Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Podsumowanie

Celem tego artykułu jest nakreślenie kroków wymaganych do wytworzenia włókienek z monomerycznej alfa-synukleiny, późniejszej kontroli jakości i użycia wstępnie uformowanych włókienek in vivo.

Streszczenie

Wykorzystanie modelu in vivo synukleinopatii z fibrylu alfa-synukleiny (α-syn PFF) zyskuje na popularności wśród badaczy dążących do modelowania synukleinopatii choroby Parkinsona i zwyrodnienia nigrostriatalnej. Standaryzacja generowania α-syn PFF i aplikacji in vivo ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia spójnej, solidnej patologii α-syn. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania włókienek z monomerycznej α-syn, etapy kontroli jakości po fibrylacji oraz sugerowane parametry skutecznego neurochirurgicznego wstrzykiwania α-syn PFF szczurom lub myszom. Począwszy od monomerycznej α-syn, fibrylacja zachodzi w ciągu 7-dniowego okresu inkubacji podczas wstrząsania w optymalnych warunkach buforowych, stężeniu i temperaturze. Kontrola jakości po fibrylacji jest oceniana na podstawie obecności włókienek granulowanych za pomocą testu sedymentacji, tworzenia konformacji amyloidu w włókienkach za pomocą testu tioflawiny T oraz wizualizacji włókienek pod mikroskopem elektronowym. Podczas gdy pomyślna walidacja przy użyciu tych testów jest niezbędna do osiągnięcia sukcesu, nie są one wystarczające, aby zagwarantować, że PFF zapoczątkują inkluzje α-syn w neuronach, ponieważ taka aktywność agregacji każdej partii PFF powinna być testowana w hodowli komórkowej lub w kohortach zwierząt pilotażowych. Przed użyciem PFF muszą zostać poddane sonikacji w ściśle znormalizowanych warunkach, a następnie badaniom za pomocą mikroskopii elektronowej lub dynamicznego rozpraszania światła, aby potwierdzić, że długości włókien mieszczą się w optymalnym zakresie wielkości, przy średniej długości 50 nm. PFF mogą być następnie dodawane do pożywek do hodowli komórkowych lub stosowane u zwierząt. Patologia wykrywalna przez barwienie immunologiczne dla fosforylowanego α-syn (psyn; seryna 129) jest widoczna kilka dni lub tygodni później odpowiednio w hodowlach komórkowych i modelach gryzoni.

Wprowadzenie

Choroba Parkinsona (PD) charakteryzuje się przede wszystkim pośmiertną charakterystyką dwóch głównych cech patologicznych: rozległą i postępującą patologią alfa-synukleiny (α-syn) oraz zwyrodnieniem nigrostriatalnym. Po wstrzyknięciu myszom lub szczurom typu dzikiego, α-syn preformowane fibryle (PFF) indukują postępującą akumulację patologicznej α-syn, co może skutkować przedłużającą się degeneracją neuronów dopaminowych istoty czarnej pars compacta (SNpc) w ciągu wielu miesięcy, a także deficytami sensomotorycznymi1^,2,3,4,5,6. Neurony są wystawione na działanie włókien α-syn, albo poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie domózgowe, albo dodane do pożywki hodowanych neuronów. Kiedy PFF są wprowadzane do neuronów, PFF działają, aby "zasiać" tworzenie inkluzji poprzez szablonowanie i akumulację endogennego α-syn do fosforylowanych inkluzji^1,7,8,9. Inkluzje mają podobne właściwości do ciał Lewy'ego: zawierają α-syn fosforylowany w serynie 129 (pSyn), ubikwitynę i p62; posiadają czwartorzędowe struktury amyloidowe, jak wykazano w przypadku dodatniego barwienia tioflawiną; i są odporne na trawienie proteinazy K^{1,3,5,7,8,9,10,11,12}. Ekspozycja na PFF prowadzi do powstania inkluzji α-syn w pierwotnych i niektórych unieśmiertelnionych neuronach w hodowli, a także u myszy, szczurów i naczelnych in vivo^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,13}. Ważne jest, aby pamiętać, że PFF nie doprowadzą do powstania inkluzji α-syn we wszystkich modelach hodowli komórkowych, a niektóre hodowane neurony będą się lepiej wysiewać niż inne.

Inną ważną cechą modelu PFF in vivo α-syn są wyraźne sekwencyjne fazy patologiczne, które pojawiają się w ciągu kilku miesięcy. U gryzoni, po wstrzyknięciu śródprążkowiowym, tworzenie inkluzji α-syn zwykle osiąga szczyt w SNpc i wielu regionach korowych w ciągu 1-2 miesięcy. Po tym szczycie agregacji następuje zwyrodnienie nigrostriatalne ≈2-4 miesiące później^1,3,5. Te odrębne etapy patologiczne zapewniają naukowcom platformę, za pomocą której mogą badać i opracowywać strategie, które 1) zmniejszają agregację α-syn, 2) usuwają już powstałe inkluzje α-syn i/lub 3) zapobiegają późniejszej neurodegeneracji. Model PFF ma wyraźne zalety i wady w porównaniu z modelami nadekspresji α-syn za pośrednictwem wektorów neurotoksycznych, transgenicznych i wirusowych, jak wcześniej recenzowano⁶. Wybór modelu lub podejścia powinien być uzależniony od tego, który model najlepiej odpowiada pytaniu, które zadają sobie badacze.

Chociaż model PFF został z powodzeniem wykorzystany przez wiele laboratoriów, nadal istnieją grupy, które doświadczyły niespójności w generowaniu włókienek i wytwarzaniu spójnych α-syn patologii¹⁴. Przykłady niespójności obejmują PFF, które wytwarzają niewielką lub żadną patologię α-syn, wydajność wysiewu z partii na partię, a nawet niepowodzenie w tworzeniu włókienek. W związku z tym standaryzacja generowania α-syn PFF i stosowania in vivo ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić dokładną interpretację wpływu nowych interwencji terapeutycznych. Poniższy protokół przedstawia kroki wymagane do wytworzenia PFF z monomerów α-syn, kontrolę jakości in vitro PFF po utworzeniu, sonikację i pomiar PFF przed użyciem oraz sugestie ułatwiające skuteczne wstrzyknięcie PFF in vivo szczurom lub myszom.

