Artykuł metodologiczny

Opracowanie ukierunkowanych populacji indukowanych miejscowymi zmianami chorobowymi w genomach (TILLING) w małych uprawach zbóż metodą mutagenezy metanosulfonianu etylu

DOI:

10.3791/59743

⸱

16 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science and Landscape Architecture, University of Maryland, College Park

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany jest protokół rozwoju populacji Indukowanych Miejscowych Zmian Chorobowych (TILLING) w małych uprawach zbóż z użyciem metanosulfonianu etylu (EMS) jako mutagenu. Podano również protokół wykrywania mutacji za pomocą testu Cel-1.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) to potężne narzędzie genetyki odwrotnej, które obejmuje mutagenezę chemiczną i wykrywanie zmienności sekwencji w genach docelowych. TILLING jest bardzo cennym narzędziem genomiki funkcjonalnej do walidacji genów, zwłaszcza w przypadku małych ziaren, w których podejścia oparte na transformacji mają poważne ograniczenia. Opracowanie silnej, zmutagenizowanej populacji ma kluczowe znaczenie dla określenia skuteczności badania walidacji genów opartego na projekcie TILLING. Populacja TILLING o niskiej ogólnej częstości mutacji wskazuje, że niepraktycznie duża populacja musi zostać poddana badaniom przesiewowym w celu znalezienia pożądanych mutacji, podczas gdy wysokie stężenie mutagenu prowadzi do wysokiej śmiertelności w populacji, co prowadzi do niewystarczającej liczby mutagenizowanych osobników. Po opracowaniu efektywnej populacji istnieje wiele sposobów wykrywania mutacji w genie będącym przedmiotem zainteresowania, a wybór platformy zależy od skali eksperymentu i dostępności zasobów. Test Cel-1 i podejście oparte na żelu agarozowym do identyfikacji mutantów jest wygodną, powtarzalną i mniej zasobożerną platformą. Jest to korzystne, ponieważ jest proste, nie wymaga wiedzy obliczeniowej i szczególnie nadaje się do walidacji niewielkiej liczby genów za pomocą podstawowego sprzętu laboratoryjnego. W niniejszym artykule opisano metody rozwoju dobrej populacji TILLING, w tym przygotowanie krzywej dawkowania, mutagenezę i utrzymanie populacji mutantów oraz badania przesiewowe populacji mutantów za pomocą testu Cel-1 opartego na PCR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Punktowe mutacje w genomach mogą służyć wielu użytecznym celom dla badaczy. W zależności od ich charakteru i lokalizacji, mutacje te mogą być wykorzystywane do przypisywania funkcji genom lub nawet odrębnym domenom białek będących przedmiotem zainteresowania. Z drugiej strony, jako źródło nowej zmienności genetycznej, użyteczne mutacje mogą być wybierane pod kątem pożądanych cech za pomocą badań przesiewowych fenotypowania i dalej wykorzystywane w ulepszaniu upraw. TILLING to potężne narzędzie genetyki odwrotnej, które obejmuje mutagenezę chemiczną i wykrywanie zmienności sekwencji w genie docelowym. Po raz pierwszy opracowane w Arabidopsis1 i Drosophilia melanogaster2, populacje TILLING zostały opracowane i wykorzystane w wielu małych uprawach zbóż, takich jak heksaploidalna pszenica chlebowa (Triticum aestivum)3, jęczmień (Hordeum vulgare)4, tetraploidalna pszenica durum (T. dicoccoides durum)5, pszenica diploidalna (T. monococcum)6 i przodek genomu "D" pszenicy Aegilops tauschii7. Zasoby te zostały wykorzystane do walidacji roli genów w regulacji tolerancji na stres abiotyczny i biotyczny8, regulacji czasu kwitnienia9 oraz rozwoju odmian roślin uprawnych o wysokiej jakości odżywczej5.

