Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER

Podsumowanie

Framework eVOLVER umożliwia wysokoprzepustową ciągłą hodowlę mikroorganizmów z wysoką rozdzielczością i dynamiczną kontrolą parametrów eksperymentalnych. Protokół ten pokazuje, jak zastosować system do przeprowadzenia złożonego eksperymentu fitness, prowadząc użytkowników przez programowanie automatycznej kontroli nad wieloma indywidualnymi kulturami, mierzenie, gromadzenie i interakcję z danymi eksperymentalnymi w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Metody hodowli ciągłej umożliwiają hodowlę komórek w ilościowo kontrolowanych warunkach środowiskowych, a zatem są szeroko przydatne do pomiaru fenotypów dopasowania i poprawy naszego zrozumienia, jak genotypy są kształtowane przez selekcję. Niedawne szeroko zakrojone wysiłki mające na celu opracowanie i zastosowanie niszowych urządzeń do ciągłej hodowli ujawniły korzyści płynące z prowadzenia nowych form kontroli hodowli komórkowych. Obejmuje to definiowanie niestandardowych nacisków selekcyjnych i zwiększanie przepustowości dla badań, począwszy od długoterminowej ewolucji eksperymentalnej, a skończywszy na selekcji bibliotek obejmujących cały genom i charakterystyce obwodów syntetycznych genów. Aby sprostać temu rosnącemu zapotrzebowaniu, platforma eVOLVER została niedawno opracowana: platforma o ciągłym poziomie skalowalności, elastyczności i automatyzacji. eVOLVER zapewnia pojedynczą platformę standaryzacyjną, którą można (ponownie) konfigurować i skalować przy minimalnym wysiłku w celu wykonywania wielu różnych typów wysokowydajnych lub wielowymiarowych eksperymentów selekcji wzrostu. W tym miejscu przedstawiono protokół, który ma zapewnić użytkownikom frameworka eVOLVER opis konfiguracji systemu do przeprowadzenia niestandardowego, zakrojonego na szeroką skalę eksperymentu ciągłego wzrostu. W szczególności protokół prowadzi użytkowników, jak zaprogramować system tak, aby zwielokrotniał dwa ciśnienia selekcyjne - temperaturę i osmolarność - w wielu fiolkach eVOLVER w celu ilościowego określenia krajobrazów sprawności mutantów Saccharomyces cerevisiae w dokładnej rozdzielczości. Pokazujemy, w jaki sposób urządzenie można skonfigurować zarówno programowo, za pomocą oprogramowania internetowego typu open source, jak i fizycznie, poprzez rozmieszczenie układów płynów i sprzętu. Szczegółowo opisano proces fizycznej konfiguracji urządzenia, programowania rutyny hodowli, monitorowania i interakcji z eksperymentem w czasie rzeczywistym przez Internet, pobierania próbek fiolek do późniejszej analizy offline oraz analizy danych po eksperymencie. Powinno to posłużyć jako punkt wyjścia dla naukowców z różnych dyscyplin do zastosowania eVOLVER w projektowaniu własnych, złożonych i wysokoprzepustowych eksperymentów wzrostu komórek w celu badania i manipulowania systemami biologicznymi.

Wprowadzenie

Techniki ciągłej hodowli komórkowej, opracowane po raz pierwszy prawie 70 lat temu^1,2, cieszą się niedawnym odrodzeniem^3,4. Wynika to ze zbiegu czynników. Po pierwsze, rozwój wysokoprzepustowych technik -omicznych, które umożliwiły odczytywanie i generowanie dużej liczby genotypów^5,6, stworzył jednoczesny popyt na techniki eksperymentalne, które ułatwiają dobrze kontrolowany wzrost komórek i fenotypowanie. W tym celu hodowla ciągła stanowi potężne podejście eksperymentalne mające na celu wykorzystanie pojawiających się postępów w genomice. Ułatwiając selekcję/eksperymenty wzrostu na populacjach komórkowych w precyzyjnie kontrolowanych (i dynamicznych) warunkach środowiskowych, ciągła hodowla zapewnia środki do rygorystycznego mapowania genotypów do fenotypów^7,8, ilościowo charakteryzować zmodyfikowane szczepy i organizmy⁹, oraz śledzić adaptacyjne zmiany genetyczne w laboratoryjnych badaniach ewolucji^10,11,12.

Po drugie, niedawne pojawienie się dostępnych technik prototypowania, takich jak produkcja addytywna oraz elementy sprzętowe i programowe open-source, umożliwiło szerszemu gronu użytkowników projektowanie i budowanie własnych, opłacalnych form systemów ciągłej hodowli bezpośrednio w laboratorium. Wszystko to doprowadziło do powstania ekscytującej gamy urządzeń typu "zrób to sam" (DIY), które wykonują funkcje ciągłej hodowli, takich jak chemostat¹³, turbidostat¹⁴ lub morbidostat¹⁵. Niestety, mimo że te doraźne rozwiązania są skuteczne w rozwiązywaniu konkretnych (niszowych) problemów, dla których zostały zaprojektowane, na ogół nie mają możliwości skalowania pod względem przepustowości i/lub złożoności eksperymentalnego projektu.

