Wysokoprzepustowa analiza danych mapowania optycznego za pomocą ElectroMap

Summary

Ten protokół opisuje konfigurację i korzystanie z ElectroMap, opartej na MATLAB platformy oprogramowania open source do analizy danych mapowania optycznego serca. ElectroMap zapewnia wszechstronne, wysokowydajne narzędzie do analizy zestawów danych dotyczących napięcia i wapnia w mapowaniu optycznym w szerokim zakresie eksperymentalnych modeli serca.

Abstract

Mapowanie optyczne jest uznaną techniką do badania elektrofizjologii serca w preparatach wielokomórkowych w wysokiej rozdzielczości czasowej. W tym miejscu przedstawiamy, w przewodniku krok po kroku, wykorzystanie ElectroMap do analizy, kwantyfikacji i mapowania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości napięcia i wapnia uzyskanych za pomocą mapowania optycznego. Opcje analizy ElectroMap obejmują szeroki zakres kluczowych parametrów elektrofizjologicznych, a graficzny interfejs użytkownika umożliwia prostą modyfikację przetwarzania wstępnego i definicji parametrów, dzięki czemu ElectroMap można zastosować w szerokim zakresie modeli eksperymentalnych. Pokazujemy, w jaki sposób wbudowana detekcja częstotliwości stymulacji i segmentacja sygnału umożliwia analizę o wysokiej przepustowości całych nagrań eksperymentalnych, ostrych odpowiedzi i zmienności między uderzeniami. Ponadto ElectroMap zawiera automatyczne uśrednianie wielu uderzeń w celu poprawy jakości sygnału w hałaśliwych zestawach danych, a tutaj pokazujemy, w jaki sposób ta funkcja może pomóc w wyjaśnieniu zmian elektrofizjologicznych, które w przeciwnym razie mogłyby pozostać niewykryte podczas korzystania z analizy pojedynczego uderzenia. W oprogramowaniu znajdują się niestandardowe moduły do szczegółowego badania przewodzenia, analizy pojedynczego pliku i alternanów, jak pokazano tutaj. Ta platforma oprogramowania może być wykorzystana do umożliwienia i przyspieszenia przetwarzania, analizy i mapowania złożonej elektrofizjologii serca.

Introduction

Mapowanie optyczne wykorzystuje fluorescencyjne reportery napięcia i/lub stężenia wapnia do badania elektrofizjologii serca (EP) i obchodzenia się z wapniem w preparatach wielokomórkowych, z większą rozdzielczością przestrzenną niż możliwe do osiągnięcia przy użyciu tradycyjnych technik^1,2,3. W związku z tym mapowanie optyczne stało się ważną i coraz częściej wykorzystywaną techniką, dostarczającą kluczowych informacji na temat fizjologicznych i patofizjologicznych zachowań elektrycznych w sercu^3,4,5,6,7,8. Efektywne przetwarzanie i analiza danych uzyskanych z eksperymentów mapowania optycznego jest skomplikowana przez kilka czynników. Wysoka rozdzielczość czasowo-przestrzenna zestawów danych mapowania optycznego powoduje, że surowe pliki wideo składają się z tysięcy klatek obrazu, z których każda składa się z kilku pojedynczych pikseli, co powoduje powstawanie dużych plików danych, które wymagają wysokiej przepustowości i automatycznego przetwarzania⁹. Małe rozmiary pikseli, słabe i nierównomierne ładowanie barwnika oraz małe ułamkowe zmiany fluorescencji powodują, że sygnały optyczne mają niski stosunek sygnału do szumu (SNR), wymagające wstępnego przetwarzania, zanim możliwa będzie skuteczna analiza¹⁰. Przetwarzanie i analiza mogą być dodatkowo skomplikowane przez zastosowanie optogenetycznych protokołów stymulacji, które wykorzystują światło do zainicjowania aktywacji, potencjalnie zniekształcając zarejestrowany sygnał z czujników fluorescencyjnych^11,12. Ponadto, po przetworzeniu danych, kilka niespójnych technik i definicji może zostać zastosowanych do pomiaru parametrów będących przedmiotem zainteresowania, przy czym najbardziej odpowiednie techniki różnią się w zależności od konfiguracji eksperymentalnej, modelu i pytania^2,10,13. Ograniczenia te uniemożliwiają dalsze wdrażanie technologii i utrudniają naprawdę obiektywną analizę.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, kilka grup badawczych zaprojektowało niestandardowe potoki przetwarzania dostosowane do ich eksperymentalnego modelu, pytania i sprzętu^7,14,15,16. Inne wykorzystują komercyjne oprogramowanie własnościowe, w którym dostęp do podstawowych algorytmów może być utrudniony^4,17. W związku z tym istnieje wyraźne zapotrzebowanie na ogólnodostępną platformę oprogramowania typu open source do przetwarzania i analizy danych mapowania optycznego. Ważne jest, aby oprogramowanie to było open-source, łatwe w użyciu, elastyczne w dostosowywaniu parametrów, miało zastosowanie do szeregu modeli eksperymentalnych o różnych właściwościach EP i co najważniejsze, umożliwiało prostą i dostrajalną kwantyfikację zakresu parametrów serca, które można badać za pomocą mapowania optycznego.

Niedawno opublikowaliśmy i wydaliśmy kompleksową platformę oprogramowania, ElectroMap, do zaawansowanego, półautomatycznego przetwarzania, analizy i mapowania zestawów danych do optycznego mapowania serca¹³. W tym miejscu przedstawiamy instrukcję wideo dotyczącą wykorzystania oprogramowania ElectroMap i pokazujemy, w jaki sposób można go wykorzystać do przetwarzania, analizowania i mapowania kilku zestawów danych mapowania optycznego. Koncentrujemy się na wykorzystaniu ElectroMap do ilościowego określania standardowych zmiennych EP i wapnia oraz demonstrujemy zastosowanie autonomicznych modułów prędkości przewodzenia, analizy pojedynczego pliku i alternanów.

