Artykuł metodologiczny

Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59655

⸱

6 października 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials, Radboud University, 3Institute of Bioengineering, School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano proces wytwarzania wielowarstwowego, mikroprzepływowego urządzenia opartego na PDMS, które umożliwia przeprowadzanie reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) przez dłuższy czas. Ponadto zapewniony jest kompleksowy przegląd sprzętu i oprogramowania wymaganego do automatyzacji i utrzymania tych reakcji przez dłuższy czas.

Streszczenie

Ograniczenia syntetycznej biologii opartej na komórkach stają się coraz bardziej widoczne, ponieważ naukowcy dążą do opracowania większych i bardziej złożonych syntetycznych genetycznych obwodów regulacyjnych. Analiza syntetycznych genetycznych sieci regulacyjnych in vivo jest czasochłonna i cierpi z powodu braku kontroli środowiska, w której egzogenne składniki syntetyczne wchodzą w interakcje z procesami gospodarza, co skutkuje niepożądanym zachowaniem. Aby przezwyciężyć te problemy, coraz powszechniejsza staje się bezkomórkowa charakterystyka nowych obwodów. Mieszaniny do transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) umożliwiają regulację środowiska eksperymentalnego i mogą być zoptymalizowane dla każdego unikalnego systemu. Przedstawione tutaj protokoły szczegółowo opisują wytwarzanie wielowarstwowego urządzenia mikroprzepływowego, które może być wykorzystane do podtrzymywania reakcji IVTT przez dłuższy czas. W przeciwieństwie do reakcji okresowych, w których zasoby wyczerpują się z czasem, a produkty (uboczne) gromadzą się, zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych pozwala na uzupełnienie zasobów, a także usunięcie produktów reakcji. W ten sposób środowisko komórkowe jest emulowane poprzez utrzymywanie środowiska nierównowagi, w którym dynamiczne zachowanie obwodów genowych może być badane przez dłuższy czas. Aby w pełni wykorzystać możliwości wielowarstwowego urządzenia mikroprzepływowego, zintegrowano sprzęt i oprogramowanie w celu automatyzacji reakcji IVTT. Łącząc reakcje IVTT z prezentowaną tutaj platformą mikroprzepływową, możliwa staje się kompleksowa analiza złożonych zachowań sieci, pogłębiając nasze zrozumienie mechanizmów regulujących procesy komórkowe.

Wprowadzenie

Komórki są w stanie wykrywać i reagować na swoje otoczenie za pomocą złożonych dynamicznych sieci regulacyjnych1,2. Dziedzina biologii syntetycznej wykorzystuje naszą wiedzę na temat naturalnie występujących składników składających się na te sieci do projektowania systemów biologicznych, które mogą rozszerzyć funkcjonalność komórek3,4. Z drugiej strony, możliwe jest również pogłębienie naszego zrozumienia naturalnych sieci rządzących życiem poprzez projektowanie uproszczonych, syntetycznych analogów istniejących obwodów lub poprzez postępową inżynierię systemów biologicznych, które wykazują naturalnie występujące zachowania. Inżynieria de novo takich systemów biologicznych jest wykonywana w sposób oddolny, w którym nowe obwody genetyczne lub szlaki sygnałowe są projektowane w racjonalny sposób, przy użyciu dobrze zdefiniowanych części5,6. Połączenie racjonalnego projektowania sieci z projektowaniem biologicznie istotnych systemów umożliwia dogłębną charakterystykę i badanie biologicznych systemów regulacyjnych o różnych poziomach abstrakcji7.

Pionierskie prace Elowitza i Leiblera8 oraz Gardnera et al.9 były pierwszymi, które wykazały udane wprowadzenie syntetycznych sieci genetycznych do gospodarzy komórkowych. W następnej dekadzie wielu badaczy kontynuowało rozwijanie tych początkowych sukcesów, pomimo pojawienia się kilku ograniczeń dotyczących wprowadzania obwodów syntetycznych do komórek7,10,11,12. Idealnie byłoby, gdyby wprowadzenie syntetycznych obwodów do gospodarzy komórkowych odbywało się w sposób modułowy. Niestety, złożoność środowiska komórkowego sprawia, że jest to szczególnie trudne, ponieważ funkcja wielu części i sieci jest wysoce zależna od kontekstu12,13,14. W rezultacie sieci często doświadczają niepożądanych interakcji z natywnymi komponentami hosta, które mogą wpływać na działanie obwodu syntetycznego. Podobnie, składniki sieci egzogenicznej mogą hamować procesy hosta, rywalizować o współdzielone zasoby w hoście i wpływać na kinetykę wzrostu15,16,17. W związku z tym, aby racjonalnie zaprojektować i przewidzieć zachowanie sieci syntetycznych w środowisku in vivo, wymagany jest kompleksowy model całej dynamiki specyficznej dla hosta i obwodu18.

Realną alternatywą dla wykorzystania hostów komórkowych do charakterystyki sieci syntetycznych jest zastosowanie technologii transkrypcji i translacji in vitro (IVTT). Działając jako poligon testowy dla sieci syntetycznych, reakcje są przeprowadzane w roztworach zawierających wszystkie składniki wymagane do umożliwienia ekspresji genów19,20,21. W ten sposób tworzone jest biologicznie istotne, choć sztuczne, środowisko, w którym można testować sieci syntetyczne22,23,24,25,26,27,28. Główną zaletą korzystania z rozwiązań IVTT jest możliwość przeprowadzania reakcji w warunkach określonych przez użytkownika, przy czym badacze są w stanie dostroić dokładny skład każdej reakcji2. Co więcej, podejście bezkomórkowe umożliwia wysokoprzepustowe testowanie sieci syntetycznych, ponieważ eliminuje potrzebę wykonywania czasochłonnych etapów klonowania komórek. W rezultacie, czas trwania kolejnych cykli projektowania - budowy - testów jest znacznie skrócony29,30,31,32. Cykl projektowania można jeszcze bardziej przyspieszyć poprzez wykorzystanie technik klonowania bezkomórkowego, takich jak montaż Gibsona, do szybkiego projektowania nowych sieci, oraz poprzez konstruowanie sieci z liniowych matryc DNA, które - w przeciwieństwie do plazmidów wymaganych do testów in vivo - mogą być amplifikowane za pomocą reakcji łańcuchowych polimerazy (PCR)33,34.

Reakcje wsadowe są najprostszą metodą, za pomocą której można przeprowadzić reakcje IVTT, wymagającą pojedynczego naczynia reakcyjnego, w którym wszystkie składniki reakcji są połączone35. Takie reakcje są wystarczające do ekspresji białek i podstawowych testów obwodów, ale okazują się niewystarczające przy próbie zbadania długoterminowego dynamicznego zachowania sieci. W trakcie reakcji okresowej odczynniki ulegają wyczerpaniu lub degradacji, co powoduje ciągły spadek szybkości transkrypcji i translacji. Co więcej, w miarę postępu reakcji gromadzą się produkty uboczne, które mogą zakłócać - lub całkowicie hamować - prawidłowe funkcjonowanie sieci. Ostatecznie, zastosowanie reaktorów wsadowych ogranicza dynamiczne zachowanie, które można zaobserwować, przy czym negatywna regulacja jest szczególnie trudna do wdrożenia5,36.

Wszechstronność systemów IVTT umożliwia wiele alternatywnych metod, za pomocą których można przeprowadzać przedłużone reakcje IVTT, począwszy od metod ciągłego przepływu do metod opartych na kropelkach, a także prostszych metod dializy2,30,37,38,39,40. Zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych zapewnia użytkownikom większą kontrolę nad ich reakcjami, jednocześnie zwiększając przepustowość i minimalizując koszty35,41,42, przy czym każde konkretne podejście ma swoje zalety. Wykorzystanie ciągłego przepływu można łatwo zoptymalizować w celu zwiększenia wydajności ekspresji, jednak niezdolność do skutecznego usuwania określonych produktów reakcji sprawia, że badanie dynamicznego zachowania jest nietrywialne39. Podczas gdy zastosowanie kropelkowych systemów mikroprzepływowych pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe nowych sieci, trudność w dostarczaniu świeżych odczynników do reakcji powoduje, że kropelki przypominają reakcje wsadowe o małej objętości43. Reaktory oparte na dializie umożliwiają wprowadzanie świeżych odczynników, a także usuwanie niektórych produktów reakcji, jednak cząsteczki RNA i większe białka gromadzą się w reaktorze, będąc zbyt duże, aby dyfundować przez pory błony. Co więcej, do podtrzymania tych reakcji przez dłuższy czas potrzebne są duże ilości odczynników30,44. W 2013 roku Maerkl i wsp. zaprezentowali wielowarstwowe urządzenie mikroprzepływowe zaprojektowane specjalnie do przeprowadzania przedłużonych reakcji IVTT 36,45. Zastosowanie wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych pozwala na bezpośrednią kontrolę przepływu płynu, co pozwala na przekierowanie przepływu, a także izolację płynu w określonych obszarach urządzenia46,47. Te izolowane obszary mogą funkcjonować jako niezależne komory reakcyjne w skali nanolitrów, w których można przeprowadzać reakcje IVTT. W trakcie pojedynczej reakcji IVTT stosuje się okresowe wstrzykiwanie świeżych odczynników do reaktora w celu uzupełnienia składników IVTT i matryc DNA. Jednocześnie równa objętość starego roztworu reakcyjnego jest przemieszczana, usuwając produkty reakcji. W ten sposób utrzymywane jest środowisko nierównowagi, w którym podstawowe tempo transkrypcji i translacji pozostaje w stanie stałym, przedłużając czas życia reakcji IVTT i umożliwiając występowanie bogatych zachowań dynamicznych. Stosując to podejście, naukowcy są w stanie badać tempo kinetyczne poszczególnych procesów zachodzących w określonym obwodzie, pomagając w inżynierii nowej sieci genetycznej. Na przykład Niederholtmeyer i in. zastosowali to podejście do scharakteryzowania różnych elementów genetycznego oscylatora pierścieniowego, określając jego wskaźniki kinetyczne36. W dalszych badaniach Yelleswarapu i in. wykazali, że wskaźniki kinetyczne czynnika sigma 28 (σ28) określone w warunkach wsadowych były niewystarczające do opisania zachowania oscylatora opartego na σ28, a dodanie danych opartych na przepływie poprawiło przewidywania modelu zachowania sieci22.