System eVOLVER został zaprojektowany z myślą o stworzeniu pojedynczej platformy, która może sprostać rosnącym potrzebom eksperymentalnym ciągłej hodowli oraz dorównać szybkością i skalą powstających technik genomicznych¹⁶ (Rysunek 1A). Projekt eVOLVER implementuje wspólne założenia leżące u podstaw wysoce skalowalnych technologii z innych dyscyplin¹⁷, w tym ustandaryzowane rozmiary, komponenty modułowe i zasady projektowania typu open source. Dzięki temu rozwiązania dla nowych niszowych aplikacji mogą być projektowane bez większych modyfikacji systemu. Składający się z wysoce modułowego oprogramowania wetware, sprzętu, elektroniki i oprogramowania internetowego o otwartym kodzie źródłowym, eVOLVER jest pierwszym zautomatyzowanym systemem hodowli ciągłej, który można ekonomicznie i łatwo ponownie skonfigurować w celu przeprowadzenia praktycznie każdego rodzaju eksperymentu wzrostu o wysokiej przepustowości. Dzięki modułowym i programowalnym tulejom Smart Sleeves, w których znajdują się wszystkie czujniki i siłowniki potrzebne do sterowania poszczególnymi kulturami, eVOLVER w unikalny sposób umożliwia skalowanie zarówno przepustowości, jak i indywidualnej kontroli warunków hodowli. Ponadto, jako platforma internetowa, eVOLVER wymienia dane i informacje ze zdalnymi komputerami w czasie rzeczywistym, umożliwiając jednoczesne monitorowanie setek indywidualnych kultur i zautomatyzowane perturbacje kulturowe za pomocą dowolnie zdefiniowanych algorytmów sterowania.

W poprzednim worku¹⁶, solidna wydajność eVOLVER została zademonstrowana w długotrwałych eksperymentach przez setki godzin pracy, a także jego zdolność do hodowli różnych organizmów, od E. coli i S. cerevisiae po nieudomowione mikroby. Przeprowadzono serię odrębnych eksperymentów selekcji wzrostu, w których programowo zdefiniowane wielowymiarowe gradienty selekcyjne zastosowano w szeregu indywidualnych warunków hodowli, a uzyskane krajobrazy sprawności komórkowej określono ilościowo. W tym przypadku celem jest dostarczenie użytkownikom eVOLVER opisu, w jaki sposób można wykorzystać system do projektowania i tego typu eksperymentów. Jako ilustracyjny przykład przedstawiono metody ilościowego określania krajobrazu przystosowania mutantów S. cerevisiae w dwuwymiarowym gradieniu środowiskowym złożonym z temperatury i stresu osmotycznego. Protokół prowadzi użytkowników przez konfigurację ramy eVOLVER dla tego eksperymentu, zarówno programowo, wykorzystując oprogramowanie do ustawiania niestandardowych procedur kontroli zmętnienia i temperatury dla każdej z 16 równoległych ciągłych hodowli, jak i fizycznie, poprzez układ fluidyki w celu odpowiedniego kierowania pożywek o różnych stężeniach soli. Protokół ten powinien służyć jako ogólna rubryka do konfiguracji eVOLVER do wykonywania szerokiej gamy zautomatyzowanych eksperymentów z hodowlami ciągłymi dla różnych badań i dyscyplin.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki, fiolek i inokulum

UWAGA: Ten protokół zakłada, że użytkownicy już skalibrowali system eVOLVER i korzystają z konfiguracji Smart Sleeve opisanej w poprzednich pracach¹⁶. Inteligentne rękawy można łatwo przeprojektować lub zmodyfikować, ale szczegóły konfiguracji głośności i parametrów sterowania mogą się różnić w przypadku alternatywnych konfiguracji.

1. Dzień przed eksperymentem należy przygotować 2 ml płynnych kultur szczepu referencyjnego S. cerevisiae BY4741 przez noc i szczepów wariantowych w pożywce YPD (dekstroza peptonowo-drożdżowa) w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na co najmniej 300 obr./min.
2. Przenieś sterylne podłoża YPD do czystych, autoklawowanych butelek wyposażonych w rurki. Alternatywnie, podłoża mogą być sterylizowane w autoklawie bezpośrednio w butelkach wyposażonych w przewody.
   nuta: Butelki są dopasowywane do rurek poprzez wywiercenie otworu w nakrętce i przepuszczenie przez niego rurki za pomocą łączników, aby zabezpieczyć je na miejscu. Zobacz tabelę materiałów.
3. Dodać mieszadło do każdej fiolki i przykręcić pokrywkę fiolki wyposażoną w słomki do napływu i odpływu. Upewnij się, że wszystkie elementy są czyste podczas oględzin.
4. Umieść fiolki w stojaku do sterylizacji w autoklawie, przykryj folią i autoklaw w cyklu grawitacyjnym lub próżniowym z 20-minutowym etapem sterylizacji.