Protocol

1. Zbieranie danych mapowania optycznego

1. Wykonaj optyczne mapowanie serca przy użyciu jednego z wielu modeli eksperymentalnych, w tym nienaruszonych i izolowanych całych serc^6,18, izolowane przedsionki^14,19, kliny komorowe²⁰, plastry serca^21,22 i monowarstwy komórkowe²³. Zapoznaj się z powiązanymi odniesieniami dla projektów eksperymentalnych, aby zebrać nieprzetworzone dane mapowania optycznego z tych przygotowań. Pod warunkiem, że uzyskane dane można przekonwertować na stos TIFF lub zapisać w pliku . MAT, powinien być możliwy do przeanalizowania za pomocą ElectroMap. Obejmuje to dane o różnych wymiarach (kwadrat/prostokąt) i rozdzielczościach (maksymalna testowana obecnie 2048 x 2048 pikseli).

2. Instalacja i uruchomienie oprogramowania

UWAGA: Poniżej znajdują się szczegółowe informacje na temat dwóch metod instalacji i uruchamiania ElectroMap - zarówno w MATLAB, uruchamianym z kodu źródłowego (.m), jak i jako samodzielny plik wykonywalny (.exe dla systemu Windows). Ostateczne oprogramowanie i jego funkcjonalność są niezmienne między tymi dwiema opcjami konfiguracji (poza kilkoma różnicami w nawigacji po katalogach). W związku z tym głównymi kwestiami branymi pod uwagę przy wyborze wersji do zainstalowania są dostęp do MATLAB i wymaganych zestawów narzędzi oraz to, czy pożądany jest dostęp do kodu źródłowego. Tam, gdzie to możliwe, zaleca się korzystanie z wersji MATLAB w celu skrócenia czasu uruchamiania, krótszego czasu przetwarzania i łatwiejszego raportowania błędów.

1. Konfiguracja 1: Uruchamianie electromap w MATLAB
   1. Zainstaluj program MATLAB. ElectroMap został zaprojektowany w MATLAB 2017a, jednak oprogramowanie zostało przetestowane pod kątem użycia we wszystkich kolejnych wersjach MATLAB (do 2018b w momencie pisania tego tekstu). Wymagane są następujące zestawy narzędzi: Przetwarzanie obrazu, Przetwarzanie sygnału, Statystyka i uczenie maszynowe oraz Dopasowywanie krzywych.
   2. Pobierz/sklonuj wszystkie pliki z najnowszej wersji "kodu źródłowego" ElectroMap z repozytorium GitHub (https://github.com/CXO531/ElectroMap). Rozpakuj pobraną zawartość w żądane miejsce.
   3. Otwórz program MATLAB i przejdź do lokalizacji folderu, w której znajduje się kod źródłowy ElectroMap. Następnie otwórz plik ElectroMap.m i naciśnij uruchom w edytorze lub alternatywnie wpisz ElectroMap w oknie poleceń i naciśnij RETURN. Spowoduje to uruchomienie interfejsu użytkownika ElectroMap, Rysunek 1A.
2. Konfiguracja 2: Samodzielny plik .exe
   1. Pobierz plik instalatora: https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI.
   2. Postępuj zgodnie z instrukcjami w instalatorze, który pobierze wymagane środowisko uruchomieniowe MATLAB z Internetu wraz z oprogramowaniem ElectroMap.
   3. Uruchom polecenie ElectroMap.exe.
      UWAGA: Czas uruchamiania wersji autonomicznej może wynosić kilka minut.