Protokół

Wszystkie metody z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Michigan (IACUC).

1. Tworzenie włókienek z monomerów α-synukleinowych (Rysunek 1)

1. Monomery α-synukleiny rozmrozić na lodzie, delikatnie zawiesić ponownie przez ruch probówki i odwirować przy 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Monomer α-syn musi być specjalnie opracowany do fibrylacji. Rekombinowane monomery można kupić ze źródeł komercyjnych lub wygenerować za pomocą protokołów na stronie^4,9,14,15. W przypadku zakupu ze źródeł komercyjnych produkt musi stwierdzać, że monomer α-syn jest przeznaczony specjalnie do wytwarzania włókienek. Niezależnie od tego, czy monomery są kupowane, czy wytwarzane na miejscu, opisane poniżej kroki kontroli jakości powinny być wykonywane dla każdej partii, aby upewnić się, że fibryle się uformowały i będą skutecznie wysiewać się przed użyciem w eksperymentach.
2. Przenieść supernatant do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zapisać przeniesioną ilość.
   UWAGA: Uważaj, aby uniknąć granulki, która, jeśli jest obecna, będzie mała.
3. Zmierzyć stężenie białka w przenoszonym supernatantze za pomocą standardowego testu kwasu bicinchoninowego (BCA) lub zmierzyć absorbancję przy 280 nm za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
   UWAGA: Test BCA nie jest tak dokładny dla specyficznego pomiaru α-syn i może dawać wyniki przeszacowujące stężenie białka. W związku z tym pomiar absorbancji przy 280 nm jest zalecaną metodą oznaczania stężenia białka.
   1. Aby dokonać pomiaru za pomocą testu BCA, postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami BCA i wykonaj z trzema różnymi rozcieńczeniami monomeru α-syn. Sugerowane rozcieńczenia to 1:25, 1:50 i 1:100.
   2. Aby dokonać pomiaru metodą A280, należy zaślepić czytnik sterylnym 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (dPBS) firmy Dulbecco bez wapnia i magnezu, o stężeniu soli około 100 mM NaCl i zakresie pH 7,0-7,3 (tabela materiałów).
   3. Dodać 2 μl próbki do czytnika i odczytać absorbancję przy 280 nm.
   4. Użyj prawa Beera-Lamberta, aby określić stężenie monomerów.
      
      UWAGA: Współczynnik ekstynkcji ε dla człowieka α-syn wynosi 5,960 ^{M-1 cm-1}, a dla myszy α-syn wynosi 7,450 M^{1 cm-1}. Długość ścieżki mierzona jest w cm. Masę cząsteczkową α-syn (14 kDa) szacuje się przy założeniu, że 1 Da = 1 g/mol.
4. Rozcieńczyć monomery 1x dPBS do końcowego stężenia 5 mg/ml. Skorzystaj z poniższego równania, aby obliczyć ilość 1x dPBS dodanego w celu rozcieńczenia monomerów.
   
   UWAGA: Wszystkie stężenia podane są w mg/ml, a objętości w μl. Rozcieńczenia monomerów należy przeprowadzać z 1x dPBS. Całkowita objętość użyta do wytworzenia włókienek powinna wynosić od 100 do 500 μl, aby uzyskać powtarzalne wyniki fibrylizacji.
5. Krótko zwirować, aby wymieszać i odwirować, aby zebrać cały płyn na dnie probówki. Podwielokrotne monomery do porównania kontroli jakości z włókienkami, jak wskazano w krokach 1.8.1 - 1.8.4.
6. Użyj zamka do probówki lub folii woskowej/plastikowej (tabela materiałów), aby zamknąć pokrywę probówki do mikrowirówki.
7. Umieść probówkę w termomikserze orbitalnym z pokrywką na 7 dni w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 1,000 obr./min (tabela materiałów).
   UWAGA: Pod koniec 7 dni zawartość probówki powinna wydawać się mętna. Termomikser musi mieć pokrywę, aby zapobiec tworzeniu się kondensatu na pokrywkach rurek.
8. Delikatnie przesuń rurkę, aby ponownie zawiesić włókienka α-syn. Podwielokrotne włókna dla następujących etapów kontroli jakości, jak wskazano w krokach 1.8.1 - 1.8.4.
   UWAGA: Włókna do etapów kontroli jakości mogą być przechowywane w RT przez noc.
   1. Podwielokrotność 6 μl do oznaczania sedymentacji.
   2. Podwielokrotność 5 μl do oznaczania wiązania tioflawiny T.
   3. Podwielokrotność 2 μl do transmisyjnej mikroskopii elektronowej do wizualizacji włókienek.
   4. Podwielokrotność co najmniej 10 μl do oznaczania endotoksyn.
      UWAGA: Do oznaczania endotoksyn stosuje się komercyjny lizat lizatu amebocytów limulusa (LAL), zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). Poziom endotoksyn powinien wynosić ≤0,5 jednostki endotoksyny/ml dla włókienek. Jeśli to kryterium nie jest spełnione, można użyć zestawu do usuwania endotoksyn.
9. Pozostałe włókienka podzielić na porcje i przechowywać. W przypadku długotrwałego przechowywania (12-18 miesięcy) należy szybko zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Ilość do podwielokrotności zależy od pożądanej aplikacji końcowej. Stosowanie in vivo zazwyczaj wymaga większej liczby włókienek w wyższych stężeniach niż stosowanie in vitro, a podwielokrotne objętości powinny być odpowiednio zaplanowane. Włókna należy przechowywać z tyłu zamrażarki, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym potencjalnym zamarznięciem/rozmrożeniem. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Test sedymentacji