2. Przygotowanie eksperymentu

1. W trzech dużych zlewkach przygotuj 500 ml 10% wybielacza, 200 ml 10% wybielacza i 300 ml 70% etanolu.
2. Za pomocą przełączników na urządzeniu eVOLVER włącz zasilanie 5 V w eVOLVER, odczekaj 5 sekund, a następnie włącz zasilanie 12 V.
3. W przypadku uruchamiania kilku fiolek z tej samej butelki z pożywką, należy podłączyć wiele linii wejściowych pożywki za pomocą rozdzielaczy przewodów. Niestandardowe rozdzielacze rur mogą być zbudowane z komponentów Luer.
4. Zanurz przewody wejściowe pożywki w pierwszej zlewce wybielacza, a przewody wypływu pożywki w drugiej zlewce wybielacza. Umieść dolny koniec przewodów doprowadzających media w drugiej zlewce z przewodami wypływu. Umieść linie odpływowe w gąsiorze na odpady.
5. Dodaj 1-2 litry wybielacza do dużego pustego pojemnika na odpady, który wysterylizuje odpady powstałe podczas eksperymentu. Skonsultuj się z koordynatorem ds. bezpieczeństwa, aby zapewnić prawidłową utylizację odpadów.
6. Korzystając z ekranu dotykowego w eVOLVER, przejdź do sekcji konfiguracji i uruchom wszystkie pompy na 20 sekund, aby napełnić przewody płynów 10% wybielaczem. Podczas pracy należy upewnić się, że wszystkie przewody zostały napełnione i że pompy działają normalnie. Pozostaw wybielacz w liniach na co najmniej 30 minut w celu sterylizacji.
7. Uruchom pompy ponownie za pomocą aplikacji na ekranie dotykowym, aż przewody przestaną być zanurzone, przepychając powietrze przez przewody, aby usunąć jak najwięcej wybielacza.
8. Umieść przewody wejściowe mediów w zlewce na etanol i powtórz jak powyżej, napełniając przewody etanolem i przepłukując powietrzem.
   nuta: Ponieważ etanol zabija szybko, nie trzeba czekać 30 minut na sterylizację.
9. Podłącz przewody wejściowe mediów do butelek z mediami za pomocą złączy Luer i uruchom pompy, aż media całkowicie przejdą przez przewody, wypłukując resztki etanolu.
10. Częściowo włóż wysterylizowane fiolki do inteligentnych rękawów eVOLVER i podłącz żyłki do odpowiednich pozycji, zgodnie z kodowaniem kolorów na żyłkach. Zacznij od przymocowania przewodów wejściowych do krótkiej słomy napływowej, a następnie przewodów odpływowych do długiej słomy odpływowej.
    ostrożność: Bardzo ważne jest, aby sprawdzić, czy nie ma luźnych połączeń lub nieprawidłowo poprowadzonych przewodów. Niezastosowanie się do tego spowoduje przepełnienie i potencjalne uszkodzenie rękawa Smart Sleeve.
11. Uruchamiaj wszystkie pompy w odstępach co 10 sekund, aby napełnić fiolki pożywką. Upewnij się, że pompy wypływowe skutecznie usuwają media przez słomki odpływowe, aby zapobiec przepełnieniu. Jeśli wydaje się, że słomki odpływowe nie działają wydajnie, sprawdź połączenia przewodów płynowych i pompę perystaltyczną. W razie potrzeby popraw lub wymień części.
12. Wcisnąć fiolki w dół, aż zostaną całkowicie zamknięte przez Smart Sleeve.
13. Ustaw warunki początkowe dla parametrów eksperymentalnych za pomocą ekranu dotykowego eVOLVER na interaktywnej stronie konfiguracji. Dla wszystkich fiolek ustawić temperaturę na 30 °C, a mieszać na 10. Można to zrobić dla wszystkich fiolek jednocześnie, przeciągając palcem po ekranie dotykowym, aby wybrać wszystkie fiolki.

3. Konfiguracja oprogramowania eVOLVER i programowanie procedur kultur algorytmicznych

1. Na pulpicie nawigacyjnym eVOLVER na komputerze przejdź do strony menedżera eksperymentów. Jako punkt wyjścia wybierz eksperyment podstawowy w panelu nawigatora eksperymentów lub istniejący eksperyment i kliknij przycisk klonuj nowy.
   nuta: Możliwe jest użycie eksperymentów z innych grup, wklejając link GitHub do repozytorium, w którym definicja eksperymentu jest zapisywana w menedżerze eksperymentów.
2. Określ nazwę eksperymentu i urządzenie eVOLVER, na którym eksperyment zostanie przeprowadzony. Upewnij się, że żądane ustawienia kalibracji zostały wybrane, modyfikując te pola na stronie.
3. Użyj okienek selektora fiolki i definicji parametrów, aby ustawić warunki eksperymentalne. Na przykład, aby ustawić temperaturę dla fiolek od 0-4 do 30 °C, wybierz fiolki w selektorze fiolek, ustaw definicję parametru na 30 i kliknij przycisk Ustaw. Powtórz tę czynność dla OD, aby ustawić górny i dolny próg dla każdej fiolki.
4. Po zakończeniu definicji parametrów eksperymentalnych zapisz eksperyment, klikając przycisk Zapisz, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić.

4. Inicjowanie eksperymentu i monitorowanie w czasie rzeczywistym

1. Po zakończeniu eksperymentu przejdź do panelu danych w czasie rzeczywistym na interaktywnym pulpicie nawigacyjnym. Dla każdej fiolki sprawdź, czy wartości OD utrzymują się na poziomie zerowym i czy temperatury są na poziomie zaprogramowanym lub zbliżają się do zaprogramowanych poziomów, przeglądając wykresy.
2. Aby przygotować inokulum, zmierz OD kultur przez noc, oblicz pożądane rozcieńczenie krotne, przyjmując objętość fiolki 25 ml i odpipetuj obliczoną objętość inokulum do fiolek przez port do pobierania próbek. Na przykład, aby osiągnąć pożądany początkowy OD około 0,05 w fiolce hodowlanej z nocnych kultur o OD 2,0, do każdej fiolki należy dodać 625 μl komórek.
3. Sprawdź wykresy na desce rozdzielczej, aby zobaczyć, czy wykresy OD zostały odpowiednio zaktualizowane. Na wykresach powinien być widoczny wzrost do poziomu zbliżonego do pożądanego początkowego OD.
4. Śledź różne typy danych (takie jak OD, temperatura, tempo wzrostu, generacje i zużycie mediów) przez cały czas trwania eksperymentu, przeglądając odpowiednie wykresy na pulpicie nawigacyjnym. Wartości te mogą informować użytkownika o decyzjach eksperymentalnych (np. punkty czasowe harmonogramu) lub nawet być wykorzystywane w funkcjach do wykonywania automatycznych informacji zwrotnych.
5. Aby wymienić butelki z pożywką w trakcie eksperymentu, wstrzymaj eksperyment w panelu menedżera eksperymentu, aby zapobiec wystąpieniu zdarzeń związanych z pompą. Szybko odkręć przewód pożywki od pustej butelki i podłącz go do nowej butelki. Unikaj dotykania końców przewodów, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Wznów eksperyment w menedżerze eksperymentów.

