Przezczaszkowe obrazowanie optyczne umożliwia szerokie obrazowanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w korze mózgowej żywych myszy przez nienaruszoną czaszkę.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) u gryzoni został w dużej mierze zbadany za pomocą kwantyfikacji ex vivo znaczników. Techniki takie jak mikroskopia dwufotonowa i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) umożliwiły ilościowe określenie przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego in vivo, ale są one ograniczone odpowiednio przez zmniejszoną objętość obrazowania i niską rozdzielczość przestrzenną. Ostatnie prace wykazały, że płyn mózgowo-rdzeniowy dostaje się do miąższu mózgu poprzez sieć przestrzeni okołonaczyniowych otaczających tętnice okołonaczyniowe i penetrujące korę gryzonia. To okołonaczyniowe wejście płynu mózgowo-rdzeniowego jest głównym czynnikiem napędzającym układ limfatyczny, szlak zaangażowany w usuwanie toksycznych substancji metabolicznych rozpuszczonych (np. β amyloidu). W tym miejscu ilustrujemy nową technikę obrazowania makroskopowego, która umożliwia mezoskopowe obrazowanie w czasie rzeczywistym fluorescencyjnych znaczników płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę żywych myszy. Ta minimalnie inwazyjna metoda ułatwia wiele projektów eksperymentalnych i umożliwia pojedyncze lub wielokrotne testowanie dynamiki płynu mózgowo-rdzeniowego. Makroskopy charakteryzują się wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową, a ich duża suwnica i odległość robocza pozwalają na obrazowanie podczas wykonywania zadań na urządzeniach behawioralnych. To podejście do obrazowania zostało zwalidowane przy użyciu obrazowania dwufotonowego i pomiarów fluorescencji uzyskanych tą techniką, silnie koreluje z fluorescencją ex vivo i kwantyfikacją znaczników znakowanych radioaktywnie. W tym protokole opisujemy, w jaki sposób przezczaszkowe obrazowanie makroskopowe może być wykorzystane do oceny transportu glimfatycznego u żywych myszy, oferując dostępną alternatywę dla bardziej kosztownych metod obrazowania.
Wprowadzenie
Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) obmywa mózg i rdzeń kręgowy i bierze udział w utrzymaniu homeostazy, dostarczaniu składników odżywczych i regulacji ciśnienia śródczaszkowego1. Płyn mózgowo-rdzeniowy w przestrzeni podpajęczynówkowej dostaje się do mózgu przez sieć przestrzeni okołonaczyniowych (PVS) otaczających tętnice korowe, a następnie spływa w dół wzdłuż tętniczek penetrujących2. Po dotarciu do miąższu płyn mózgowo-rdzeniowy wymienia się z płynem śródmiąższowym (ISF), przenosząc szkodliwe metabolity, takie jak amyloid-β (Aβ) i agregaty białka tau z mózgu przez drogi istoty białej o niskim oporze i przestrzenie okołożyln....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Uniwersytecki Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych (UCAR, Protokół nr 2011-023) na Uniwersytecie w Rochester i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie kaniuli cisterna magna, płyty na głowę i uchwytu na głowę
- Przed zabiegiem wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i płytki głowy.
UWAGA: Znaczniki fluorescencyjne są dostarczane bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego za pośrednictwem kaniulacji cisterna magna. Szczegółowe instrukcje dotyczące tej procedury można znaleźć w Xavier et al
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Napływ płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obrazuje się za pomocą makroskopu epifluorescencyjnego (Rysunek 1A), który umożliwia obrazowanie mezoskopowe transportu znacznika CSF w korze mysiej. Płytka mocowana do całej czaszki pozwala na wizualizację rostralnych kości nosowych, obu kości czołowych i ciemieniowych w centrum oraz rostralnej części kości międzyciemieniowej w kierunku ogonowym (Rysunek 1B). Podczas obrazowania można łatwo zidentyfikować szwy nosowo-czoło.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisaliśmy szczegółowy protokół wykonywania przezczaszkowego obrazowania płynu mózgowo-rdzeniowego u żywych myszy przy użyciu dostępnych na rynku makroskopów fluorescencyjnych i znaczników. Ta technika jest prosta i mało inwazyjna, a jednocześnie ilościowa. Obrazowanie in vivo dobrze koreluje z czułymi metodami, takimi jak zliczanie płynnych znaczników znakowanych radioaktywnie, w tym 3H-dekstranu i 14C-inuliny po dostarczeniu CM, oraz z kwantyfikacją ex vivo przekroju koronalnego1.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke oraz National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 i RF1AG057575 do MN), Program Transatlantyckich Sieci Doskonałości Fondation Leducq oraz unijny program badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (grant nr 666881; SVDs@target). Chcielibyśmy również podziękować Dan Xue za fachową pomoc przy ilustracjach graficznych.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% Bupiwakaina HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 &mikro; L Gazoszczelna strzykawka Model 1710 TLL, PTFE Luer | Lock Hamilton Company | 81020 | |
| AM Systems Cement dentystyczny w proszku | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Wiwarium | ||
| Chlorheksydyna | Prevantics | B10800 | |
| Kamera CMOS | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Płyta czołowa | University of Rochester | Brak katalogu # | Wykonane na zamówienie w warsztacie mechanicznym na Uniwersytecie w Rochester |
| Kauteryzacja wysokotemperaturowa | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Akcelerator Insta-set | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Izofluran - Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamina | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | Brak katalogu #, zobacz link w komentarzach | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Taśma chirurgiczna Micropore | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 - Polietylen .011" x .024" na stopę, 100 ft. ciągły | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Podwójna strzykawka | Aparat Harvard | 70-4501 | |
| PURALUBE MAŚĆ WETERYNARYJNA | Dechra | ||
| Puritan Puritan Patyczki do czyszczenia z bawełnianą końcówką | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Mikroskop badawczy z zoomem makro | Olympus | MVX10 | |
| Prosta płyta mocująca głowę (dla myszy) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Igły jednorazowego użytku, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterylne podkładki nasączone alkoholem | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Przestrajalna dioda LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Ksylazyna | Wiwarium Uniwersytetu w Rochester |
Bibliografia
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