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie kompletnego protokołu produkcji wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych zdolnych do przeprowadzania długotrwałych reakcji IVTT. Ponadto w manuskrypcie tym opisano cały sprzęt i oprogramowanie wymagane do przeprowadzenia przedłużonych reakcji IVTT. Uruchamianie urządzenia mikroprzepływowego - niezbędnego do kontrolowania przepływu płynów w nim - odbywa się za pomocą szeregu zaworów pneumatycznych, które łączą się bezpośrednio z urządzeniami mikroprzepływowymi za pomocą odcinków przewodów. Z kolei zawory pneumatyczne są sterowane za pomocą specjalnie zaprojektowanego wirtualnego interfejsu sterowania. Przepływ płynu w urządzeniach mikroprzepływowych odbywa się za pomocą ciągłego ciśnienia, które jest zapewniane przez dostępny na rynku system regulacji ciśnienia. Reakcje IVTT są zwykle przeprowadzane w temperaturze od 29 °C do 37 °C, a inkubator mikroskopowy służy do regulacji temperatury podczas reakcji. Funkcjonalność mieszaniny IVTT ulega jednak stopniowemu pogorszeniu, gdy jest przechowywana w temperaturze powyżej 4 °C. W związku z tym manuskrypt ten będzie rozwijał temat systemu chłodzenia poza chipem używanego do chłodzenia mieszaniny IVTT przed wstrzyknięciem do urządzenia mikroprzepływowego. Podsumowując, niniejszy manuskrypt zawiera kompleksowy przegląd procedur wymaganych do pomyślnego przeprowadzenia przedłużonych reakcji IVTT przy użyciu mikroprzepływowego reaktora przepływowego, dzięki czemu inni badacze będą w stanie stosunkowo łatwo odtworzyć tę technologię.

Protokół

1. Przygotowanie wafla

UWAGA: Nasze protokoły są specyficzne dla fotorezystu 40 XT dodatniego i fotorezystu ujemnego SU8 3050 używanego podczas tych badań. Można zastosować alternatywne fotorezystu, jednak konkretne prędkości wirowania, temperatury pieczenia i czasy pieczenia będą się różnić. Projekt urządzenia mikroprzepływowego dostarczony przez Niederholtmeyer et al.36 jest podlinkowany w Tabeli Materiałów.

  1. Umieść dwie czyste płytki krzemowe (o średnicy 100 mm, zorientowane <1-0-0>, grubość 525 μm) w piekarniku nagrzanym do 250 °C i pozostaw wafle do odwodnienia na noc (~16 h).
    UWAGA: Możliwe jest również zagruntowanie wafli za pomocą osadzania z fazy gazowej HMDS; Nie jest to jednak konieczne, jeśli wafle są wystarczająco odwodnione.
  2. Wyjmij jedną płytkę silikonową z piekarnika i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej przed przystąpieniem do wirowania. Nałóż 3-4 ml fotorezystu 40 XT na środek płytki.
  3. Aby uzyskać wysokość elementu 25 μm, należy zastosować następujący protokół wirowania: wirować przez 20 s przy 500 obr./min (110 obr./min), zwiększyć prędkość wirowania do 3100 obr./min (300 obr./s) i przytrzymać przez 30 s, a następnie zwolnić płytkę do 0 obr./min ze spowolnieniem 200 obr./min/s. Za pomocą chusteczki z mikrofibry ostrożnie usuń wszelkie zgrubienia krawędzi, które mogły powstać podczas powlekania wirowego.
  4. Pieczenie na miękko przy użyciu dwóch oddzielnych płyt grzewczych ustawionych na 70 °C i 120 °C w następujący sposób: pozostaw wafel w temperaturze 70 °C na 30 sekund. Następnie przenieś wafel na płytę grzejną o temperaturze 120 °C i pozwól mu odpocząć przez 3,5 minuty, a następnie umieść płytkę z powrotem na płycie grzejnej o temperaturze 70 °C na kolejne 30 sekund. Wyjmij wafel z płyty grzejnej i – unikając nagłych szoków temperaturowych – pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
  5. Umieść fotomaskę warstwy przepływowej (stroną emulsyjną do dołu) na folii fotorezystu i naświetlaj płytkę za pomocą lampy UV, aż do uzyskania całkowitej ekspozycji 200 mJ/cm2.
  6. Pieczenie po ekspozycji na dwóch płytach grzewczych (70 °C i 105 °C) w następujący sposób: pozostawić wafel w temperaturze 70 °C na 20 sekund, a następnie przenieść wafel na płytę grzejną o temperaturze 105 °C i pozostawić go tutaj na 40 sekund. Na koniec umieść wafel z powrotem na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C na kolejne 20 sekund, aby zakończyć pieczenie po ekspozycji.
  7. Pozwól wafli ostygnąć do temperatury pokojowej na stosie chusteczek z mikrofibry. Opracuj wafel, przenosząc go na szalkę Petriego wypełnioną wywoływaczem fotorezystu 726 MIF, aby rozpocząć proces rozwoju. Wywoływanie jest przyspieszane, gdy jest wykonywane na wytrząsarce stołowej, a cała płytka jest zanurzana w wywoływaczu.
  8. Opłucz wafel wodą demineralizowaną i użyj mikroskopu stereoskopowego, aby sprawdzić powierzchnię płytki pod kątem pozostałości fotorezystu. Jeśli widoczne są pozostałości fotorezystu, zwróć wafel do wywoływacza.
  9. Rozpłynąć dodatni fotorezystor, umieszczając płytkę na płycie grzejnej ustawionej w temperaturze 110 °C na 25 minut. Proces ten spowoduje zaokrąglone elementy, a także wyżarzanie wszelkich pęknięć, które mogły pojawić się podczas procesu produkcyjnego. Przystąp do silanizowania płytki zgodnie z opisem w kroku 1.17.
  10. Wyjmij drugą płytkę silikonową z piekarnika, pozwalając jej ostygnąć do temperatury pokojowej przed przystąpieniem do wirowania. Nałóż 5 ml fotorezystu SU8 3050 na środek płytki.
  11. Aby uzyskać wysokość elementu 30 μm, należy zastosować następujący protokół wirowania: wirować przez 20 s przy 500 obr./min (110 obr./min), zwiększyć prędkość wirowania do 4 000 obr./min (330 obr./min/s) i przytrzymać przez 42 s, a następnie zwolnić płytkę do 0 obr./min ze spowolnieniem 200 obr./min/s. Za pomocą chusteczki z mikrofibry ostrożnie usuń wszelkie zgrubienia krawędzi, które mogły powstać podczas powlekania.
  12. Pieczenie na miękko na dwóch oddzielnych płytach grzewczych (65 °C i 95 °C) w następujący sposób: pozostaw wafel w temperaturze 65 °C na 30 sekund. Następnie przenieś wafel na płytę grzejną o temperaturze 95 °C i pozwól mu odpocząć tutaj przez 14 minut, zanim włożysz płytkę z powrotem do płyty grzejnej o temperaturze 65 °C na kolejne 30 sekund. Wyjmij wafel z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
  13. Zmierz intensywność lampy UV przed ekspozycją i użyj jej do określenia czasu ekspozycji wymaganego do osiągnięcia całkowitej dawki ekspozycji 260 mJ/cm2. Umieść fotomaskę (emulsją skierowaną w dół) na folię fotorezystową i umieść wafel pod źródłem światła UV. Naświetlić wafel za pomocą lampy UV, aż do uzyskania całkowitej ekspozycji 260 mJ/cm2.
  14. Pieczenie poekspozycyjne przy użyciu dwóch płyt grzewczych (65 °C i 95 °C) w następujący sposób: pozostawić wafel w temperaturze 65 °C na 60 sekund, a następnie przenieść wafel na płytę grzejną o temperaturze 95 °C i pozostawić go tutaj na 4,5 minuty. Włóż wafel z powrotem do płyty grzejnej o temperaturze 65 °C na kolejne 30 sekund, aby zakończyć pieczenie po ekspozycji.
  15. Pozwól wafli ostygnąć do temperatury pokojowej na stosie chusteczek z mikrofibry. Rozwiń wafel, przenosząc go na szalkę Petriego wypełnioną wywoływaczem fotograficznym mrDev-600, aby rozpocząć proces rozwoju. Wywoływanie jest przyspieszane, gdy jest wykonywane na wytrząsarce stołowej, a cała płytka jest zanurzana w wywoływaczu.
  16. Opłucz wafel izopropanolem i użyj mikroskopu stereoskopowego, aby sprawdzić powierzchnię płytki pod kątem pozostałości fotorezystu. Jeśli widoczne są pozostałości fotorezystu, zwróć wafel do wywoływacza. Po pełnym rozwinięciu fotorezystor upiecz na twardo, umieszczając wafel na płycie grzejnej ustawionej na 150 °C na 1 godzinę.
  17. Scharakteryzuj obie płytki, aby zapobiec przywieraniu PDMS podczas procesów miękkiej litografii. Aby przeprowadzić silanizację, odpipetuj 2-3 kropelki (na płytkę) silanu do małej szklanej fiolki. Umieść tę fiolkę wraz z waflami w eksykatorze i odkurzaj przez 5-10 minut. Uszczelnić eksykator i pozostawić płytki w próżni na okres 12 – 16 h.
    UWAGA: Silan jest toksyczny i nie należy go wdychać. Należy pamiętać o pracy pod wyciągiem i nosić rękawice nitrylowe podczas obchodzenia się z silanem. Obejmuje to umieszczenie pompy próżniowej w dygestoriach podczas pobierania podciśnienia na eksykatorze.
  18. Uwolnić próżnię od eksykatora i usunąć silanizowane płytki. Spłucz wodą i użyj pary N2 do wysuszenia wafli. W tym momencie wafle można umieścić w magazynie, aż będą potrzebne.

2. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

UWAGA: Proces miękkiej litografii używany do produkcji wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych opartych na PDMS można podzielić na trzy odrębne etapy: 1) Przygotowanie PDMS zarówno warstwy przepływowej, jak i kontrolnej, 2) Wyrównanie i połączenie dwóch warstw PDMS, 3) Ukończenie urządzenia.