5. Pobieranie próbek komórek drożdży z fiolek eVOLVER

1. Przygotować roztwór cykloheksymidu w celu zahamowania syntezy białek i utrwalenia komórek drożdży do analizy metodą cytometrii przepływowej. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml dodaj 12 ml PBS i 12 μl 20 mg/ml cykloheksymidu i wiruj przez 5 s.
2. Za pomocą pipety wielokanałowej podsycić 100 μl do każdego dołka 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.
3. Zawiń płytkę w folię aluminiową, aby zablokować światło i trzymaj w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie potrzebna.
4. Aby pobrać próbkę, należy pipetować przez otwór pobierania próbek na wieczku fiolki za pomocą przedłużonych końcówek o pojemności 200 μl.
5. Odpipetować 100 μl z fiolki do studzienki w płytce utrwalającej, mieszając 2-3 razy pipetując w górę i w dół, następnie odzyskać w folii i przywrócić płytkę do temperatury 4 °C.

6. Eksperyment Rozkład i Porządkowanie

1. Przygotuj 1 l 10% wybielacza i dwa 500 ml roztworów wody DI w dużych zlewkach.
2. Zatrzymaj eksperyment, wysyłając polecenie stop w panelu menedżera eksperymentów. Dane są nadal przechowywane w bazie danych w chmurze i nadal można je później wyświetlić w panelu danych w czasie rzeczywistym na pulpicie nawigacyjnym lub pobrać do analizy w trybie offline.
3. Wyjmij fiolki z rękawów Smart Sleeve i umieść je w stojaku na autoklaw, aby uniknąć przelania w kolejnych krokach.
4. Odkręć przewody wejściowe pożywki z butelek z pożywką i umieść je w zlewce z 10% wybielaczem. Uruchamiaj pompy z interfejsu użytkownika eVOLVER, tak jak w konfiguracji, aby sterylizować linie i fiolki.
5. Odłącz przewody od fiolek i zanurz przewody w wodzie DI. Uruchom pompy, aby wypłukać cały wybielacz z systemu, najpierw wodą DI, a następnie powietrzem.
6. Wyłącz eVOLVER, najpierw wyłączając zasilanie 12 V, odczekaj 5 s, a następnie wyłączając zasilanie 5 V.
7. Namocz kostki i nakrętki w 10% wybielaczu, a następnie spłucz wodą DI. Pamiętaj, aby wypłukać słomki napływowe i odpływowe każdej nakrętki, przepuszczając przez nie wodę DI. Wyszoruj fiolki za pomocą szczotki do probówki, jeśli na ściankach utworzył się film.
8. Odpady należy utylizować w odpowiedni sposób i dokładnie wypłukać pojemniki na odpady.
   ostrożność: Pojemniki na odpady będą zawierały mieszaninę 10% wybielacza, wysterylizowanych odpadów z kultur komórkowych i śladowych ilości etanolu. Skonsultuj się z koordynatorem ds. bezpieczeństwa w celu prawidłowego obchodzenia się i utylizacji.

7. Kwantyfikacja dopasowania za pomocą analizy cytometrii przepływowej populacji frakcyjnych

1. Analizę pobranych próbek z sekcji 5 należy przeprowadzić za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w odpowiedni kanał fluorescencyjny i detektory¹⁶.
2. Uzyskaj co najmniej 10 000 zdarzeń na próbkę i bramka dla nienaruszonych komórek, korzystając z danych rozproszenia do przodu i boku.
3. Bramka oparta na odpowiednim kanale fluorescencyjnym (np. GFP) w celu określenia rozkładu frakcyjnego każdej populacji.
4. Na komputerze zapisz dane w żądanej lokalizacji na stronie Menedżer eksperymentów, klikając przycisk "Eksportuj".
5. Na podstawie plików danych eVOLVER określ liczbę pokoleń zakończonych przez każdy punkt czasowy dla każdej fiolki. W kodzie eVOLVER generacje są obliczane poprzez najpierw segmentację danych OD między każdym zdarzeniem rozcieńczenia, a następnie każdy segment jest dopasowywany do podstawowego wykładnika postaci do każdego segmentu, co daje r, stopę wzrostu¹⁶. Liczba pokoleń w danym okresie jest następnie obliczana przy użyciu następującego wzoru:
   
6. Wykreślić stosunek logarytmiczny populacji znakowanych i nieznakowanych na podstawie danych cytometrii przepływowej w funkcji liczby generacji z powyższych obliczeń w momencie pobierania próbek. Zidentyfikuj obszar liniowy i dopasuj nachylenie zgodnie z poniższym równaniem. To nachylenie jest powszechnie definiowane jako konkurencyjna klasa fitness^18,< klasa sup = "xref">19.
   

