Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59720

⸱

11 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alabama, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Streszczenie

Jest wiele do zrozumienia na temat powstawania i postępu chorób neurodegeneracyjnych, w tym genów odpowiedzialnych za ich powstanie. Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem mutagenów chemicznych są użyteczną strategią mapowania zmutowanych fenotypów do genów wśród Drosophila i innych organizmów modelowych, które dzielą konserwatywne szlaki komórkowe z ludźmi. Jeśli zmutowany gen będący przedmiotem zainteresowania nie jest śmiertelny we wczesnych stadiach rozwojowych much, można przeprowadzić test wspinaczkowy w celu wykrycia fenotypowych wskaźników zmniejszonego funkcjonowania mózgu, takich jak niskie tempo wspinania się. Następnie można przeprowadzić wtórną analizę histologiczną tkanki mózgowej w celu zweryfikowania neuroprotekcyjnej funkcji genu poprzez ocenę fenotypów neurodegeneracji. Strategie mapowania genów obejmują mapowanie mejotyczne i niedoborów, które opierają się na tych samych testach, a następnie sekwencjonowanie DNA w celu zidentyfikowania możliwych zmian nukleotydowych w genie będącym przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Neurony są w większości postmitotyczne i niezdolne do podziału1,2. U większości zwierząt istnieją mechanizmy neuroprotekcyjne, które utrzymują te komórki przez całe życie organizmu, zwłaszcza w starszym wieku, kiedy neurony są najbardziej podatne na uszkodzenia. Geny leżące u podstaw tych mechanizmów można zidentyfikować u mutantów wykazujących neurodegenerację, fenotypowy wskaźnik utraty neuroprotekcji, przy użyciu protokołu genetycznego do przodu. Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem mutagenów chemicznych, takich jak metanosulfonian etylu (EMS) lub N-etylo-N-nitrozomocznik (ENU), są szczególnie przydatne ze względu na losowe mutacje punktowe, które wywołują, co skutkuje z natury bezstronnym podejściem, które rzuciło światło na liczne funkcje genów w eukariotycznych organizmach modelowych3,4,5 (w przeciwieństwie do tego, mutageneza rentgenowska powoduje pęknięcia DNA i może powodować rearanżację, a nie mutacje punktowe6).

Pospolita muszka owocowa Drosophila melanogaster jest idealnym obiektem do tych badań ze względu na jej wysokiej jakości, dobrze opisaną sekwencję genomu, długą historię jako organizmu modelowego z wysoko rozwiniętymi narzędziami genetycznymi, a co najważniejsze, jej wspólną historię ewolucyjną z ludźmi7,8. Czynnikiem ograniczającym możliwość zastosowania tego protokołu jest wczesna śmiertelność spowodowana przez zmutowane geny, co uniemożliwiłoby testowanie w starszym wieku9. Jednak w przypadku mutacji nieletalnych, test wspinaczkowy, który wykorzystuje ujemną geotaksję, jest prostą, choć obszerną metodą ilościowego określania upośledzonych funkcji motorycznych10. Aby wykazywać wystarczającą reaktywność lokomotoryczną, muchy polegają na funkcjach neuronalnych, które określają kierunek, wyczuwają jego położenie i koordynują ruch. Niezdolność much do wystarczającego wspinania się w odpowiedzi na bodźce może zatem wskazywać na defekty neurologiczne11. Po zidentyfikowaniu konkretnego wadliwego fenotypu wspinaczkowego, dalsze badania z wykorzystaniem wtórnego badania przesiewowego, takie jak analiza histologiczna tkanki mózgowej, mogą być wykorzystane do identyfikacji neurodegeneracji u much z wadami wspinaczki. Późniejsze mapowanie genów może być następnie wykorzystane do ujawnienia regionu genomu na chromosomie przenoszącym wadliwy gen neuroprotekcyjny, który jest przedmiotem zainteresowania. Aby zawęzić obszar chromosomowy będący przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić mapowanie mejotyczne przy użyciu zmutowanych linii muchówek przenoszących dominujące geny markerowe o znanych lokalizacjach na chromosomie. Geny markerowe służą jako punkt odniesienia dla mutacji, ponieważ częstotliwość rekombinacji między dwoma loci zapewnia mierzalną odległość, którą można wykorzystać do mapowania przybliżonej lokalizacji genu. Wreszcie, skrzyżowanie zmutowanych linii z liniami niosącymi zrównoważone niedobory w mejotycznym zmapowanym regionie chromosomalnym będącym przedmiotem zainteresowania tworzy test komplementacji, w którym gen będący przedmiotem zainteresowania może zostać zweryfikowany, czy jego znany fenotyp ulega ekspresji5. Polimorficzne sekwencje nukleotydowe w zidentyfikowanym genie, które mogą prowadzić do zmiany sekwencji aminokwasów, można ocenić poprzez sekwencjonowanie genu i porównanie go z sekwencją genomu Drosophila. Późniejsza charakterystyka genu będącego przedmiotem zainteresowania może obejmować testowanie dodatkowych zmutowanych alleli, eksperymenty ratowania mutacji i badanie dodatkowych fenotypów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie i starzenie się much

  1. Uzyskaj lub wygeneruj6 zbiór mutantów Drosophila, który zostanie wykorzystany do genetycznego badania przesiewowego. W tym przypadku stosuje się linie zmutagizowane ENU zmapowane do drugiego chromosomu i zrównoważone przez CyO.
  2. Amplifikować eksperymentalne linie genotypu w inkubatorze ustawionym w temperaturze 25 °C, 12 godzin cykl światło/ciemność na pożywce z mąki kukurydzianej i melasy.
  3. Zbierz około 20 homozygotycznych potomków w okresie 0-2 dni od wylęgu dorosłego osobnika z każdego eksperymentalnego genotypu. Wyeliminuj uprzedzenia związane z płcią, konsekwentnie zbierając muchy męskie lub żeńskie.
  4. Starzeć muchy na podłożu z mąki kukurydzianej i melasy według uznania w temperaturze 29 °C, przewracając fiolki co 2-3 dni, aby utrzymać muchy na świeżym pokarmie w miarę starzenia się. Na prezentowanym tutaj ekranie muchy leżakowały przez 10-12 dni.
  5. Zmontuj komorę do testowania wspinaczkowego, używając dwóch fiolek i taśmy, jak opisano wcześniej10. Fiolki powinny być połączone na obu otwartych końcach. Za pomocą linijki zaznacz 5-centymetrową linię na jednym końcu komory.

2. Protokół 1: Test wspinaczkowy (Na podstawie Ali et al.10)

  1. Zatwierdzić test wspinaczkowy. W tym badaniu przetestuj test wspinaczkowy w oparciu o wcześniej opisaną metodologię przez Ali et al.10, używając much ElavC155>UAS-TauR406W (wykazujących niższe wskaźniki zdawalności wspinaczki) oraz ElavC155>UAS-GFP (kontrola) i ElavC155>UAS-mCherry (kontrola).
  2. Wrzuć muchy do komory testowej, po jednej linii na raz (nie używaj znieczulenia CO2) i pozwól im dojść do siebie przez 5 minut. Jeśli badanie jest wykonywane w różnych dniach, należy je wykonać o tej samej porze dnia. W tym badaniu wszystkie testy wspinaczkowe przeprowadzono po południu, aby kontrolować wpływ okołodobowy na lokomocję12.
    nuta: Unikaj wystawiania much na bezpośrednie działanie promieni słonecznych podczas testowania; Będzie to kolidować z ich zdolnością do wspinania się.
  3. Na siłę postukaj komorą (oznaczoną stroną do dołu) o podkładkę pod mysz umieszczoną na twardej powierzchni 3 razy, aby wszystkie muchy rozpoczęły test od dołu. Obserwuj lokomocję much przez okres 10 sekund.
  4. Należy odnotować liczbę much, które w tym czasie osiągną lub przekroczą linię 5 cm, a także całkowitą liczbę przebadanych much. Powtórz protokół, odczekując 1 minutę między każdą próbą, dla co najmniej 3 powtórzeń próby na linię.
    nuta: W niniejszym badaniu każda fiolka zawierała od 2 do 19 much do wstępnego badania przesiewowego (samce) i od 6 do 21 much do analizy niedoboru mutantów w skrzyżowanych liniach żeńskich (sekcja 5.3.).

3. Protokół 2: Wybór szczepów Drosophila do dalszej analizy

  1. Wprowadź dane z testu wspinaczkowego do programu Microsoft Excel lub podobnego oprogramowania i oblicz współczynnik przejścia wspinaczki dla każdej linii we wszystkich powtórzeniach jako wartość procentową.
  2. Wykonaj analizę statystyczną w celu wykrycia zmutowanych linii, które znacznie odbiegają od średniej wartości procentowej wznoszenia wszystkich linii, korzystając z pakietu oprogramowania R13.
    1. Wczytywanie plików danych wyselekcjonowanych dla języka R (pliki .csv lub .txt z kolumną dla każdej zmiennej lub współczynnika oraz wierszami reprezentującymi określone wartości).
      nuta: W tym przypadku dane dotyczące samców (test wstępny) i samic (linia 867 przecięta z liniami niedoboru) zostały wprowadzone do oddzielnych arkuszy .xlsx w postaci dwóch kolumn, z których jedna zawiera wiersze kolumny identyfikujące linię mutacji i liczbę powtórzeń testu, a druga, w której wiersze reprezentują średni sukces wspinaczki (w procentach) dla każdej powtórzonej fiolki much.
    2. Wczytaj dane do języka R przy użyciu następującego kodu:
      mali<-read.csv(".. /male_init.csv")
      femdef<-read.csv(".. /fem_def_cross.csv")
      nuta: Plik ".. " w katalogu Path są ścieżkami bezwzględnymi z katalogu głównego komputera użytkownika i muszą być określone przez indywidualnego użytkownika dla ścieżek katalogów jego komputera.
    3. Wykonywanie modelowania liniowego
      1. Wykonaj fikcyjną regresję zmiennych za pomocą funkcji lm w R. W przypadku wstępnej analizy linii mutantów należy ocenić znaczenie wpływu czynników (linii mutantów) na procent sukcesu wspinaczki w stosunku do średniej głównej dla średniej wyśrodkowanej na zero zmiennej odpowiedzi (procent sukcesu).
        nuta: Znak "-1" na końcu wywołania funkcji lm w sekcji 3.2.3.2. Usuwa punkt przecięcia i pozwala nam przetestować wszystkie poziomy współczynników w odniesieniu do zerowej średniej wyśrodkowanej procentowego wskaźnika podań po wzniesieniu.
      2. Wydrukuj wyniki na ekranie za pomocą funkcji podsumowania R:
        mali_anova<-lm(scale(mali$P_Success)~mali$Mutant_line -1)
        Podsumowanie(mali_anova)
      3. Użyj linii kontrolnych (jeśli są obecne) jako linii bazowej do testowania wpływu na poziom czynnika przy użyciu następującego kodu R: x<-relevel(femdef$Mutant_line, ref="a867_plus")
        femdef_anova<-lm(femdef$P_success~x)
        summary(femdef_anova)
        nuta: Pierwszy wiersz kodu zmienia kolejność poziomów czynników w taki sposób, że linia kontroli ujemnej staje się punktem przecięcia linii bazowej, do której wszystkie inne poziomy czynników (linie zmutowane) są testowane za pomocą wbudowanych testów t w funkcji lm.
  3. Wybierz próg dla linii kandydujących w zależności od wieku w momencie testowania. Aby określić próg, przeprowadź wstępny test w pożądanym wieku przy użyciu znanych mutantów, które wykazują neurodegenerację i niskie wskaźniki zdawalności wspinaczki w porównaniu z typem dzikim, muchy kontrolne10.
    nuta: Wskaźnik przechodzenia poniżej 50% może być odpowiedni dla 10-dniowych muszek, jak wcześniej doniesiono dla linii Drosophila z nadekspresją ludzkiego genu Tau związanego z neurodegeneracją w układzie nerwowym10. Starsze muchy powinny mieć wyższy próg zdawalności, ponieważ oczekuje się, że będą wykazywać zmniejszoną lokomocję, a tym samym zwiększoną neurodegenerację.