TILLING, wraz z użyciem alkilujących środków mutagennych, takich jak metanosulfonian etylu (EMS), azydek sodu, N-metylo-N-nitrozourea (MNU) i metanosulfonian metylu (MMS), ma przewagę nad innymi narzędziami genetyki odwrotnej z kilku powodów. Po pierwsze, mutagenezę można przeprowadzić na praktycznie każdym gatunku lub odmianie roślin10 i jest niezależna od wąskiego gardła transformacji, co jest szczególnie trudne w przypadku małych ziaren11. Po drugie, oprócz generowania mutacji nokautujących, które można uzyskać za pomocą innych podejść do walidacji genów, można indukować szereg mutacji typu missense i splicing , które mogą rozpoznać funkcje poszczególnych domen białek będących przedmiotem zainteresowania12. Co więcej, TILLING generuje nieśmiertelną kolekcję mutacji w całym genomie; W ten sposób pojedyncza populacja może być wykorzystana do funkcjonalnej walidacji wielu genów. W przeciwieństwie do tego, inne narzędzia genetyki odwrotnej generują zasoby specyficzne tylko dla badanego genu13. Użyteczne mutacje zidentyfikowane w ramach projektu TILLING mogą być wykorzystywane do celów hodowlanych i nie podlegają regulacji, w przeciwieństwie do edycji genów, której klasyfikacja nietransgeniczna jest nadal niepewna w wielu krajach. Jest to szczególnie istotne w przypadku małych ziaren, które są przedmiotem handlu międzynarodowego14.

TILLING to prosta i skuteczna strategia walidacji genów, która wymaga opracowania mutagenizowanych populacji do badania interesujących genów. Opracowanie skutecznej mutagenizowanej populacji jest kluczem do określenia skuteczności badania walidacji genów opartego na TILLING. Populacja TILLING o niskiej ogólnej częstości mutacji wskazuje, że niepraktycznie duża populacja musi zostać przebadana pod kątem pożądanych mutacji, podczas gdy wysokie stężenie mutagenu prowadzi do wysokiej śmiertelności w populacji i niewystarczającej liczby mutagenizowanych osobników. Po rozwinięciu dobrej populacji istnieje wiele sposobów wykrywania mutacji w genach będących przedmiotem zainteresowania, a wybór platformy zależy od skali eksperymentu i dostępności zasobów. Sekwencjonowanie całego genomu i sekwencjonowanie egzomu zostało wykorzystane do scharakteryzowania wszystkich mutacji w populacjach TILLING u roślin o małych genomach15,16. Sekwencjonowanie egzomu dwóch populacji TILLING zostało przeprowadzone w chlebie i pszenicy durum i jest dostępne publicznie w celu identyfikacji pożądanych mutacji i uporządkowania zmutowanych linii zainteresowania17. Jest to wielki zasób publiczny pod względem dostępności pożądanych mutacji; Jednak w badaniach walidacji genów linia typu dzikiego powinna posiadać gen kandydujący będący przedmiotem zainteresowania. Niestety, sekwencjonowanie egzomu całej populacji TILLING w celu odwrotnej walidacji genetycznej kilku genów kandydujących na innym tle jest nadal zbyt kosztowne. Sekwencjonowanie amplikonów i testy oparte na Cel-1 zostały wykorzystane do wykrywania mutacji w docelowych populacjach pszenicy, a testy Cel-1 są prostsze, nie wymagają wiedzy obliczeniowej i są szczególnie odpowiednie do walidacji niewielkiej liczby genów za pomocą podstawowego sprzętu laboratoryjnego6,18.

W niniejszym artykule opisane są metody rozwoju dobrej populacji TILLING, w tym przygotowanie krzywej dawkowania, mutageneza i utrzymanie populacji mutantów oraz badania przesiewowe populacji mutantów za pomocą testu Cel-1 opartego na PCR. Protokół ten został już z powodzeniem wdrożony w rozwoju i wykorzystaniu mutagenizowanych populacji Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, jęczmienia, Aegilops tauchii7 i kilku innych. Zamieszczono szczegółowe informacje na temat tych metod wraz z przydatnymi wskazówkami, które pomogą naukowcom opracować populacje TILLING, wykorzystując EMS jako mutagen w dowolnej roślinie o małym zbożu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie krzywej dawkowania dla skutecznej mutagenezy

  1. Namoczyć 100 nasion o interesującym genotypie w sześciu szklanych kolbach o pojemności 250 ml (po 100 w każdej kolbie) zawierających 50 ml wody destylowanej. Wstrząsać z prędkością 100 obr./min przez 8 godzin w temperaturze pokojowej (RT) do wchłonięcia przez nasiona.
  2. W dygestorium przygotuj 50 ml roztworu 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% i 1,2% (w/v) metanosulfonianu etylu (EMS), rozpuszczając odpowiednio 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 i 0,498 ml EMS w wodzie destylowanej.
    UWAGA: EMS jest cieczą w temperaturze pokojowej o gęstości 1,206 g/ml.
    UWAGA: Podczas pracy z EMS należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE).
  3. Zdekantować wodę z pięciu kolb i dodać 50 ml roztworu EMS do każdej kolby zawierającej wchłonięte nasiona, tak aby przeprowadzono sześć różnych zabiegów z użyciem 0,0%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% i 1,2% roztworu EMS. Wytrząsać kolby przez 16 godzin przy 75 obr./min i przy RT.
  4. Zdekantować roztwór EMS i zebrać zaprawione nasiona oddzielnie dla każdego zabiegu za pomocą gazy serowej. Dezaktywować zużyty roztwór EMS, dodając jedną objętość roztworu inaktywującego EMS (0,1 M NaOH, 20% w/v Na2S2O3) przez 24 godziny. Zanieczyszczone kolby i końcówki pipet należy również traktować roztworem dezaktywującym EMS przez 24 godziny.
  5. Umyj nasiona zaprawione EMS pod bieżącą wodą z kranu przez 2 godziny. Przesadź każde nasiono indywidualnie do trenażerów korzeni zawierających ziemię doniczkową.
  6. Rośliny uprawiać w temperaturze 20–25 °C przez 16 godzin w świetle trwającym 16 godzin.
  7. Zapisuj dane dotyczące przeżywalności roślin po 15 dniach od przesadzenia. Użyj poniższego równania, aby obliczyć wskaźnik przeżycia dla każdego leczenia:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Jeśli zdolność kiełkowania jest niższa niż 100% w kontrolach, dokładne wskaźniki przeżywalności we wszystkich zabiegach należy obliczyć po odjęciu liczby nasion, które nie wykiełkowały w kontrolach. Wskaźnik przeżycia na poziomie 40%–60% jest pożądany dla skutecznej mutagenezy. Może być konieczne przeprowadzenie drugiej rundy optymalizacji dawkowania ze zmodyfikowanym stężeniem w zależności od przeżywalności zaprawionych nasion, aż do osiągnięcia pożądanego wskaźnika śmiertelności 40%-60%.