Wyniki

Opisany tutaj protokół został wykorzystany do skonstruowania map dopasowania dla wariantów genetycznych S. cerevisiae w dwuwymiarowym gradieniu stresu temperatury i zasolenia. W szczególności, dla każdego szczepu wariantowego, użyliśmy eVOLVER do przeprowadzenia eksperymentów konkurencji parami przeciwko szczepowi referencyjnemu znakowanemu fluorescencyjnie (szczep S. cerevisiae BY4741 ze zintegrowanym konstytutywnym reporterem mNeonGreen) w 16 różnych kombinacjach tych naprężeń (Rysunek 1). Dla wariantów wybrano dwa szczepy nokautujące, z których każdy miał być wrażliwy na jedną z osi warunków stresowych: ΔPRX1, który według doniesień ma defekty dopasowania w wysokich temperaturach²⁰ i ΔPBS2 z defektami dopasowania przy wysokich stężeniach soli²¹. Jako wariant kontrolny użyto nieznakowanego szczepu BY4741 typu dzikiego, od którego oczekiwano, że będzie działał podobnie do szczepu referencyjnego. W sumie te trzy 72-godzinne eksperymenty konkursowe przeprowadzono jednocześnie w 48 fiolkach na trzech urządzeniach eVOLVER (16-fiolkowatych), z których wszystkie były uruchamiane z jednego komputera.

Interaktywny pulpit nawigacyjny eVOLVER służy do nawigacji po dużej ilości danych, które są generowane podczas każdego eksperymentu (Rysunek 2A). Reprezentatywne ślady OD we wszystkich 16 fiolkach pojedynczego urządzenia eVOLVER są pokazane na Rysunek 2B. Każda ścieżka wykazuje charakterystyczny wzór piłokształtny z algorytmu kontroli turbidostatu, który wykorzystuje sprzężenie zwrotne od OD do wyzwalania rozcieńczeń i utrzymywania kultur w wąskim zakresie gęstości (w tym przypadku 0,2-0,3). Dane dotyczące średnicy zewnętrznej i temperatury są stale mierzone, przesyłane strumieniowo do bazy danych w chmurze i aktualizowane w czasie rzeczywistym na interaktywnym pulpicie nawigacyjnym eVOLVER. Na podstawie danych przesyłanych w sposób ciągły można obliczyć i wykreślić na pulpicie nawigacyjnym wskaźniki wyższego rzędu (np. tempo wzrostu, skumulowane generacje) (Rysunek 2C), a nawet wykorzystać jako parametry sprzężenia zwrotnego w różnych schematach wyboru (np. morbidostat).

Aby wygenerować mapy sprawności, mierzymy tempo, w jakim szczep referencyjny konkuruje ze szczepem wariantowym, uwzględniając zarówno pomiary cytometrii przepływowej, jak i dane o wzroście eVOLVER. W szczególności frakcje populacji są obliczane jako stosunek logarytmiczny szczepu wariantowego do szczepu referencyjnego przy użyciu danych cytometrii przepływowej z każdej próbki punktu czasowego. Dla każdej kultury i punktu czasowego liczba pokoleń, które upłynęły od czasu, jest interpolowana na podstawie danych eVOLVER dotyczących tempa wzrostu w każdym okresie rozcieńczania. Wykreślając proporcje logarytmiczne w stosunku do pokoleń, zaczynają się wyłaniać jakościowe różnice między warunkami (Rysunek 3A). Aby obliczyć dopasowanie, nachylenie jest dopasowywane przez liniową część każdego wykresu^18,19, co daje ilościową wartość dopasowania (zarówno ze znakiem, jak i szybkością), która opisuje, w jaki sposób szczep wariantowy konkuruje ze szczepem referencyjnym (Rysunek 3B). W tym eksperymencie ujemne wartości dopasowania wskazują, że szczep wariantowy jest konkurowany przez szczep referencyjny. Konstruowanie map cieplnych na podstawie wszystkich obliczeń fitness pozwala na wizualizację dwuwymiarowego krajobrazu fitness, ujawniając subtelne różnice ilościowe w wydajności między szczepami i warunkami (Rysunek 3C).

Z map popularności fitness widzimy, że każdy wariant szczepu wykazuje wady sprawnościowe, które objawiają się na różne sposoby. ΔPRX1 jest przede wszystkim wrażliwy na wysokie temperatury, ale stres solny wydaje się mieć działanie addytywne, zwiększając wadę sprawności. I odwrotnie, ΔPBS2 wykazuje defekty dopasowania przede wszystkim w odpowiedzi na wysokie stężenia soli, przy minimalnych różnicach wzdłuż osi temperatury. Wyniki te podkreślają użyteczność eksperymentów selekcyjnych o wysokiej rozdzielczości, szczególnie w przypadku rozszyfrowywania interakcji wielu stresorów środowiskowych, które mogą mieć efekty addytywne, synergiczne lub epistatyczne.

Na koniec, ważne jest, aby zauważyć, że w niektórych przypadkach, szczególnie w przypadku ciężkich warunków stresowych, obliczenia sprawności mogą prowadzić do przesadzonych lub wypaczonych wyników. Na przykład, ΔPBS2 wydaje się wykazywać strome dodatnie nachylenie w warunkach 39 °C/1 M NaCl w stosunku do odkształcenia referencyjnego (Rysunek 3A). Przypisuje się to słabemu wzrostowi obu szczepów, co znajduje odzwierciedlenie w danych dotyczących typu dzikiego i ogranicza użyteczność tej konkretnej metryki w tym stanie. Niewystarczająca liczba pokoleń skutkuje 1) słabą separacją punktów czasowych, co przeszkadza w dopasowaniu nachylenia, oraz 2) wrażliwością na efekty stochastyczne pochodzące z fazy opóźnienia. Chociaż nie zdecydowaliśmy się na to w tym badaniu, dane o wzroście w czasie rzeczywistym zebrane przez eVOLVER podczas eksperymentu mogły zostać wykorzystane do podjęcia decyzji o przedłużeniu eksperymentu i zebraniu dodatkowych punktów czasowych dla tego stanu przy niewielkim wysiłku. W eksperymentach uzupełniających proporcje początkowe mogą być również modulowane w celu wydłużenia długości obszaru liniowego przed wystąpieniem nasycenia.