4. Protokół 3: Analiza histologiczna

  1. Zakładając rękawiczki, odetnij głowy muchy ostrzem chirurgicznym po teście wspinaczkowym i za pomocą pędzla delikatnie umieść je w 1 ml utrwalacza Carnoya (6:3:1 100% EtOH: chloroform: lodowaty kwas octowy) w 1,5 ml mikroprobówki wirówkowej O/N w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że głowice zanurzają się w roztworze utrwalającym.
  2. Następnego dnia roztwór utrwalający należy zastąpić 1 ml 70% EtOH i utrzymywać próbki w temperaturze 4 °C do przyszłej analizy.
    nuta: Na tym etapie protokół może zostać wstrzymany.
  3. Umieścić głowice z kroku 4.2 w maksymalnej liczbie pięciu na kasetę do mikrobiopsji. Natychmiast umieść kasety w pojemniku wypełnionym 70% EtOH. Przechowywać pojemnik w temperaturze 4 °C przed wysyłką do zakładu histologicznego w celu przetworzenia i zatopienia główek w parafinie. Jeśli dostępny jest sprzęt do przetwarzania i zatapiania tkanek, wykonaj krok 4.4.
  4. Zanurz głowy w parafinie w celu przecięcia mikrotomem:
    1. Postępuj zgodnie z ustawieniami programu dla automatycznej maszyny do przetwarzania tkanek w kolejności przedstawionej w tabeli 1, aby odwodnić, oczyścić i naciekać głowice parafiną.
    2. Przenieść próbki do metalowych form bazowych, które pasują do kasety, za pomocą parafiny podgrzanej do 60 °C za pomocą stacji zatapiania parafiny.
    3. Ustaw głowy (orientacja przednio-tylna skierowana do góry) w formie podstawowej za pomocą cienkich kleszczyków, aby umożliwić prawidłową wizualizację tkanki mózgowej po przekrojeniu. Można to zrobić poprzez ponowne podgrzanie parafiny w temperaturze 60 °C i w razie potrzeby zmianę położenia głowic.
      nuta: Formy metalowe można zastąpić jednorazowymi formami podstawowymi.
    4. Umieść kasetę na górze odpowiedniej formy bazowej i delikatnie przesuń ją na chłodzoną stronę stacji zatapiania parafiny (4 °C). Poczekaj, aż blok stwardnieje przed wyjęciem go ze stacji.
    5. Wyjmij blok z formy, delikatnie odłączając formę od kasety.
  5. Przytnij każdy blok parafiny przed przekrojeniem, aby zminimalizować powierzchnię, która zostanie przecięta.
  6. Ustaw mikrotom tak, aby wyciął 5 μm odcinków każdego bloku.
  7. Pociętą wstęgę parafinową zawierającą tkankę umieścić w podgrzanej łaźni wodnej (35 °C) na maksymalnie 5 minut.
  8. Zanurz szkiełko pokryte polilizyną (pomaga zatrzymać tkankę) w podgrzanej kąpieli wodnej, umieszczając podzieloną wstążkę na szkiełku za pomocą drewnianych aplikatorów. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu O/N w temperaturze pokojowej.
  9. Podgrzewać szkiełka przez 15 minut w temperaturze 63 °C za pomocą podgrzewacza do szkiełek.
  10. Umieść szkiełka na stojaku do barwienia szkiełek i zabarwij hematoksyną i eozyną (H&E) pod wyciągiem, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Umieść stojak w Histochoice (nietoksyczny zamiennik ksylenu, który pomaga usunąć parafinę z próbki) na 5 minut.
    2. Przenieś ruszt do pojemnika wypełnionego Histochoice na 5 minut.
    3. Przenieś stojak w pojemniku wypełnionym 100% EtOH 1 na 5 minut.
    4. Przenieś stojak w pojemniku wypełnionym 100% EtOH 2 na 5 minut.
    5. Przenieś stojak w pojemniku wypełnionym 95% EtOH na 3 minuty.
    6. Przenieś stojak w pojemniku wypełnionym 70% EtOH na 3 minuty.
    7. Przenieś ruszt do pojemnika wypełnionego destylowanymH2Ona 5 minut.
    8. Przenieś stojak do pojemnika wypełnionego hematoksyliną Harris na 2-5 minut.
    9. Wyjmij ruszt z roztworu Hematoxylin i umieść go pod bieżącą wodą z kranu na 10 minut.
    10. Przenieś stojak do pojemnika wypełnionego wodą destylowaną, wykonując krótkie zanurzenie.
    11. Przenieś stojak w pojemniku wypełnionym Eozyną na 1-2 minuty.
    12. Przenieś stojak do pojemnika wypełnionego 95% EtOH, wykonując krótki wsad.
    13. Przenieś stojak w pojemniku wypełnionym 95% EtOH na 5 minut.
    14. Przenieś stojak do pojemnika wypełnionego 100% EtOH na 5 minut.
    15. Przenieś stojak do pojemnika wypełnionego 100% EtOH na 5 minut.
    16. Przenieś stojak w pojemniku wypełnionym Histochoice (lub ksylenem) na 5-10 minut, aż wszystkie prowadnice zostaną zamontowane.
    17. Zamontuj szkiełko i szkiełko nakrywkowe (o wymiarach 24 mm x 60 mm). Za pomocą kleszczy wyjmij szkiełko z roztworu Histochoice lub ksylenu i wykonaj na nim cienki pasek podłoża montażowego. Delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu, starając się uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
    18. Przed analizą poczekaj, aż medium montażowe na zamontowanych prowadnicach stwardnieje pod wyciągiem.
    19. Poplamione szkiełka należy przechowywać w pudełku w temperaturze pokojowej.
  11. Określ ilościowo neurodegenerację, patrząc na wszystkie seryjne sekcje na szkiełku przy 20-krotnym powiększeniu pod mikroskopem świetlnym. Zbadaj cały mózg, zwracając uwagę na wielkość i liczbę wakuoli, które pojawiają się w trzech kolejnych sekcjach.
  12. Uzyskaj obrazy reprezentatywnych odcinków mózgu w przybliżeniu w środkowej części mózgu za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w oprogramowanie do obrazowania.