2. Mutageneza i utrzymanie populacji mutantów

  1. Namocz ostatnią partię co najmniej 3,000 nasion, dzieląc się równo (po 600 nasion każda) w pięciu kolbach o pojemności 1,000 ml zawierających 300 ml wody destylowanej. Wstrząsaj przez 8 godzin przy 100 obr./min w temperaturze RT w celu wchłonięcia.
    UWAGA: Ostateczna wielkość pożądanej populacji będzie zależeć od częstotliwości mutacji i poziomu ploidalności genotypu, ale zaleca się użycie co najmniej 3000 nasion dla heksaploidów, 4000 nasion dla tetraploidów i ponad 7000 nasion dla diploidów.
  2. W dygestorium przygotować 1 500 ml zoptymalizowanego roztworu o stężeniu EMS w wodzie destylowanej.
  3. Zdekantować wodę z kolb i dodać 300 ml roztworu EMS o optymalnym stężeniu do każdej kolby zawierającej 600 wchłoniętych nasion. Potrząsać kolbami przez 16 godzin przy 75 obr./min i przy RT.
  4. Zdekantować EMS i zebrać zaprawione nasiona w gazie serowym. Dezaktywować roztwór EMS i pojemniki do uzdatniania roztworem dezaktywującym EMS, jak wykonano w kroku 1.4.
  5. Umyj nasiona zaprawione EMS pod bieżącą wodą z kranu przez 2 godziny. Przeszczep każde nasiono M1 zaprawione EMS indywidualnie do trenażerów korzeni.
  6. Uprawiać rośliny M1 (pochodzące z nasion M0) w temperaturze 20–25 °C w okresie świetlnym trwającym 16 godzin.
    UWAGA: Może być konieczne wernalizowanie sadzonek w fazie dwóch liści przez 6 tygodni w temperaturze 4 °C, jeśli interesujący genotyp ma pokrój zimowy.
  7. Pozwól roślinom M1 na samozapylenie i zbierz nasiona M2 oddzielnie dla każdej płodnej rośliny M1.
    UWAGA: Aby uniknąć ryzyka potencjalnego krzyżowania, przykryj kolce roślin M1 workami do zapylania przed wylęgiem.
  8. Posadź pojedyncze nasionoM2 z każdej rośliny M1, aby uniknąć redundancji genetycznej.
  9. Zbierz tkankę z roślinM2 w fazie dwóch liści w 1,1 ml 96-dołkowych mikroprobówek. Zbierz około 80 mm tkanki liściowej z każdej rośliny i zapisz identyfikator każdej próbki w planie pobierania tkanek.
  10. Liofilizować tkankę liścia za pomocą liofilizatora i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  11. Utrzymuj roślinyM2 w temperaturze 20–25 °C przez 16 godzin w okresie świetlnym.
  12. Rejestruj dane dotyczące zmutowanych fenotypów roślinM2 w regularnych odstępach czasu. Oczekiwane fenotypy to albinosy, chlorina, pędy trawiaste, pstrokate, częściowo płodne, bezpłodne itp.
  13. Pozwól roślinom M2 na samozapłodnienie i dojrzewanie. Oddzielnie zbierz i zachowaj nasiona M3 roślin M2 (Rysunek 1).
    UWAGA: Nasiona M są używane do walidacji fenotypu w badaniach genetyki odwrotnej. Dlatego M powinien być starannie skatalogowany i przechowywany w chłodnych i suchych warunkach. Alternatywnie, jeśli nasiona muszą być zwiększone na polu, rzędy głów można sadzić dla każdej rośliny M, a nasiona M z każdego rzędu można zbierać i przechowywać osobno jako zasób populacji TILLING.