Rysunek 1: Przegląd ram eVOLVER i projektu eksperymentalnego. (A) eVOLVER to zautomatyzowana, ciągła platforma hodowlana umożliwiająca wieloparametrową kontrolę warunków hodowli. Platforma składa się z inteligentnych rękawów, w których znajdują się czujniki i siłowniki do kontrolowania warunków hodowli, zestawu pomp perystaltycznych do przepływu mediów i odpadów do i z kultur, ekranu dotykowego do ręcznej interakcji z urządzeniem oraz komputera służącego do interakcji z infrastrukturą chmury, do której przesyłane są dane z platformy. (B) eVOLVER można skonfigurować na wiele sposobów: fizycznie, poprzez wejścia ogniw i mediów oraz programowo, dostosowując algorytmy sterujące modułami fiolek do hodowli Smart Sleeve. Można to wykorzystać do zaprogramowania wielowymiarowej selekcji/gradientów środowiskowych w wysokiej rozdzielczości, z danymi wyjściowymi składającymi się z fizycznie zebranych komórek w określonych punktach czasowych i strumieniowego przesyłania danych hodowlanych w czasie rzeczywistym. (C) Konfiguracja eVOLVER w celu przeprowadzenia eksperymentu dopasowania wzrostu w dwuwymiarowym gradiencie selekcji, składającym się z temperatury i stresu osmotycznego. Fiolki z kulturami eVOLVER wysiewano w równych proporcjach referencyjnego i wariantowego szczepu drożdży. Procedura turbidostatu została zaprogramowana tak, aby utrzymać wszystkie kultury w fazie wykładniczej w zdefiniowanym oknie OD (OD 0,2-0,3). Temperatura i warunki podłoża były zróżnicowane w całym układzie Smart Sleeve, tworząc dwa niezależne gradienty naprężeń. Pożywka bazowa składała się z YPD (2% glukozy) + 100 μg/ml karbenicyliny + 25 μg/ml chloramfenikolu jako środek ostrożności przed zanieczyszczeniem bakteryjnym. Skład pożywek zmieniano poprzez dodanie uzupełniającego NaCl do 0 M, 0,6 M, 0,8 M lub 1,0 M. Temperatury fiolek zaprogramowano na jedną z czterech wartości: 30 °C, 35 °C, 37 °C lub 39 °C. (D) Przykłady surowej produkcji dla OD hodowli i frakcji populacji z trzech badanych warunków. Eksperyment konkursowy utrzymywano przez 72 godziny, pobieranie próbek przez 24 godziny, a następnie co 12 godzin aż do zakończenia eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Pulpit nawigacyjny analizy danych w czasie rzeczywistym eVOLVER. (A) Dane eVOLVER są przetwarzane i przesyłane strumieniowo w czasie rzeczywistym za pośrednictwem oprogramowania opartego na chmurze do interaktywnego pulpitu nawigacyjnego. Za pomocą pulpitu nawigacyjnego użytkownicy mogą definiować i inicjować własne procedury hodowli na podłączonym eVOLVER, monitorować aktualnie prowadzone eksperymenty we wszystkich jednostkach eVOLVER i w razie potrzeby ręcznie zmieniać warunki eksperymentalne na pojedynczej fiolce lub zestawie fiolek. (B) Ślady OD dla każdej fiolki w poprzek matrycy warunków badanych przez cały czas trwania eksperymentu. Ślady można przeglądać w czasie rzeczywistym, aby upewnić się, że eksperyment przebiega zgodnie z oczekiwaniami i jest używany po eksperymencie do dalszej analizy. (C) Tempo wzrostu i generacje komórek można obliczyć na podstawie śladów OD w locie, aby śledzić postęp eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Budowa nawierzchni fitness. (A) Logarytm naturalny frakcji populacji komórek (szczep wariantowy/szczep referencyjny) wykreślony w odniesieniu do generacji komórek. Kolor wskazuje temperaturę selekcji, a kreski rozróżniają stężenia soli. (B) Aby określić ilościowo względne dopasowanie wariantu do szczepu referencyjnego, wskaźnik dopasowania uzyskuje się na podstawie szybkości, z jaką zmienia się frakcja populacji komórkowej na przestrzeni pokoleń. Ta metryka jest obliczana na podstawie obszaru liniowego wykresów frakcji komórkowej przy użyciu co najmniej trzech punktów. (C) Względne wskaźniki sprawności są wyświetlane na mapie cieplnej w celu skonstruowania powierzchni fitness nad gradientami stresu środowiskowego. Warunek w prawym górnym rogu (39 °C/1,0 M NaCl) dla typu dzikiego i ΔPBS2 nie są uwzględnione w tej analizie, ponieważ kultury przeszły przez niewystarczające pokolenia (patrz wyniki reprezentatywne). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Selekcja wzrostu jest niezbędnym narzędziem w biologii, szeroko stosowanym do generowania i charakteryzowania różnic fenotypowych między populacjami komórkowymi. Podczas gdy hodowle okresowe pozwalają na selekcję wzrostu w ograniczony sposób, techniki hodowli ciągłej radykalnie zwiększają stopień kontroli i przewidywalności tych eksperymentów, wywierając precyzyjną regulację nad formą i dynamiką selekcji w celu uzyskania powtarzalnych, ilościowych wyników²². Kultura ciągła została wykorzystana do rygorystycznej kontroli selekcji bibliotek o wysokiej różnorodności 20,23,24,25 oraz do wdrożenia wyrafinowanych reżimów adaptacyjnych w ewolucji eksperymentalnej i kierowanej 11,12,26,27. Hodowla ciągła umożliwia również precyzyjną charakterystykę komórek w szeregu ilościowo kontrolowanych warunków, aby lepiej zrozumieć złożone systemy genetyczne i zoptymalizować zmodyfikowane szczepy bioprodukcyjne ^9,14,28.