3. Wczytywanie i wstępne przetwarzanie obrazu

1. Naciśnij Wybierz folder i przejdź do lokalizacji plików danych, które mają zostać przeanalizowane. Spowoduje to wypełnienie pola listy po lewej stronie wszystkimi plikami w tym katalogu, które mają prawidłowy typ pliku (.tif lub . MAT). . Pliki MAT mogą zawierać tylko zmienną stosu obrazów.
   UWAGA: Podczas poruszania się po selektorze katalogów pojawią się tylko foldery, a nie pojedyncze pliki.
2. Wybierz plik do załadowania z poziomu interfejsu i naciśnij Załaduj obrazy.
   1. Po załadowaniu pojawi się pierwsza klatka, a czerwony kontur będzie wskazywał automatyczne progowanie obrazu. W razie potrzeby ponownie załaduj poprzednio używane ROI, wybierając opcję Zapisz/Załaduj ROI. W takim przypadku pomiń krok 3.3.
   2. Domyślnie próg jest oparty na intensywności pikseli w pierwszej klatce. W razie potrzeby zmodyfikuj to na próg oparty na amplitudzie przebiegu czasu sygnału, zmieniając opcję w menu rozwijanym Obraz dla progu. Należy pamiętać, że po wybraniu progu jest on stosowany do całego stosu obrazów.
3. W razie potrzeby zmień opcję progu na ręczny, co spowoduje aktywację suwaka w celu ręcznego dostosowania progu obrazu. Dodatkowo przytnij obrazy (Przytnij obraz) i/lub narysuj niestandardowy obszar zainteresowania (Niestandardowy ROI) do analizy, zaznaczając odpowiednie pola wyboru poniżej opcji progowych. Należy pamiętać, że zaawansowane opcje wyboru obszaru zainteresowania, takie jak liczba obszarów, są dostępne w Wyborze ROI z górnego menu.
4. Po zastosowaniu odpowiedniego progu naciśnij przycisk Przetwarzaj obrazy, aby zastosować przetwarzanie. Ustawienia przetwarzania są szczegółowo opisane poniżej (kroki 3.4.1-3.4.5). W tym momencie upewnij się, że zostały wprowadzone prawidłowe ustawienia aparatu. Są to rozmiar piksela w μm (WAŻNE: jest to rozmiar piksela obrazu, a nie rozmiar pikseli składających się na chip lub równoważny sprzęt w urządzeniu do przetwarzania obrazu) i liczba klatek na sekundę w kHz.
   1. W przypadku odwrócenia sygnału zaznacz pole wyboru Odwróć dane, aby je włączyć. Jeśli podawany sygnał fluorescencyjny jest odwrotnie proporcjonalny do parametru zainteresowania (jak w przypadku powszechnie stosowanych barwników potencjometrycznych), sygnał może być odwrócony.
   2. Aby filtrować przestrzennie, wybierz opcję Gaussian lub Average z menu jądra. Rozmiar uśrednionego przestrzennie obszaru jest kontrolowany przez dane wejściowe Rozmiar znajdujące się obok menu rozwijanego Jądro (tj. 3 wyniki w jądrze filtra 3 piksele x 3 piksele). Podczas stosowania filtra Gaussa odchylenie standardowe można również ustawić na podstawie danych wejściowych Sigma.
   3. Aby uzyskać korektę linii bazowej, wybierz Top-hat²⁴ lub wielomian (4^lub 11 stopnia) correction²⁵ z menu Linia bazowa. Korekcja może być stosowana do każdego piksela indywidualnie (długi czas przetwarzania) lub jako średnia z całego obrazu (szybsza, ale zakładająca jednorodne zmiany linii bazowej). Korekcję cylindra można również zmodyfikować, ustawiając długość cylindra w milisekundach, obok menu rozwijanego wyboru linii bazowej. Długość jądra Top-Hat powinna być większa niż skala czasowa poszczególnych potencjałów czynnościowych/stanów przejściowych wapnia.
   4. Aby filtrować czasowo, wybierz filtrowanie Savitzky'ego-Goaly'ego lub filtrowanie impulsów nieskończonych (IIR) z menu Filtrowanie.
      UWAGA: Z wyjątkiem uśrednionego sygnału tkankowego, który pojawia się w lewym dolnym rogu, filtrowanie czasowe jest stosowane do każdego piksela indywidualnie w momencie kwantyfikacji parametrów na podstawie uśrednionych zakresów obrazu. Zostało to zaimplementowane w celu skrócenia czasu przetwarzania poprzez filtrowanie małych sekcji danych, gdy jest to wymagane, a nie całych plików.
   5. W przypadku usuwania klatek należy pamiętać, że jeśli wybrana jest opcja Usuń klatki, duże piki o amplitudzie większej niż sygnał zainteresowania mogą zostać usunięte z zestawu obrazów. Może to być przydatne w zestawach danych z stymulacją optyczną, takich jak stymulacja optogenetyczna, w których depolaryzacja jest inicjowana przez optyczną aktywację opsyn, takich jak rodopsyna kanałowa 2^11,12.
      UWAGA: Ponieważ usunięcie klatek może potencjalnie wprowadzić niefizjologiczne zmiany krokowe w sygnałach obrazu, filtrowanie czasowe może wprowadzić artefakty do danych i dlatego nie jest zalecane w tym miejscu.
5. Należy pamiętać, że sygnał zostanie podzielony na segmenty po wybraniu opcji Przetwarzaj obrazy zgodnie z opcjami w sekcji Opcje segmentacji, jednak można to szybko zmienić bez ponownego przetwarzania całego zestawu danych (patrz sekcja 4).

4. Segmentacja danych i uśrednianie zespołów

UWAGA: Gdy plik zostanie przetworzony, piki w sygnale uśrednionej tkanki (ślad na dole po prawej, Rysunek 1A) zostaną wykryte i oznaczone czerwonymi kółkami. Zliczane są tylko szczyty powyżej ustawionego progu (niebieska linia na śladzie ustawionym przez próg szczytu). Ponadto szczyty są liczone tylko wtedy, gdy są wystarczająco opóźnione w porównaniu z poprzednimi szczytami, ustawionymi przez wejście Min Peak Distance. Sygnał jest następnie segmentowany na podstawie wykrytych pików. Po pierwsze, efektywna długość cyklu (CL) każdego piku jest obliczana poprzez pomiar czasu między nim a następnym pikiem. Jeśli liczba pików (ustawiona przez Min. liczbę pików wejściowych) ma podobne CL (dla których próg jest ustawiany przez wejście Minimalnej granicy), są one grupowane i obliczana jest średnia CL dla tych pików.

1. Aby uzyskać dalszą segmentację danych, naciśnij Sygnał segmentu. Opcje podsegmentacji to: Brak – wszystkie piki z tym samym CL zgrupowane razem; Wszystkie – identyfikowane są segmenty n_pików w stałych czasach CL (n_pików jest ustawiane przez wejście Rozmiar segmentu); Ostatni — ostatnie n_pików przed zmianą CL jest identyfikowane i grupowane, a wszystkie inne nie są analizowane; i Single Beat – Jest to równoznaczne z zastosowaniem segmentacji All z n_szczytami = 1, a więc nie stosuje się grupowania ani uśredniania zespołowego (patrz 4.5). Można to zastosować, wybierając przycisk Single Beat.
   1. Zastosuj niestandardową segmentację sygnału, powiększając interesujący Cię czas i wybierając opcję Sygnał segmentu. Spowoduje to dodanie dodatkowej opcji zatytułowanej Powiększony przekrój do pola listy sekcji, odpowiadającej wybranym punktom czasu.
2. Wyniki segmentacji pojawią się w polu listy obok sygnału uśrednionego tkankowo i pokażą numer sekcji oraz szacowaną CL. Wszystkie segmentowane sekcje czasu są oznaczone różnymi kolorami. Wybierz segment z listy, aby podświetlić go na czerwono. Spowoduje to również automatyczne uruchomienie analiz tej sekcji, tak jakby wybrano przycisk Twórz mapy (patrz sekcja 5).
3. Analizy zgrupowanych pików zostaną przeprowadzone na danych "uśrednionych zespołowo". Polega to na uśrednieniu pików w segmencie, przy czym czasy odniesienia to piki określone w kroku 4.2. Zaktualizuj okno czasu do średniej, modyfikując wejścia przed i po oraz naciskając Sygnał segmentu.

5. Analiza potencjału czynnościowego/czasu trwania stanu nieustalonego wapnia i prędkości przewodzenia

1. Po przetworzeniu obrazów przycisk Utwórz mapy stanie się aktywny. Naciśnij przycisk Utwórz mapy, aby zastosować czas trwania potencjału czynnościowego (APD), czas aktywacji, prędkość przewodzenia i analizę SNR. Domyślnie analiza zostanie zastosowana do pierwszego segmentu sygnału. Wybierz inne segmenty z listy, aby zastosować analizę do wybranego segmentu.
   UWAGA: Wyniki analizy są wyświetlane w tabeli wyników, w tym średnia, odchylenie standardowe, błąd standardowy, wariancja i analiza od 5 do 95 percentyla. Mapy czasu trwania są nazywane mapami "APD", jednak sygnały wapnia przetworzone przy użyciu tych samych ustawień będą mierzyć czas trwania przejściowego wapnia.
2. Wybierz opcję Pobierz informacje o pikselach, aby wyświetlić szczegółowe informacje o sygnale z dowolnego piksela obrazu, oraz opcję Porównaj piksele, aby jednocześnie wykreślić sygnały z maksymalnie 6 lokalizacji.
   1. Użyj panelu Przetwarzanie sygnału, aby dostosować ustawienia analizy czasu trwania. Są to: Czas trwania – czas procentowej repolaryzacji/zaniku mierzony od szczytu; "APD" – linia podstawowa – okres sygnału określony jako punkt odniesienia dla pomiarów amplitudy; i "APD" Czas rozpoczęcia – Czas rozpoczęcia pomiarów czasu trwania. Są to te same opcje określania czasu aktywacji dla map izochronalnych (omówione poniżej) i są określane: Start ( d²F/dt²_max), Upstroke (dF/dt_max), Punkt środkowy depolaryzacji (czas 50% amplitudy), Peak (czas maksymalnej amplitudy). Te definicje stosowane do potencjałów czynnościowych myszy i świnki morskiej są pokazane w Rysunek 2A.
      UWAGA: Zmiana którejkolwiek z tych opcji spowoduje automatyczną aktualizację mapy czasu trwania i tabeli wyników. Dostępne są również opcje skalowania mapy i usuwania wartości odstających.
3. Prędkość przewodzenia jest również mierzona automatycznie w głównym interfejsie oprogramowania. Osiąga się to za pomocą metody wielowektorowej Bayly et al²⁶ z mapy izochronalnej zdefiniowanej przez wybraną miarę aktywacji (omówioną w kroku 5.4). Naciśnij przycisk Punkty aktywacji, aby wyrenderować reprezentację 3D mapy aktywacji.
4. Wielowektorowa metoda pomiaru prędkości przewodzenia przestrzennie dzieli mapę izochronalną na obszary n x n pikseli. Ustaw wartość n przy użyciu danych wejściowych Local Window Size (Rozmiar okna lokalnego) i ustaw zakres czasów aktywacji, do których ma zostać zastosowana analiza przy użyciu danych wejściowych Dopasowanie czasów aktywacji.
   UWAGA: Dla każdego regionu lokalnego dopasowana jest powierzchnia wielomianowa f, która najlepiej opisuje zależność między czasem aktywacji a położeniem przestrzennym (x,y). Wektor gradientu, _{CV local}, tej powierzchni jest następnie obliczany jako:
   (1)
   gdzie oznacza dwuwymiarowy kartezjański przestrzenny operator różniczkowy²⁶.
5. Dla każdego piksela na mapie izochronalnej obliczany jest lokalny wektor reprezentujący prędkość i kierunek przewodzenia. Wybierz opcję Mapa izochroniczna z wektorami z menu rozwijanego wyświetlania, aby wyświetlić tę analizę.
6. Stosunek sygnału do szumu (SNR) oblicza się jako stosunek maksymalnej amplitudy do odchylenia standardowego sygnału na linii podstawowej. Analiza ta jest przeprowadzana po wszystkich etapach przetwarzania. Naciśnij Obliczanie SNR w górnym menu, aby edytować ustawienia dla okresu sygnału zdefiniowanego jako linia bazowa.

