspierany przez grant badawczy od FONDECYT #1180900. J.I., D.F. i J.L. byli wspierani przez stypendia od Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Dziękujemy Davidowi Osorio z Pontificia Universidad Católica de Chile za nagranie i edycję wideo.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie