Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

24.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59758

⸱

2 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Science and Molecular Medicine, Michigan State University, 2The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, 3Neuroscience Program, Michigan State University, 4Center for Neurodegenerative Disease Research, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 5Center for Neurodegeneration and Experimental Therapeutics, University of Alabama at Birmingham, 6Mercy Health Hauenstein Neuroscience Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego artykułu jest nakreślenie kroków wymaganych do wytworzenia włókienek z monomerycznej alfa-synukleiny, późniejszej kontroli jakości i użycia wstępnie uformowanych włókienek in vivo.

Streszczenie

Wykorzystanie modelu in vivo synukleinopatii z fibrylu alfa-synukleiny (α-syn PFF) zyskuje na popularności wśród badaczy dążących do modelowania synukleinopatii choroby Parkinsona i zwyrodnienia nigrostriatalnej. Standaryzacja generowania α-syn PFF i aplikacji in vivo ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia spójnej, solidnej patologii α-syn. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania włókienek z monomerycznej α-syn, etapy kontroli jakości po fibrylacji oraz sugerowane parametry skutecznego neurochirurgicznego wstrzykiwania α-syn PFF szczurom lub myszom. Począwszy od monomerycznej α-syn, fibrylacja zachodzi w ciągu 7-dniowego okresu inkubacji podczas wstrząsania w optymalnych warunkach buforowych, stężeniu i temperaturze. Kontrola jakości po fibrylacji jest oceniana na podstawie obecności włókienek granulowanych za pomocą testu sedymentacji, tworzenia konformacji amyloidu w włókienkach za pomocą testu tioflawiny T oraz wizualizacji włókienek pod mikroskopem elektronowym. Podczas gdy pomyślna walidacja przy użyciu tych testów jest niezbędna do osiągnięcia sukcesu, nie są one wystarczające, aby zagwarantować, że PFF zapoczątkują inkluzje α-syn w neuronach, ponieważ taka aktywność agregacji każdej partii PFF powinna być testowana w hodowli komórkowej lub w kohortach zwierząt pilotażowych. Przed użyciem PFF muszą zostać poddane sonikacji w ściśle znormalizowanych warunkach, a następnie badaniom za pomocą mikroskopii elektronowej lub dynamicznego rozpraszania światła, aby potwierdzić, że długości włókien mieszczą się w optymalnym zakresie wielkości, przy średniej długości 50 nm. PFF mogą być następnie dodawane do pożywek do hodowli komórkowych lub stosowane u zwierząt. Patologia wykrywalna przez barwienie immunologiczne dla fosforylowanego α-syn (psyn; seryna 129) jest widoczna kilka dni lub tygodni później odpowiednio w hodowlach komórkowych i modelach gryzoni.

Wprowadzenie

Choroba Parkinsona (PD) charakteryzuje się przede wszystkim pośmiertną charakterystyką dwóch głównych cech patologicznych: rozległą i postępującą patologią alfa-synukleiny (α-syn) oraz zwyrodnieniem nigrostriatalnym. Po wstrzyknięciu myszom lub szczurom typu dzikiego, α-syn preformowane fibryle (PFF) indukują postępującą akumulację patologicznej α-syn, co może skutkować przedłużającą się degeneracją neuronów dopaminowych istoty czarnej pars compacta (SNpc) w ciągu wielu miesięcy, a także deficytami sensomotorycznymi1,2,3,4,5,6. Neurony są wystawione na działanie włókien α-syn, albo poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie domózgowe, albo dodane do pożywki hodowanych neuronów. Kiedy PFF są wprowadzane do neuronów, PFF działają, aby "zasiać" tworzenie inkluzji poprzez szablonowanie i akumulację endogennego α-syn do fosforylowanych inkluzji1,7,8,9. Inkluzje mają podobne właściwości do ciał Lewy'ego: zawierają α-syn fosforylowany w serynie 129 (pSyn), ubikwitynę i p62; posiadają czwartorzędowe struktury amyloidowe, jak wykazano w przypadku dodatniego barwienia tioflawiną; i są odporne na trawienie proteinazy K1,3,5,7,8,9,10,11,12. Ekspozycja na PFF prowadzi do powstania inkluzji α-syn w pierwotnych i niektórych unieśmiertelnionych neuronach w hodowli, a także u myszy, szczurów i naczelnych in vivo1,2,3,4,5,6,7,8,9,13. Ważne jest, aby pamiętać, że PFF nie doprowadzą do powstania inkluzji α-syn we wszystkich modelach hodowli komórkowych, a niektóre hodowane neurony będą się lepiej wysiewać niż inne.

Inną ważną cechą modelu PFF in vivo α-syn są wyraźne sekwencyjne fazy patologiczne, które pojawiają się w ciągu kilku miesięcy. U gryzoni, po wstrzyknięciu śródprążkowiowym, tworzenie inkluzji α-syn zwykle osiąga szczyt w SNpc i wielu regionach korowych w ciągu 1-2 miesięcy. Po tym szczycie agregacji następuje zwyrodnienie nigrostriatalne ≈2-4 miesiące później1,3,5. Te odrębne etapy patologiczne zapewniają naukowcom platformę, za pomocą której mogą badać i opracowywać strategie, które 1) zmniejszają agregację α-syn, 2) usuwają już powstałe inkluzje α-syn i/lub 3) zapobiegają późniejszej neurodegeneracji. Model PFF ma wyraźne zalety i wady w porównaniu z modelami nadekspresji α-syn za pośrednictwem wektorów neurotoksycznych, transgenicznych i wirusowych, jak wcześniej recenzowano6. Wybór modelu lub podejścia powinien być uzależniony od tego, który model najlepiej odpowiada pytaniu, które zadają sobie badacze.

Chociaż model PFF został z powodzeniem wykorzystany przez wiele laboratoriów, nadal istnieją grupy, które doświadczyły niespójności w generowaniu włókienek i wytwarzaniu spójnych α-syn patologii14. Przykłady niespójności obejmują PFF, które wytwarzają niewielką lub żadną patologię α-syn, wydajność wysiewu z partii na partię, a nawet niepowodzenie w tworzeniu włókienek. W związku z tym standaryzacja generowania α-syn PFF i stosowania in vivo ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić dokładną interpretację wpływu nowych interwencji terapeutycznych. Poniższy protokół przedstawia kroki wymagane do wytworzenia PFF z monomerów α-syn, kontrolę jakości in vitro PFF po utworzeniu, sonikację i pomiar PFF przed użyciem oraz sugestie ułatwiające skuteczne wstrzyknięcie PFF in vivo szczurom lub myszom.

Protokół

Wszystkie metody z wykorzystaniem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Michigan.