  1. Przygotowanie PDMS
    1. Przygotować dwa roztwory prekursorów PDMS, łącząc bazę i utwardzacze w plastikowej zlewce i używając pręta mieszającego, aby wymieszać oba składniki, aż do całkowitego wymieszania. Warstwa kontrolna wymaga 20 g środka bazowego i 1 g utwardzacza (proporcja 20:1). Warstwa przepływowa wymaga 40 g środka bazowego i 8 g utwardzacza (stosunek 5:1). Odgazowanie roztworów w eksykatorze.
    2. Umieść wafel warstwy przepływowej na szalce Petriego i wlej na płytkę mieszaninę PDMS w proporcji 5:1. Odgazuj PDMS przez 30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
    3. Odwiruj płytkę warstwy kontrolnej (przygotowaną przy użyciu negatywu SU8 3050photoresist) o proporcjach 20:1 PDMS. Wlej 5-10 ml PDMS na środek wafla i uruchom następujący protokół wirowania (zachowaj pozostały PDMS do późniejszego wykorzystania): wiruj z prędkością 500 obr./min przez 15 s (100 obr./min), zwiększ prędkość wirowania do 1450 obr./min (300 obr./min/s) przez 45 s, a następnie zwolnij płytkę do 0 obr./min (200 obr./min/s).
    4. Aby zapewnić jednorodną grubość warstwy PDMS, umieść płytkę pokrytą PDMS na równej powierzchni na zamkniętej szalce Petriego (aby uniknąć zanieczyszczenia pyłem). Odstaw wafel na 30 minut.
    5. Usunąć warstwę przepływową z eksykatora i umieścić zarówno warstwę przepływu, jak i warstwę kontrolną w piecu (80 °C). Utwardź obie warstwy przez 28-30 minut i usuń, gdy PDMS jest wystarczająco plastyczny, aby można było nim manipulować, pozostając lekko lepkim. Natychmiast przystąp do procesu wyrównywania.
  2. Wyrównanie i klejenie
    1. Za pomocą skalpela usuń każde z czterech urządzeń z PDMS na płytce warstwy przepływowej. Po usunięciu warstwy PDMS z płytki krzemowej należy natychmiast przykryć stronę elementu taśmą klejącą, aby uniknąć zanieczyszczenia cząsteczkami kurzu.
    2. Z grubsza wyrównaj bloki warstwy przepływu na warstwie kontrolnej na oko, umieszczając stronę elementu urządzenia w kontakcie z warstwą kontrolną PDMS. Następnie dokonaj precyzyjnych korekt położenia każdego z bloków warstwy przepływu, aby wyrównać kanały warstwy przepływu z kanałami warstwy kontrolnej, używając mikroskopu stereoskopowego, aby pomóc w wizualizacji korekt.
    3. Zastosuj nacisk, aby usunąć kieszenie powietrzne między dwiema warstwami PDMS. Pozostałe PDMS w proporcji 20:1 zapisane wcześniej wlej wokół wyrównanych bloków warstwy przepływu. Umieść odważniki o wadze 100 g na każdym z urządzeń, aby zapewnić wystarczający kontakt podczas procesu łączenia.
    4. Włóż wyrównane urządzenia (wraz z obciążnikami) do piekarnika o temperaturze 80 °C i pozostaw je do połączenia na co najmniej 1,5 godziny i nie dłużej niż 6 godzin.
  3. Wykończenie urządzenia
    1. Wyjmij wafel z piekarnika i wyjmij każde z poszczególnych urządzeń z płytki warstwy kontrolnej, zakrywając stronę charakterystyczną każdego urządzenia taśmą klejącą.
    2. Iteracyjnie wybij pojedynczy otwór dla każdego z 9 wlotów warstwy przepływu, 24 wlotów kanałów warstwy kontrolnej i wylotu pojedynczej warstwy przepływu każdego urządzenia. Uderz urządzenie stroną z elementem skierowanym do góry, używając kamery, aby upewnić się, że otwory są wybite w granicach funkcji.
    3. Dla każdego urządzenia wyczyść pojedyncze szkiełko mikroskopowe izopropanolem i acetonem i wysusz szkiełka pod strumieniemN2. Następnie umieść szkiełka mikroskopowe na płycie grzejnej ustawionej na 150 °C na 15 minut.
    4. Użyj spopielania plazmą tlenową, aby połączyć urządzenia PDMS ze szklanymi szkiełkami, stosując moc spopielania 50 W przez 45 s. Upewnij się, że strona urządzenia jest skierowana do góry podczas spopielania. Po zakończeniu umieść urządzenie stroną do dołu na szklanym szkiełku, wywierając nacisk, aby usunąć uwięziony gaz między powierzchniami.
    5. Umieść połączone urządzenia na płycie grzejnej ustawionej na 110 °C na 1 godzinę. Na urządzeniach można umieścić obciążniki, aby poprawić przyczepność urządzenia.

3. Konfiguracja sprzętu

UWAGA: Aby uzyskać kontrolę nad układami mikroprzepływowymi, konieczne jest zainstalowanie i połączenie ze sobą wielu elementów sprzętu. Wymagane są trzy odrębne grupy sprzętu: 1) Pneumatyczny system sterowania kanałami sterującymi, 2) Pneumatyczny regulator ciśnienia do kontrolowania przepływu odczynników reakcyjnych w urządzeniu oraz 3) System chłodzenia do chłodzenia roztworu reakcyjnego IVTT przed wstrzyknięciem do urządzenia mikroprzepływowego. Przegląd konfiguracji sprzętu znajduje się w Rysunek 1. Należy zauważyć, że przedstawione tutaj protokoły starają się być tak ogólne, jak to tylko możliwe, jednak odniesione są do niektórych konkretnych elementów sprzętu używanych w naszych badaniach. Cały sprzęt można zastąpić alternatywami, które mogą pełnić tę samą funkcję. W takich przypadkach poniższe protokoły mogą być wykorzystane do nakreślenia ogólnych kroków potrzebnych do skonfigurowania systemu i wymagań każdego z komponentów. Alternatywne konfiguracje sprzętowe są przedstawione przez Brower et al.48 oraz White and Streets49.

  1. Pneumatyczny system sterowania (patrz Rysunek 2)
    1. Korzystając z protokołu producenta, nawiąż połączenie TCP między sterownikiem magistrali obiektowej a stacją roboczą użytkownika. Użyj oprogramowania sterującego (dostarczonego jako pliki dodatkowe), aby skomponować polecenia MODBUS, które są wysyłane przez połączenie TCP do sterownika i uruchomić zawory elektromagnetyczne.
    2. Sterownik magistrali obiektowej można rozbudować o osiem 4-kanałowych cyfrowych modułów wyjściowych, po jednym dla każdego używanego zaworu elektromagnetycznego. Każdy zawór elektromagnetyczny znajduje się nad sworzniem łączącym. Podłącz przewód dodatni do jednego z czterech wyjść dodatnich na jednym z cyfrowych modułów wyjściowych, jednocześnie podłączając przewód ujemny do jednego z portów uziemienia cyfrowych modułów wyjściowych.
      UWAGA: Aby system działał poprawnie, elektrozawory powinny być podłączane systematycznie, przy czym pierwszy elektrozawór powinien być podłączony do pierwszego portu wyjściowego, drugi elektromagnes do drugiego portu wyjściowego i tak dalej. W naszym systemie stosowane są dwa układy zaworów z odpowiednio 8 i 22 zaworami elektromagnetycznymi. Porty wyjściowe 1-8 łączą się z układem 8-zaworowym, a porty wyjściowe 9-30 łączą się z układem 22-zaworowym.
    3. Podłącz oba układy zaworów do źródła sprężonego powietrza za pomocą rurki 1/4". Użyj regulatorów ciśnienia, aby ustawić ciśnienie w 22-zaworowym układzie na 3 bary, a w 8-zaworowym na 1 bar.
  2. Regulacja ciśnienia przepływu (patrz Rysunek 3)
    UWAGA: Do przepływu płynów przez warstwę przepływową urządzenia mikroprzepływowego stosuje się dostępny w handlu 4-portowy regulator ciśnienia. Ciśnienie wyjściowe w każdym porcie jest regulowane za pomocą oprogramowania dostarczonego z regulatorem ciśnienia. Podłącz regulator ciśnienia do komputera za pomocą dostarczonego złącza USB.
    1. Podłącz regulator ciśnienia do źródła sprężonego powietrza, upewniając się, że dostarczane ciśnienie nie przekracza maksymalnego ciśnienia dozwolonego przez reduktor.
    2. Podłącz męskie złącze Luer do 3/32" z zadziorem do każdego z czterech żeńskich portów wyjściowych Luer lock regulatora ciśnienia. Podłącz kawałek miękkiej rurki (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 10 cm) do zadzioru.
    3. Podłącz drugie męskie złącze kolczaste Luer do 3/32" do otwartego końca miękkiego przewodu i podłącz go do portów złącza zbiornika płynu.
    4. Użyj dostarczonego oprogramowania, aby ustawić żądane ciśnienie na każdym wylocie regulatora przepływu, zwiększając ciśnienie odczynników przechowywanych w zbiornikach, aby spowodować przepływ odczynników do urządzenia mikroprzepływowego. Podłączenie zbiorników do urządzenia mikroprzepływowego zostanie omówione w rozdziale 4.2.
  3. Konfiguracja chłodzenia Off-Chip (patrz Rysunek 4)
    1. Za pomocą rurki PVC (średnica zewnętrzna: 10 mm, średnica wewnętrzna: 6 mm) należy podłączyć układ chłodzenia wodnego do bloku wody z zimną płytą za pomocą złączek zaciskowych. Napełnij zbiornik płynu w układzie chłodzenia wodą płynem chłodzącym i delikatnie przechyl urządzenie, aby usunąć uwięzione powietrze, stale dodając płyn chłodzący do zbiornika, aby upewnić się, że pozostaje pełny. Po usunięciu całego gazu z układu należy napełnić zbiornik do około 90-95% jego maksymalnej objętości.
    2. Zwiń rurkę PTFE (OD: 0,042", ID: 0,022") na zimną powierzchnię elementu Peltiera i zabezpiecz ją taśmą. Upewnij się, że jeden koniec rurki PTFE jest podłączony do zbiorników układu kontroli ciśnienia warstwy przepływowej (zgodnie z opisem w rozdziale 4.3). Drugi koniec rurki PTFE powinien wystawać nie więcej niż 1 cm z powierzchni Peltiera. Włóż rurkę PEEK o długości 5 – 10 cm (średnica zewnętrzna: 0.794 mm, średnica wewnętrzna: 0.127 mm) do wystającego końca rurki PTFE. Napełnianie przewodu i podłączenie do urządzenia mikroprzepływowego wyjaśniono bardziej szczegółowo w ppkt 4.3.
    3. Umieść gorącą powierzchnię elementu Peltiera na zimnej płycie bloku wodnego, nakładając wystarczającą ilość pasty termicznej na obie powierzchnie. Upewnij się, że wężyk, element Peltiera i blok chłodzący są przez cały czas w bezpośrednim kontakcie ze sobą.
    4. Podłącz element Peltiera do regulatora temperatury (poprzez złącze magistrali szeregowej), tak aby można było regulować napięcie dostarczane do Peltiera. Bezpiecznie umieść termistor na powierzchni Peltiera, łącząc wyjście z regulatorem temperatury. Po włączeniu chłodnicy wody należy dostosować napięcie dostarczane do Peltiera, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 4 °C.
      UWAGA: Przy tej konfiguracji temperatura Peltiera jest kontrolowana ręcznie poprzez dostosowanie dostarczonego napięcia, podczas gdy termistor służy tylko do monitorowania temperatury.