1. W czystej probówce do mikrowirówek dodać 6 μl PFF do 54 μl dPBS, aby rozcieńczyć fibryle w stosunku 1:10 i pipetować do mieszania.
   1. W osobnej probówce dodać 6 μl monomeru do 54 μl dPBS jako dodatkową kontrolę.
2. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej i przenieść supernatant do czystej probówki do mikrowirówki.
3. Dodać 60 μl dPBS do pozostałej osadki i odwirować do ponownego zawieszenia.
4. Dodaj 30 μl 3x buforu do próbek (140 μl 50% glicerolu/0,1% błękitu bromofenolowego, 40 μl 10% SDS i 20 μl β-merkaptoetanolu) do każdej probówki i wiruj do wymieszania.
5. Próbki inkubować w temperaturze 100 °C przez 10 minut i pozostawić do ostygnięcia na lodzie przez 5 minut.
6. Użyj standardowego protokołu elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), aby oddzielić białko od masy. Należy użyć drabinki białkowej o zakresie obejmującym 14 kDa (przedział wielkości oczekiwany dla monomerycznej α-syn).
7. Przenieś żel do naczynia barwiącego i pokryj żel niebieską plamą Coomassie (0,1% błękitu brylantowego Coomassie, 20% metanolu objętościowo i 10% objętościowo kwasu octowego w ddH₂O). Inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej podczas wytrząsania.
8. Odlej niebieską plamę Coomassie i dodaj tyle odbarwiacza (50% objętości metanolu i 10% objętościowo kwasu octowego w ddH₂O), aby pokryć żel. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając.
9. Odlej odplamienie i powtórz etap odbarwiania, aż żel będzie przezroczysty i widoczne będą pasma.
10. Umyj żel 3 razy po 5 minut, potrząsając ddH₂O i zobrazuj żel.

3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa do wizualizacji włókien

1. Odważyć 20 mg octanu uranylu w probówce do mikrowirówki i dodać 1 ml ddH₂O, aby uzyskać 2% roztwór wodny. Wirować, aż octan uranylu znajdzie się w roztworze i pozostawić na noc.
   UWAGA: Octan uranylu należy wykonać dzień przed przygotowaniem próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Wystawienie na działanie światła lub pomieszanie może spowodować wytrącanie się octanu uranylu, w związku z czym probówkę zawierającą roztwór octanu uranylu należy przykryć folią aluminiową, przechowywać w ciemnym miejscu i nie wstrząsać po tym, jak octan uranylu znajdzie się w roztworze.
2. Dodać 2 μl PFF do 98 μl dPBS do rozcieńczenia włókienek w stosunku 1:50, a następnie pipetować do mieszania.
3. Przygotuj czystą powierzchnię pokrytą woskiem/folią z tworzywa sztucznego (tabela materiałów) (około 50 mm x 50 mm) na blacie stołu. Na czystej folii woskowej/plastikowej (Tabela materiałów) dodaj następujące elementy (Rysunek 2).
   1. Dodaj 4 x 10 μl kropli ddH₂O.
   2. Dodać 1 x 10 μl kropli rozcieńczonych włókienek lub próbki monomeru.
   3. Dodaj 2 x 10 μl kropli 2% octanu uranylu.
4. Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby podnieść siatkę mikroskopii elektronowej z formvarem/węglem, pokrytą miedzią, (tabela materiałów).
   UWAGA: Upewnij się, że podnosisz siatkę tylko za krawędź, unikając części siatki pośrodku (Rysunek 2A). Jeśli kleszcze dotkną siatki, folia pokryta formvarem/węglem zostanie uszkodzona, co uniemożliwi obrazowanie w tym obszarze siatki.
5. Przesuń siatkę w górę/stronę pokrytą węglem (błyszcząca strona) w dół przy pierwszym upuszczeniu ddH₂O. Delikatnie użyj kleszczyków, aby przytrzymać siatkę i dociśnij, aby upewnić się, że cała powlekana powierzchnia styka się z ddH₂O. Pozwól siatce unosić się na wodzie przez 1 minutę.
6. Podnieś siatkę i nie dotykając części siatki siatki, odchować ddH₂O bibułą filtracyjną.
7. Unosić siatkę jak powyżej na drugim kropli ddH₂O przez 1 minutę i odsunąć ddH₂O.
8. Unosić siatkę na kropli rozcieńczonych włókienek przez 1 minutę i odgarnąć nadmiar jak wyżej.
9. Unosić siatkę na pierwszej kropli octanu uranylu przez 1 minutę i odsącz nadmiar.
10. Unosić siatkę na drugiej kropli octanu uranylu przez 1 minutę, odsącz nadmiar.
11. Przesunąć na krótko siatkę jak powyżej na trzecim kropli ddH₂O i odsunąć ddH₂O.
12. Unieść siatkę jak powyżej na czwartej kropli ddH₂O i odsunąć ddH₂O, upewniając się, że usunąłeś jak najwięcej ddH₂O.
13. Przenieś do skrzynki siatkowej w celu przechowywania do czasu obrazowania.
    UWAGA: Siatki powinny schnąć przez co najmniej 5 minut przed obrazowaniem. Siatki można obrazować przez co najmniej rok po przygotowaniu i należy je przechowywać w suchym środowisku.

4. Test tioflawiny T

1. W czystej probówce do mikrowirówki dodać 5 μl PFF do 245 μl dPBS, aby rozcieńczyć fibryle w stosunku 1:50 i pipetować do mieszania.
2. Dodać 250 μl dPBS do oddzielnej probówki do mikrowirówki, aby służyła jako kontrola ujemna.
3. Dodać 5 μl monomeru do 245 μl dPBS, aby służył jako kontrola monomeru.
4. Dodać 250 μl tioflawiny T w buforze glicyny (25 μM tioflawiny T, 100 mM glicyny, 1% Triton X-100, pH 8,5) do każdej próbki i delikatnie wymieszać.
5. Odpipetować 2 powtórzenia, po 200 μl każdy, na czarną płytkę 96-dołkową. Trzymaj płytkę w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu.
6. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i odczytać płytkę przy wzbudzeniu 450 nm i emisji 510 nm.
   UWAGA: Odczyty tioflawiny T będą się zmieniać w czasie. Próbki należy odczytać w tym samym czasie inkubacji. W razie potrzeby można wykonać wiele odczytów podczas godzinnej inkubacji i wykreślić je w czasie.