6. Moduł analizy kondukcyjnej

1. Naciśnij Przewodzenie, aby uzyskać dostęp do bardziej szczegółowej analizy prędkości przewodzenia. Otwiera to oddzielny moduł, w którym przewodzenie można określić ilościowo za pomocą metody wielowektorowej Bayly'ego, jak w głównym interfejsie, metodach pojedynczych wektorów oraz jako krzywej aktywacji.
2. Naciśnij przycisk Pojedynczy wektor, aby przeanalizować przewodzenie przy użyciu metody pojedynczego wektora, gdzie CV jest obliczane na podstawie opóźnienia w czasie aktywacji między dwoma punktami. Można to zrobić za pomocą metod automatycznych lub ręcznych, które można wybrać poniżej przycisku Pojedynczy wektor.
   1. W przypadku automatycznej metody pojedynczego wektora wybierz odległość i punkt początkowy, od którego chcesz mierzyć przewodzenie. Następnie oprogramowanie wykona przemiatanie o 360 stopni od wybranego punktu, mierząc opóźnienie czasowe i obliczając powiązaną prędkość przewodzenia we wszystkich kierunkach w krokach co 1 stopień. Wyniki tej analizy są wyświetlane na wykresie obok mapy, a kierunek najwolniejszego przewodzenia jest pokazany na czerwono.
   2. W przypadku ręcznej metody pojedynczego wektora należy wybrać zarówno punkt początkowy, jak i końcowy z mapy izochronicznej, aby obliczyć prędkość przewodzenia. Aby wybrać nowy punkt początkowy, naciśnij przycisk Wyczyść punkt początkowy.
3. Naciśnij Wektor lokalny, aby zastosować metodę wielowektorową, z ustawieniami odpowiadającymi tym z głównego interfejsu. W module przewodzenia można wyświetlić rozkład prędkości przewodzenia, a także rozkład kątowy obliczonych wektorów i zależność kątową prędkości przewodzenia.
4. Naciśnij krzywą aktywacji, aby wykreślić procent tkanki aktywowanej w funkcji czasu. Czas do 100% aktywacji jest wyświetlany automatycznie, a także można wybrać niestandardowe wartości minimalnego (niebieskiego) i maksymalnego (czerwonego) procentu aktywacji, między którymi można mierzyć.

7. Dodatkowe analizy i moduły

1. Oprócz automatycznie przeprowadzanych analiz czasu trwania i prędkości przewodzenia, za pomocą ElectroMap można określić ilościowo kilka innych parametrów. Analizy te można wybrać z menu rozwijanego nad wyświetlaną mapą. Wybierz jedną z tych opcji, aby przeprowadzić analizę, a wyniki pojawią się w^{4 wierszu} tabeli wyników: 1) Interwał rozkurczowy – czas od 90% repolaryzacji do czasu aktywacji następnego potencjału czynnościowego; 2) Częstotliwość dominująca – Widmo częstotliwości każdego piksela jest obliczane za pomocą szybkiej transformaty Fouriera, a częstotliwość o największej mocy jest definiowana jako częstotliwość dominująca. Zaawansowane ustawienia zakresu i okna dla analizy częstotliwości dominującej są dostępne po wybraniu opcji Mapowanie częstotliwości; 3) Czas do osiągnięcia szczytu – czas narastania między dwoma wybranymi przez użytkownika wartościami procentowymi (domyślnie od 10 do 90%) fazy depolaryzacji potencjału czynnościowego lub uwalniania wapnia. Wartości procentowe można zmienić, wybierając Ustawienia TTP; oraz 4) Stała relaksacji (τ) – Stała relaksacji jest obliczana poprzez dopasowanie monowykładniczego zaniku postaci postaci:
   (2)
   gdzie poziom fluorescencji w czasie t zależy od piku fluorescencji, F₀, i następującego po nim zaniku (C jest stałą)²⁷. Wartość, między którą należy dopasować równanie 2, można wybrać w głównych interfejsach użytkownika ElectroMap, a także kryteria wykluczenia dopasowania oparte na wartości r².
2. Naciśnij przycisk Analiza pojedynczego pliku, aby otworzyć dedykowany moduł do analizy czasu trwania i przewodzenia każdego zidentyfikowanego segmentu w pliku. Analiza może być wykonywana zarówno na całym obrazie (czas trwania, czas przewodzenia i aktywacji), jak i na wybranych obszarach lub punktach zainteresowania (obecnie tylko czas trwania). Wyniki są wyprowadzane do pliku .csv.
   UWAGA: W przypadku wartości APD z całego obrazu pierwsza kolumna w pliku .csv jest średnią, a druga kolumna jest odchyleniem standardowym.
3. Naciśnij Alternans, aby zainicjować samodzielny moduł do dedykowanej analizy i mapowania zmienności między uderzeniami. Zobacz O'Shea et al. 2019¹³, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat opcji przetwarzania i analizy alternanów. W szczególności moduł ten jest przeznaczony do identyfikacji dwóch oscylacji okresowych, znanych jako alternany. Obliczane i wyprowadzane są zarówno alternany czasu trwania, jak i amplitudy.
   UWAGA: Przemienne wartości czasu trwania są mierzone poprzez porównanie pomiaru czasu trwania od jednego szczytu do drugiego; tj. jeżeli pik pierwszy i drugi oraz APD₁ i APD₂ odpowiednio, wówczas czas trwania alternan (ΔAPD) oblicza się jako
   (3)
   Pomiar czasu trwania odbywa się za pomocą ustawień w głównym interfejsie. Tymczasem alternany amplitudy można określić ilościowo i zmapować w preparatach wielokomórkowych jako zmianę bezwzględną (zdefiniowaną jako procent, gdzie 0% = ta sama amplituda między jednym uderzeniem a drugim). Co więcej, wpływ zjawisk takich jak obciążenie wapniem może być dalej badany poprzez pomiar i porównywanie alternanów obciążenia i zwolnienia, jak to zostało wcześniej zgłoszone²⁸. Jeśli L jest zdefiniowane jako szczytowa amplituda dużych dudnień (tj. tam, gdzie amplituda jest większa niż poprzednia amplituda), S amplituda małych uderzeń, iD obciążenie rozkurczowe małych uderzeń, alternany uwalniania () są zdefiniowane jako:
   (4)
   I odwrotnie, alternany obciążenia () są zdefiniowane jako:
   (5)
   Pomiary alternans mogą być wykonywane na całej tkance, a wyniki analizy są wyświetlane w prawym dolnym rogu modułu. Przy pierwszym użyciu modułu analiza jest wykonywana w całym pliku eksperymentalnym, a wyświetlane wyniki są średnią różnicą uderzeń w całym pliku. Analizę można jednak ograniczyć do określonych momentów w pliku, usuwając zaznaczenie opcji Przytrzymaj powiększenie, powiększając określony przedział czasu i wybierając opcję Analizuj powiększoną sekcję. Spowoduje to zaktualizowanie panelu wyników, aby wyświetlić analizę z wybranego okresu.
   1. Wybierz opcję odtwarzania, aby wyświetlić wideo z analizą alternanów w każdym uderzeniu. Dodatkowo wybierz opcję Utwórz mapę średnich, aby wyeksportować mapę zachowania alternanów uśrednioną z wybranych punktów czasowych, które są ustawiane w menu podręcznym podczas korzystania z tej funkcji.
4. Naciśnij przycisk Mapa faz, aby zainicjować moduł mapowania faz. Transformata Hilberta jest wykonywana w celu obliczenia chwilowej fazy (od -π do +π) sygnałów w każdym punkcie czasowym. Naciśnij suwak odtwarzania lub przeciągnij, aby wyświetlić zachowanie fazy w czasie, a następnie kliknij piksel, aby wyrenderować diagram faz.