1. Tworzenie preformowanych włókien α-synucleiny z monomerów (Rycina 1)

  1. Rozmrozić monomery α-synukleiny na lodzie, delikatnie resuspendować poprzez lekkie potrząsanie probówką i odwirować przy 15 0 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Monomer α-synucleiny musi zostać specjalnie sformułowany w celu przeprowadzenia fibrylizacji. Monomery rekombinowane można nabyć z komercyjnych źródeł lub wytworzyć zgodnie z protokołami wewnątrz laboratorium.4,9,14,15W przypadku zakupu z komercyjnych źródeł, produkt musi posiadać informację, że monomer $\alpha$-syn służy specjalnie do generowania włókien. Niezależnie od tego, czy monomery zostały zakupione, czy przygotowane na miejscu, w przypadku każdej partii należy przeprowadzić opisane poniżej kroki kontroli jakości, aby upewnić się, że włókna zostały utworzone i będą efektywnie inicjować agregację przed użyciem w eksperymentach.
  2. Przenieś supernatant do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i zapisz objętość przeniesionego płynu.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie naruszyć osadu, który w razie jego obecności będzie niewielki.
  3. Zmierz stężenie białka w przeniesionym supernatancie, stosując standardowy test kwasu bicinchonininowego (BCA) lub mierząc absorbancję przy 280 nm za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru.
    UWAGA: Metoda BCA nie jest na tyle dokładna w specyficznym pomiarze α-syn i może prowadzić do wyników zawyżających stężenie białka. W związku z tym zalecaną metodą określania stężenia białka jest pomiar absorbancji przy 280 nm.
    1. Aby przeprowadzić pomiar za pomocą testu BCA, należy postępować zgodnie ze standardowymi protokołami BCA, wykorzystując trzy różne rozcieńczenia monomeru α-syn. Sugerowane rozcieńczenia to 1:25, 1:50 i 1:10.
    2. Aby przeprowadzić pomiar metodą A280, należy wyzerować czytnik, używając sterylnego 1x Dulbecco’s phosphate buffered saline (dPBS) bez dodatku wapnia i magnezu, o stężeniu soli NaCl około 10 mM i pH w zakresie 7,0–7,3 (Tabela materiałów).
    3. Dodaj 2 µL próbki do kuwety i odczytać absorbancję przy 280 nm.
    4. Należy wykorzystać prawo Beer-Lambert do wyznaczenia stężenia monomerów.
      Równanie wzoru na stężenie; absorbancja przy 280 nm; analiza spektroskopowa; obliczenia biochemiczne.
      UWAGA: Współczynnik ekstynkcji ε dla ludzkiej $\alpha$-synukleiny wynosi 5 960 $\text{M}^{-1}\text{cm}^{-1}$-1cm-1 a dla mysiej α-syn wynosi 7,450 M1cm-1Długość drogi optycznej mierzona jest w cm. Masę cząsteczkową $\alpha$-syn (14 kDa) oszacowano przy założeniu, że 1 Da = 1 g/mol.
  4. Rozcieńczyć monomery w 1x dPBS do stężenia końcowego 5 mg/ml. Do obliczenia ilości dPBS 1x niezbędnej do rozcieńczenia monomerów należy użyć poniższego równania.
    Wzór na obliczenie objętości dla przygotowania monomeru w eksperymencie polimeryzacyjnym; równanie przedstawia stosunek.
    UWAGA: Wszystkie stężenia podano w mg/ml, a objętości w µLRozcieńczanie monomerów należy przeprowadzać w 1x dPBS. Całkowita objętość użyta do wytworzenia fibryli powinna wynosić od 100 do 500 µL aby uzyskać powtarzalne wyniki fibrylizacji.
  5. Krótko wymieszać na wirówce typu vortex, a następnie odwirować, aby zebrać całą ciecz na dnie probówki. Odmierzyć alikwoty monomerów do porównania w ramach kontroli jakości z fibryllami, zgodnie ze wskazówkami w krokach 1.8.1 – 1.8.4.
  6. użyć blokady probówki lub folii woskowej/plastikowej (Tabela materiałów), aby zabezpieczyć zamknięcie pokrywy probówki do mikrowirówki.
  7. Umieść probówkę w orbitalnym termomikserze z pokrywą na 7 dni w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 10 obr./min (Tabela materiałów).
    UWAGA: Po upływie 7 dni zawartość probówki powinna być mętna. Thermomixer musi posiadać pokrywę, aby zapobiec skraplaniu się pary wodnej na nakrętkach probówek.
  8. Delikatnie potrząśnij probówką, aby resuspendować włókna α-syn. Pobierz aliquoty włókien do następnych etapów kontroli jakości, zgodnie ze wskazówkami w krokach 1.8.1 – 1.8.4.
    UWAGA: Fibryle do etapów kontroli jakości można przechowywać w temperaturze pokojowej przez noc.
    1. Aliquota 6 µL do testu sedymentacyjnego.
    2. Aliquota 5 µL do analizy wiązania tioflawiny T.
    3. Aliquota 2 µL do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu wizualizacji fibryl.
    4. Odpowiednio odmierzyć co najmniej 10 µL do analizy endotoksyn.
      UWAGA: Do testu na obecność endotoksyn stosuje się komercyjny odczyn LAL (Limulus Amebocyte Lysate), zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów). Poziom endotoksyn dla fibryli powinien wynosić ≤0,5 jednostek endotoksyn/ml. W przypadku niespełnienia tego kryterium można zastosować zestaw do usuwania endotoksyn.
  9. Podziel pozostałe włókna na alikwoty i przechowuj. W przypadku długotrwałego przechowywania (12–18 miesięcy) szybko zamroź na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Ilość pobranej porcji zależy od planowanego zastosowania w dalszych etapach analizy. Zastosowania in vivo zazwyczaj wymagają większej ilości włókien w wyższych stężeniach niż zastosowania in vitro, dlatego objętości porcji należy zaplanować odpowiednio. Włókna powinny być przechowywane w głębi zamrażarki, aby zapobiec uszkodzeniom wynikającym z potencjalnych cykli zamrażania i rozmrażania. Na tym etapie można przerwać protokół.

2. Analiza sedymentacji

  1. W czystej probówce do mikrocentryfugi dodać 6 µL PFF do 54 µL dPBS w celu rozcieńczenia fibryli 1:10, a następnie wymieszać pipetą.
    1. W oddzielnej probówce dodać 6 µL monomeru do 54 µL dPBS jako dodatkową próbę kontrolną.
  2. Próbki odwirować przy 10 0 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT) i przenieść nadfiltr do czystej probówki do mikrocentryfugi.
  3. Do pozostałego osadu dodać 60 µL dPBS i wymieszać na wortexie w celu resuspensji.
  4. Do każdej probówki dodać 30 µL 3x buforu do próbek (140 µL 50% glicerolu/0,1% błękitu bromofenolowego, 40 µL 10% SDS oraz 20 µL β-merkaptoetanolu) i wymieszać na wortexie.
  5. Próbki inkubować w temperaturze 10 °C przez 10 min, a następnie schładzać przez 5 min na lodzie.
  6. Zastosować standardowy protokół elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), aby rozdzielić białka według masy. Użyć drabinki białkowej o zakresie obejmującym 14 kDa (przewidywana wielkość prążka dla monomerycznej α-syn).
  7. Przenieść żel do kuwety do barwienia i przykryć go barwnikiem Coomassie blue (0,1% Coomassie brilliant blue, 20% metanolu objętościowo i 10% kwasu octowego objętościowo w ddH2O). Inkubować przez 3 h w RT przy ciągłym wstrząsaniu.
  8. Zlać barwnik Coomassie blue i dodać wystarczającą ilość odbarwiacza (50% metanolu objętościowo i 10% kwasu octowego objętościowo w ddH2O), aby przykryć żel. Inkubować przez 30 min w RT przy wstrząsaniu.
  9. Zlać odbarwiacz i powtarzać etap odbarwiania do momentu, aż żel stanie się przejrzysty, a prążki będą widoczne.
  10. Przemyć żel 3 razy po 5 min w ddH2O przy wstrząsaniu, a następnie wykonać obrazowanie żelu.

3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa do wizualizacji włókien

  1. Odważ 20 mg octanu uranylu do probówki do mikrowirówki i dodaj 1 mL ddH2O, aby przygotować 2% roztwór wodny. Mieszaj w wirówce typu vortex do rozpuszczenia octanu uranylu, a następnie pozostaw na noc.
    UWAGA: Octan uranylu należy przygotować dzień przed przygotowaniem próbek do transmisyjnej elektronowej mikroskopii. Ekspozycja na światło lub wstrząsanie mogą spowodować wytrącenie octanu uranylu, dlatego probówkę z roztworem octanu uranylu należy owinąć folią aluminiową, przechowywać w ciemnym miejscu i nie wstrząsać po rozpuszczeniu substancji.
  2. Dodaj 2 µL PFF do 98 µL dPBS, aby rozcieńczyć włókna w stosunku 1:50, a następnie wymieszaj za pomocą pipety.
  3. Przygotuj na blacie powierzchnię (około 50 mm x 50 mm) pokrytą czystą folią woskową/plastikową (Tabela materiałów). Na czystej folii woskowej/plastikowej (Tabela materiałów) nanieś następujące krople (Rysunek 2).
    1. Nanieś 4 krople ddH2O po 10 µL każda.
    2. Nanieś 1 kroplę (10 µL) rozcieńczonych włókien lub próbki monomeru.
    3. Nanieś 2 krople 2% octanu uranylu po 10 µL każda.
  4. Używając pęsety z cienkimi końcówkami, pobierz miedzianą siatkę do transmisyjnej mikroskopii elektronowej pokrytą formwarem/węglem (Tabela materiałów).
    UWAGA: Należy chwytać siatkę wyłącznie za krawędź, unikając dotykania części siateczkowej w centrum (Rysunek 2A). Jeśli pęseta dotknie siatki, warstwa formvaru/węgla zostanie uszkodzona, co uniemożliwi obrazowanie w tym obszarze.
  5. Umieść siatkę stroną pokrytą formwarem/węglem (stroną błyszczącą) skierowaną w dół na pierwszej kropli ddH2O. Delikatnie przytrzymaj siatkę pęsetą i dociśnij, aby upewnić się, że cała pokryta powierzchnia ma kontakt z ddH2O. Pozostaw siatkę na 1 min.
  6. Podnieś siatkę i, nie dotykając jej części siateczkowej, odsącz ddH2O za pomocą papieru filtracyjnego.
  7. Umieść siatkę w ten sam sposób na drugiej kropli ddH2O na 1 min, a następnie odsącz ddH2O.
  8. Umieść siatkę na kropli rozcieńczonych włókien na 1 min i odsącz nadmiar w opisany wyżej sposób.
  9. Umieść siatkę na pierwszej kropli octanu uranylu na 1 min i odsącz nadmiar.
  10. Umieść siatkę na drugiej kropli octanu uranylu na 1 min, a następnie odsącz nadmiar.
  11. Umieść siatkę w ten sam sposób na trzeciej kropli ddH2O na krótką chwilę i odsącz ddH2O.
  12. Umieść siatkę w ten sam sposób na czwartej kropli ddH2O na krótką chwilę i odsącz ddH2O, dbając o usunięcie jak największej ilości ddH2O.
  13. Przenieś do pudełka na siatki i przechowuj do czasu obrazowania.
    UWAGA: Siatki powinny schnąć przez co najmniej 5 min przed obrazowaniem. Przygotowane siatki można obrazować przez co najmniej rok, pod warunkiem przechowywania ich w suchym środowisku.

4. Analiza z użyciem tioflawiny T

  1. Do czystej probówki do mikrocentryfugi dodać 5 µL PFF do 245 µL dPBS, aby rozcieńczyć włókna w stosunku 1:50, a następnie wymieszać pipetą.
  2. Do oddzielnej probówki do mikrocentryfugi dodać 250 µL dPBS, która posłuży jako kontrola negatywna.
  3. Dodać 5 µL monomeru do 245 µL dPBS, aby przygotować kontrolę monomeru.
  4. Do każdej próbki dodać 250 µL tioflawiny T w buforze glicynowym (25 µM tioflawiny T, 10 mM glicyny, 1% Triton X-10, pH 8.5) i delikatnie wymieszać.
  5. Przenieść 2 powtórzenia po 20 µL każde do czarnej płytki 96-dołkowej. Płytkę przechowywać w ciemności, aby zapobiec fotobleakingu.
  6. Inkubować przez 1 h w RT i odczytać wyniki z płytki, stosując wzbudzenie 450 nm i emisję 510 nm.
    UWAGA: Odczyty tioflawiny T będą zmieniać się w czasie. Próbki należy odczytywać po tym samym czasie inkubacji. W razie potrzeby można wykonać wielokrotne odczyty podczas godzinnej inkubacji i przedstawić je na wykresie w funkcji czasu.

5. Sonikacja preformowanych włókien α-synukleiny

OSTREŻENIE: Sonikator oraz wszystkie etapy sonikacji należy obsługiwać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zapobiec ekspozycji na fibryle, które mogą ulec aerozolizacji podczas procesu. Osoba przeprowadzająca sonikację powinna stosować środki ochrony osobistej, w tym rękawiczki, odzież ochronną w postaci fartucha laboratoryjnego oraz osłonę twarzy podczas pracy z urządzeniem. Ryzyko ekspozycji na fibryle można zminimalizować, stosując sonikator z końcówką typu „cup horn”, co pozwala na pozostawienie probówki z fibrylami zamkniętej podczas sonikacji.

UWAGA: Optymalne parametry sonikacji włókien zależą od modelu zastosowanego sonikatora. Z tego powodu konieczne będzie przeprowadzenie optymalizacji w celu zapewnienia uzyskania włókien o odpowiedniej wielkości. Informacje o zastosowanym sonikatorze znajdują się w Tabela materiałów a przedstawione parametry opierają się na poprzednich wynikach uzyskanych przy użyciu tego modelu sonikatora. Poniższe parametry będą odpowiednie dla 2-4 µg/µL PFF w 20-400 µL roztworu. Przed wykorzystaniem PFF w eksperymentach należy przeprowadzić test sonikacji za pomocą używanego urządzenia oraz przeanalizować fibryle, aby upewnić się, że osiągnięto pożądane wyniki.

  1. Przymocuj sondę o średnicy 3,2 mm (Tabela materiałów) do przetwornika i ustaw parametry sonikatora zgodnie z opisem w krokach 5.1.1 – 5.1.3 poniżej.
    1. Ustaw amplitudę na 30%.
    2. Ustaw impulsy na 01 01 (1 s włączone; 1 s wyłączone).
    3. Ustaw czas na 0:01:0.
      UWAGA: 1 min impulsowania odpowiada 60 impulsom, a ten model sonikatora (Tabela materiałów) zatrzyma się automatycznie. W przypadku innych modeli sonikatorów należy samodzielnie odliczyć liczbę impulsów.
  2. Rozmroź włókna w temperaturze pokojowej i rozcieńcz sterylnym dPBS w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    UWAGA: Do sonikacji najlepiej nadają się przezroczyste probówki do mikrocentryfugi o objętości 0,6 mL; końcowe stężenie włókien zależy od zamierzonego zastosowania. Przedstawione reprezentatywne wyniki uzyskano przy końcowym stężeniu włókien 4 µg/µL.
  3. Przetrzyj sondę sonikatora chusteczką laboratoryjną zwilżoną 70% etanolem w celu jej oczyszczenia. Zanurz końcówkę sondy w ddH2O i wykonaj 10 impulsów, aby dodatkowo oczyścić sondę, a następnie wytrzyj ją do sucha chusteczką laboratoryjną.
  4. Włóż końcówkę sondy do probówki z rozcieńczonymi włóknami, umieszczając końcówkę na dnie probówki.
  5. Sonicuj przez 60 impulsów (1 s włączone; 1 s wyłączone). Podczas każdego impulsu przesuwaj sondę w górę i w dół, aby upewnić się, że wszystkie włókna w cieczy zostały poddane sonikacji i oczyszczone.
  6. Po 60 impulsach wyjmij sondę z PFF, a następnie dodaj 2 µL PFF do 98 µL dPBS w czystej probówce do mikrocentryfugi, aby rozcieńczyć włókna w stosunku 1:50 do pomiaru sonikowanych włókien za pomocą mikroskopii elektronowej.
    UWAGA: Idealnie byłoby zmierzyć niewielką podgrupę włókien przed wstrzyknięciem in vivo, a bardziej szczegółowy pomiar włókien przeprowadzić w późniejszym terminie.
  7. Po sonikacji krótko odwiruj PFF przez 1 s przy 2 0 x g, aby zebrać cały płyn ze ścianek probówki.
    OSTROŻNIE: Jeśli probówka stanie się gorąca w dotyku, przerwij sonikację po 30 impulsach, odczekaj 1 min, a następnie wykonaj pozostałe 30 impulsów.
    UWAGA: Podczas sonikacji na początku każdego impulsu trzymaj końcówkę sondy blisko dna cieczy; zbyt bliskie umieszczenie końcówki przy powierzchni cieczy spowoduje utratę próbki.
  8. Zanurz końcówkę sondy w 1% SDS i wykonaj 10 impulsów, aby oczyścić sondę. Wyjmij końcówkę z SDS, zanurz ją w ddH2O i wykonaj 10 impulsów.
  9. Przetrzyj sondę chusteczką laboratoryjną zwilżoną 70% etanolem, a następnie wytrzyj ją suchą chusteczką laboratoryjną. Odłącz sondę od przetwornika i schowaj.
  10. Przetrzyj wszystkie powierzchnie w komorze 1% SDS, a następnie 70% etanolem.
    UWAGA: Roztwór 1% SDS służy do dysocjacji włókien oraz czyszczenia powierzchni i sprzętu16.

6. Transmisyjna mikroskopia elektronowa do pomiaru sonikowanych fibryli

UWAGA: Jeśli mikroskopia elektronowa nie jest możliwa do zastosowania, w celu pośredniego pomiaru wydajności inicjacji procesu tworzenia włókien oraz wielkości włókien można wykorzystać analizę kinetyki tioflawiny T oraz dynamiczne rozpraszanie światła4,14.

  1. Przygotować próbki zgodnie z protokołem opisanym w powyższej sekcji „Mikroskopia elektronowa w wizualizacji włókien”.
  2. Użyć transmisyjnego mikroskopu elektronowego do wykonania obrazów włókien z 6 do 10 różnych pól siatek.
    UWAGA: Powiększenie obrazów powinno być wystarczająco duże, aby zmierzyć włókna, ale jednocześnie na tyle niskie, aby umożliwić jednoczesną wizualizację wielu włókien. Powiększenie końcowe wynoszące około 75,00x powinno być wystarczające.
  3. Przed wykorzystaniem włókien w eksperymencie zmierzyć długość niewielkiej podgrupy obejmującej co najmniej 25 włókien.
    UWAGA: Pomiary te można zazwyczaj przeprowadzić przy użyciu oprogramowania do obrazowania powiązanego z mikroskopem. W celu szybkiej walidacji osoba wykonująca pomiary powinna wybrać reprezentatywne włókna i obliczyć ich średnią wielkość. Średnia długość włókien powinna wynosić około 50 nm lub mniej, a następnie należy przeprowadzić dokładniejszy pomiar.
  4. Zmierzyć długość ponad 500 włókien w celu uzyskania bardziej kompleksowych wyników.
    UWAGA: Do pomiarów włókien można wykorzystać oprogramowanie do obrazowania powiązane z mikroskopem. Alternatywnie obrazy można otworzyć i zmierzyć włókna za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu, używając paska skali przypisanego do każdego obrazu jako referencji wielkości do porównania długości włókien.

7. Przygotowanie niestandardowych strzykawek z igieł szklanych do wstrzyknięć stereotaktycznych (Rysunek 3)

  1. Do czystego zlewka o pojemności 50 mL wlej około 10 mL odczynnika do silikonizacji (Tabela materiałów).
  2. Umieść szklane kapilary (długość 54 mm; średnica zewnętrzna: 0,86 mm; średnica wewnętrzna 0,59 mm) pionowo w zlewce z odczynnikiem do silikonizacji i pozwól, aby siły kapilarne wciągnęły odczynnik do wnętrza rurki przez dolny otwór zanurzony w odczynniku.
  3. Za pomocą pipety dodaj dodatkowy odczynnik do silikonizacji do górnego otworu rurki (niezanurzonego w odczynniku), aby całkowicie wypełnić szklaną kapilarę.
  4. Wyjmij kapilary z odczynnika i osusz ich otwarte końce ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar odczynnika z rurek. Pozostaw kapilary do wyschnięcia na co najmniej 8 godzin.
  5. Umieść zsilikonizowaną szklaną kapilarę w wyciągarce do szklanych igieł (Tabela materiałów).
  6. Włącz element grzejny i pozwól, aby przymocowane obciążniki rozciągnęły podgrzaną szklaną kapilarę.
  7. Przetnij rozciągniętą szklaną kapilarę nożyczkami w najcieńszym punkcie w środku i wyjmij szklaną igłę z wyciągarki.
    UWAGA: Średnica wewnętrzna i zewnętrzna wyciągniętej igły powinna wynosić odpowiednio około 80 i 100 µm. Można przygotować wiele szklanych igieł jednocześnie i przechowywać je do czasu zamocowania w szklanej strzykawce z dołączoną metalową igłą (Tabela materiałów).
  8. Utnij nożyczkami fragment rurki termokurczliwej (średnia średnica wewnętrzna 0,021" i średnia grubość ścianki 0,01") o długości około 40 mm. Nasuń rurkę termokurczliwą na metalową igłę strzykawki ściętej o pojemności 10 µL (Tabela materiałów).
  9. Użyj otwartego płomienia, aby podgrzać i przytwierdzić rurkę termokurczliwą do igły, obracając igłę w celu równomiernego rozprowadzenia ciepła.
  10. Ostrożnie nasuń szerszy koniec wyciągniętej szklanej igły na metalową igłę strzykawki.
  11. Utnij nożyczkami fragment rurki termokurczliwej (średnia średnica wewnętrzna 0,036" i średnia grubość ścianki 0,05") o długości około 40 mm i ostrożnie nasuń ją na szklaną igłę tak, aby pokrywała podstawę szklanej igły oraz metalową igłę strzykawki (Tabela materiałów). Użyj otwartego płomienia, aby podgrzać rurkę i zabezpieczyć szklaną igłę na metalowej igle.
  12. Nałóż dodatkową warstwę rurki termokurczliwej, aby lepiej zabezpieczyć szklaną igłę. Utnij nożyczkami fragment rurki termokurczliwej (średnia średnica wewnętrzna 0,04" i średnia grubość ścianki 0,005") o długości około 40 mm i ostrożnie nasuń ją na szklaną igłę tak, aby pokrywała podstawę szklanej igły oraz metalową igłę strzykawki (Tabela materiałów). Użyj otwartego płomienia, aby podgrzać rurkę i zabezpieczyć szklaną igłę na metalowej igle.
  13. Przytnij szklaną igłę nożyczkami tak, aby grocik miał długość około 8 mm.
    UWAGA: Igła musi być wystarczająco długa, aby dotrzeć do wybranych obszarów mózgu (wymagana długość zależy od współrzędnych grzbietowo-brzusznych).
  14. Wykonaj kroki 7.14.1 – 7.14.3, aby przetestować igłę pod kątem szczelności oraz prawidłowego przepływu cieczy podczas pobierania i podawania z szklanej igły.
    1. Wypełnij strzykawkę 1 mL z dołączoną igłą 26 G wodą dH2O.
    2. Wyjmij metalowy tłok z niestandardowej strzykawki z szklaną igłą i włóż igłę strzykawki wypełnionej dH2O do podstawy strzykawki. Przyłóż nacisk, aby podać dH2O przez szklaną igłę. Sprawdź miejsce styku szklanej igły i metalowej igły pod kątem nieszczelności i potwierdź stały przepływ dH2O.
      UWAGA: W razie potrzeby można przyciąć szklaną igłę, aby ułatwić przepływ, oraz dodać dodatkowe warstwy rurki termokurczliwej, aby uszczelnić ewentualne przecieki u podstawy szklanej igły.
    3. Napełnij probówkę do mikrowirówki wodą dH2O. Za pomocą niestandardowej strzykawki z szklaną igłą pobierz dH2O. Sprawdź igłę, aby upewnić się, że ciecz jest wciągana do strzykawki i nie ma pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Jeśli pojawiają się pęcherzyki lub dH2O nie jest wciągana do igły, przycięcie igły może pomóc zmniejszyć opór.
  15. Ostrożnie przechowuj strzykawki z zamocowanymi szklanymi igłami w pudełkach do strzykawek aż do czasu operacji.
  16. Zastosuj standardowe metody chirurgii stereotaktycznej do podawania PFF do prążkowia w zoptymalizowanych współrzędnych u myszy (jedno miejsce: AP +0,2 mm i ML +2,0 mm od bregmy, DV -2,6 mm od twardówki) lub u szczurów (dwa miejsca: AP +1,6 mm i ML +2,0 mm od bregmy, DV -4,0 od twardówki; AP +0,1 mm i ML +4,2 mm od bregmy, DV -5,0 od twardówki)1,14,17.
    UWAGA: Współrzędne te były stosowane u myszy C57BL6/C3H oraz szczurów Fischer 34. W przypadku stosowania innych szczepów współrzędne powinny zostać zoptymalizowane.

Wyniki

Generowanie włókien z monomerów α-syn rozpoczyna się od oznaczenia stężenia monomerów. Do pomiaru zawartości białka można zastosować zarówno test BCA, jak i pomiar absorbancji przy 280 nm (A280); jednak wyniki testu BCA sugerowały wyższe stężenie niż metoda A280. PFF pochodzące z mysiego monomeru α-syn miały wartość BCA wynoszącą 14,05 ± 0,2 oraz A280 wynoszącą 8,05 ± 0,03 µg/µL (Rysunek 1). Podobnie PFF pochodzące z ludzkiego monomeru α-syn również wydawały się mieć wyższe stężenie, z wartością BCA 12,95 ± 0,38 i A280 7,83 ± 0,05 µg/µL (Rysunek 1). Pomiary A280 są specyficzne dla α-syn dzięki uwzględnieniu współczynników ekstynkcji i to te wyniki wykorzystano do rozcieńczenia monomerów przed 7-dniową inkubacją.

Przed inkubacją ciecz zawierająca monomery α-syn była klarowna, jednak po wytworzeniu się fibryl powinna stać się mętna. Badanie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej potwierdziło obecność długich fibryli o szerokości 10-20 nm (Rycina 4). W porównaniu z nimi monomery α-syn były ledwo widoczne i nie posiadały wyraźnego kształtu (Rycina 4). Po wizualnym potwierdzeniu struktur włóknistych kolejnym parametrem PFF, który należy potwierdzić, jest amyloidna konformacja fibryli, co wykonuje się za pomocą testu z tioflawiną T. Tioflawina T wykazuje wzmocnioną fluorescencję po związaniu z amyloidem, zatem zwiększony sygnał fluorescencyjny z próbek wskazuje na obecność amyloidu. Przykładowo, tioflawina w dPBS wygenerowała sygnał 3 287 ± 580 względnych jednostek fluorescencji (RFU), monomer α-syn mysi wygenerował sygnał 4 174 ± 158 RFU, a mysie PFF wygenerowały sygnał 59 754 ± 6 24 RFU (Rycina 5). Dla porównania, ludzki monomer α-syn wygenerował podobny sygnał co monomer mysi, wynoszący 4 158 ± 105 RFU, natomiast ludzkie PFF wygenerowały wyższy sygnał 1 235 967 ± 13 747 RFU w porównaniu do mysich PFF (Rycina 5). Aby ocenić obecność fibryli zdolnych do sedymentacji, przeprowadzono test sedymentacyjny. Fibryle osadzają się podczas wirowania. W próbkach mysich i ludzkich PFF w frakcji nadosadu powinno znajdować się więcej białka w osadzie niż w nadosadzie (Rycina 6). W przeciwieństwie do tego, większość białka z mysich i ludzkich monomerów znajdowała się w nadosadzie, przy niewielkiej ilości w osadzie (Rycina 6). Dzięki wizualnemu potwierdzeniu obecności PFF w mikroskopii elektronowej, stwierdzeniu struktur amyloidowych oraz zdolności fibryli do sedymentacji, PFF przeszły wszystkie etapy kontroli jakości in vitro.

Zarówno mysie, jak i ludzkie PFF poddano sonikacji, aby uzyskać włókna o odpowiedniej długości do inicjowania powstawania inkluzji α-syn4,18. PFF rozcieńczono do pożądanego stężenia 4 µg/µL i poddano sonikacji. Bezpośrednio przed zabiegiem wykonano obrazowanie 25 reprezentatywnych fibryl za pomocą mikroskopii elektronowej i zmierzono je w celu doraźnej kontroli rozmiaru włókien. Sonikowane mysie PFF miały długość 48,8 ± 3,1 nm, natomiast ludzkie PFF miały długość 52,1 ± 4,4 nm; zatem PFF obu gatunków miały odpowiednią długość (50 nm lub mniej), aby wywołać aktywność zasiewania. Bardziej szczegółowa analiza około 500 fibryl pozwoliła określić średnią długość i rozkład długości sonikowanych włókien mysich. Średnia długość wynosiła 4,4 ± 0,6 nm, przy czym 86,6% PFF miało długość 60 nm lub mniej (Rysunek 4). W porównaniu z nimi ludzkie PFF miały średnią długość 5,9 ± 1,1 nm, a 69,6% PFF miało długość 60 nm lub mniej (Rysunek 4).

Po wewnątrzprążkowym wstrzyknięciu sonikowanych mysich PFF do organizmów szczurów, zgodnie z wcześniejszym opisem3,5, seria przekrojów tkanek została poddana obróbce 2 miesiące po zabiegu, kiedy liczba neuronów zawierających inkluzje w SNpc zazwyczaj osiąga szczyt, w celu potwierdzenia obecności inkluzji fosforylowanego α-syn5. Neurony z inkluzjami, wskazane przez barwienie immunohistochemiczne na pSyn (przeciwciało w Tabeli Materiałów), występują w SNpc (Rycina 7), a także w innych obszarach mózgu unerwiających prążkowie (jądro węchowe przednie, kora ruchowa, obręża, piriformowa, przedlimbiczna, somatosensoryczna, entorynalna i wyspowa, ciało migdałowate, prążkowie)1,3,4,5,19. Inkluzje te wykazują właściwości podobne do ciał Lewy'ego, takie jak wiązanie tioflawiny S oraz oporność całkowitego α-syn na proteinazę K (Rycina 7), co wykazano w barwieniu immunohistochemicznym (przeciwciało i proteinaza K w Tabeli Materiałów). Potwierdzenie siewania wewnątrz mózgu wskazuje na pomyślną kontrolę jakości in vivo, co pozwala na sonikację z tą samą partii wcześniej zamrożonych i zachowanych aliquotów PFF przy identycznych parametrach, z walidacją długości, w większych eksperymentach.

Oznaczanie stężenia białka za pomocą wirowania, testu BCA, mieszania wstrząsarzu i inkubacji; schemat.
Rycina 1Metody generowania fibryli α-syn. Schemat kroków niezbędnych do otrzymania włókien z monomerów α-syn. Monomery są wirowane przez 10 min (15 0 x g, w 4 °C). Nadpływ przenosi się do czystej probówki, a stężenie białka określa się poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm lub za pomocą testu BCA. Wykres przedstawia stężenia monomerów α-syn ludzkich i mysich. Słupki wskazują średnie grupowe, a słupki błędów reprezentują ±1 błąd standardowy średniej. Po określeniu stężenia białka monomery α-syn rozcieńcza się, krótko miesza w wortexie i inkubuje przez 37 °C przez 7 dni, podczas mieszania na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 10 obr./min. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat przenoszenia siatek z etapami użycia octanu uranylu i wody; przedstawia porównanie strony matowej i błyszczącej.
Rysunek 2Metody barwienia w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Schemat barwienia negatywowego do mikroskopii elektronowej. A) Zdjęcia przedstawiające siatki do preparatów do mikroskopii elektronowej. Siatka posiada stronę matową lub jasną oraz stronę błyszczącą lub ciemną. Strona błyszcząca/ciemna jest pokryta wspierającą warstwą filmu z formvaru i węgla. B) Ilustracja procedury barwienia. Siatkę nanosi się błyszczącą/ciemną stroną dołu na pierwszą kroplę ddH2przez 1 min, a nadmiar jest odsączany za pomocą papieru filtracyjnego. Proces powtarza się z drugą kroplą ddH2O.2O, rozcieńczone PFF lub monomery, dwie krople octanu uranylu oraz dwie dodatkowe krople ddH2O2Siatki można przechowywać w pudełku do siatek do momentu obrazowania. Pasek skali = 3 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces uszczelniania szklanej rurki kapilarnej za pomocą rurek termokurczliwych; schemat krok po kroku z pomiarami.
Rycina 3Montaż szklanych strzykawek z igłami wykonanymi na zamówienie. Schemat kroków niezbędnych do montażu strzykawek z przymocowaną szklaną igłą. Silikonizowane szklane kapilary są rozciągane i przecinane w połowie, aby uzyskać szklane igły. Tubing termokurczliwy jest wykorzystywany do przygotowania metalowej igły i utworzenia wewnętrznej uszczelki podczas nasuwania szklanej igły na igłę metalową. Następnie dodaje się kolejne dwie warstwy tubingu termokurczliwego, które nakładają się na podstawę szklanej igły i igłę metalową, a następnie stosuje się obróbkę termiczną w celu zabezpieczenia szklanej igły i utworzenia wodoszczelnego uszczelnienia. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Mikroskopia elektronowa; monomer, PFF, sonikowane PFF; wykres rozkładu długości; włókna białkowe.
Rysunek 4Wizualizacja monomerów α-syn i α-syn fibryle za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Reprezentatywne mikrografie monomerów i włókien α-syn. Panele górne: monomery α-syn mysie i ludzkie. Panele środkowe: pełnowymiarowe PFF α-syn mysie i ludzkie. Panele dolne: PFF α-syn mysie i ludzkie po sonikacji. Wykres dolny: rozkład długości sonikowanych PFF α-syn mysich i ludzkich. Pasek skali = 50 nm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres testu z tioflawiną T: fluorescencja (RFU); mysz, człowiek; PFF vs. dPBS, monomer.
Rysunek 5Potwierdzenie struktur amyloidowych za pomocą testu z tioflawiną T. Pomiar sygnału fluorescencyjnego w próbkach monomerów i PFF $\alpha$-synucleiny mysiej i ludzkiej. Po lewej: wyniki dla monomerów $\alpha$-syn i PFF $\alpha$-syn mysich. Po prawej: wyniki dla monomerów $\alpha$-syn i PFF $\alpha$-syn ludzkich. Na każdym wykresie przedstawiono ujemną kontrolę dPBS. Wszystkie pomiary wyrażono w względnych jednostkach fluorescencji (RFU). Słupki wskazują średnie grupowe, a słupki błędów reprezentują $\pm$1 błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Żel do analizy sedymentacyjnej, białka mysie i ludzkie; analiza monomerów i PFF; wyniki rozdziału białek.
Rycina 6Analiza sedymentacyjna w celu oceny zdolności do tworzenia osadu α-syn. Obrazy żeli barwionych Coomassie. Widoczne prążki znajdują się na wysokości około 14 kDa w odniesieniu do drabinki białkowej. Po lewej: monomery i PFF mysie. Po prawej: monomery i PFF ludzkie. Dla wszystkich próbek monomerów i PFF przedstawiono resuspenderowany osad (P) oraz nadsącz (S). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

potwierdzenie patologii α-synukleiny, immunostaining, pSyn, tioflawina S, wyniki analizy białek.
Rycina 7Cechy inkluzji w modelu szczura potwierdzające patologię α-syn. Reprezentatywne mikrografie z części zwartej istoty czarnej 2 miesiące po wstrzyknięciu. Lewo: Neurony zawierające pSyn, przeciwbarwione fioletem krezylowym. Środek: Neurony wykazujące pozytywną reakcję z tioflawiną S. Prawo: Ink grieving zawierające α-syn, odporne na proteinazę K. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Produkcja α-syn PFF zdolnych do wysiewania neuronów i prowadzenia do inkluzji podobnych do ciał Lewy'ego zależy od wielu czynników i etapów. Krytycznym czynnikiem jest to, że monomery używane do generowania włókienek muszą być specjalnie opracowane do fibrylizacji 4,9,14,15. Jeśli monomery nie są sformułowane do fibrylizacji, fibryle mogą się nie tworzyć lub fibryle, które się tworzą, mogą nie wytwarzać patologii α-syn. Podobnie bufor, w którym znajdują się monomery, również wpływa na fibrylizację. W związku z tym, aby uzyskać najlepsze wyniki, stężenie soli powinno wynosić około 100 mM NaCl, a pH między 7,0 a 7,3. Pierwszym krokiem, który wprowadza zmienność, jest metoda, za pomocą której określa się początkową zawartość białka, przy czym pomiar przy A280 prawdopodobnie da dokładniejsze wyniki i dlatego jest to metoda preferowana. Rozbieżność w stężeniu białka może zmniejszyć skuteczność procesu fibrylacji, a także zmienić założone stężenie PFF stosowane w eksperymentach. Oba mogą prowadzić do spadku wydajności wysiewu i różnic w partiach między eksperymentami.

Wstępne etapy kontroli jakości potwierdzą krytyczne cechy PFF, w szczególności to, że mają one konformację fibrylarną (mikroskopia elektronowa), zawierają struktury amyloidowe (test tioflawiny T) i są granulowane (test sedymentacyjny). Ważne jest, aby pamiętać, że wyniki testu tioflawiny T będą się zmieniać w czasie i nie są bezpośrednią miarą ilości obecnych struktur amyloidowych, a raczej test tioflawiny T powinien być stosowany tylko jako wskaźnik obecności struktur amyloidowych w próbce. Tioflawina T jest zwykle stosowana w testach in vitro, takich jak wyżej wymieniony test, aby wykazać, że fibryle zawierają struktury amyloidowe. Alternatywnie, tioflawina S jest stosowana w tkankach do wykrywania struktur amyloidowych, jak pokazano na rycinie 7. Jeśli chodzi o test sedymentacji, wyniki pokazują jedynie, że PFF występują głównie we frakcji granulowanej. Ponieważ próbki są prowadzone w warunkach denaturacji, na żelach znajduje się pojedyncze wyraźne pasmo o wielkości około 14 kDa, wielkości monomerów α-syn. W przeciwieństwie do wielu prążków obecnych przy wyższych masach cząsteczkowych, których można by się spodziewać w przypadku PFF, gdyby zastosowano żel natywny lub niedenaturujący. Wreszcie, pomyślne przejście wszystkich tych początkowych etapów kontroli jakości nie gwarantuje działania polegającego na zasiewaniu inkluzji α-syn. Z tego powodu należy przeprowadzić eksperymenty z hodowlą komórkową lub małą kohortą zwierząt, którym wstrzyknięto chirurgicznie, w celu zbadania skuteczności PFF przed użyciem w większych eksperymentach.