5. Sonikacja włókienek α-synukleinowych

UWAGA: Sonikator i wszystkie etapy sonikacji są wykonywane w kapturze hodowlanym, aby zapobiec ekspozycji na włókienka, które mogą rozpylać się podczas sonikacji. Personel wykonujący czynności sonikacyjne powinien nosić środki ochrony osobistej, w tym rękawice, odzież ochronną w postaci fartucha laboratoryjnego oraz osłonę twarzy podczas sonikacji. Ryzyko ekspozycji włókien można zmniejszyć poprzez sonikację za pomocą sonografu z tubą kubkową, dzięki czemu rurka zawierająca włókienka pozostaje zamknięta podczas sonikacji.  

UWAGA: Optymalne parametry sonikacji włókien zależą od zastosowanego modelu sonikatora. Z tego powodu konieczne będzie przeprowadzenie pewnej optymalizacji, aby upewnić się, że fibryle mają odpowiedni rozmiar. Zastosowany sonikator można znaleźć w Tabeli Materiałów, a przedstawione parametry są oparte na poprzednich wynikach z tym modelem sonikatora. Poniższe parametry sprawdzą się dla 2-4 μg/μL PFF w 200-400 μL roztworu. Należy przeprowadzić próbną sonikację za pomocą przyrządu i przeanalizować fibryle, aby zapewnić osiągnięcie pożądanych wyników przed użyciem PFF w eksperymentach.

1. Podłącz sondę o średnicy 3.2 mm (Tabela materiałów) do konwertera i ustaw parametry sonikatora zgodnie z poniższymi instrukcjami w krokach 5.1.1 - 5.1.3.
   1. Ustaw amplitudę na 30%.
   2. Ustaw impuls na 01 01 (1 s wł.; 1 s wyłącz.).
   3. Ustaw godzinę na 0:01:00.
      UWAGA: 1 minuta pulsowania równa się 60 impulsom, a ten model sonikatora (Tabela Materiałów) zatrzyma się automatycznie. W przypadku innych modeli sonikatorów liczba impulsów będzie musiała zostać policzona.
2. Rozmrozić włókna w temperaturze RT i rozcieńczyć sterylnym dPBS w kapturze hodowlanym.
   UWAGA: Przezroczysta probówka mikrowirówkowa o pojemności 0,6 ml najlepiej sprawdza się w sonikacji, a końcowe stężenie włókienek zależy od zamierzonego zastosowania. Przedstawione reprezentatywne wyniki pochodzą z końcowego stężenia włókienek wynoszącego 4 μg/μl.
3. Przetrzyj sondę sonikatora chusteczką laboratoryjną zwilżoną 70% etanolem, aby wyczyścić sondę. Zanurz końcówkę sondy w ddH₂O i pulsuj 10 razy, aby dalej wyczyścić sondę, a następnie wytrzyj do sucha chusteczką laboratoryjną.
4. Umieść końcówkę sondy w probówce z rozcieńczonymi włókienkami i umieść końcówkę na dnie rurki.
5. Sonikacja przez 60 impulsów (1 s wł., 1 s wyłączona). Przesuwaj sondę w górę i w dół podczas każdego impulsu, aby upewnić się, że wszystkie fibryle w cieczy są sonikowane. i czyste.
6. Po 60 impulsach wyjmij sondę z PFF i dodaj 2 μl PFF do 98 μl dPBS w czystej probówce mikrowirówkowej, aby rozcieńczyć fibryle w stosunku 1:50 do sonicznego pomiaru włókienek za pomocą mikroskopii elektronowej.
   UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby przed wstrzyknięciem in vivo zmierzono niewielką podgrupę włókienek, a bardziej kompleksowy pomiar włókienek wykonano, gdy pozwala na to czas.
7. Po sonikacji krótko odwirować PFF przez 1 s przy 2,000 x g, aby zebrać cały płyn z boków probówki.
   UWAGA: Jeśli rurka stanie się gorąca w dotyku, przerwij sonikację po 30 impulsach, odczekaj 1 minutę i wykonaj sonizację do ostatnich 30 impulsów.
   UWAGA: Podczas sonikacji trzymaj końcówkę sondy w kierunku dna cieczy na początku każdego impulsu, zbyt blisko górnej części cieczy spowoduje utratę próbki.
8. Zanurz końcówkę sondy w 1% SDS i naciśnij impuls 10 razy, aby wyczyścić sondę. Wyjmij końcówkę z SDS, zanurz w ddH₂O i pulsuj 10 razy.
9. Przetrzyj sondę chusteczką laboratoryjną zwilżoną 70% etanolem, a następnie przetrzyj sondę suchą chusteczką laboratoryjną. Odłącz sondę od konwertera i schowaj.
10. Przetrzyj wszystkie powierzchnie w masce 1% SDS, a następnie 70% etanolem.
    UWAGA: 1% roztwór SDS służy do dysocjacji włókien oraz czyszczenia powierzchni i sprzętu¹⁶.

6. Transmisyjna mikroskopia elektronowa do pomiaru sonikowanych włókienek

UWAGA: Jeśli mikroskopia elektronowa nie jest możliwa, test kinetyki tioflawiny T i dynamiczne rozpraszanie światła mogą być użyte jako pośrednie miary efektywności wysiewu i wielkości włókienek^4,14.

1. Przygotuj próbki, korzystając z protokołu z sekcji "Mikroskopia elektronowa do wizualizacji włókienek" powyżej.
2. Użyj transmisyjnego mikroskopu elektronowego, aby wykonać obraz włókienek z 6 do 10 różnych otworów siatki.
   UWAGA: Obrazy powinny mieć wystarczająco duże powiększenie, aby zmierzyć fibryle, ale wystarczająco niskie, aby uwidocznić wiele włókienek jednocześnie. Końcowe powiększenie około 75 000x powinno być wystarczające.
3. Zmierz długość małego podzbioru co najmniej 25 włókienek przed użyciem włókienek w eksperymencie.
   UWAGA: Pomiary te można zazwyczaj wykonywać za pomocą oprogramowania do obrazowania dołączonego do mikroskopu. W celu szybkiej walidacji osoba mierząca powinna wybrać reprezentatywne włókienka i obliczyć średnią wielkość. Długość włókien powinna wynosić średnio około 50 nm lub mniej, przy czym należy wykonać dokładniejszy pomiar.
4. Zmierz długość 500+ włókienek, aby uzyskać bardziej kompleksowe wyniki.
   UWAGA: Oprogramowanie do obrazowania powiązane z mikroskopem może być używane do pomiarów włókienek. Alternatywnie można otwierać obrazy i mierzyć włókienka za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu, używając paska skali powiązanego z każdym obrazem jako odniesienia rozmiaru, z którym można porównać długości włókien.