3. Test Cel-1 do genetycznej charakterystyki mutantów

  1. Ekstrahować DNA z tkanki liściaM2 za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA roślinnego z systemem oczyszczania DNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Określ ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru i znormalizuj stężenia DNA do 25 ng / μl za pomocą wody wolnej od nukleaz w 96 blokach dołków.
    UWAGA: Ważne jest, aby sprawdzić jakość DNA, przeprowadzając je na żelu, ponieważ DNA niskiej jakości (rozmazane DNA) może skutkować fałszywie ujemnymi wynikami w próbkach zbiorczych.
  3. Stwórz 4 pule DNA, łącząc DNA z czterech 96-dołkowych bloków w jedną płytkę, zachowując tożsamość rzędu i kolumny każdej próbki. Dodaj 50 μl DNA z każdej pojedynczej próbki do płytki basenowej, tak aby każda studzienka zawierała łącznie 200 μl DNA z czterech różnych 96 bloków dołków.
  4. Skatalogować tożsamość połączonego DNA w formacie Pool Plate-Row-Column (np. Pool 1 A1 = Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box4A1).
  5. Zaprojektuj startery specyficzne dla genomu [A1] dla genu będącego przedmiotem zainteresowania, korzystając ze strony Startery specyficzne dla genomu (GSP) z domyślnymi ustawieniami dla gatunków poliploidalnych. W przypadku diploidów użyj Primer 3 do projektowania podkładów przy użyciu ustawień domyślnych. W razie potrzeby zaprojektuj wiele starterów, aby pokryć cały region kodujący interesującego nas genu.
    UWAGA: Najnowszy zestaw IWGSC może być wykorzystany do uzyskania sekwencji dla genu będącego przedmiotem zainteresowania u pszenicy za pomocą narzędzia URGI BLAST . Optymalna długość amplikonu mieści się w zakresie 800–1 500 pz. Tabela 1 przedstawia przykłady starterów dla woskowych genów w pszenicy heksaploidalnej.
  6. Uruchom PCR dla starterów specyficznych dla genu na połączonym DNA w następujący sposób:
    1. Dodać 5 μl buforu PCR, po 2 μl (każdy) 4 μM starterów do przodu i do tyłu, 0,1 μl polimerazy DNA (patrz tabela materiałów), 5 μl zbiorczej matrycy DNA, a następnie zwiększyć objętość do 25 μl za pomocą wody wolnej od nukleaz.
    2. Użyć profilu przyłożenia, aby uruchomić reakcję PCR na termocyklerze w następujący sposób: 95 °C przez 1 minutę, siedem cykli po 95 °C przez 1 minutę, 67 °C do 60 °C przez 1 minutę ze spadkiem temperatury o 1 °C na cykl i 72 °C przez 2 minuty, następnie 30 cykli w temperaturze 95 °C przez 1 min, 60 °C przez 1 minutę, 72 °C przez 2 minuty i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 7 minut
      UWAGA: Powyższy profil PCR działa na matrycy DNA pszenicy dla większości starterów zaprojektowanych przy użyciu domyślnych ustawień startera 3. W przypadku niespecyficznej amplifikacji, profil PCR powinien być rygorystyczny przed przejściem do kolejnych kroków.
  7. Generuj heterodupleksy między niedopasowanym DNA poprzez inkubację produktów PCR w termocyklerze przy użyciu profilu w następujący sposób: 95 °C przez 2 minuty, pięć cykli po 95 °C przez 1 s, 95 °C do 85 °C przez 1 minutę ze spadkiem temperatury o 2 °C na cykl i 60 cykli od 85 °C do 25 °C ze spadkiem o 1 °C na cykl.
  8. Dodać 2,5 μl domowej endonukleazy Cel-1 do heterodupleksowanych produktów PCR i inkubować przez 45 minut w temperaturze 45 °C. Zakończyć reakcję Cel-1 przez dodanie 2,5 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0).
    UWAGA: Endonukleaza Cel-1 może być ekstrahowana ze świeżych łodyg selera przy użyciu protokołu wykonanego przez Tilla i wsp.19 Bardzo ważne jest przetestowanie aktywności i optymalnej ilości endonukleazy Cel-1, którą można przetestować przy użyciu wcześniej scharakteryzowanych mutantów lub dostępnego na rynku zestawu do wykrywania mutacji.
  9. Uruchom produkty poddane działaniu Cel-1 na 3,0% żelu agarozowym pod napięciem 100 V przez 2,5 godziny. Studzienki zawierające mniejsze i unikalne rozszczepione prążki, oprócz nierozszczepionych prążków o pełnej długości, będą zawierały próbkę zmutowanego DNA.
  10. Denconvolute pule mutantów.
    1. Wykonaj kroki 3.6, 3.7, 3.8 i 3.9 dla poszczególnych próbek DNAM2 stanowiących pule mutantów zidentyfikowane w kroku 3.9.
    2. Aby określić zygotyczność mutantów, należy przeprowadzić dwie reakcje PCR (zgodnie z opisem w kroku 3.6) dla pojedynczego DNAM2, w których pierwsza reakcja zawiera 2,5 μlM2 DNA i 2,5 μl DNA typu dzikiego, a druga reakcja zawiera tylko 5 μlM2 DNA. Jeśli mutacja jest heterozygotyczna, w obu reakcjach będzie obecny dodatkowy rozszczepiony prążek. Z drugiej strony, dodatkowe rozszczepione prążki zostaną znalezione tylko w pierwszej reakcji, jeśli mutant jest homozygotyczny.
  11. Aby określić charakter mutacji, należy zsekwencjonować produkty PCR potwierdzonych mutantów za pomocą platformy sekwencjonowania Sangera zgodnie z instrukcjami producenta.