5. Protokół 4: Mapowanie genów recesywnego fenotypu mmutanta

  1. Przeciąć linię kandydującą z dzikim typem CantonS (BL_ 9517) lub innym dzikim typem lub szczepem izogenizowanym (np. OregonR (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) lub yw (BL_ 6599), aby określić, czy fenotyp jest dominujący czy recesywny.
    UWAGA:     Wyniki tego kroku będą stanowić wskazówkę dla kolejnych kroków mapowania. Jeśli fenotyp jest recesywny, można przeprowadzić mapowanie niedoborów.
    1. Za pomocą pędzla wykonaj krzyż, umieszczając w fiolce zawierającej żywność znieczulone CO2 muchy z linii zainteresowania mutantów (5 samców) i linii CantonS (10-15 dziewiczych samic). Umieścić fiolkę w temperaturze 25 °C.
    2. Zbierz heterozygotyczne potomstwo F1 i powtórz eksperymenty wspinaczkowe i histologiczne.
    3. Porównaj uzyskane wyniki z samą linią kontrolną i z homozygotycznymi mutantami. Dobrym wskaźnikiem fenotypu recesywnego będzie to, że heterozygotyczne mutanty wykazują podobne fenotypy jak muchy typu dzikiego.
  2. Wykonaj mapowanie mejotyczne, aby z grubsza oszacować lokalizację mutacji na drugim chromosomie przy użyciu wgSp-1 J1 L 2 Pin1 / CyO (BL_3227) lub równoważnego szczepu z powiązanymi dominującymi markerami w znanej lokalizacji cytologicznej. W tym przypadku wcześniej wiadomo, że mutacja znajduje się na drugim chromosomie.
    1. Za pomocą pędzla wykonaj krzyż, umieszczając w fiolce zawierającej żywność znieczulone CO2 znieczulone muchy z linii zainteresowania mutanta (5 samców) i linii wgSp-1 J1 L 2 Pin1/CyO (10 samic). Umieścić fiolkę w temperaturze 25 °C.
      nuta: Celem tej krzyżówki jest wygenerowanie heterozygotycznych samic posiadających chromosom z nową mutacją i chromosomem markerowym, który ulegnie rekombinacji podczas mejozy6,14. Żeńskie potomstwo F1 jest wybierane, a nie męskie, ponieważ rekombinacja nie zachodzi u samców.
    2. Zebrać co najmniej 15 dziewiczych żeńskich potomstwa będących nosicielami chromosomu z nową mutacją i chromosomem markerowym i skrzyżować je z 5 samcami ze zrównoważonej linii, która zawiera inny widoczny marker dominujący (np. CyO/snaSco (BL_2555) lub równoważny).
    3. Zebrać heterozygotyczne męskie potomstwo będące nosicielami Sco lub CyO i potencjalnie zrekombinowanego chromosomu z krzyżówki w kroku 5.2.2. i indywidualnie kojarzyć je z dziewiczymi samicami z trzonu posiadającego zmutowany chromosom.
    4. Zebrać potomstwo z końcowej krzyżówki opisanej w kroku 5.2.3 i postarzać muchy w temperaturze 29 °C (w tym badaniu muchy dojrzewały przez 10-14 dni).
    5. Zebrać głowy, przeprowadzić analizę histologiczną zgodnie z opisem w Protokole 3 i spojrzeć na szkiełka z wycinkami mózgu, aby określić stopień neuropatologii zgodnie z opisem w kroku 4.11. Przeprowadzana jest analiza histologiczna, a nie analiza lokomocji, ze względu na fenotypy, które mogą wpływać na test wspinaczkowy, takie jak Jammed (J), który powoduje gromadzenie się płynu w wings15.
  3. Wykonaj mapowanie niedoborów w zwężonym regionie chromosomu, aby doprecyzować lokalizację mutacji recesywnej za pomocą testu wspinaczkowego. Każda linia niedoboru ma delecję innego regionu chromosomów, co pozwala na wykorzystanie ich do testowania komplementacji.
    1. Zacznij od dużych braków, które obejmują region zidentyfikowany w mapowaniu mejotycznym, które można następnie dodatkowo zawęzić poprzez zastosowanie mniejszych braków. Jeśli analiza niedoboru prowadzi do więcej niż jednego genu kandydującego, zaleca się użycie zapasów interferencyjnych RNA (RNAi) w celu ich ukierunkowania.
    2. Skrzyżuj linie z zestawu niedoboru Drosophila16 dla drugiego chromosomu (DK2L w tym badaniu) i poszukaj braku komplementacji fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania (w tym badaniu: wskaźnik przejścia wspinaczkowego wynoszący 8,5%, co odpowiada wskaźnikowi przejścia homozygotycznych muszek z linii 867 stosowanej jako kontrola pozytywna).
    3. Potwierdzić fenotyp neurodegeneracji za pomocą weryfikacji histologicznej, jak opisano w sekcji 4 (protokół 3).

6. Protokół 5: Sekwencjonowanie i analiza DNA

UWAGA: Pamiętaj, że mutageneza ENU wprowadza mutacje punktowe11.