7. Przygotowanie niestandardowych strzykawek szklanych do iniekcji stereotaktycznych (Rysunek 3)

1. Dodać około 10 ml odczynnika silikonowego (tabela materiałów) do czystej zlewki o pojemności 50 ml.
2. Umieść szklane rurki kapilarne (długość 54 mm; średnica zewnętrzna: 0,86 mm; średnica wewnętrzna 0,59 mm) pionowo w zlewce odczynnika silikonowającego i pozwól, aby działanie kapilarne wciągnęło odczynnik silikonowy w górę probówki przez dolny otwór rurki zanurzony w odczynniku silikonowym.
3. Wlej dodatkowy odczynnik silikonowy do górnego otworu probówki, który nie jest zanurzony w odczynniku silikonowym, aby całkowicie wypełnić szklaną rurkę kapilarną.
4. Wyjmij rurki kapilarne z odczynnika silikonowającego i osusz otwarte końce probówek ręcznikiem papierowym, aby usunąć odczynnik silikonowy z probówek. Pozostaw rurki kapilarne do wyschnięcia na co najmniej 8 godzin.
5. Umieść rurkę kapilarną ze szkła silikonowanego w szklanym ściągaczu igieł (tabela materiałów).
6. Włącz element grzejny i pozwól, aby dołączone ciężarki rozciągnęły rozgrzaną szklaną rurkę kapilarną.
7. Przetnij wyciągniętą szklaną rurkę kapilarną nożyczkami w najcieńszym miejscu pośrodku i wyjmij szklaną igłę ze ściągacza do szklanych igieł.
   UWAGA: Średnica wewnętrzna i zewnętrzna ciągniętej igły powinna wynosić odpowiednio około 80 i 100 μm. Jednorazowo można wykonać wiele szklanych igieł i przechowywać je do momentu, gdy będą gotowe do zamocowania w szklanej strzykawce z dołączoną metalową igłą (tabela materiałów).
8. Przytnij nożyczkami rurkę z folii termokurczliwej (średnia średnica wewnętrzna 0,021 cala i średnia grubość ścianki 0,001") do około 40 mm. Nasunąć folię termokurczliwą na metalową igłę strzykawki ze skosem o pojemności 10 μl (tabela materiałów).
9. Użyj otwartego ognia do podgrzania i przyklej folię termokurczliwą do igły, jednocześnie obracając igłę, aby równomiernie rozgrzać ciepło.
10. Ostrożnie nasunąć większy koniec wyciągniętej szklanej igły na metalową igłę strzykawki.
11. Przyciąć nożyczkami rurkę z folii termokurczliwej (średnia średnica wewnętrzna 0,036 cala i średnia grubość ścianki 0,005") do około 40 mm i ostrożnie nasunąć na szklaną igłę, aby zachodziła na podstawę szklanej igły i metalową igłę strzykawki (Tabela materiałów). Użyj otwartego ognia, aby podgrzać folię termokurczliwą, aby przymocować szklaną igłę do metalowej igły.
12. Dodaj dodatkową warstwę folii termokurczliwej, aby zabezpieczyć szklaną igłę. Przyciąć nożyczkami rurkę z folią termokurczliwą (średnia średnica wewnętrzna 0,044 cala i średnia grubość ścianki 0,005") do około 40 mm i ostrożnie nasunąć na szklaną igłę, aby zachodziła na podstawę szklanej igły i metalową igłę strzykawki (Tabela materiałów). Użyj otwartego ognia, aby podgrzać folię termokurczliwą, aby przymocować szklaną igłę do metalowej igły.
13. Przytnij szklaną igłę nożyczkami tak, aby końcówka miała około 8 mm długości.
    UWAGA: Igła musi być wystarczająco długa, aby celować w pożądane obszary mózgu (wymagana długość zależy od współrzędnych grzbietowych/brzusznych).
14. Wykonaj kroki 7.14.1 - 7.14.3, aby przetestować igłę, aby upewnić się, że nie ma wycieków i że jest odpowiedni przepływ zarówno podczas pobierania, jak i dozowania płynu ze szklanej igły.
    1. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml dołączoną igłą o rozmiarze 26 z dH₂O.
    2. Usunąć metalowy tłok z niestandardowej strzykawki ze szklaną igłą i włożyć igłę strzykawki wypełnionej_{dH 2}O do podstawy strzykawki. Zastosować nacisk, aby dozować dH₂O ze szklanej igły. Sprawdzić powierzchnię styku szklanej igły i metalowej igły pod kątem wycieków i potwierdzić stały przepływ dH₂O.
       UWAGA: W razie potrzeby szklaną igłę można przyciąć, aby zwiększyć łatwość przepływu i dodać dodatkowe warstwy folii termokurczliwej, aby załatać wszelkie nieszczelności z podstawy szklanej igły.
    3. Napełnij probówkę do mikrowirówki dH₂O. Użyj niestandardowej strzykawki ze szklaną igłą, aby pobrać dH₂O. Sprawdź igłę, aby upewnić się, że płyn jest pobierany do strzykawki i czy nie ma pęcherzyków.
       UWAGA: Jeśli występują pęcherzyki lub_dH2Onie jest wciągane do igły, przycinanie igły może pomóc złagodzić nacisk.
15. Strzykawkę z dołączonymi szklanymi igłami należy ostrożnie przechowywać w pudełkach na strzykawki, dopóki nie będzie potrzebna do operacji.
16. Stosować standardowe metody chirurgii stereotaktycznej do doprążkowiowego dostarczania PFF w zoptymalizowanych współrzędnych u myszy (jedno miejsce: AP +0,2 mm i ML +2,0 mm od bregma, DV -2,6 mm od opony twardej) lub u szczurów (dwie lokalizacje: AP +1,6 mm i ML +2,0 mm od bregma, DV -4,0 od opony twardej; AP +0,1 mm i ML +4,2 mm od bregma, DV -5,0 od dura)^1,14,17.
    UWAGA: Te współrzędne zostały użyte u myszy C57BL6/C3H i szczurów Fischer 344. W przypadku korzystania z innych szczepów współrzędne powinny być zoptymalizowane.