Nie ma jednak uniwersalnego protokołu dla hodowli ciągłej, ponieważ subtelne zmiany w warunkach selekcji mogą prowadzić do dramatycznych zmian w wynikach biologicznych ^4,29,30. Eksperymentatorzy muszą mieć możliwość wyboru między systemami selekcji i odpowiednio dostosować protokoły i sprzęt eksperymentalny. Oprócz oferowania wyboru między parametrami kontrolnymi, takie systemy powinny być wystarczająco zaawansowane, aby niezależnie zarządzać kilkoma parametrami jednocześnie w wysoce równoległych eksperymentach, które są potrzebne do rozszyfrowania oddziałujących danych wejściowych w złożonych systemach biologicznych (np. epistaza). eVOLVER rozwiązuje to wyzwanie, umożliwiając użytkownikom arbitralne programowanie sterowania sprzężeniem zwrotnym między warunkami hodowli a funkcjami płynów w celu określenia wysoce wyspecjalizowanych nisz środowiskowych.

Aby przezwyciężyć ograniczenia w obecnej konfiguracji i rozszerzyć lub zmienić parametry sterowania, Smart Sleeve można łatwo przeprojektować w celu dodania nowych czujników lub siłowników. Ponadto zmniejszenie objętości fiolki zmniejszyłoby wydatki na pożywkę, co może być znaczące w przypadku hodowli ciągłej. Podczas gdy obecna konstrukcja pozwala na pomiar i kontrolę temperatury, mieszania kultur, indukcji światła, zmętnienia i płynów, inne parametry muszą być mierzone zewnętrznie poprzez pobieranie próbek z fiolek. Obecne prace obejmują wykorzystanie możliwości monitorowania aktywności enzymatycznej za pomocą lucyferazy oraz regulacji rozpuszczonego tlenu i pH bezpośrednio w kulturach eVOLVER. Ponadto, choć nie wykazano tego w niniejszej pracy, eVOLVER może współpracować z nowatorskimi milifluidycznymi urządzeniami multipleksującymi¹⁶ , które opierają się na zasadach integracji na dużą skalę (wywodzących się z elektroniki i przyjętych przez mikrofluidykę) w celu niedrogiego umożliwienia bardziej złożonej obsługi płynów (np. multipleksowane wejścia płynów, transfery między fiolkami). Te moduły mokrego oprogramowania mogą być projektowane i produkowane w całości w laboratorium, umożliwiając użytkownikom kierowanie płynów poprzez programowe uruchamianie różnych kombinacji zaworów w zautomatyzowanych procedurach hydraulicznych. Pozwala to użytkownikom przezwyciężyć sztywne konstrukcje płynów tradycyjnie stosowane w hodowli ciągłej, ale także skalować możliwości płynów do wysokiej przepustowości przy mniejszej liczbie kosztownych elementów sterujących (np. pomp perystaltycznych). Wreszcie, mamy nadzieję na włączenie platformy automatycznego próbkowania, która będzie wykorzystywać te millifluidyki i komponenty DIY, pokonując ograniczenia ręcznej interakcji podczas dłuższych i większych eksperymentów, w których pobieranie próbek kultur byłoby kłopotliwe.

Oprócz fizycznych modyfikacji platformy, oprogramowanie internetowe otwiera nowe stopnie swobody, umożliwiając użytkownikom pisanie, edytowanie i udostępnianie niestandardowych skryptów eVOLVER, generując w pełni zautomatyzowane programy do hodowli oparte na informacjach zwrotnych (np. turbidostat). Użytkownicy mogą programowo przechodzić przez zakresy parametrów w subtelnych wariacjach na temat tego samego schematu wyboru lub łączyć algorytmy sterujące w nowatorskie kombinacje, aby określić dowolną liczbę wyrafinowanych schematów wyboru. Co więcej, możliwość łatwego monitorowania kultur w czasie rzeczywistym zmienia sposób, w jaki przeprowadzane są eksperymenty. Dzięki monitorowaniu w czasie rzeczywistym użytkownicy mogą 1) sprawdzać spójność między cyklami, co jest krytyczną funkcją dla zastosowań bioprodukcyjnych i eksperymentów o wysokiej przepustowości, oraz 2) interweniować podczas eksperymentów, jeśli to konieczne, w celu rozwiązania problemów z trudnymi szczepami, które wykazują słaby wzrost lub tworzenie biofilmu, lub zdiagnozować błędy użytkownika (np. zanieczyszczenie). Wreszcie, dzięki gromadzeniu i interpretowaniu wielu strumieni danych w czasie rzeczywistym dla każdej kultury, eVOLVER generuje dużą gęstość danych, co może ułatwić podejście uczenia maszynowego do nowatorskiej analizy końcowej.