4. Przygotowanie eksperymentu

UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu, urządzenie mikroprzepływowe musi być przygotowane, a odczynniki reakcyjne muszą być włożone do odpowiedniego przewodu do wstrzyknięcia do urządzenia. W tej sekcji omówione: 1) Podłączenie przewodów kanału sterującego do urządzenia, 2) Podłączenie niechłodzonych odczynników dopływowych do urządzenia oraz 3) Podłączenie schłodzonych odczynników dopływowych do urządzenia.

  1. Podłączanie rurki kanału sterującego
    1. Dla każdego z kanałów sterujących urządzenia mikroprzepływowego należy przeciąć rurkę (OD: 0.06", ID: 0.02"). Z jednej strony włóż kołek króćca Luer 23 G, 1/2", a z drugiej włóż kołek łączący ze stali nierdzewnej (średnica zewnętrzna: 0,65 mm, średnica wewnętrzna: 0,35 mm, dł.: 8 mm).
    2. Podłącz króciec Luer do męskiego złącza nylonowego Luer do 3/32" zadzioru. Włóż zadzior łącznika do rurki poliuretanowej (OD: 4 mm, ID: 2.5 mm). Włóż tę rurkę poliuretanową bezpośrednio do jednego z zaworów elektromagnetycznych.
    3. Podłącz króciec Luer 23 G, 1/2" do strzykawki i włóż go do krótkiego (3-4 cm) kawałka rurki (OD: 0.06", ID: 0.02"). Umieść otwarty koniec tej rurki w zbiorniku z ultraczystą wodą i napełnij strzykawkę ultraczystą wodą.
    4. Ponumeruj każdy kanał sterujący urządzenia mikroprzepływowego, jak pokazano na rysunku Rysunek 5. Dla każdego kanału (z wyjątkiem kanałów sterujących od 1 do 3, które nie są wypełnione wodą) znajdź odpowiednią rurkę (podłączoną do zaworów elektromagnetycznych) i włóż metalowy kołek do otwartego końca rurki dołączonej do strzykawki. Wlej wodę do rurki kanału sterującego, aż zostanie wypełniona połowa długości.
    5. Odłącz rurkę od strzykawki i włóż kołek łączący ze stali nierdzewnej do odpowiedniego otworu urządzenia mikroprzepływowego. Powtórz te czynności dla wszystkich kanałów sterujących.
    6. Użyj interfejsu sterowania, aby otworzyć wszystkie zawory elektromagnetyczne. Spowoduje to zwiększenie ciśnienia płynu w rurce kanału sterującego, wtłaczając go do urządzenia mikroprzepływowego i zamykając wszystkie zawory membranowe w urządzeniu. Przykład membran otwartych i zamkniętych w urządzeniu znajduje się w Rysunek 6.
  2. Podłączanie niechłodzonych odczynników do urządzenia
    1. Dla każdego z niechłodzonych odczynników należy przeciąć odcinek rurki (OD: 0.06", ID: 0.02"), aby połączyć wylot zbiornika z wlotami urządzenia mikroprzepływowego.
    2. Weź jeden koniec rurki i włóż go do zbiornika, upewniając się, że rurka dociera do podstawy zbiornika. Wylot rurki zbiornika należy dokręcić w taki sposób, aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie. Włóż kołek połączeniowy ze stali nierdzewnej (OD: 0.65 mm, ID: 0.35 mm, L: 8 mm) do otwartego końca rurki.
    3. Podłącz 23 G, 1/2" Luer stub do końca małej (1 ml) strzykawki. Dodaj krótki odcinek rurki (OD: 0.06", ID: 0.02") do króćca Luer. Umieszczając koniec rurki w żądanym roztworze odczynnika, napełnij strzykawkę odczynnikiem.
    4. Włóż kołek łączący ze stali nierdzewnej do rurki poliuretanowej podłączonej do strzykawki i napełnij rurkę odczynnikiem. W przypadku stosowania małych objętości reakcji odczynnik nie dostanie się do zbiornika, a sam przewód będzie działał jako zbiornik. Odłączyć strzykawkę i włożyć kołek złącza do jednego z otworów wlotowych warstwy przepływowej urządzenia mikroprzepływowego.
    5. Zastosuj ciśnienie do każdego ze zbiorników za pomocą oprogramowania regulatora ciśnienia, aby wtłoczyć odczynniki do urządzenia mikroprzepływowego.
  3. Podłączanie schłodzonych płynów do urządzenia mikroprzepływowego
    1. Upewnij się, że chłodnica wody i element Peltiera są włączone, a temperatura powierzchni ogniwa Peltiera jest ustawiona na 4 °C. Zamontuj układ chłodzenia jak najbliżej urządzenia mikroprzepływowego, minimalizując niechłodzoną objętość między urządzeniem Peltiera a wlotem urządzenia.
    2. Podłącz otwarty koniec rurki PTFE do rurki podłączonej do jednego ze zbiorników płynu (zgodnie z opisem w rozdziale 4.2) za pomocą wtyku ze stali nierdzewnej (OD: 0.65 mm, ID: 0.35 mm, L: 8 mm).
    3. Podłącz małą strzykawkę (1 ml) do króćca Luer (23 G, 1/2") z krótką rurką (OD: 0.06", ID: 0.02") przymocowaną do końca. Napełnij strzykawkę odczynnikiem, który ma być schłodzony (w tym przypadku roztworem reakcyjnym IVTT).
    4. Podłącz rurkę PEEK do strzykawki za pomocą rurki łączącej i wywieraj stały nacisk na strzykawkę, przetłaczając odczynnik przez rurkę PEEK do rurki PTFE. Odłączyć rurkę PEEK od strzykawki i włożyć ją bezpośrednio do jednego z wlotów kanału przepływowego urządzenia mikroprzepływowego. Po przyłożeniu ciśnienia za pomocą oprogramowania regulatora ciśnienia schłodzony odczynnik zostanie wtłoczony do urządzenia mikroprzepływowego.

5. Eksperymentowanie

UWAGA: Przed przeprowadzeniem eksperymentów wszystkie połączenia sprzętowe i rurki wyszczególnione w sekcjach protokołów 3 i 4 powinny być zakończone, a wszystkie odczynniki powinny być podłączone do urządzenia. Procedurę eksperymentalną można następnie podzielić na cztery odrębne części: 1) Załadunek urządzenia mikroprzepływowego, 2) Przygotowanie mikroskopu, 3) Kalibracja urządzenia i 4) Przeprowadzenie eksperymentu. Niestandardowy wirtualny interfejs sterowania (patrz Rysunek 7) używany podczas tych badań jest dostarczany jako zasób uzupełniający za pośrednictwem listy materiałów)

  1. Ładowanie urządzenia mikroprzepływowego
    1. Umieść urządzenie mikroprzepływowe ze wszystkimi rurkami warstwy sterującej i przepływowej podłączonymi do stolika mikroskopu i zamknij wszystkie otwory w inkubatorze. Ustaw temperaturę otoczenia inkubatora na 29 °C. Upewnij się, że system chłodzenia został włączony i jest ustawiony na 4 °C przed rozpoczęciem eksperymentu.
    2. Upewnij się, że wszystkie kanały przepływu i sterowania są pod ciśnieniem. Ustaw ciśnienie kanałów sterujących 1-3 na 1 bar i zwiększ ciśnienie w kanałach sterujących 9-29 na 3 bary. Odczynniki wymagają ciśnienia od 20 do 100 mbar w celu nałożenia na zbiorniki płynu za pomocą oprogramowania regulatora ciśnienia.
    3. Usunąć powietrze z urządzenia mikroprzepływowego za pomocą jednego z odczynników. Zamknij wylot urządzenia (kanał sterowania ciśnieniem 29) i jednocześnie rozhermetyzuj kanały sterujące 1-3 i 15-28. Następnie selektywnie rozhermetyzuj kanały sterujące multipleksera, aby umożliwić przepływ wybranego odczynnika do urządzenia. Użyj mikroskopu, aby monitorować usuwanie powietrza.
      UWAGA: W przypadku, gdy odczynniki nie ładują się prawidłowo do urządzenia lub pęcherzyki powietrza nie są usuwane, ciśnienie można zwiększyć do 350 mbar.
    4. Upewnij się, że wszystkie odczynniki przepływają prawidłowo, bez wprowadzania powietrza - za pomocą funkcji Flush w oprogramowaniu sterującym. Monitorowanie przepływu płynu można uprościć, ładując najpierw fluorofor i monitorując jego przemieszczanie przez poszczególne odczynniki.
  2. Przygotowanie mikroskopu
    1. Za pomocą mikroskopu zlokalizuj dowolne punkty zainteresowania (wystarczy jeden punkt w każdym reaktorze) w urządzeniu mikroprzepływowym i zapisz jego współrzędne. Punkty te zostaną zobrazowane podczas kalibracji i procesów eksperymentalnych.
      UWAGA: Podczas procedur kalibracyjnych i eksperymentalnych zawartych w oprogramowaniu kontrolnym, mikroskop jest instruowany, aby okresowo rejestrować obrazy w poprzednio zapisanych współrzędnych. Aby to osiągnąć, oprogramowanie sterujące komunikuje się z oprogramowaniem mikroskopu, informując go o konieczności zarejestrowania nowych obrazów. Ta komunikacja jest unikalna dla każdej konfiguracji mikroskopu i jako taka funkcja ta została zmodyfikowana w dostarczonym interfejsie oprogramowania. Dostarczany jest fikcyjny plik wykonywalny, który może być modyfikowany przez użytkownika końcowego w celu zapewnienia kompatybilności z jego własnym systemem mikroskopu.
  3. Kalibracja urządzenia mikroprzepływowego
    1. Określ objętość płynu wypieranego z każdego reaktora podczas pojedynczego kroku dopływu (sekwencja pomp dostarczana przez perystalcznie uruchamiające kanały sterujące 15-17, składające się z 6 poleceń MODBUS wykonywanych sekwencyjnie), wykonując protokół kalibracji dostarczony w pakiecie oprogramowania.
    2. Ustaw następujące pola danych w oprogramowaniu sterującym: Kanał buforowy elucji, Kanał fluoroforowy, Liczba cykli rozcieńczania (domyślnie 10 rozcieńczeń), Liczba kroków dopływu (domyślnie 15 kroków), Liczba cykli mieszania (domyślnie 4 cykle) i Czas między cyklami mieszania (domyślnie 0 sekund). Rozpocznij kalibrację, naciskając przycisk Perform Calibration Experiment (Wykonaj eksperyment kalibracji).
      UWAGA: Podczas procesu kalibracji wszystkie reaktory są napełniane fluoroforem i rejestrowane są obrazy. Następnie przeprowadza się serię rozcieńczeń, w których eluent jest dozowany do reaktorów (w oparciu o ustaloną liczbę kroków dopływu), wypierając w ten sposób fluorofor. Po dokładnym wymieszaniu wykonywane są nowe obrazy. Proces ten powtarza się dla ustawionej liczby cykli rozcieńczania.
    3. Po zakończeniu kalibracji postępuj zgodnie z krokami przedstawionymi przez oprogramowanie sterujące, kończąc analizę eksperymentu kalibracyjnego.
      UWAGA: Analiza dostarczy użytkownikom współczynnika odświeżania dla każdego reaktora w oparciu o spadek fluorescencji zarejestrowany podczas każdego cyklu rozcieńczania. Wartość ta wskazuje ułamek objętości reaktora przemieszczony przez ustawioną liczbę stopni dopływu. Z kolei wartość ta będzie wykorzystywana podczas eksperymentów w celu określenia, ile kroków dopływu jest wymaganych do przemieszczenia określonej objętości reaktora.
  4. Przeprowadzanie eksperymentu
    1. Ustaw wymagane wartości dla żądanego eksperymentu w wirtualnym interfejsie sterowania. Krytyczna to frakcja odświeżania [%], która określa objętość reaktora przemieszczoną w cyklu eksperymentalnym i powinna być ustawiona w zakresie od 15 do 40%.
      UWAGA: Konkretny protokół eksperymentalny określi, które pola interfejsu sterującego powinny zostać ustawione przed rozpoczęciem eksperymentu. Konieczne będzie drobne kodowanie, aby dostosować interfejs sterowania do nowatorskich eksperymentów.
    2. Zainicjuj protokół eksperymentalny, naciskając przycisk Wykonaj eksperyment w interfejsie sterowania.
      UWAGA: Niezmienione, dostarczone oprogramowanie inicjuje prostą ekspresję białka. Reaktory 1 i 8 są wykorzystywane jako kontrole, podczas gdy reaktory 2-7 przeprowadzają identyczne eksperymenty. W tym przypadku 75% objętości reaktora składa się z roztworu IVTT, a 25% to woda ultraczysta lub liniowy roztwór DNA o długości 2,5 nM. Rozcieńczenia następują co 15 minut, przy czym 30% objętości reaktora jest przemieszczane na każde rozcieńczenie. Obrazy są rejestrowane na końcu każdego cyklu rozcieńczania.

