Poniżej opisano dwa podejścia do charakteryzacji zdarzeń polaryzacji komórkowej w limfocytach B podczas formowania IS. Pierwsze obejmuje ilościową analizę rekrutacji organelli i reorganizacji cytoszkieletu w błonie synaptycznej. Drugie to podejście biochemiczne, którego celem jest charakterystyka zmian w składzie centrosomy, która ulega polaryzacji w synapsie immunologicznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie dynamiki organelli w komórkach B podczas formowania się synapsy immunologicznej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozpoznanie antygenów związanych z powierzchnią przez receptor komórek B (BCR) wyzwala powstanie synapsy odpornościowej (IS), gdzie zarówno sygnalizacja jak i przyjmowanie antygenu są skoordynowane. Powstawanie IS wymaga dynamicznej reorganizacji aktyny towarzyszącej spolaryzowanemu rekrutowaniu do błony synaptycznej centrum komórkowego i powiązanych organelli wewnątrzkomórkowych, takich jak lizozomy i aparat Golgiego. Wczesne etapy reorganizacji aktyny pozwalają komórkom B zwiększyć powierzchnię komórki i zmaksymalizować ilość kompleksów antygen-BCR gromadzonych w synapsie. W pewnych warunkach, gdy komórki B rozpoznają antygeny związane z sztywnymi powierzchniami, proces ten jest sprzężony z lokalnym rekrutowaniu i sekrecją lizozomów, które mogą ułatwić ekstrakcję antygenu. Przyjęte antygeny są internalizowane do specjalizowanych kompartmentów endo-lizosomalnych w celu przetworzenia na peptydy, które są ładowane na cząsteczki kompleksu głównej zgodności tkankowej II (MHC-II) do dalszej prezentacji limfocytom T pomocniczym. Dlatego badanie dynamiki organelli związanej z tworzeniem IS jest kluczowe dla zrozumienia, w jaki sposób aktywowane są komórki B. W niniejszym artykule omówimy zarówno obrazowanie, jak i technikę biochemiczną stosowaną do badania zmian w pozycji organelli wewnątrzkomórkowych i przemieszczenia cytoszkieletu, które są związane z tworzeniem IS w komórkach B.
Wprowadzenie
Limfocyty B są istotnym elementem układu odpornościowego adaptacyjnego, odpowiedzialnym za produkcję przeciwciał przeciwko różnym zagrożeniom i najeżdżającym patogenom. Skuteczność produkcji przeciwciał zależy od zdolności komórek B do pozyskiwania, przetwarzania i prezentacji antygenów spotykanych w postaci rozpuszczalnej lub związanych na powierzchni1,2. Rozpoznanie antygenów związanych z powierzchnią komórki prezentującej przez receptor przeciwciałowy (BCR) prowadzi do powstania ścisłego kontaktu międzykomórkowego, zwanego interfejsem immunologicznym (IS)3,4. Wewnątrz tej dynamicznej platformy ma miejsce zarówno zależne od BCR przekazywanie sygnałów w dół, jak i internalizacja antygenów do komórtek endolizosomowy. Przechwycone antygeny są przetwarzane i montowane na cząsteczkach MHC klasy II, a następnie prezentowane limfocytom T. Produktywne interakcje B-T, zwane współpracą komórek B-T, pozwalają limfocytom B na otrzymanie odpowiednich sygnałów, które sprzyjają ich różnicowaniu się w komórki plazmatyczne produkujące przeciwciała lub komórki pamięci8.