8. Eksport danych

1. Dane są eksportowane z ElectroMap w różnych formach. Naciśnij przycisk Eksportuj wartości, aby zapisać wartości aktualnie wyświetlanej mapy w głównym używanym interfejsie. Zmierzone wartości mogą być zapisywane jako mapa (z zachowaniem lokalizacji pikseli) lub skondensowane w jedną listę, a także mogą być zapisywane jako .csv, .txt lub . Pliki MAT.
2. Naciśnij przycisk Eksportuj mapę, aby wyświetlić wyskakujące okienko zawierające aktualnie wyświetlaną mapę, którą można następnie zapisać w różnych formatach graficznych. Opcje wyświetlania mapy są kontrolowane przez wybranie opcji Ustawienia mapy, ale można je również edytować po wybraniu opcji Eksportuj mapę. Na przykład pasek koloru można dodać, wybierając tę ikonę z górnego menu, a skalę można ustawić, wybierając opcję Edytuj > Mapa kolorów.
3. Naciśnij przycisk Activation Video (Wideo aktywacyjne), aby wyrenderować animację sekwencji aktywacji, którą można zapisać jako animowany plik .gif.
4. Naciśnij przycisk Segmentuj wideo, aby zapisać plik wideo .avi aktualnie wyświetlanym parametrem każdego zidentyfikowanego segmentu.

Results

Wszystkie prace wykonane w ramach tego badania zostały podjęte zgodnie z wytycznymi etycznymi określonymi w brytyjskiej ustawie o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r. i dyrektywie Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Ministerstwo Spraw Wewnętrznych (mysz: PPL 30/2967 i PFDAAF77F, świnka morska: PPL PF75E5F7F) oraz instytucjonalne komisje rewizyjne na Uniwersytecie w Birmingham (mysz) i King's College London (świnka morska). Szczegółowe metody zbierania surowych danych, które zostały tutaj przeanalizowane, można znaleźć w naszych poprzednich publikacjach^5,6,14,19.

Główny interfejs, z którego sterowany jest ElectroMap, jest pokazany w Rysunek 1A. Kroki niezbędne do analizy zestawu danych są kontrolowane głównie przez przyciski Załaduj obrazy, Przetwarzaj obrazy i Utwórz mapy i są wyróżnione odpowiednio na zielono, niebiesko i czerwono w Rysunek 1A. Rysunek 1B-D przedstawia operacje, które są wykonywane po wybraniu każdego z tych przycisków. Polecenie Wczytaj obrazy stosuje opcje progowania obrazów wybrane przez użytkownika (Rysunek 1B), podczas gdy narzędzie Przetwarzaj obrazy (Rysunek 1C) stosuje filtrowanie i korekcję linii bazowej. Na koniec Produce Maps najpierw uśrednia dane zgodnie z oknem czasowym i ustawieniami segmentacji (chyba że wybrana jest segmentacja pojedynczego uderzenia), a następnie przeprowadzi analizy opisane powyżej.

Kluczowym aspektem ElectroMap jest jego elastyczność w odniesieniu do typu kamery i modelu eksperymentalnego. Ma to kluczowe znaczenie dla użyteczności oprogramowania do mapowania optycznego ze względu na odrębne cechy EP serca i anatomiczne, które istnieją między powszechnie stosowanymi modelami. Rysunek 2A na przykład pokazuje morfologię potencjału czynnościowego mysich przedsionków w porównaniu z komorą świnki morskiej, zarejestrowaną przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie, jak wcześniej podano^6,14. Pomimo wyraźnego kształtu potencjału czynnościowego i zastosowania dwóch oddzielnych kamer do mapowania optycznego o różnej liczbie klatek na sekundę i rozmiarach pikseli, ElectroMap może być wykorzystany do skutecznej analizy obu zestawów danych. Wymaga to jednak modyfikacji niektórych parametrów w interfejsie użytkownika (Rysunek 2B). Należy zauważyć, że przedłużony potencjał czynnościowy świnki morskiej wymaga większego okna czasowego. Dodatkowo, aby zapobiec niefizjologicznej modyfikacji optycznie zarejestrowanych sygnałów przez korekcję linii podstawowej cylindra, należy zwiększyć jej długość w czasie, tak aby była większa niż przebieg czasowy potencjału czynnościowego.