Wyniki

Generowanie włókienek z monomerów α-syn rozpoczyna się od określenia stężenia monomerów. Do pomiaru zawartości białka można zastosować zarówno test BCA, jak i pomiar absorbancji przy 280 nm (A280); wyniki testu BCA sugerowały jednak wyższe stężenie niż metoda A280. PFF pochodzące z mysiego monomeru α-syn miały wartość BCA 14,05 ± 0,22 i A280 8,05 ± 0,03 μg/μL (Rysunek 1). Podobnie, PFF pochodzące z ludzkiego monomeru α-syn również wydawały się mieć wyższe stężenie, z wartością BCA 12,95 ± 0,38 i A280 wynoszącą 7,83 ± 0,05 μg/μL (Rysunek 1). Pomiary A280 są specyficzne dla α-syn w oparciu o włączenie współczynników ekstynkcji, a wyniki te wykorzystano do rozcieńczenia monomerów przed 7-dniową inkubacją.

Przed inkubacją, płyn zawierający monomery α-syn był klarowny, ale po utworzeniu włókienek powinien wydawać się mętny. Badanie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej potwierdziło obecność długich włókienek o szerokości 10-20 nm (Ryc. 4). Dla porównania, monomery α-syn były ledwo widoczne, bez widocznego kształtu (Ryc. 4). Wraz z wizualnym potwierdzeniem struktur fibrylarnych, konformacja amyloidu włókienek jest kolejną cechą PFF, która powinna zostać potwierdzona za pomocą testu tioflawiny T. Tioflawina T wykazuje zwiększoną fluorescencję podczas wiązania się z amyloidem; Tak więc zwiększony sygnał fluorescencyjny z próbek wskazuje na obecność amyloidu. Na przykład tioflawina w dPBS wytworzyła sygnał o wartości 3 287 ± 580 względnych jednostek fluorescencyjnych (RFU), monomer mysi α-syn wytworzył sygnał o wartości 4 174 ± 158 RFU, a mysie PFF wytworzyły sygnał o wartości 59 754 ± 6 224 RFU (Rysunek 5). Dla porównania, ludzki monomer α-syn wytwarzał podobny sygnał 4 158 ± 105 RFU do monomeru myszy, a ludzkie PFF wytwarzały wyższy sygnał 1 235 967 ± 113 747 RFU w porównaniu z mysimi PFF (Rysunek 5). Aby ocenić obecność włókienek granulowanych, przeprowadzono test sedymentacji. Fibryle będą granulowane przez odwirowanie. Zarówno w mysich, jak i ludzkich próbkach PFF, frakcja supernatantu powinna mieć więcej białka w osadzie niż supernatant (Rysunek 6). W przeciwieństwie do tego, większość białka z monomerów mysich i ludzkich była obecna w supernatancie, z niewielką obecnością w osadzie (Rysunek 6). Z obecnością PFF w sposób widoczny pod mikroskopią elektronową, obecnymi strukturami amyloidowymi i granulkowalnymi włókienkami, PFF przeszły wszystkie etapy kontroli jakości in vitro.

Zarówno myszy, jak i ludzkie PFF-y zostały poddane sonikacji, aby wytworzyć PFF o odpowiedniej długości do zasiewania inkluzji α-syn^4,18. PFF rozcieńczono do pożądanego stężenia 4 μg/μL i poddano sonikacji. Bezpośrednio przed zabiegiem 25 reprezentatywnych włókienek zobrazowano za pomocą mikroskopii elektronowej i zmierzono w celu wyrywkowego sprawdzenia wielkości włókienek. Sonikowane mysie PFF mierzyły 48,8 ± 3,1 nm, podczas gdy ludzkie PFF mierzyły długość 52,1 ± 4,4 nm; PFF obu gatunków miały zatem odpowiednią długość (50 nm lub mniej), aby wywołać aktywność wysiewu. Bardziej kompleksowe badanie około 500 włókienek ujawniło średnią długość i rozkład długości włókienek myszy poddanych sonikacji. Średnia długość wynosiła 44,4 ± 0,6 nm, przy czym 86,6% PFF miało 60 nm lub mniej (Rysunek 4). Dla porównania, ludzkie PFF wynosiły średnio 55,9 ± 1,1 nm, przy czym 69,6% PFF miało 60 nm lub mniej (Rysunek 4).

Po doprążkowiowym wstrzyknięciu sonikowanych mysich PFF szczurom, jak wcześniej opisano^3,5, seria skrawków tkanek została przetworzona 2 miesiące po operacji, kiedy wiadomo, że liczba inkluzji zawierających neurony osiąga szczyt w SNpc, w celu potwierdzenia fosforylowanych inkluzji α-syn⁵. Neurony zawierające inkluzje, na co wskazuje barwienie immunohistochemiczne dla pSyn (przeciwciało w Tabeli Materiałów) są obecne w SNpc (Ryc. 7), a także w innych obszarach mózgu, które unerwiają prążkowie (przednie jądro węchowe, motoryczne, obręcz, gruszkowate, przedlimbiczne, somatosensoryczne, śródwęchowe i wyspowe, ciało migdałowate, prążkowie „ ciało migdałowate, prążkowie " <„ „ " „ >„ „ <" „ „ >„ " „ ‥ „ ��^4,5,19. Inkluzje te mają podobne właściwości jak ciała Lewy'ego, takie jak wiązanie tioflawiny S i oporność całkowitego α-syn na proteinazę K (Ryc. 7), jak pokazano za pomocą barwienia immunohistochemicznego (przeciwciało i proteinaza K w tabeli materiałów). Potwierdzenie wysiewu w mózgu wskazuje, że kontrola jakości in vivo została przeprowadzona, a porcje PFF wcześniej zamrożone i zachowane z tej samej partii mogą być sonikowane przy identycznych parametrach, z zatwierdzonymi długościami, w większych eksperymentach.