Dwa mechanizmy są zaangażowane w ekstrakcję antygenów przez limfocyty B. Pierwszy polega na wydalaniu proteaz pochodzących z lizosomu, które ulegają rekrutacji i fuzji w szczelinie synaptycznej5,6. Drugi zależy od sił ciągnięcia wywołanych przez Myozynę IIA, które wywołują wgłębienie membran zawierających antygen, które są internalizowane do zanurzonych w klatrynie kopców7. Sposób ekstrakcji antygenów zależy od właściwości fizycznych membrany, w której znajdują się antygeny. Niemniej, w obu przypadkach, limfocyty B przechodzą dwie główne reorganizacje: reorganizację cytoszkieletu aktynowego i polaryzację organelli do IS. Reorganizacja cytoszkieletu aktynowego obejmuje początkową fazę rozprzestrzeniania, w której aktyna-zależne wypustki na błonie synaptycznej zwiększają powierzchnię w kontakcie z antygenem. Następuje to faza kurczenia, w której BCR związane z antygenami są skoncentrowane w centrum IS dzięki zgodnej akcji motorów molekularnych i reorganizacji cytoszkieletu aktynowego8,9,10,11. Polaryzacja organelli również opiera się na reorganizacji cytoszkieletu aktynowego. Na przykład, centrosoma zostaje odłączona od jądra poprzez lokalną depolimeryzację skojarzonej aktyny, co pozwala na przemieszczenie tej organelli do IS5,12. U limfocytów B, przemieszczenie centrosomy do jednego zbiega komórki (IS) prowadzi do rekrutacji lizosomy do błony synaptycznej, które po wydzielaniu mogą ułatwić ekstrakcję i/lub przetwarzanie antygenów związanych z powierzchnią6. Lizosomy zrekrutowanej w IS są wzbogacone w MHC klasy II, co sprzyja formowaniu kompleksów peptyd-MHC-II w komórkach endosomalnych do prezentacji limfocytom T13. Dodatkowo, aparat Golgiego również obserwowano jako blisko rekrutowany do IS14, co sugeruje, że wezykuły pochodzące z Golgiego z szlaku wydzielniczego mogą być zaangażowane w ekstrakcję i/lub przetwarzanie antygenów.
W sumie, wewnątrzkomórkowe przekształcenia organelli i cytoszkieletu w limfocytach B podczas formowania synapsy są kluczowymi krokami, które umożliwiają efektywne pozyskiwanie i przetwarzanie antygenów wymagane do dalszej ich aktywacji. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowe protokoły dotyczące wykonywania obrazowania i analizy biochemicznej w limfocytach B w celu badania wewnątrzkomórkowego przekształcania organelli związanych z formowaniem IS. Te techniki obejmują: (i) immunofluorescencje i analizę obrazów limfocytów B aktywowanych kulkami pokrytymi antygenem i na pokrytych antygenem szkiełkach, co pozwala na wizualizację i ilościową ocenę komponentów wewnątrzkomórkowych, które są mobilizowane do IS oraz (ii) izolację frakcji wzbogaconych w centrosomy w limfocytach B poprzez ultrawirowanie na gradientach sacharozy, co pozwala na identyfikację białek związanych z centrosomami, potencjalnie zaangażowanych w regulację polaryzacja komórki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Następujące kroki zostały wykonane przy użyciu komórek B IIA1.6.
1. Aktywacja komórek B za pomocą koralików pokrytych antygenem
- Przygotowanie koralików pokrytych antygenem
- Aby aktywować komórki B, użyj koralików NH2 kowalencyjnie pokrytych antygenem (koraliki pokryte antygenem), które są przygotowywane za pomocą 50 μL (~20 x 106 koralików) koralików NH2 3 μm z aktywującymi (BCR-ligandi+) lub nieaktywującymi (BCR-ligandi-) antygenami.
- W przypadku komórek B IIA1.6 użyj fragmentu przeciwciała przeciw IgG-F(ab')2 jako BCR-ligandi+ i fragmentu przeciwciała przeciw IgM-F(ab')2 lub albuminy surowicy wołowej (BSA) jako BCR-ligandi-. Aby aktywować pierwotne komórki B lub linię komórek B IgM+, użyj fragmentu przeciwciała przeciw IgM-F(ab')2 jako BCR-ligandi+ i BSA jako BCR-ligandi-.
UWAGA: Aby uniknąć wiązania ligandów z receptorem Fc, użyj fragmentów przeciwciał F(ab') lub F(ab')2 zamiast pełnowymiarowych przeciwciał. - Aby przystąpić do przygotowania koralików pokrytych antygenem, umieść koraliki w mikroprobówkach do mikrowirowania o niskim wiązaniu białka, aby maksymalizować odzyskiwanie koralików podczas manipulacji próbkami. Dodaj 1 ml buforu fosforanowego 1x (PBS) do wypłukania koralików i wiruj przez 5 min przy 16 000 x g. Zasądź nadstan.
- Zawieś reaktywne grupy NH2 za pomocą 500 μL 8% glutaraldehydu i wiruj przez 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
UWAGA: Roztwór glutaraldehydu należy używać tylko w kapturze chemicznym. Należy przestrzegać instrukcji zawartych w karcie danych bezpieczeństwa materiału (MSDS). - Wiruj koraliki przez 5 min przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C, usuń glutaraldehyd i wypłukuj koraliki jeszcze trzykrotnie 1 ml 1x PBS.