4. Obliczanie częstości mutacji

UWAGA: Częstotliwość mutacji w populacji TILLING odnosi się do średniej fizycznej odległości, na której występuje jedna mutacja u osobników z tej populacji. Na przykład częstość mutacji 1/35 kb w populacji TILLING oznacza, że przeciętny osobnik z tej populacji posiada 1 mutację na każde 35 kb w genomie.

  1. Aby określić częstość mutacji w populacji TILLING, należy obliczyć całkowitą liczbę przebadanych zasad.
  2. Aby obliczyć całkowitą liczbę przebadanych zasad, pomnóż wielkość produktu PCR przez całkowitą liczbę osób poddanych badaniom przesiewowym.
  3. Podziel całkowitą liczbę zasad poddanych badaniu przesiewowemu przez liczbę unikalnych mutacji zaobserwowanych przy użyciu następującego równania, co da region fizyczny posiadający 1 mutację w danej populacji TILLING:
    figure-protocol-2
    UWAGA: Aby uwzględnić ograniczenie rozdzielczości do 50 pz na obu końcach w oparciu o platformę na bazie żelu agarozowego, odejmij 100 pz od rozmiaru produktu w obliczeniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje krzywą dawkowania heksaploidalnej odmiany pszenicy chlebowej Jagger, diploidalnej pszenicy Triticum monococcum6, oraz dawcy genomu pszenicy Aegilops tauschii7. Dawki EMS dla pożądanych 50% wskaźników przeżycia wynosiły odpowiednio około 0,25%, 0,6% i 0,7% dla T. monococcum, Ae. tauschii i T. aestivum. Wyższa tolerancja EMS pszenicy heksaploidalnej w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TILLING jest bardzo cennym narzędziem genetyki odwrotnej do walidacji genów, zwłaszcza w przypadku małych ziaren, w przypadku których podejścia oparte na transformacji mają poważne wąskie gardła11. Opracowanie mutagenizowanej populacji o wysokiej częstości mutacji jest jednym z kluczowych kroków w prowadzeniu badań genomiki funkcjonalnej. Najważniejszym krokiem w rozwoju silnej populacji TILLING jest określenie optymalnego stężenia EMS. Stwierdzono, że wskaźnik przeżycia 40%-60% w grupie M1 <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez USDA National Institute of Food and Agriculture, projekt Hatch 1016879 oraz Maryland Agricultural Experiment Station poprzez MAES Grant No. 2956952.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96 dołków 1,1 ml mikroprobówek w mikrostojakachNational ScientificTN0946-08RDo zbierania tkanek liści
Agaroza I klasa biotechnologicznaVWR0710-500G
Biosprint 96 DNA Plant KitQiagen941558Kit do ekstrakcji DNA
Endonukleaza Cel-1Ekstrahowana zgodnie z opisem Tilla i wsp. 2006Endonukleaza specyficzna dla pojedynczej nici
Wirówka 5430 REppendorf
Metanosulfonian etyluSigma AldrichM-0880-25GEMS - Chemiczny mutagen
System zamrażania na sucho/skorupieLabconcoDo liofilizacji tkanek liści
System oczyszczania Kingfisher FlexThermo fisher 5400610 Robot doekstrakcji DNA o wysokiej przepustowości
Mój Taq DNA PolimerazaBiolineBIO-21107
Woda wolna od nukleazSigma aldrichW4502-1L
Syngene
Orbit Environ-shakerLab-line
SPECTROstar NanoBMG LABTECHdo oznaczania DNA
T100 TermocyklerBIO-RAD1861096
System obrazowania żelowego Nano kropla

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
  2. Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
  3. Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
  4. Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
  5. Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
  6. Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205(2012).
  7. Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
  8. Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
  9. Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
  10. Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
  11. Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
  12. Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
  13. Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115(2009).
  14. Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
  15. Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
  16. Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
  17. Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268(2017).
  18. Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
  19. Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
  20. Wu, J. -L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
  21. Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
  22. Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
  23. Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  24. Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
  25. Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Populacja TILLINGmutagenza EMStest Cel 1krzywa dawka odpowieddetekcja mutacjiekstrakcja DNAamplifikacja PCRelektroforeza w elu agarozygenomika funkcjonalna

Powiązane artykuły