  1. Zaprojektuj sekwencje starterów do przodu i do tyłu flankujące region kodujący egzon genu brat do amplifikacji przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) regionu zainteresowania (w przypadku linii 867 fragment DNA o wielkości 3,247 pz jest amplifikowany do sekwencjonowania17).
  2. Wyodrębnij DNA z pojedynczej muchy18 :
    1. Delikatnie zgnieć muchę w 0,5 ml mikroprobówce wirówkowej zawierającej 50 μl buforu do zgniatania (10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl i 200 μg/ml proteinazy K; enzym musi być rozcieńczony świeżo z zamrożonego wywaru przed każdym użyciem) za pomocą końcówki do pipety P100 lub P200.
    2. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C
    3. Dezaktywować proteinazę K, umieszczając probówkę w temperaturze 95 °C na 2 min.
      nuta: Wyekstrahowane DNA może być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  3. Przeprowadzić reakcję PCR przy użyciu polimerazy DNA Taq o wysokiej wierności (odczynniki i warunki cykli termicznych użyte w tym badaniu przedstawiono odpowiednio w Tabeli 2 i Tabeli 3), przestrzegając instrukcji producenta i uruchomić produkt PCR na 1% żelu agarozowym zawierającym Invitrogen SYBR Safe DNA Gel Stain, który jest nietoksyczną alternatywą bromku etydyny.
  4. Usuń z żelu opaskę o odpowiednim rozmiarze za pomocą skalpela i oczyść produkt PCR za pomocą Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) lub równoważnego zestawu, przestrzegając instrukcji producenta.
  5. Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu, które będą używane do sekwencjonowania DNA, aby pokryć cały obszar zainteresowania, jeśli to możliwe. Zsekwencjonuj oczyszczone żelem DNA z poprzedniego kroku, aby zidentyfikować mutacje punktowe. Wysoka dokładność w zautomatyzowanym sekwencjonowaniu fluorescencyjnym Sangera może być osiągnięta do 700 bp.
    nuta: Polimeraza Ex Taq (TaKaRa) może być stosowana do amplifikacji produktów PCR z matryc genomowego DNA o wielkości do 20 kb.
  6. Analizuj uzyskane sekwencje DNA za pomocą edytora plazmidów A (ApE, M. Wayne Davis) lub podobnego oprogramowania, dopasowując je i porównując z sekwencjami uzyskanymi po sekwencjonowaniu tego samego regionu genomowego szczepu referencyjnego (np. pierwotnie zmutagenizowanej linii).
    1. Otwórz pliki sekwencjonowania za pomocą ApE. Jako odniesienie użyj pliku ApE zawierającego genomową sekwencję konsensusu genu brata pobraną w formacie FASTA z Flybase lub pliku zawierającego wyniki sekwencji genetycznej kontroli tła (np. pierwotnie zmutagenizowana linia Drosophila).
    2. Przejdź do Narzędzia, a następnie Wyrównaj sekwencje. Za pomocą myszy komputera wybierz wszystkie sekwencje do porównania. Pamiętaj, aby wskazać sekwencję odwołań używaną do tego wyrównania w menu rozwijanym.
    3. Sprawdź sekwencjonowany region pod kątem zmian nukleotydów w porównaniu z sekwencją referencyjną. W razie potrzeby zapisz wyrównanie na komputerze w .rtf formacie, klikając Tekst, a następnie Zapisz.
      nuta: Jeśli nie zidentyfikowano żadnych mutacji, protokół sekwencjonowania i analizy DNA zostałby powtórzony ze starterami zaprojektowanymi tak, aby zawierały niekodujące regiony genu.