ElectroMap oferuje wiele opcji przetwarzania, które pomagają poprawić SNR sygnałów rejestrowanych optycznie, które mogą być wymagane do skutecznego odzyskania parametrów EP. Przykładem jest automatyczne grupowe uśrednianie szczytów po segmentacji danych. Rysunek 3A-C pokazuje, w jaki sposób zastosowanie uśredniania zespołowego, zamiast innych metod, może poprawić SNR z izolowanych mysich lewych przedsionków (n = 13). Zmniejsza to niejednorodność pomiarów i prawdopodobieństwo niepowodzenia analizy (Rysunek 3D). Na przykład zmiana częstotliwości stymulacji z 3 Hz na 10 Hz nie zmieniła APD₅₀, gdy nie przeprowadza się uśredniania zespołu, ale > spadek APD₅₀ przy 10 Hz, gdy mierzono go na podstawie danych uśrednionych dla zespołu (Rysunek 3E).

Rysunek 4 pokazuje skuteczność i użyteczność automatycznego wykrywania częstotliwości stymulacji i segmentacji oferowanego przez ElectroMap. W tym przypadku lewe przedsionki myszy (n = 5) były poruszane w tempie cyklu o długości 120 ms, a długość cyklu była stopniowo skracana o 10 ms, aż osiągnęła 50 ms. ElectroMap automatycznie zidentyfikował długość cyklu stymulacji i odpowiednio pogrupował uśrednione piki tkanek (Rysunek 4A). Udało się to osiągnąć z dużą dokładnością we wszystkich zestawach danych (Rysunek 4B). Zautomatyzowana segmentacja danych pozwoliła na prostą i wysokoprzepustową analizę spowolnienia prędkości przewodzenia wraz ze zwiększoną częstotliwością stymulacji/skróconą długością cyklu (Rysunek 4C,D). Jednocześnie skrócono APD₅₀ (Rysunek 4E) i interwał rozkurczowy (Rysunek 4F). Amplituda optycznie mierzonych pików zmniejszyła się, a czas do osiągnięcia piku wydłużył się (Rysunek 4G,H). Są to ponownie oczekiwane reakcje restytucyjne w tkance serca^29,30, a zastosowanie ElectroMap może zatem pomóc w wyjaśnieniu zmian w odpowiedzi na częstotliwość stymulacji w obecności środków farmakologicznych, modyfikacji genetycznych lub stanów chorobowych.

Ważną kwestią przy korzystaniu z oprogramowania takiego jak ElectroMap jest obecność artefaktów w danych źródłowych. Rysunek 5, na przykład pokazuje, że artefakty ruchu (zniekształcenie optycznie zarejestrowanego sygnału przez ruch tkanki) mogą uniemożliwić dokładne pomiary aktywacji, a zwłaszcza repolaryzacji w ElectroMap. Zobacz Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji.

Rysunek 1: Główne etapy przetwarzania ElectroMap. (A) Graficzny interfejs użytkownika ElectroMap, z podświetlonymi przyciskami Załaduj obrazy (zielony), Przetwarzaj obrazy (niebieski) i Utwórz mapy (czerwony). (B) Opcje progowania obrazu, które można zastosować po wybraniu opcji Wczytaj obrazy. (C) Opcje przetwarzania sygnału dostępne dla użytkownika obejmują filtrowanie przestrzenne i czasowe oraz korekcję linii bazowej i można je zastosować do stosu obrazów, naciskając przycisk Przetwarzaj obrazy. (D) Uśrednianie zespołu i kwantyfikacja parametrów (pokazany pomiar APD), które są aktywowane przez wybranie opcji Twórz mapy. Rysunek zaczerpnięty z O'Shea et al., 2019¹³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza danych dotyczących myszy i świnek morskich za pomocą ElectroMap. (A) Optycznie zarejestrowany potencjał czynnościowy z przedsionków myszy i komór świnki morskiej, wraz z pierwszym (df/dt), jak i drugim (d²f/dt²) pochodnym tych sygnałów. Podkreślono różne definicje czasów aktywacji i repolaryzacji, które można zastosować w ElectroMap. (B) Zrzuty ekranu przedstawiające ustawienia przetwarzania obrazu i sygnału wykorzystywane w interfejsie ElectroMaps. Czerwone pola podświetlają ustawienia, które wymagały modyfikacji między analizami danych myszy i świnki morskiej. Rysunek zaczerpnięty z O'Shea et al., 2019¹³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Uśrednianie zespołów w celu rozwiązania zmian APD. (A) Mapa APD₅₀ i przykładowy sygnał pojedynczego piksela z potencjałów czynnościowych pojedynczych uderzeń. (B) Mapa APD₅₀ i przykładowy sygnał pojedynczego piksela z optycznych potencjałów czynnościowych generowany przez zespołowe uśrednianie 10 kolejnych uderzeń (metoda szczytowa). (C) SNR pojedynczego uderzenia w porównaniu z 10 uśrednionymi sygnałami. (D) Niejednorodność APD₅₀ (i) i liczba niepowodzeń pomiaru (ii) w funkcji SNR dla map APD₅₀ z pojedynczym uderzeniem i 10 uderzeniami uśrednionych. (E) APD₅₀ przy częstotliwości stymulacji 3 i 10 Hz, mierzonej na podstawie map pojedynczych uderzeń i 10 uderzeń. (Dane przedstawione jako średnia ± błędem standardowym, n = 13 lewych przedsionków, ****p < 0,001 za pomocą sparowanego testu t-Studenta). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Wykorzystanie oprogramowania ElectroMap do badania odpowiedzi częstotliwościowych stymulacji w tkance serca. (A) Przykładowy zrzut ekranu ElectroMap przedstawiający stymulację, rozpoznawanie częstotliwości i segmentację. (B) Porównanie znanych i zmierzonych przez ElectroMap długości cykli stymulacji. (C) Mapy aktywacji przy długości cyklu stymulacji 120 ms i 60 ms. (D-H) Zgrupowane dane prędkości przewodzenia (D), APD₅₀ (E), interwału rozkurczowego (F), amplitudy (G) i czasu do szczytu (H) w funkcji długości cyklu stymulacji zmniejszającej się ze 120 ms do 60 ms w krokach co 10 ms. (Dane przedstawione jako średnia ± błąd standardowy, n = 5 lewe przedsionki) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wpływ artefaktów ruchu. (A) Mapa APD₅₀. (B) Mapa aktywacji. (C) Przykładowe sygnały z miejsc oznaczonych (krzyżykami) na mapach APD i aktywacji. W obszarze tkanki oznaczonej czerwonym krzyżykiem skurcz nie został pomyślnie rozprzężony, co zniekształciło mierzony sygnał optyczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tym miejscu przedstawiamy przewodnik krok po kroku dotyczący wykorzystania oprogramowania typu open source ElectroMap do elastycznej i wielowymiarowej analizy zestawów danych mapowania optycznego serca. Aby korzystanie z aplikacji ElectroMap działało prawidłowo, dane obrazowania muszą być w formacie .tif lub . Formaty MAT. ElectroMap zawiera kilka modyfikowalnych ustawień użytkownika. Jak pokazano na rysunku 2A, jest to konieczne ze względu na dużą niejednorodność, jaka istnieje między modelami eksperymentalnymi a sprzętem do obrazowania. Oznacza to jednak, że domyślne ustawienia w oprogramowaniu nie zawsze będą optymalne, więc krytycznym krokiem w korzystaniu z oprogramowania jest dostrojenie ustawień przez użytkownika do konkretnej konfiguracji eksperymentalnej. Należą do nich ustawienia kamery i skale czasowe, jak pokazano na rysunku 2B. Po znalezieniu optymalnych ustawień można je zapisać i ponownie załadować w późniejszym czasie, wybierając opcję Plik konfiguracyjny.