UWAGA: Roztwór glutaraldehydu należy wyrzucić jako odpady chemiczne. - Zawieś aktywowane koraliki w 100 μL 1x PBS. Próbkę można podzielić na dwie mikroprobówki do mikrowirowania o niskim wiązaniu białka: 50 μL na BCR-ligandi+ i 50 μL na BCR-ligandi-.
- Aby przygotować roztwór antygenu, użyj dwóch 2 mL mikroprobówek do mikrowirowania o niskim wiązaniu białka zawierających 100 μg/mL roztworu antygenu w 150 μL PBS: jedna probówka z BCR-ligandi+ a druga z BCR-ligandi-.
- Dodaj 50 μL roztworu aktywowanych koralików do każdej probówki zawierającej 150 μL roztworu antygenu, zmieszaj wirując i wiruj przez noc w 4 °C.
- Dodaj 500 μL 10 mg/mL BSA, aby zablokować pozostałe reaktywne grupy NH2 na koralikach, i wiruj przez 1 godzinę w 4 °C.
- Wiruj koraliki przez 5 min przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C i zasądź nadstan. Wypłukuj koraliki zimnym 1x PBS jeszcze trzykrotnie.
- Zawieś aktywowane koraliki w 70 μL 1x PBS.
- Aby wyznaczyć końcową koncentrację koralików pokrytych antygenem, rozcieńcz niewielką objętość koralików w PBS (1:200) i zlicz za pomocą hematometru. Następnie przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
UWAGA: Koraliki pokryte antygenem nie należy przechowywać dłużej niż miesiąc.
- Przygotowanie szkiełków pokrytych poli-L-lizyną
- Przed testem aktywacji komórek B za pomocą koralików pokrytych antygenem, przygotuj szkiełka pokryte poli-L-lizyną (PLL-szkiełka). Użyj 50 mL probówki zawierającej 40 mL 0,01% w/v roztworu PLL i zanurz szkiełka o średnicy 12 mm w roztworze. Wiruj przez noc w temperaturze pokojowej.
- Wypłucz szkiełka 1x PBS i pozostaw do wyschnięcia na 24-dołkowej patelni pokrytej folią parafinową. Przejdź do aktywacji komórek B.
- Aktywacja komórek B
- Aby rozpocząć aktywację komórek B za pomocą koralików, najpierw rozcieńcz linię komórek B IIA1.6 do 1,5 x 106 komórek/mL w środowisku CLICK (RPMI-1640 uzupełnionym o 2 mM L-alanino-L-glutaminę + 55 μM beta-merkaptoetanol + 1 mM pirogalakton + 100 U/mL Penicyliny + 100 μg/mL streptomycyny) + 5% ogrzewanego surowicy wołowej inaktywowanej termicznie [FBS]).
- Skombinuj 100 μL (150 000 komórek) komórek B IIA1.6 z koralikami pokrytymi antygenem w proporcji 1:1 w 0,6 mL probówkach. Mieszaj delikatnie wirując i rozsiewaj na PLL-szkiełkach. Inkubatorz przez różne punkty czasowe w inkubatorze komórkowym (37 °C / 5% CO2). Typowe punkty
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy artykuł pokazuje, jak komórki B można aktywować za pomocą unieruchomionego antygenu na kulkach lub pokrywach szkieletowych w celu wywołania formowania się IS. Przedstawiamy informacje o tym, jak zidentyfikować i określić liczbowo polaryzację różnych organelli za pomocą immunofluorescencji oraz jak scharakteryzować białka, które ulegają dynamicznym zmianom w ich skojarzeniu z centrosomom, które polaryzuje się do IS, stosując podejście biochemiczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisujemy kompleksową metodę badania, w jaki sposób limfocyty B reorganizują swoją wewnątrzkomórkową architekturę, aby wspierać tworzenie IS. Badanie to obejmuje zastosowanie technik obrazowania do ilościowego określenia dystrybucji organelli wewnątrz komórki, takich jak centrosomy, aparat Golgiego i lizosomy podczas aktywacji limfocytów B oraz ich polaryzacji do IS. Dodatkowo opisujemy biochemiczną metodę badania zmian w składzie centrosomy po aktywacji limfocytów B.
Aby wspierać tworzenie IS...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnięcia.
Podziękowania
M.-I.Y. jest wspierany przez grant badawczy od FONDECYT #1180900. J.I., D.F. i J.L. byli wspierani przez stypendia od Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Dziękujemy Davidowi Osorio z Pontificia Universidad Católica de Chile za nagranie i edycję wideo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
Bibliografia
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