Rysunek 1. Metody generowania włókienek α-syn. Zarys etapów wymaganych do wytworzenia włókienek z monomerów α-syn. Monomery odwirowuje się przez 10 minut (15 000 x g, w temperaturze 4 °C). Supernatant przenosi się do czystej probówki, a stężenie białka określa się albo przez absorbancję przy 280 nm, albo przez test BCA. Wykres przedstawia stężenia z ludzkich i mysich monomerów α-syn. Kolumny wskazują średnie grupy, słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej ±1. Po określeniu stężenia białka, monomery α-syn rozcieńcza się, krótko wiruje i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 7 dni, wytrząsając na mieszalniku orbitalnym ustawionym na 1000 obr./min. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Metody barwienia w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Schemat barwienia ujemnego do mikroskopii elektronowej. A) Obrazy przedstawiające siatki próbek z mikroskopii elektronowej. Siatka ma matową lub jasną stronę i błyszczącą lub ciemną stronę. Błyszcząca/ciemna strona pokryta jest folią nośną formvar/carbon. B) Ilustracja procedury barwienia. Siatka jest spławiana błyszczącą/ciemną stroną do dołu przy pierwszej kropli ddH₂O przez 1 minutę, a nadmiar jest odprowadzany za pomocą bibuły filtracyjnej. Proces powtarza się z drugą kroplą ddH₂O, rozcieńczonymi PFF lub monomerami, dwiema kroplami octanu uranylu i dwiema dodatkowymi kroplami ddH₂O. Siatki mogą być przechowywane w pudełku siatkowym do czasu zobrazowania. Podziałka = 3 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Montaż niestandardowych strzykawek szklanych z igłą. Schemat kroków wymaganych do montażu strzykawek z igłą szklaną. Rurki kapilarne ze szkła silikonowanego są ciągnięte i cięte w środku w celu wytworzenia szklanych igieł. Rurka z folią termokurczliwą służy do przygotowania metalowej igły i utworzenia wewnętrznego uszczelnienia, gdy szklana igła jest nasunięta na metalową igłę. Dwie dodatkowe warstwy rurki z folii termokurczliwej, które zachodzą na podstawę szklanej igły i metalowej igły, są kolejno dodawane i podgrzewane w celu zabezpieczenia szklanej igły i utworzenia wodoszczelnego uszczelnienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Wizualizacja monomerów α-syn i włókienek α-syn za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Reprezentatywne mikrofotografie monomerów i włókienek α-syn. Górne panele: monomer α-syn myszy i człowieka. Środkowe panele: Pełnowymiarowe PFF dla myszy i ludzi α-syn. Dolne panele: Mysz i człowiek α-syn PFF po sonikacji. Dolny wykres: Rozkład długości PFF dla myszy i ludzi α-syn dla stonowanych. Podziałka = 500 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Potwierdzenie struktur amyloidowych za pomocą testu tioflawiny T. Pomiar sygnału fluorescencyjnego z mysiego i ludzkiego monomeru α-syn oraz próbek PFF. Po lewej: Wyniki z mysich monomerów α-syn i α-syn PFF. Po prawej: Wyniki z ludzkich monomerów α-syn i α-syn PFF. Na każdym wykresie pokazana jest kontrola ujemna dPBS. Wszystkie pomiary są wyrażone jako względne jednostki fluorescencyjne (RFU). Kolumny wskazują średnie grupy, słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej ±1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Test sedymentacji dla granulowanych α-syn. Obrazy z barwionych żeli Coomassie. Pokazane pasma mają około 14 kDa w oparciu o drabinkę białkową. Po lewej: monomer myszy i PFF. Po prawej: Ludzkie monomery i PFF. Dla wszystkich próbek monomerów i PFF pokazano zawieszony osad (P) i supernatant (S). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Cechy inkluzji w modelu szczurzym potwierdzające patologię α-syn. Reprezentatywne mikrofotografie z istoty czarnej pars compacta po 2 miesiącach od wstrzyknięcia. Po lewej: Neurony zawierające pSyn i barwione fioletem krezylowym. Środek: neurony tioflawiny S dodatnie. Po prawej: inkluzje zawierające α-syn odporne na proteinazę K. Pasek skali = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Produkcja α-syn PFF zdolnych do wysiewania neuronów i prowadzenia do inkluzji podobnych do ciał Lewy'ego zależy od wielu czynników i etapów. Krytycznym czynnikiem jest to, że monomery używane do generowania włókienek muszą być specjalnie opracowane do fibrylizacji 4,9,14,15. Jeśli monomery nie są sformułowane do fibrylizacji, fibryle mogą się nie tworzyć lub fibryle, które się tworzą, mogą nie wytwarzać patologii α-syn. Podobnie bufor, w którym znajdują się monomery, również wpływa na fibrylizację. W związku z tym, aby uzyskać najlepsze wyniki, stężenie soli powinno wynosić około 100 mM NaCl, a pH między 7,0 a 7,3. Pierwszym krokiem, który wprowadza zmienność, jest metoda, za pomocą której określa się początkową zawartość białka, przy czym pomiar przy A280 prawdopodobnie da dokładniejsze wyniki i dlatego jest to metoda preferowana. Rozbieżność w stężeniu białka może zmniejszyć skuteczność procesu fibrylacji, a także zmienić założone stężenie PFF stosowane w eksperymentach. Oba mogą prowadzić do spadku wydajności wysiewu i różnic w partiach między eksperymentami.

Wstępne etapy kontroli jakości potwierdzą krytyczne cechy PFF, w szczególności to, że mają one konformację fibrylarną (mikroskopia elektronowa), zawierają struktury amyloidowe (test tioflawiny T) i są granulowane (test sedymentacyjny). Ważne jest, aby pamiętać, że wyniki testu tioflawiny T będą się zmieniać w czasie i nie są bezpośrednią miarą ilości obecnych struktur amyloidowych, a raczej test tioflawiny T powinien być stosowany tylko jako wskaźnik obecności struktur amyloidowych w próbce. Tioflawina T jest zwykle stosowana w testach in vitro, takich jak wyżej wymieniony test, aby wykazać, że fibryle zawierają struktury amyloidowe. Alternatywnie, tioflawina S jest stosowana w tkankach do wykrywania struktur amyloidowych, jak pokazano na rycinie 7. Jeśli chodzi o test sedymentacji, wyniki pokazują jedynie, że PFF występują głównie we frakcji granulowanej. Ponieważ próbki są prowadzone w warunkach denaturacji, na żelach znajduje się pojedyncze wyraźne pasmo o wielkości około 14 kDa, wielkości monomerów α-syn. W przeciwieństwie do wielu prążków obecnych przy wyższych masach cząsteczkowych, których można by się spodziewać w przypadku PFF, gdyby zastosowano żel natywny lub niedenaturujący. Wreszcie, pomyślne przejście wszystkich tych początkowych etapów kontroli jakości nie gwarantuje działania polegającego na zasiewaniu inkluzji α-syn. Z tego powodu należy przeprowadzić eksperymenty z hodowlą komórkową lub małą kohortą zwierząt, którym wstrzyknięto chirurgicznie, w celu zbadania skuteczności PFF przed użyciem w większych eksperymentach.