Włączenie automatycznego pomiaru CL i segmentacji sygnału to kluczowe zalety oprogramowania. Cechy te pozwalają na analizę ostrych reakcji w nagraniach eksperymentalnych i poszerzają analizę z skupiania się na izolowanych pojedynczych uderzeniach. Po osiągnięciu pożądanej segmentacji, moduł Single File Analysis umożliwia automatyczną analizę każdego pojedynczego segmentu (w tym pojedynczych uderzeń), realizując wysokoprzepustową analizę wielu zmiennych w całym nagraniu wyprowadzonym w jednym pliku .csv. W związku z tym, grupowe uśrednianie zgrupowanych pików jest skuteczną metodą poprawy jakości sygnałów szumowych, która jest automatycznie wykonywana w ElectroMap. Jednak uśrednianie zespołów nie jest wszechobecne korzystne, na przykład w badaniach nad zmiennością między uderzeniami. W związku z tym ElectroMap integruje segmentację pojedynczych miar, aby uniknąć uśredniania zespołów, alternatywne opcje przetwarzania w celu poprawy SNR (filtrowanie przestrzenne i czasowe) oraz zawiera moduł analizy Alternans w celu dalszego badania i mapowania zmienności między uderzeniami.

Zestawy danych mapowania optycznego często zawierają artefakty, takie jak dryf linii bazowej i artefakty ruchu. Podobnie, generowane sygnały mogą być niskiej jakości ze względu na małe rozmiary pikseli, krótkie czasy naświetlania i niskie frakcyjne zmiany fluorescencji². Czynniki te uniemożliwiają skuteczną i dokładną analizę leżącego u podstaw zachowania EP. Jak wspomniano, ElectroMap ma kilka strategii przetwarzania, aby przezwyciężyć te problemy. Jednak zastosowanie tych algorytmów do danych o zasadniczo niskiej jakości/zniekształconych danych nadal uniemożliwi skuteczną analizę. Stosunek sygnału do szumu (SNR) jest zatem jednym z parametrów, które są mierzone i wyświetlane w ElectroMap. Równocześnie, użytkownik może wybierać i porównywać sygnały z określonych regionów z próbki za pomocą modułów Pixel Info i Compare , co pozwala na identyfikację zjawisk takich jak artefakty ruchu pokazane na rysunku 5 i odpowiednie wykluczenie danych.

Obecnie ElectroMap nie obsługuje usuwania artefaktów ruchu z surowych danych w taki sam sposób, jak korekcja linii bazowej. W związku z tym, możliwym przyszłym rozwojem oprogramowania jest włączenie usuwania artefaktów ruchomych za pomocą metod obliczeniowych, jak donoszono^31,32. Co więcej, ElectroMap jest obecnie ograniczony do badania jednego sygnału optycznego. Jednak w przypadku barwników ratiometrycznych i jednoczesnego stosowania barwników napięciowych i wapniowych²⁷ wymagane jest jednoczesne przetwarzanie dwóch kanałów długości fali. Integracja podwójnej analizy sygnału jest zatem ważnym przyszłym dodatkiem do oprogramowania. Rozszerzenie możliwości analizy mających zastosowanie do zestawów danych arytmicznych, takich jak śledzenie osobliwości fazowej, w równym stopniu poszerzyłoby zakres oprogramowania^33,34. Wreszcie, kilka z opisanych opcji analizy może być również przydatnych w analizie danych mapowania elektrod. Rzeczywiście, ElectroMap został wykorzystany do analizy danych mapowania elektrod pomimo kontrastującego przebiegu elektrogramu^20,35, a dalsza optymalizacja rozszerzy jego zastosowanie dla tej modalności.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oprogramowanie MATLAB i Simulink R2018a	Mathworks, Inc, Natick, MA		MATLAB