7. Protokół 6: Dalsza analiza funkcji genu kandydującego

  1. Przeprowadź eksperymenty ratunkowe na neuroblastach, aby ustalić, czy gen bachor jest odpowiedzialny za fenotyp neurodegeneracji.
    1. Podwójnie zrównoważ UAS-brat19 i specyficzne dla neuroblastów worniu-Gal4 (wor-G4) zawierające konstrukty na trzecim chromosomie, a także linię 867, która jest zmutowana dla genu brat znajdującego się na drugim chromosomie.
      1. Wykonaj trzy oddzielne krzyżówki, umieszczając w trzech różnych fiolkach zawierających żywność 5 samców z linii UAS-Brat, wor-G4 i 867 i dodaj do każdego zestawu samców 10-15 dziewiczych samic z linii zawierającej markery i równoważniki dla drugiego i trzeciego chromosomu (Sp/CyO; dr/tm3,sb; BL_59967).
      2. Zbierz 10-15 dziewiczych samic z F1 każdej krzyżówki o następujących genotypach: +/CyO; UAS-brat/Tm3,sb, +/CyO; wor-G4/Tm3,sb i 867/CyO;+/Tm3,sb i 5 samców każdego z następujących genotypów: +/Sp; UAS-brat/Tm3,sb, +/Sp; wor-G4/Tm3,sb oraz 867/CyO; +/Dr.
      3. Krzyż collelcted +/CyO; UAS-brat/Tm3,sb dziewicze samice do +/Sp; UAS-brat/Tm3,sb mężczyźni; w osobnej fiolce należy wykonać drugą krzyżówkę z +/CyO; wor-G4 /Tm3,sb dziewicze samice do +/Sp; wor-G4/Tm3,sb samców, a następnie w trzeciej fiolce krzyżować 867/CyO;+/Tm3,sb dziewicze samice i 867/CyO; +/Dr samce.
      4. Z F1 każdej z tych krzyżówek zbierz zarówno samce, jak i samice o następujących genotypach: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb z pierwszego krzyża, Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb z drugiego krzyża i 867/CyO; Dr/Tm3,sb z drugiego krzyża.
      5. Wykonaj ostateczną krzyżówkę między braćmi i siostrami zebranymi z każdego potomstwa F1, aby ustalić trwałe, podwójnie zrównoważone stada dla wszystkich trzech linii.
    2. Połącz UAS-brat i wor-G4 z mutacją 867.
      1. Zbierz wystarczającą liczbę (~20-30 much) dziewiczych samic z 867/CyO; Dr/Tm3,sb podwójnie wyważony zapas do wykonania dwóch krzyżówek.
      2. Umieść 10-15 dziewiczych samic z ~5 samcami ze Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb (krzyż #1) i w drugiej fiolce 10-15 dziewiczych samic z ~5 Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb samce.
      3. Zbierz braci i siostry z F1 każdej krzyżówki o następujących genotypach: 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb z krzyża #1 i 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb od krzyża #2. Użyj zebranego potomstwa F1 z każdej krzyżówki, aby założyć stałe stada poprzez krzyżowanie między nimi braci i sióstr.
        nuta: Po tym ostatnim kroku, zapasy dla 867/CyO; Należy wygenerować UAS-brat/Tm3,sb i 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb.
    3. Wykonaj eksperyment ratunkowy.
      1. Zbierz ~15-20 dziewiczych samic z 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb i skrzyżuj je z 5-10 samcami ze stada 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb. Jako kontrolę, krzyżuj ~ 15-20 dziewiczych samic z 867 / CyO; wor-G4 / Tm3,sb i ~ 15-20 dziewiczych samic z 867 / CyO; Linia UAS-brat/Tm3,sb do samej linii 867/CyO.
        UWAGA: Muchy 867 są nosicielami wrażliwego na temperaturę allelu bachora, a krzyżowanie ratunkowe powinno być wykonane w temperaturze 29 °C.
      2. Zbierz następujące potomstwo F1 z każdej krzyżówki, starannie wybierając oznaczone balansery: 867/867; wor-G4/UAS-brat (ratownictwo), 867/867; wor-G4/+ (kontrola) oraz 867/867; UAS-brat/+ (kontrola).
      3. Starzej muszki zgodnie z życzeniem w temperaturze 29 °C i przeprowadź analizę histologiczną mózgu w poszukiwaniu neurodegeneracji, korzystając z protokołu opisanego w sekcji 4 (Protokół 3).
  2. Wykonaj zależną od wieku analizę neurodegeneracji u 867 mutantów.
    1. Zbierz 867; Muchy kontrolne pcna-GFP i yw, które są nosicielami genu reporterowego (pcna-GFP) i są żywotne w temperaturze 25°C oraz wykazują zarówno wyższą penetrację, jak i wyższą ekspresję fenotypu neurodegeneracji niż sam 867 w tej temperaturze17.
    2. Starzeć muszki do 5, 15 i 25 lat, jak opisano w sekcji 1.4, a następnie przeprowadzić analizę histologiczną, postępując zgodnie z protokołem w sekcji 4 (Protokół 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym artykule przedstawiamy kroki podjęte w celu zidentyfikowania genu brain tumor (brat) jako odgrywającego rolę w utrzymaniu integralności neuronalnej (np. neuroprotekcji) u dorosłych much17; jest to metodologia, która może być wykorzystana do identyfikacji genów zaangażowanych w neuroprotekcję. Zastosowaliśmy podejście genetyki forward (strategia została przedstawiona na Rysunku 1A), aby przeszukać kolekcję...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zaawansowane badania genetyczne u Drosophila są skutecznym podejściem do identyfikacji genów zaangażowanych w różne procesy biologiczne, w tym neuroprotekcję zależną od wieku 5,23,24,25. Korzystając z tej strategii, udało nam się zidentyfikować bachora jako nowy gen neuroprotekcyjny17.