6. Analiza danych

UWAGA: Dostarczono skrypty do analizy obrazów (zobacz pliki uzupełniające lub Tabelę materiałów), korzystając z pakietu analitycznego 'bfopen', który jest wymagany do przeglądania plików '.nd2' (dostarczanych przez naszą konfigurację mikroskopu).

  1. Uruchom skrypt analizy "calibrationScript.m" i po wyświetleniu monitu wybierz żądany plik ".nd2". Zostanie wyświetlony pojedynczy obraz reaktora, na podstawie którego będzie można określić prawidłową intensywność obrazu. Użyj suwaka, aby zoptymalizować intensywność obrazu w taki sposób, aby krawędzie kanału mikroprzepływowego były wyraźnie widoczne.
  2. Zostanie pokazany obraz reaktora. Na tym obrazie wybierz obszar wewnątrz kanału reaktora, w którym należy określić intensywność fluorescencji.
    UWAGA: Intensywność fluorescencji każdego reaktora, dla każdego zarejestrowanego obrazu, zostanie określona na podstawie wyników przedstawionych na prostym wykresie, co pozwoli na wizualizację wyników.

Wyniki

Aby zademonstrować skuteczność wielowarstwowej platformy mikrofluidycznej do przeprowadzania eksperymentów IVTT, opisany układ został wykorzystany do ekspresji białka deGFP. Eksperyment przeprowadzono w dostępnej komercyjnie30 mieszaninie reakcyjnej IVTT – zawierającej wszystkie niezbędne komponenty transkrypcyjne i translacyjne – uzupełnionej o substraty reakcji i matryce DNA. Eksperymenty prowadzono w temperaturze 29 °C; uznano ją za optymalną dla ekspresji białek metodą IVTT.

Urządzenie mikrofluidyczne posiada dziewięć oddzielnych wlotów, z których cztery zostały wykorzystane podczas tego eksperymentu. W pierwszym znajdowała się komercyjnie pozyskana mieszanina do reakcji IVTT. Mieszanina IVTT zawiera wszystkie komponenty niezbędne do pomyślnej ekspresji białek, jednak przed wprowadzeniem do urządzenia mikrofluidycznego do mieszaniny dodano oczyszczone białko GamS – do końcowego stężenia 1.3 µM. Dodatek białka GamS służy zminimalizowaniu degradacji liniowych form DNA podczas przeprowadzania eksperymentów. Co istotne, mieszaninę IVTT wstrzyknięto do rurek z politetrafluoroetylenu (PTFE), nawiniętych na element Peltiera o temperaturze powierzchni 4 °C, aby schłodzić roztwór przed jego wprowadzeniem do urządzenia mikrofluidycznego, co zapobiega degradacji roztworu reakcyjnego przed jego użyciem. Do połączenia rurek PTFE opuszczających powierzchnię elementu Peltiera z urządzeniem mikrofluidycznym wykorzystano rurki z polieteroeteroketonu (PEEK) o małej średnicy, co pozwoliło zmniejszyć objętość niechłodzonej mieszaniny IVTT. Drugi roztwór wprowadzony do urządzenia zawierał liniowy matrycowy DNA kodujący deGFP – rozpuszczony w wodzie ultrapure – w stężeniu 10 nM. Trzeci roztwór, woda ultrapure, pełnił wiele funkcji podczas procedur eksperymentalnych. Przede wszystkim woda ultrapure była stosowana w celu zapewnienia, aby objętość wypierana podczas rozcieńczania była taka sama dla wszystkich reaktorów, służąc jako zamiennik DNA w reakcjach kontrolnych. Ponadto wodę ultrapure wykorzystano do rozcieńczenia fluoroforu podczas kalibracji urządzenia oraz do przepłukania objętości martwej urządzenia przy zmianie odczynników. Ostatnim roztworem wprowadzonym do urządzenia był oczyszczony roztwór FITC-dekstranu (25 μM), niezbędny do przeprowadzenia wstępnej kalibracji urządzenia. Roztwory DNA, wody i fluoroforu wstrzykiwano do rurek (0.02” ID, 0.06” OD), które następnie można było wprowadzić do jednego z kanałów dopływowych urządzenia mikrofluidycznego zgodnie z sekcją 4.2 protokołów. W związku z tym roztwory te były przechowywane w temperaturze 29 °C przez cały czas trwania eksperymentów.

Aktywacja kanałów sterujących urządzenia mikroprzepływowego odbywa się za pomocą specjalistycznego oprogramowania sterującego, w którym każdy z kanałów sterujących może być aktywowany indywidualnie. Przeprowadzenie przedłużonych reakcji IVTT nie jest możliwe za pomocą tego procesu manualnego i wymaga zastosowania zautomatyzowanych protokołów wbudowanych w oprogramowanie sterujące. Podczas przygotowywania urządzenia mikroprzepływowego do eksperymentów można wykorzystać podobne zautomatyzowane protokoły do wykonania szeregu przydatnych procesów: płukania objętości martwej urządzenia nowym odczynnikiem, mieszania odczynników w reaktorze pierścieniowym oraz wprowadzania nowego odczynnika do reaktora przy jednoczesnym wypieraniu równiej objętości aktualnego roztworu. Dodatkowo dostępne są dwa złożone procesy: przeprowadzanie kalibracji urządzenia oraz realizacja przedłużonej bezkomórkowej ekspresji białek. Wszystkie wyżej wymienione procesy można łatwo wykonać z głównego interfejsu, mając jednocześnie możliwość konfiguracji wielu parametrów w celu zmiany konkretnych ustawień procesu, takich jak kanał dopływowy, objętość dopływu i czas mieszania.

Ze względu na wahania ciśnienia i niedoskonałości podczas wytwarzania urządzenia mikrofluidycznego, objętość cieczy wypieranej podczas jednego cyklu iniekcji może się różnić między poszczególnymi urządzeniami. W związku z tym, przed przeprowadzeniem eksperymentów IVTT, wyznaczono objętość reaktora wypieraną w jednym cyklu iniekcji (Refresh Fraction). Kalibracja ta wymaga wypełnienia wszystkich ośmiu reaktorów fluorescencyjnym roztworem referencyjnym. W tym przypadku zastosowano oczyszczony roztwór FITC-dekstranu (25 μM). Następnie zawartość reaktorów rozcieńczono 10-krotnie wodą ultrapure. Poprzez pomiar spadku fluorescencji w każdym cyklu rozcieńczania dla każdego reaktora, wyznaczono objętość cieczy wypieranej podczas jednego cyklu iniekcji. W oprogramowaniu sterującym wartość ta (Refresh Ratio) została zapisana do wykorzystania podczas eksperymentu IVTT. Co kluczowe, aby uwzględnić różnice w szybkości przepływu w obrębie urządzenia, a także rozbieżności w objętościach poszczególnych reaktorów, współczynnik Refresh Ratio jest wyznaczany i przechowywany dla każdego reaktora z osobna. Sekwencja napełniania i rozcieńczania reaktorów została przeprowadzona automatycznie za pomocą programu Perform Calibration, który jest częścią oprogramowania sterującego. Wyniki eksperymentu kalibracyjnego przedstawiono na Rysunku 8.

Najbardziej złożony zaprogramowany proces obejmuje długotrwały eksperyment IVTT, który pozwala użytkownikom na zainicjowanie badania, a następnie pozostawienie go bez nadzoru aż do zakończenia. W trakcie eksperymentu reaktory 1 i 5 służyły jako próbki blank, do których podczas rozcieńczania dodawano wyłącznie wodę. Reaktory 2 i 6 wykorzystano jako kontrole negatywne; zawierały one jedynie roztwór reakcyjny IVTT oraz wodę ultrapurą. Pozostałe reaktory (3, 4, 7 i 8) zawierały roztwory reakcyjne IVTT oraz 2,5 nM liniowego DNA kodującego gen deGFP. Inicjalizację reaktorów przeprowadzono poprzez całkowite wypełnienie wszystkich reaktorów (z wyjątkiem 1 i 5) roztworem reakcyjnym IVTT, a następnie zastąpienie 25% objętości reaktora wodą ultrapurą. Następnie rozpoczęto okresowe wstrzykiwanie odczynników do reaktorów. Eksperyment przeprowadzono w taki sposób, aby nowe odczynniki były wstrzykiwane do reaktorów co 14,7 minuty, przy czym podczas każdego cyklu rozcieńczania zastępowano 30% objętości reaktora. Skład każdego wstrzyku był taki, że 75% wstrzykiwanego płynu stanowił świeży roztwór IVTT, natomiast pozostałe 25% stanowiło DNA lub woda ultrapura. Po każdym wstrzyknięciu nowych odczynników zawartość reaktorów była nieustannie mieszana, a następnie za pomocą mikroskopu rejestrowano obraz fluorescencyjny każdego reaktora. Reakcję kontynuowano przez 68 cykli, co przełożyło się na czas trwania eksperymentu wynoszący 16,5 h. Wyniki tego eksperymentu przedstawiono na Rysunku 9.