Sonikacja jest kluczowym krokiem w procesie, a parametry będą się różnić w zależności od zastosowanego modelu sonikatora. Parametry sonikacji muszą być zastosowane i zweryfikowane, aby wykazać, że wyprodukowano krótkie fragmenty PFF. Wielkość włókienek ma wpływ na wysiew, przy czym krótszy filament wysiewa się bardziej efektywnie. Chociaż krótsze włókienki wysiewają się bardziej efektywnie, efekt ten stabilizuje się, a optymalna długość PFF wynosi około 50 nm ^4,18. Ważne jest również, aby nie poddawać próbek nadmiernymi sonikacjami i nie wystawiać PFF na nadmierne ciepło, ponieważ może to obniżyć wydajność wysiewu. Te sonikowane PFF powinny być testowane pod kątem skuteczności w hodowlach małych komórek lub eksperymentach in vivo przed użyciem w eksperymentach na większą skalę. Ponieważ różne sesje sonikacji mogą potencjalnie wprowadzać zmienność, należy odpowiednio zaplanować eksperymentalne grupy leczenia.

Podczas dostarczania PFF in vivo, lokalizacja miejsca wstrzyknięcia i całkowita ilość użytych PFF może wpływać na liczbę neuronów, u których rozwiną się inkluzje, a także na zakres neurodegeneracji ^7,14. Współrzędne w protokole stanowią punkt wyjścia, ale powinny zostać przetestowane w laboratorium, aby upewnić się, że pożądany region docelowy rozwija patologię α-syn przed użyciem w eksperymentach na dużą skalę. W razie potrzeby można użyć barwnika śledzącego lub kulek fluorescencyjnych jako sposobu na przetestowanie kierowania regionalnego przed użyciem PFF. Ilość PFF stosowanych in vivo różni się w zależności od grupy, przy czym większość grup używa łącznie od 5 do 20 μg PFF w jednym lub podzielonym między dwa miejsca wstrzyknięcia 1,2,3,4,5,6,7,14. Ponieważ liczba miejsc wstrzyknięcia, lokalizacja miejsc wstrzyknięć i ilość wstrzykniętych PFF mogą wpływać na wyniki i progresję synukleinopatii, przed użyciem modelu do testowania potencjalnych interwencji lub badania czasowych cech modelu należy scharakteryzować dalsze wyniki zastosowanych parametrów.

Wybierając model do wykorzystania do testowania środków terapeutycznych lub badania progresji choroby, należy wybrać zastosowany model tak, aby jak najlepiej odpowiadał na zadane pytanie. Nie wszystkie modele będą posiadały pewne cechy chorobowe choroby Parkinsona lub będą oferować ramy czasowe potrzebne do przetestowania potencjalnych interwencji. Model PFF podsumowuje kluczowe cechy choroby Parkinsona, takie jak patologia α-syn i neurodegeneracja, i może prowadzić do umiarkowanych zaburzeń motorycznych. Model oferuje przewidywalny i długotrwały przebieg w czasie, w którym inkluzje tworzą się na kilka miesięcy przed neurodegeneracją. Pozwala to naukowcom na zbadanie i wykorzystanie różnych faz przedłużającej się progresji synukleinopatii. Oczekuje się, że obecne i przyszłe wykorzystanie modelu w ujęciu ogólnym będzie korzystne w badaniach nad progresją choroby i opracowywaniem nowych terapii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Thermo Fisher (Gibco)	14190144
Przeciwciało anty-alfa-synukleinowe (fosforylowane przez serynę 129)	Abcam	AB184674
Przeciwciało anty-alfa-synukleinowe	Abcam	AB15530
Kwas bicynchonowy	Thermo Fisher (Pierce)	PI23228
Przezroczysta medyczna rurka termokurczliwa (średnica wewnętrzna 0,036 cala)	Medical	103-0143
Przezroczysta medyczna rurka termokurczliwa (średnica wewnętrzna 0,044")	Nordson Medical	103-0296
Siarczan miedzi	Thermo Fisher (Pierce)	PI23224
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	2231000574
Eppendorf ThermoTop Podgrzewana pokrywa	Eppendorf	5308000003
Formvar/Carbon Siatki do mikroskopii elektronowej	Eletron Microscopy Sciences	FCF300-Cu
Szklana rurka kapilarna (średnica zewnętrzna 0,53 mm; średnica wewnętrzna 0,09 mm; długość 54 mm)	Drummond	22-326223
Ściągacz do igieł szklanych	Narishige	PC-10
Strzykawka Hamilton	Hamilton	80000
Ludzki monomer alfa-synukleiny do generowania wstępnie uformowanych włókienek	Proteos	RP-003
Mysi monomer alfa-synukleiny do generowania wstępnie uformowanych włókien	Proteos	RP-009
Pomarańczowa medyczna rurka termokurczliwa (średnica wewnętrzna 0,021 cala)	Nordson Medical	103-0152
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7543
Proteinaza K	Invitrogen	25530015
końcówką	Qsonica 3,2 mmQsonica	4422
Sonikator Qsonica Q125	Qsonica	Q125
Tioflawina S	Sigma-Aldrich	T1892
Tioflawina T	EMD Milipore	596200
ToxinSensor Chromogenny zestaw do oznaczania endotoksyn LAL Genscript		L00350C
Octan uranylu	Eletron Microscopy Sciences	22400