Poza zademonstrowanymi zastosowaniami w charakterystyce sprawności, wyborze bibliotek i ewolucji laboratoriów, uważamy, że wiele powiązanych dziedzin jest gotowych do wdrożenia w eVOLVER ze zintegrowaną fluidyką. Eksperymenty prowadzone w ramach projektu eVOLVER na próbkach mikrobiomu mogą badać stabilność zbiorowisk w kontrolowanych środowiskach^31,32, badać skład mikrobioty przy użyciu technik kultururomicznych³³ lub dynamicznie mieszać gatunki w celu zbadania ekologicznej dynamiki kolonizacji lub inwazji^34,35. W urządzeniu można również łatwo zaimplementować liczne metody ciągłej, ukierunkowanej ewolucji biomolekuł 26,36,37, co znacznie zwiększa dostępność i przepustowość tych systemów. Możliwość optymalizacji warunków uprawy, takich jak skład podłoża, temperatura i szczepy, w dynamicznym, wysokowydajnym charakterze, może pomóc w optymalizacji zastosowań w bioprodukcji przemysłowej⁹. Przewidujemy również pionową integrację eVOLVER z innymi technikami analizy, takimi jak mikroskopia i cytometria przepływowa, w sposób zamknięty, zapewniając w pełni zautomatyzowany system do wzrostu i analizy kultur komórkowych zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji. Co więcej, dzięki pewnym modyfikacjom sprzętowym inteligentnego rękawa, takim jak uszczelnienie naczynia i kontrola zawartości gazu, eVOLVER może potencjalnie zostać przystosowany do wspierania wzrostu szerszego zakresu typów komórek, takich jak zawieszone komórki ssaków. Możliwe jest również umieszczenie całego szkieletu w komorze beztlenowej do beztlenowej hodowli komórek. Patrząc w przyszłość, dążymy do zbudowania naszej struktury oprogramowania w scentralizowanej infrastrukturze chmurowej i wierzymy, że umożliwi to użytkownikom łatwe zdalne konfigurowanie, analizowanie i udostępnianie danych bez konieczności fizycznej obecności w laboratorium. Funkcjonując jako kurator danych, infrastruktura chmurowa nadawałaby się również do metaanaliz na dużą skalę w ramach eksperymentów. Przewidujemy, że eVOLVER i te przyszłe postępy znacznie rozszerzą zakres możliwych eksperymentów selekcji wzrostu, ułatwiając automatyzację i innowacje w kulturze ciągłej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-galonowy plastikowy Hedpack z nasadką	Midwest Browarnictwo i materiały do produkcji wina	45-56Y8-E2FR	Do zbiórki odpadów
a-D(+)-Glukoza	Chem-Impex	00805	Dla YPD Medium
Attune NxT Autosampler	Thermo Fisher		umożliwia cytometrowi przepływowemu pobieranie próbek z 96-dołkowej płytki
Attune NxT Cytometr przepływowy	Thermo Fisher		Służy do określania frakcji populacji za pomocą fluorescencji pojedynczej komórki
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-07-0	Dla YPD Średnia
karbenicylina	Fisher Scientific BP2648250 Dla		YPD Średnio
odporny chemicznie łącznik trójnikowy z rurką kolczastą, do 1/8" ID rury, 250° F Maksymalna temperatura	McMaster-Carr	5121K731	Do rozgałęziania wejścia mediów
Chloramfenikol	Fisher Scientific	BP904-100	Do podłoża YPD
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25	Fisher Scientific	50371500	Do sterylizacji linii fluidycznych
Niestandardowa pokrywka fiolki eVOLVER	Pokrywka FynchBio		posiada porty do pobierania próbek i wejścia/wyjścia
płynuCykloheksymid	Fisher Scientific	ICN10018301	Do płytek do pobierania próbek cytometrii przepływowej
Etanol, Bezwodny (histologiczny)	Fisher Scientific	A405P-4	Do sterylizacji przewodów płynnych
eVOLVER Unit	FynchBio
Fisherbrand Końcówki o przedłużonej długości (stojak do podnoszenia; 1 do 200 ul)	Fisher Scientific	02-681-420	Do pobierania próbek
z fiolkiFisherbrand Octagon Spinbar Mieszadła magnetyczne	Fisher Scientific	14-513-57	Średnica: 4,5 mm, Długość, 12 mm
Fisherbrand Szklane butelki wielokrotnego użytku z nakrętką	Fisher Scientific	FB8002000	Musi być wyposażony w rurkę
Wysokotemperaturowa rurka z gumy silikonowej Półprzezroczysta biała, twardość 70A, 1/8" ID, 1/4" OD	McMaster- Carr	51135K73	Do butelek na media
Mac Mini	Apple		Do przeprowadzenia eksperymentu/zbierania danych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Fisher Scientific	BP243820	Do płytek do pobierania próbek cytometrii przepływowej
Pipety	Eppendorf
Szybkoobrotowa złączka do probówek, zatyczki, do 1/16" Rurka kolczasta ID, polipropylen	McMaster- Carr	51525K141	Do butelek z mediami
Szybkoobrotowa złączka rurowa z tworzywa sztucznego, zaślepki, do 5/32" Rura kolczasta ID, polipropylen	McMaster- Carr	51525K144	Do butelek z mediami
Szybkoobrotowa złączka rurowa z tworzywa sztucznego, gniazda, do 1/16" Rura kolczasta ID, polipropylen	McMaster- Carr	51525K291	Do butelek z mediami
Szybkozłączka rurowa z tworzywa sztucznego, gniazda, do 5/32" rura kolczasta ID, polipropylen	McMaster- Carr	51525K294	Do mediów butelki
NAKRĘTKI, OTWARTE, Z SILIKONOWĄ PRZEGRODĄ Z PTFE, LAB-PAC, PRZEGRODĄ. Rozmiar gwintu: 24-400, ZIELONY	Chemglass	CG-4910-04	Fiolki do hodowli
Chlorek sodu (NaCl)	Fsher Scientific	S271-3	do YPD Medium
SpectraMax M5 Wielomodowy czytnik mikropłytek	Urządzenia molekularne	do pomiaru OD600 w nocnych hodowlach komórkowych
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Scientific	BP1422-500	do podłoża YPD