Sonikacja jest kluczowym krokiem w procesie, a parametry będą się różnić w zależności od zastosowanego modelu sonikatora. Parametry sonikacji muszą być zastosowane i zweryfikowane, aby wykazać, że wyprodukowano krótkie fragmenty PFF. Wielkość włókienek ma wpływ na wysiew, przy czym krótszy filament wysiewa się bardziej efektywnie. Chociaż krótsze włókienki wysiewają się bardziej efektywnie, efekt ten stabilizuje się, a optymalna długość PFF wynosi około 50 nm 4,18. Ważne jest również, aby nie poddawać próbek nadmiernymi sonikacjami i nie wystawiać PFF na nadmierne ciepło, ponieważ może to obniżyć wydajność wysiewu. Te sonikowane PFF powinny być testowane pod kątem skuteczności w hodowlach małych komórek lub eksperymentach in vivo przed użyciem w eksperymentach na większą skalę. Ponieważ różne sesje sonikacji mogą potencjalnie wprowadzać zmienność, należy odpowiednio zaplanować eksperymentalne grupy leczenia.

Podczas dostarczania PFF in vivo, lokalizacja miejsca wstrzyknięcia i całkowita ilość użytych PFF może wpływać na liczbę neuronów, u których rozwiną się inkluzje, a także na zakres neurodegeneracji 7,14. Współrzędne w protokole stanowią punkt wyjścia, ale powinny zostać przetestowane w laboratorium, aby upewnić się, że pożądany region docelowy rozwija patologię α-syn przed użyciem w eksperymentach na dużą skalę. W razie potrzeby można użyć barwnika śledzącego lub kulek fluorescencyjnych jako sposobu na przetestowanie kierowania regionalnego przed użyciem PFF. Ilość PFF stosowanych in vivo różni się w zależności od grupy, przy czym większość grup używa łącznie od 5 do 20 μg PFF w jednym lub podzielonym między dwa miejsca wstrzyknięcia 1,2,3,4,5,6,7,14. Ponieważ liczba miejsc wstrzyknięcia, lokalizacja miejsc wstrzyknięć i ilość wstrzykniętych PFF mogą wpływać na wyniki i progresję synukleinopatii, przed użyciem modelu do testowania potencjalnych interwencji lub badania czasowych cech modelu należy scharakteryzować dalsze wyniki zastosowanych parametrów.

Wybierając model do wykorzystania do testowania środków terapeutycznych lub badania progresji choroby, należy wybrać zastosowany model tak, aby jak najlepiej odpowiadał na zadane pytanie. Nie wszystkie modele będą posiadały pewne cechy chorobowe choroby Parkinsona lub będą oferować ramy czasowe potrzebne do przetestowania potencjalnych interwencji. Model PFF podsumowuje kluczowe cechy choroby Parkinsona, takie jak patologia α-syn i neurodegeneracja, i może prowadzić do umiarkowanych zaburzeń motorycznych. Model oferuje przewidywalny i długotrwały przebieg w czasie, w którym inkluzje tworzą się na kilka miesięcy przed neurodegeneracją. Pozwala to naukowcom na zbadanie i wykorzystanie różnych faz przedłużającej się progresji synukleinopatii. Oczekuje się, że obecne i przyszłe wykorzystanie modelu w ujęciu ogólnym będzie korzystne w badaniach nad progresją choroby i opracowywaniem nowych terapii.

Oświadczenia

Joseph Patterson, Kelvin Luk i Caryl Sortwell są obecnie zaangażowani w ustalenia umowne z Fundacją Michaela J. Foxa w celu kontroli jakości materiału α-syn generowanego przez Proteos, Inc. Współautorka Nicole Polinski jest pracownikiem Fundacji Michaela J. Foxa, która zawarła umowę z Proteos, Inc. na produkcję monomeru α-syn. Współautorzy Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley i Nicholas Kanaan nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty Fundacji Michaela J. Foxa, Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NS099416) oraz Weston Brain Institute.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanemThermo Fisher (Gibco)14190144
Przeciwciało anty-alfa-synukleinowe (fosforylowane przez serynę 129)AbcamAB184674
Przeciwciało anty-alfa-synukleinoweAbcamAB15530
Kwas bicynchonowyThermo Fisher (Pierce)PI23228
Przezroczysta medyczna rurka termokurczliwa (średnica wewnętrzna 0,036 cala) Medical103-0143
Przezroczysta medyczna rurka termokurczliwa (średnica wewnętrzna 0,044")Nordson Medical103-0296
Siarczan miedziThermo Fisher (Pierce)PI23224
Eppendorf ThermoMixer CEppendorf2231000574
Eppendorf ThermoTop Podgrzewana pokrywaEppendorf5308000003
Formvar/Carbon Siatki do mikroskopii elektronowejEletron Microscopy SciencesFCF300-Cu
Szklana rurka kapilarna (średnica zewnętrzna 0,53 mm; średnica wewnętrzna 0,09 mm; długość 54 mm)Drummond22-326223
Ściągacz do igieł szklanychNarishigePC-10
Strzykawka HamiltonHamilton80000
Ludzki monomer alfa-synukleiny do generowania wstępnie uformowanych włókienekProteosRP-003
Mysi monomer alfa-synukleiny do generowania wstępnie uformowanych włókienProteosRP-009
Pomarańczowa medyczna rurka termokurczliwa (średnica wewnętrzna 0,021 cala)Nordson Medical103-0152
Parafilm MSigma-AldrichP7543
Proteinaza KInvitrogen25530015
końcówkąQsonica 3,2 mmQsonica4422
Sonikator Qsonica Q125QsonicaQ125
Tioflawina SSigma-AldrichT1892
Tioflawina TEMD Milipore596200
ToxinSensor Chromogenny zestaw do oznaczania endotoksyn LAL GenscriptL00350C
Octan uranyluEletron Microscopy Sciences22400

Bibliografia

  1. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  2. Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).
  3. Paumier, K. L., et al. Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration. Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).
  4. Abdelmotilib, H., et al. alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).
  5. Duffy, M. F., et al. Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration. Journal of Neuroinflammation. 15, 129(2018).
  6. Duffy, M. F., et al. Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease. Frontiers in Neuroscience. 12, 621(2018).
  7. Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).
  8. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
  9. Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).
  10. Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies. Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).
  11. Neumann, M., et al. Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies. The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).
  12. Li, J. Y., et al. Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).
  13. Shimozawa, A., et al. Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain. Acta Neuropathologica Communications. 5, 12(2017).
  14. Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).
  15. Fares, M. B., et al. Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).
  16. Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Scientific Reports. 8, 10788(2018).
  17. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. , (2008).
  18. Tarutani, A., et al. The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation. Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).
  19. Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons. Neuron. 79, 347-360 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

W kna alfa synukleinymodel synukleinopatiichoroba Parkinsonagenerowanie w kienprotok sonikacjitest sedymentacjitest z tioflawin Tmikroskopia elektronowaimmunohistochemia
Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.