Podczas przeprowadzania długotrwałych eksperymentów IVTT istnieją dwie główne przyczyny niepowodzenia reakcji: wprowadzenie powietrza do urządzenia mikroprzepływowego lub degradacja roztworu reakcyjnego IVTT. Obecność powietrza w urządzeniu mikroprzepływowym jest najczęściej bezpośrednim wynikiem małych pęcherzyków powietrza znajdujących się w roztworach dopływowych, które następnie zostają wstrzyknięte do urządzenia. Po przedostaniu się do urządzenia obecność powietrza hamuje prawidłowy przepływ płynów, w wyniku czego reakcje nie są już okresowo odświeżane, co prowadzi do powstania reakcji okresowych w obrębie pierścieni reaktora. W niektórych przypadkach powietrze jest powoli usuwane z urządzenia poprzez wielokrotne płukanie odczynnikami, po czym reakcja kontynuowana jest zgodnie z planem (jak pokazano na Rysunku 9). W innych przypadkach powietrze pozostaje uwięzione i można je usunąć jedynie poprzez przerwanie eksperymentu, a następnie zastosowanie ciągłego (wysokiego) ciśnienia do warstwy przepływowej urządzenia mikroprzepływowego, analogicznie do procesu napełniania opisanego w sekcji 5.1 protokołów. Podczas naszych eksperymentów lizat komórkowy jest przechowywany w rurkach PTFE na elemencie Peltiera chłodzonym do 4 °C. Oba te środki pomagają ograniczyć degradację roztworu reakcyjnego IVTT w czasie, przy czym obojętne rurki PTFE zapewniają ograniczoną interakcję między rurkami a roztworem reakcyjnym, a niskie temperatury chronią funkcjonalne komponenty (bio)molekularne niezbędne do przeprowadzenia IVTT. Jeśli dojdzie do degradacji roztworu reakcyjnego – w wyniku niewystarczającego chłodzenia lub niepożądanych oddziaływań między roztworem reakcyjnym a środowiskiem przechowywania – objawi się to eksperymentalnie jako stopniowy spadek ekspresji białka w czasie. Po wystąpieniu degradacji roztwór reakcyjny IVTT nie może zostać odzyskany i należy przygotować nowy eksperyment.

Układ mikroskopowy z regulacją ciśnienia, chłodzeniem Peltiera, zbiornikami na ciecze; schemat i zdjęcie laboratoryjne.
Rysunek 1. Konfiguracja sprzętowa wymagana do przeprowadzania ciągłych reakcji IVTT. A) Schemat konfiguracji sprzętowej. B) Fotografia układu wykorzystanego w niniejszym artykule. Wdrożenie wielowarstwowego urządzenia mikroprzepływowego do ciągłych reakcji IVTT wymaga rozbudowanego zaplecza sprzętowego do regulacji ciśnienia przepływu, sterowania kanałami kontrolnymi, ogrzewania i chłodzenia reakcji oraz odczynników, przechowywania cieczy oraz obrazowania urządzenia podczas eksperymentów. Eksperymenty prowadzone są w temperaturze 30 °C, co osiąga się poprzez umieszczenie mikroskopu w inkubatorze ustawionym na tę temperaturę. Aby zapobiec degradacji roztworu reakcyjnego IVTT, jest on przechowywany w rurkach z PTFE zwiniętych nad zimną stroną elementu Peltiera. Temperatura elementu Peltiera jest ustawiona na 4 °C, przy czym do utrzymania tej temperatury wykorzystuje się chłodnicę wodną i blok wodny. Odczynniki, które nie wymagają chłodzenia, są przechowywane w zbiornikach na ciecze poza inkubatorem mikroskopowym. Stałe ciśnienie jest przyłożone do tych zbiorników za pomocą sterowanego komputerowo regulatora ciśnienia. W ten sposób ciecze są tłoczone przez rurki wylotowe zbiorników, które łączą się bezpośrednio z kanałami wlotowymi urządzenia mikroprzepływowego. Każdy z kanałów kontrolnych urządzenia mikroprzepływowego jest połączony z zaworem pneumatycznym. Cały układ zaworów znajduje się pod stałym ciśnieniem. Otwarcie zaworu pozwala na zwiększenie ciśnienia cieczy w rurce łączącej zawór pneumatyczny z kanałem kontrolnym urządzenia mikroprzepływowego, co powoduje otwieranie i zamykanie membran PDMS znajdujących się w urządzeniu mikroprzepływowym. Zawory pneumatyczne są otwierane i zamykane za pomocą interfejsu użytkownika, który wydaje polecenia kontrolerowi magistrali polowej (nie pokazano), aby otwierać i zamykać konkretne zawory pneumatyczne. Rysunek zaadaptowany z Yelleswarapu i wsp.22. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat kolektora pneumatycznego; połączenie rurek; port zasilania powietrzem; konfiguracja aparatury naukowej.
Rycina 2. Przegląd konfiguracji zaworów pneumatycznych i połączeń kanałów sterujących. Przedstawiono macierz 8 zaworów z trzema połączeniami kanałów sterujących doprowadzonymi do zaworów 1, 2 i 3. Sprężone powietrze może być doprowadzane do macierzy zaworów za pomocą rurek 1/4”. Do aktywacji kanałów sterujących stosuje się dwa poziomy ciśnienia: 1 bar dla kanałów sterujących o niskim ciśnieniu (1, 2 i 3) oraz 3 bar dla kanałów sterujących o wysokim ciśnieniu (od 9 do 30, niewidoczne na rysunku). Rurki można napełnić wodą ultrapure i wprowadzić do jednego z wlotów kanału sterującego, używając stalowego pinu łączącego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ mikrofluidyczny z kontrolerem ciśnienia, zbiornikiem, rurkami i złączami; regulacja przepływu płynów.
Rysunek 3. Przegląd komercyjnego systemu regulatora ciśnienia przepływu i zbiornika.Do wstrzykiwania płynów do warstwy przepływowej wielowarstwowego urządzenia mikrofluidycznego używa się dostępnego w handlu regulatora ciśnienia. Podłączenie kontrolera ciśnienia do komputera umożliwia modulację ciśnienia wykorzystywanego do wstrzykiwania płynów. Odczynniki mogą być przechowywane w zbiorniku z płynem, który jest bezpośrednio połączony z regulatorem ciśnienia. Przyłożenie ciśnienia do zbiornika wymusza wypływ płynu ze zbiornika przez rurkę wylotową. Rurka wylotowa ta może zostać podłączona bezpośrednio do jednego z wlotów płynu w urządzeniu mikrofluidycznym za pomocą złącza ze stali nierdzewnej. W przypadku, gdy objętość odczynnika nie pozwala na jego umieszczenie w zbiorniku, rurka wylotowa pełni funkcję zbiornika dla odczynnika. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikrofluidyczny system chłodzenia z elementem Peltiera, kablem termistora oraz przewodami PTFE i PVC.
Rysunek 4. Przegląd systemu chłodzenia wykorzystywanego do chłodzenia odczynników reakcyjnych. (Lewo) Izolowany układ chłodzenia oraz (Prawo) Układ chłodzenia umieszczony w mikroskopie i podłączony do urządzenia mikrofluidycznego. Element Peltiera służy do chłodzenia roztworu reakcyjnego IVTT przed wstrzyknięciem go do urządzenia mikrofluidycznego. Odczynnik jest przechowywany w przewodach PTFE zwiniętych w coil nad zimną stroną elementu Peltiera. Do transportu schłodzonego płynu do urządzenia mikrofluidycznego użyto odcinka przewodu PEEK, którego mała średnica wewnętrzna (0.005”) minimalizuje objętość odczynnika, który nie jest już chłodzony. Obok zwiniętych przewodów PTFE umieszczono termistor, umożliwiający monitorowanie temperatury na powierzchni elementu Peltiera w czasie rzeczywistym. Napięcie przyłożone do elementu Peltiera jest ustawione tak, aby temperatura jego powierzchni utrzymywała się w zakresie od 0 °C do 4 °C. W celu odprowadzenia nadmiaru ciepła generowanego przez element Peltiera, jego gorąca strona jest przyległa do bloku chłodzonego wodą, z dodatkiem bezsilikonowej pasty termoprzewodzącej, co zapewnia optymalny transfer ciepła między obiema powierzchniami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat urządzenia mikrofluidycznego; warstwy sterujące/przepływowe; integracja chipa; zastosowanie typu lab-on-a-chip.
Rycina 5. Przegląd konstrukcji urządzenia mikrofluidycznego. Mikrofluidyczny reaktor przepływowy do ciągłych reakcji IVTT składa się z ośmiu pierścieni reaktora, z których każdy ma objętość 10.7 nL. Dziewięć wlotów umożliwia dopływ dziewięciu unikalnych roztworów reakcyjnych do urządzenia. 24 kanały sterujące regulują przepływ płynów wewnątrz urządzenia. Kanały sterujące od 9 do 14 tworzą multiplekser. Kanały te powinny być stale pod ciśnieniem, aby zapobiec przepływowi płynów do urządzenia. Jednoczesne obniżenie ciśnienia w dwóch kanałach sterujących umożliwia dopływ pojedynczego odczynnika. Kanały sterujące 15, 16 i 17 służą do kontrolowanego pompowania odczynników do urządzenia w sposób perystaltyczny. Kanały sterujące od 18 do 25 sterują odpowiednio wlotem do każdego z ośmiu reaktorów znajdujących się w urządzeniu. Kanał sterujący 26 może zamknąć kanał płukania, wymuszając tym samym przepływ płynu do reaktorów. Kanał sterujący 27 wspomaga homogeniczne napełnianie reaktorów. Kanały sterujące 28 i 29 regulują odpowiednio wyloty reaktorów pierścieniowych oraz jedyny wylot urządzenia. Na koniec, kanały sterujące 1, 2 i 3 służą do perystaltycznego pompowania płynu wewnątrz reaktorów pierścieniowych, co prowadzi do mieszania odczynników. Konstrukcja tego urządzenia mikrofluidycznego oraz rycina zostały zaadaptowane z pracy Neiderholtmeyer et al.29. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schematy urządzenia mikrofluidycznego pokazujące kontrolę przepływu w kanałach; A i B, skala 50 µm.
Rysunek 6. Zawór membranowy wewnątrz urządzenia mikrofluidycznego. A) Kanał przepływowy wewnątrz urządzenia mikrofluidycznego. W tle widoczne są dwa kanały sterujące. Kanały te nie są pod ciśnieniem, w związku z czym zawory są otwarte (płyn może przepływać). B) Dwa kanały sterujące przecinające kanały warstwy przepływowej zostały poddane ciśnieniu, co zamknęło zawory (tj. przepływ płynu został zablokowany). Po podaniu ciśnienia do kanałów sterujących, cienka membrana PDMS oddzielająca kanały warstwy przepływowej i sterującej zostaje odgięta w górę (warstwa sterująca znajduje się pod warstwą przepływową), co zamyka kanał warstwy przepływowej. Zaokrąglenie kanału warstwy przepływowej jest kluczowe dla zapewnienia pełnego zamknięcia kanału przepływowego przez odgiętą membranę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Interfejs automatycznego eksperymentu spektroskopowego; sterowanie, konfiguracja sekwencji, opcje kalibracji, wprowadzanie danych.
Rysunek 7. Interfejs użytkownika służący do sterowania urządzeniem mikroprzepływowym.W ramach niniejszych badań wykorzystano niestandardowy interfejs sterujący do kontrolowania przepływu cieczy w obrębie urządzeń mikroprzepływowych. Interfejs umożliwia użytkownikom indywidualne uruchamianie każdego z kanałów sterujących (numerowanych od 1-3 i 9-29) lub wykonywanie rozbudowanych protokołów obejmujących płukanie i ładowanie odczynników, kalibrację urządzenia mikroprzepływowego oraz realizację eksperymentów. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Diagram intensywności fluorescencji w funkcji rozcieńczenia; wykresy współczynników odświeżania reaktorów i etapów rozcieńczenia.
Rysunek 8. Wyniki eksperymentu kalibracyjnego. Podczas eksperymentu kalibracyjnego reaktory wypełnia się fluoroforem (25 µM FITC-Dextran), po czym rejestruje się intensywność fluorescencji. Następnie przeprowadza się serię rozcieńczeń, w których określona liczba kroków dopływu (15) służy do wtryskiwania wody ultrapurej do reaktorów. Po każdym rozcieńczeniu odczynniki są mieszane, a następnie mierzy się fluorescencję. Spadek intensywności fluorescencji na każde rozcieńczenie ujawnia objętość pierścienia reaktora zastąpioną dla określonej liczby kroków dopływu; wartość ta jest określana jako Współczynnik Odświeżania. A) Średnia intensywność i odchylenie standardowe dla wszystkich ośmiu reaktorów przedstawione są na czerwono, a poszczególne ścieżki intensywności na szaro. B) Średni Współczynnik Odświeżania oraz odchylenie standardowe dla każdego etapu rozcieńczenia przedstawiono na czerwono. Indywidualne Współczynniki Odświeżania dla każdego reaktora pokazano na szaro. Można zauważyć, że siedem z ośmiu reaktorów wykazuje bardzo podobne zachowanie, jednak jeden reaktor wykazuje fluktuacje Współczynnika Odświeżania po siódmym cyklu rozcieńczenia. Podkreśla to potrzebę wyznaczania unikalnych Współczynników Odświeżania dla każdego z reaktorów, zamiast stosowania średniego Współczynnika Odświeżania podczas wtryskiwania odczynników do reaktorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