Jednym z kluczowych etapów tego protokoł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy szczególnie wdzięczni doktorowi Barry'emu Ganetzky'emu, w którego laboratorium przeprowadzono badanie genetyczne, co pozwoliło zidentyfikować i scharakteryzować bachora jako gen neuroprotekcyjny. Dziękujemy dr Stevenowowi Robinowowi za uprzejme udostępnienie kolekcji much zmutagenizowanych ENU, które zostały wykorzystane w genetycznym badaniu przesiewowym przedstawionym w tym artykule. Dziękujemy członkom laboratorium Ganetzky, dr Grace Boekhoff-Falk i Davidowi Wassarmanowi za pomocne dyskusje przez cały czas trwania tego projektu, Ling Ling Ho i Bobowi Kreberowi za pomoc techniczną, dr Aki Ikeda za korzystanie z jego urządzenia do mikrotomów na Uniwersytecie Wisconsin oraz dr Kim Lackey i Optical Analysis Facility na Uniwersytecie w Alabamie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Główny sprzęt
dygestorium do histologii
Mikroskop świetlnyNikonEclipe E100Preferowany obiektyw do obrazowania to 20x
Oprogramowanie do obrazowaniaNikon
Aparat mikroskopowyNikon
TermocyklerEppendorf
Test pchania i wspinania strong
VWR® Fiolka Drosophila, wąskaVWR75813-160
VWR® Taśma do etykietowania laboratoryjnego ogólnego przeznaczenia VWR89097-912
Standardowa podkładka
StereoscopeMoticModel SMZ-168
Stacja anestezjologiczna CO2 (Pistolet pneumatyczny, zawór stopowy, Ultimate Flypad)Genesee Scientific54-104, 59-121, 59-172Doesn' t iinclude CO2 Zbiornik
CO2 Szczotki z cienką końcówkąSOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila InkubatorVWR89510-750
Mapowanie genów
CantonSBloomington Drosophila Stock Center9517
w1118Bloomington Drosophila Stock Center5905
yw Bloomington Drosophila Stock Center6599
Drosophila linia używana do mapowania rekombinacjiBloomington Drosophila Stock Center3227Genotyp: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco] Bloomington Drosophila Stock Center2555Linia równoważąca Drosophila używana do mapowania rekombinacji
Zestaw niedoborów dla chromosomu 2LBloomington Drosophila Stock CenterDK2LCook et al., 2012
Analiza histologiczna
Etanol, (100%)Thermo Fischer ScientificA4094
ChloroformThermo Fischer ScientificC298-500
Lodowaty kwas octowyThermo Fischer ScientificA38-500
Fisherbrand™   Probówki do mikrowirówek premium: 1,5 mlThermo Fischer Scientific05-408-129
Środek czyszczący Histochoice 1xVWR Life Sciences97060-934
Harris HematoxylinVWR95057-858
EosinVWR95057-848
Thermo Scientific™   Richard-Allan Nauka i handel; Mocowanie mediumThermo Scientific™ 411222-110-610CyO/sna[Sco]
Szkiełka mikroskopowe Unifrost Poly-L-Lysine, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select PlusAzer Scientific
Fisherbrand™   Okulary nakrywkowe: ProstokątyFisherbrand12-545MWymiary: 24 mm x 60 mm
Identyfikowalny timerVWR
Podgrzewacz do slajdówBarnstead Internationalnr modelu 26025
Taca na suwaki i stojakiDWK Life SciencesStojak na 20 slajdów
Fisherbrand™   Ekstra-długie kleszcze ogólnego przeznaczeniaFisherbrand10-316A
Kimwipes™Kimberly-Clark&handel; Profesjonalista 
6-calowe aplikatory Puritan HardwoodProducts Company, Guilford, Maine807-12
VWR® ŻyletkiVWR55411-050
Tupperware lub szklane pojemniki na płyny16 + 1 do bieżącej wody
Ostrza mikrotomu z powłoką o wysokim profiluVWR95057-834
Corning™   Okrągłe wiaderko na lód z pokrywką, 4 LCorning™
ZlewkaLub inny pojemnik na wodę lodową i kasety
Kąpiel tkankowaPrecyzyjna firma naukowa66630
MikrotomLeica Biosystems
Analiza molekularna
Wizard® SV Żel i system do czyszczenia PCRPromegaA9282
Ex Taq Polimeraza DNATaKaRa5 U/μ l
Invitrogen i handel;   SYBR&handel; Bezpieczny i handlowy; Barwienie żelem DNA   Invitrogen&handel;
UltraPure&handel; Agaroza  Invitrogen&handel;
1 Kb Plus drabinka DNA  Invitrogen&handel;
ApE-A Plasmid EditorDostępne do bezpłatnego pobrania
Analiza statystyczna oprogramowania
Dalsza analiza
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]Centrum magazynowe Bloomington Drosophila59967
pod mysz histologiczne Oprogramowanie strong>R

Bibliografia

  1. Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
  2. Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
  3. Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
  4. Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  5. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
  6. Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).
  7. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  8. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  9. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  10. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  11. Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
  12. Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
  13. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Foundation for Statistical Computing. (2008).
  14. Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
  15. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
  16. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21(2012).
  17. Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
  18. Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).
  19. Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
  20. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
  21. Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
  24. Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
  25. Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
  26. Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816(2015).
  27. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  28. Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
  29. Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test wspinaczkowyanaliza histologicznamapowanie deficytówsekwencjonowanie DNAutrwalacz Carnoyazatapianie w parafiniebarwienie hematoksyliną
Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.