wykres intensywności fluorescencji ekspresji deGFP; porównanie IVTT, kontroli i pustego reaktora.
Rysunek 9. Wyniki eksperymentu IVTT z ekspresją białka deGFP. Rozpoczęto przedłużoną reakcję IVTT w taki sposób, aby 30% objętości reaktora było wypierane co 14,6 minut. Reakcję prowadzono przez ponad 16 godzin przed jej zakończeniem. Dwa reaktory urządzenia mikroprzepływowego posłużyły jako próbki ślepe, przez które przez cały czas trwania eksperymentu przepływała wyłącznie woda ultrapure (reaktory 1 i 5). Wszystkie pozostałe reaktory zawierały 75% roztworu reakcyjnego IVTT oraz 25% wody ultrapure (reaktory 2 i 6) lub 2,5 nM liniowych matryc DNA kodujących ekspresję deGFP (reaktory 3, 4, 7 i 8). W czterech reaktorach, do których dodano DNA, widoczna jest wyraźna ekspresja deGFP. Trzy z czterech reaktorów wykazują podobną intensywność fluorescencji, przy czym jeden reaktor wykazuje niższy sygnał fluorescencyjny. Może to być spowodowane rozbieżnością w przepływie, w wyniku której do reaktora dostało się mniej DNA, lub wynikać z różnic w wymiarach reaktora. Po 14 godzinach w reaktorach zawierających DNA zaobserwowano gwałtowny wzrost sygnału. Jest to spowodowane dostaniem się pęcherzyka powietrza do warstwy przepływu urządzenia mikroprzepływowego, prawdopodobnie pochodzącego z jednego z roztworów dopływowych. Uwięzienie powietrza w urządzeniu mikroprzepływowym znacząco ogranicza przepływ płynów przez kanały, przez co do reaktorów nie mogą być dodawane ani usuwane świeże odczynniki, dopóki powietrze nie zostanie usunięte. Po wznowieniu przepływu eksperyment powrócił do poprzedniej intensywności fluorescencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Pliki uzupełniające. Kliknij tutaj, aby pobrać te pliki.

Dyskusja

Zaprezentowano wielowarstwowe urządzenie mikroprzepływowe oparte na PDMS i zademonstrowano jego zdolność do podtrzymywania reakcji IVTT przez dłuższy czas. Chociaż technologia ta dobrze nadaje się do tego konkretnego przykładu, może być wykorzystywana do wielu innych zastosowań. Dodatkowa kontrola nad przepływem płynu - w połączeniu ze zdolnością do ciągłego uzupełniania odczynników reakcyjnych przy jednoczesnym usuwaniu produktów (ubocznych) - jest idealna do ciągłych reakcji syntezy, badania różnych zachowań dynamicznych i jednoczesnego prowadzenia wielu wariantów pojedynczej reakcji.

Pomimo stosunkowo prostego procesu produkcji urządzeń opartych na PDMS, korzystanie z nich wymaga rozbudowanej konfiguracji sprzętowej. Składające się z układów zaworów, regulatorów ciśnienia, pomp ciśnieniowych, inkubatorów i jednostek chłodzących, przejście od produkcji do użytkowania nie jest elementarne i wymaga znacznych inwestycji początkowych. Ponadto zdolność do konsekwentnego ustawiania i przeprowadzania udanych eksperymentów z tymi urządzeniami wymaga znacznych inwestycji czasowych; Jest to kwestia, do której niniejszy manuskrypt ma się odnieść. Jednak po umieszczeniu na miejscu cała konfiguracja może być modyfikowana do różnych celów. Co więcej, konfiguracja sprzętowa składa się z wielu elementów modułowych, z których każdy można rozbudować, aby umożliwić zastosowanie bardziej złożonych konstrukcji urządzeń mikroprzepływowych. Dodatkowo, modułowa konstrukcja umożliwia wymianę komponentów sprzętowych na podobnie działające alternatywy, dzięki czemu użytkownicy nie są ograniczeni do konkretnej konfiguracji opisanej tutaj48,49.

Zmienność pomiędzy poszczególnymi urządzeniami oraz w warunkach zewnętrznych (takich jak wahania ciśnienia) może skutkować niedokładnościami podczas wykonywania eksperymentów z użyciem tych urządzeń. Aby rozwiązać ten problem, przed każdym eksperymentem należy przeprowadzić kalibrację systemu, zapewniając unikalny współczynnik odświeżania dla każdego z reaktorów. Chociaż kalibracja dotyczy różnic między urządzeniami i eksperymentów, jest to proces czasochłonny i nie bezbłędny. Płyny o różnej lepkości nie będą płynąć z taką samą szybkością, gdy zostaną wystawione na działanie identycznego ciśnienia, w związku z czym przeprowadzenie kalibracji z wieloma odczynnikami może nie dać identycznych współczynników odświeżania. Efekt ten jest tłumiony przez wykorzystanie trzech kanałów sterujących do perystaltycznego pompowania odczynników do urządzenia mikroprzepływowego, w przeciwieństwie do regulacji przepływu poprzez samą zmianę dostarczanego ciśnienia. W ostateczności w przypadkach, gdy rozbieżność lepkości jest bardzo duża, można zaimplementować unikalny współczynnik odświeżania dla każdego odczynnika z osobna, przeprowadzając wiele eksperymentów kalibracyjnych.

Zastosowanie pompy perystaltycznej do wstrzykiwania odczynników do urządzenia mikroprzepływowego niweluje efekty stosowania roztworów o różnej lepkości, jednak stwarza również problem wtórny. Zastosowanie dyskretnych kroków do pompowania płynów do urządzenia mikroprzepływowego oznacza, że rozdzielczość wtrysków do pojedynczego reaktora jest ograniczona przez objętość wtryskiwaną podczas wykonywania pojedynczego cyklu pompy. W naszych badaniach wartość ta - określona podczas kalibracji - jest w przybliżeniu równa 1%, co wskazuje, że pojedynczy cykl pompy wypiera około 1% objętości reaktora (około 0,1 nL). W związku z tym przemieszczenie 30% objętości reaktora wymaga wykonania 30 cykli pompowania, przy czym dodawane są 23 cykle pompowania roztworu reakcyjnego IVTT i tylko 7 cykli pompowania DNA lub wody ultraczystej. Chociaż jest to wystarczające dla naszych badań, alternatywne protokoły eksperymentalne mogą napotkać problemy podczas próby dodania większej liczby unikalnych odczynników, użycia niższej frakcji odświeżania lub dodania mniejszych objętości pojedynczego odczynnika do reaktora. W takich przypadkach konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego może być dostosowana do zapewnienia reaktorów o większej objętości. Przykład takiego jest opisany w Niederholtmeyer et al.36.

Co najważniejsze, urządzenie opisane w tym manuskrypcie pozwala na podtrzymywanie reakcji przez dłuższy czas, co skutkuje szybkością transkrypcji i translacji w stanie ustalonym. Poprzez okresowe wstrzykiwanie nowych odczynników do reaktorów - i usuwanie (uboczne) produktów reakcji - reakcje są podtrzymywane i można monitorować złożone zachowania dynamiczne. W ten sposób powstała platforma, która – w pewnym stopniu – naśladuje środowisko komórkowe. Co więcej, platforma ta umożliwia badanie dynamiki systemu poprzez dostosowanie okresu między iniekcjami do specyficznego składu iniekcji. W rezultacie, te wielowarstwowe urządzenia mikroprzepływowe są potężnym narzędziem do charakteryzowania i optymalizacji nowatorskich sieci syntetycznych, które wykazują złożone zachowanie dynamiczne.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych, ERC (projekt n. 677313 BioCircuit), grant NWO-VIDI z Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO, 723.016.003), finansowanie z Ministerstwa Edukacji, Kultury i Nauki (programy Gravity, 024.001.035 i 024.003.013), grant Human Frontier Science Program RGP0032/2015, Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań naukowych i innowacji Grant 723106, oraz grant Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki 200021_182019.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
AcetonVWR20063.365
AZ 40 XTMerck KGaA (Darmstadt, Niemcy)-Dodatni fotorezystu
AZ 726 MIF DeweloperMerck KGaA (Darmstadt, Niemcy)-Wywoływanik Dodatni fotorezystu
IzopropanolMerck KGaA (Darmstadt, Niemcy)109634
Szkiełka mikroskopoweVWRECN 631-1550
mr Dev 600Microresist Technology GmbH (Berlin, Niemcy)-Deweloper Ujemny fotorezystor
Bezsilikonowyradiator Smar Circuit WorksCW7270Związek termiczny
Wafle krzemoweMateriały krzemowe-< Orientacja 1-0-0>, średnica 100 mm, 525 &mikro; m grubość
SU-8 3050Microchem Corp. (Newton, MA)-Ujemny zestaw
elastomerów fotorezystu Sylgard 184 (PDMS)The Dow Chemical Company01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktyl)silanSigma-Aldrich448931-10G
NazwaCompanyKatalog NumerKomentarze
Equipment
4-kanałowy cyfrowy moduł wejść/wyjśćWAGO Kontakttechnik GmbH750-5048x
Obiektyw kameryŁącznik kompresyjny
Koolance, Inc.FIT-V06X10Złączka do rur o średnicy wewnętrznej 6 mm i średnicy zewnętrznej 10 mm. 4x
Moduł końcowy sterownikaWAGO Kontakttechnik GmbH750-600
Urządzenie łączące rurkiSaint-Gobain Performance PlasticsAAD041030,02" ID, 0,06" OD, Tygon Rurka (ND-100-80)
Piny złącza urządzeniaUnimed SA (Lozanna, Szwajcaria)200.010-ARurka AISI 304, 0,35 mm średnica wewnętrzna, 0,65 mm średnica zewnętrzna, 8 mm L
Sterownik EthernetWAGO Kontakttechnik GmbH750-881
Żeńskie złącze magistraliEncitechDTCK15-DBS-K15-biegunowe żeńskie złącze magistrali
Zbiorniki płynówFluigentFluiwell-4C
Fluigent system ciśnieniowyFluigentMFCS-EZ0 - 345 mbar
Hg lampa łukowaAdvanced Radiation Corporation- 350W
Płyta grzejnaTorrey Pines ScientificHP61
Mikroskop odwróconyNikon InstrumentsEclipse Ti-E
LabVIEW Softwarede Greef Lab, Eindhoven University ofhttps://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Płynny płyn chłodzącyKoolance, Inc.LIQ-705CL-B
Luer odgałęzieniaInstech Laboratories, Inc.LS23
Męskie złącza Luer do zadziorówCole Parmer45505-323/32" ID
MatlabSoftware de Greef Lab, Eindhoven University ofhttps://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
MikrokameraŹródło obrazowaniaDMK 42AUC03
Kamera mikroskopowaHamamatsu PhotonicsOrcaFlash4.0 V2 ( C11440-22CU)
Wytrząsarka orbitalnaCole ParmerEW-513000-05
PiekarnikThermo ScientificHeraeus T6P 50045757
Plazma tlenowa AsherQuorum TechnologiesK1050X
PDMS dziurkaczSYNEOAccu-Pucnh MP10
PEEK rurka Trajan1301005001-5F0.005" ID, 1/32" OD, czerwony
Element PeltieraTermodynamika europejskaAPH-127-10-25-S
Regulator temperatury PeltieraWarner InstrumentsCL-100
PhotomaskCAD/Art Services, Inc.-
Photomask DesignMaerkl Lab, EPFLhttps://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatyczny układ zaworówFESTO-1x22 i 1x 8 układ zaworów, Zawory normalnie zamknięte.
ZasilaczKoolance, Inc.ADT-EX004SZasilacz sieciowy 110/220 V
Rurka PTFECole Parmer06417-21#24 AWG Cienkościenny
kołek dziurkującyPTFE SYNEOCR0320245N21R4OD: 0,032" (0,8128 mm), ID: 0,024" (0,6090 mm)
Rurki PVCKoolance, Inc.HOS-06CL6 mm ID, 10 mm OD
Ostrza jednokrawędzioweGEMScientific-Miękkie
rurkiFluigent-Dostarczaneze zbiornikami płynów. (1 mm średnica wewnętrzna, 3 mm średnica zewnętrzna)
Powlekarka wirowaLaurell Technologies CorporationWS-650MZ-23NPPB
Mikroskop stereoskopowyOlympus CorporationSZ61
termistoraWarnerInstruments TA-29z termistorem koralikowym
System naświetlania UVABM, USA-NearUV Exposure System, 350W
Pompa próżniowaVacuumbrand GmbHMD1C
Chłodzony wodą blok zimnej płytyKoolance, Inc.PLT-UN40F
Chłodnica wodnaKoolance, Inc.EX2-755
WagaSartoriusM-prove
źródła obrazowania Technology Technology

Bibliografia

  1. van Roekel, H. W. H., et al. Programmable chemical reaction networks: emulating regulatory functions in living cells using a bottom-up approach. Chemical Society Reviews. 44, 7465-7483 (2015).
  2. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. , (2017).
  3. Del Vecchio, D., Sontag, E. D. Dynamics and control of synthetic bio-molecular networks. Proceedings of the American Control Conference. , 1577-1588 (2007).
  4. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 410-422 (2009).
  5. Padirac, A., Fujii, T., Rondelez, Y. Bottom-up construction of in vitro switchable memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3212-E3220 (2012).
  6. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. 439, 856-860 (2006).
  7. Genot, A. J., Fujii, T., Rondelez, Y. In vitro regulatory models for systems biology. Biotechnology Advances. 31, 789-796 (2013).
  8. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403, 335-338 (2000).
  9. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
  10. Montagne, K., Plasson, R., Sakai, Y., Fujii, T., Rondelez, Y. Programming an in vitro DNA oscillator using a molecular networking strategy. Molecular Systems Biology. 7, 466-466 (2014).
  11. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nature Reviews Genetics. 11, 367-379 (2010).
  12. Hockenberry, A. J., Jewett, M. C. Synthetic in vitro circuits. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 253-259 (2012).
  13. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33, 111-119 (2015).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology - identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnology Journal. 7, 856-866 (2012).
  15. Venturelli, O. S., et al. Programming mRNA decay to modulate synthetic circuit resource allocation. Nature Communications. 8, 1-11 (2017).
  16. Scott, M., Mateescu, E. M., Zhang, Z., Hwa, T. Interdependence of cell growth and gene expression: origins and consequences. Science. 330, 1099-1103 (2010).
  17. Borkowski, O., Ceroni, F., Stan, G. B., Ellis, T. Overloaded and stressed: whole-cell considerations for bacterial synthetic biology. Current Opinion in Microbiology. 33, 123-130 (2016).
  18. Liao, C., Blanchard, A. E., Lu, T. An integrative circuit-host modelling framework for predicting synthetic gene network behaviours. Nature Microbiology. , (2017).
  19. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).
  20. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19, 751-755 (2001).
  21. Oberholzer, T., Nierhaus, K. H., Luisi, P. L. Protein expression in liposomes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 261, 238-241 (1999).
  22. Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synthetic Biology. 7, (2018).
  23. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic Acids Research. 40, 3763-3774 (2012).
  24. Dunlop, M. J., et al. Distinct timescales of RNA regulators enable the construction of a genetic pulse generator. Biotechnology and Bioengineering. , (2019).
  25. Yoshiyama, T., Ichii, T., Yomo, T., Ichihashi, N. Automated in vitro evolution of a translation-coupled RNA replication system in a droplet flow reactor. Scientific Reports. 8, 1-8 (2018).
  26. Iyer, S., Karig, D. K., Norred, S. E., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Multi-input regulation and logic with T7 promoters in cells and cell-free systems. PLoS ONE. 8, 1-12 (2013).
  27. de los Santos, E. L. C., Meyerowitz, J. T., Mayo, S. L., Murray, R. M. Engineering Transcriptional Regulator Effector Specificity Using Computational Design and In vitro Rapid Prototyping: Developing a Vanillin Sensor. ACS Synthetic Biology. 5, 287-295 (2016).
  28. Guo, S., Murray, R. M. Construct functional feedforward loop biological circuits in a cell-free system and in cells. ACS Synthetic Biology. , (2019).
  29. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9, (2017).
  30. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The all E. coli TX-TL toolbox 2.0: A platform for cell-free synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5, 344-355 (2016).
  31. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  32. Lee, J. W., et al. Creating single-copy genetic circuits. Molecular Cell. 63, 329-336 (2016).
  33. Gibson, D. G., et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a mycoplasma genitalium genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
  34. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3, 387-397 (2014).
  35. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16, 269-281 (2016).
  36. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15985-15990 (2013).
  37. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242, 1162-1164 (1988).
  38. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  39. Timm, A. C., Shankles, P. G., Foster, C. M., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Toward microfluidic reactors for cell-free protein synthesis at the point-of-care. Small. 12, 810-817 (2016).
  40. Doktycz, M. J., Foster, C. M., Retterer, S. T., Timm, A. C., Shankles, P. G. Characterization of extended channel bioreactors for continuous-flow protein production. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 33, 06FM02(2015).
  41. Khnouf, R., Beebe, D. J., Fan, Z. H. Cell-free protein expression in a microchannel array with passive pumping. Lab on a chip. 9, 56-61 (2009).
  42. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab on a Chip. 11, 3523-3529 (2011).
  43. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16, 2168-2187 (2016).
  44. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synthetic Biology. 1, 29-41 (2012).
  45. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, 1-18 (2015).
  46. Galas, J., Haghiri-Gosnet, A. -M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab on a Chip. 13, 415-423 (2013).
  47. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2004).
  48. Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
  49. White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrofluidyczny reaktor przepływowyprzedłużone reakcje IVTTwielowarstwowe urządzenie mikrofluidycznesyntetyczne sieci genowetranskrypcja i translacja in vitroanaliza ekspresji GFPkonfiguracja systemu chłodzeniakontrola regulacji ciśnieniakalibracja objętości płynu
Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.