Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59774

⸱

29 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Translational Neuromedicine, University of Rochester Medical Center, 2Center for Translational Neuromedicine, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przezczaszkowe obrazowanie optyczne umożliwia szerokie obrazowanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w korze mózgowej żywych myszy przez nienaruszoną czaszkę.

Streszczenie

Przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) u gryzoni został w dużej mierze zbadany za pomocą kwantyfikacji ex vivo znaczników. Techniki takie jak mikroskopia dwufotonowa i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) umożliwiły ilościowe określenie przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego in vivo, ale są one ograniczone odpowiednio przez zmniejszoną objętość obrazowania i niską rozdzielczość przestrzenną. Ostatnie prace wykazały, że płyn mózgowo-rdzeniowy dostaje się do miąższu mózgu poprzez sieć przestrzeni okołonaczyniowych otaczających tętnice okołonaczyniowe i penetrujące korę gryzonia. To okołonaczyniowe wejście płynu mózgowo-rdzeniowego jest głównym czynnikiem napędzającym układ limfatyczny, szlak zaangażowany w usuwanie toksycznych substancji metabolicznych rozpuszczonych (np. β amyloidu). W tym miejscu ilustrujemy nową technikę obrazowania makroskopowego, która umożliwia mezoskopowe obrazowanie w czasie rzeczywistym fluorescencyjnych znaczników płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę żywych myszy. Ta minimalnie inwazyjna metoda ułatwia wiele projektów eksperymentalnych i umożliwia pojedyncze lub wielokrotne testowanie dynamiki płynu mózgowo-rdzeniowego. Makroskopy charakteryzują się wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową, a ich duża suwnica i odległość robocza pozwalają na obrazowanie podczas wykonywania zadań na urządzeniach behawioralnych. To podejście do obrazowania zostało zwalidowane przy użyciu obrazowania dwufotonowego i pomiarów fluorescencji uzyskanych tą techniką, silnie koreluje z fluorescencją ex vivo i kwantyfikacją znaczników znakowanych radioaktywnie. W tym protokole opisujemy, w jaki sposób przezczaszkowe obrazowanie makroskopowe może być wykorzystane do oceny transportu glimfatycznego u żywych myszy, oferując dostępną alternatywę dla bardziej kosztownych metod obrazowania.

Wprowadzenie

Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) obmywa mózg i rdzeń kręgowy i bierze udział w utrzymaniu homeostazy, dostarczaniu składników odżywczych i regulacji ciśnienia śródczaszkowego1. Płyn mózgowo-rdzeniowy w przestrzeni podpajęczynówkowej dostaje się do mózgu przez sieć przestrzeni okołonaczyniowych (PVS) otaczających tętnice korowe, a następnie spływa w dół wzdłuż tętniczek penetrujących2. Po dotarciu do miąższu płyn mózgowo-rdzeniowy wymienia się z płynem śródmiąższowym (ISF), przenosząc szkodliwe metabolity, takie jak amyloid-β (Aβ) i agregaty białka tau z mózgu przez drogi istoty białej o niskim oporze i przestrzenie okołożylne2,3. Szlak ten jest zależny od kanałów akwaporyny-4 (AQP4) i dlatego został nazwany układem glejowo-limfatycznym (glimfatycznym) 4. Produkty przemiany materii neuropilu są ostatecznie usuwane z płynu mózgowo-rdzeniowego przez naczynia limfatyczne w pobliżu nerwów czaszkowych i w oponach mózgowych w kierunku węzłów chłonnych szyjnych5. Niepowodzenie tego systemu jest związane z kilkoma chorobami neurologicznymi, takimi jak choroba Alzheimera6,7, urazowe uszkodzenie mózgu3 oraz udar niedokrwienny i krwotoczny8.

transport płynu mózgowo-rdzeniowego można zwizualizować poprzez wprowadzenie znaczników do cisterna magna (CM)9,10 a badania glimfatyczne w przeszłości wykorzystywały głównie mikroskopię dwufotonową 4,11,12,13, rezonans magnetyczny (MRI)14,15,16,17, oraz ex vivo imaging3,6,11,18 do oceny kinetyki znacznika. Mikroskopia dwufotonowa jest odpowiednią metodą do szczegółowego obrazowania znaczników płynu mózgowo-rdzeniowego w PVS i miąższu ze względu na wysoką rozdzielczość przestrzenną, jednak ma wąskie pole widzenia i wymaga inwazyjnego okna czaszkowego lub ścieńczenia czaszki. Obrazowanie ex vivo, w połączeniu z immunohistochemią, umożliwia wielopoziomowe analizy, począwszy od pojedynczych komórek, a skończywszy na całym mózgu19. Jednak proces utrwalania perfuzji, który jest wymagany do obserwacji tkanki pośmiertnej, powoduje głębokie zmiany w kierunku przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego i zapada PVS, znacząco zmieniając rozkład i lokalizację znaczników12. Wreszcie, podczas gdy rezonans magnetyczny może śledzić przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego w całym mózgu myszy i człowieka, brakuje mu przestrzennej i czasowej rozdzielczości przepływu okołonaczyniowego.

Nowa technika, przezczaszkowe obrazowanie makroskopowe, rozwiązuje niektóre z tych ograniczeń, umożliwiając szerokokątne obrazowanie okołonaczyniowego transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w całej korze grzbietowej żywych myszy. Ten rodzaj obrazowania jest wykonywany za pomocą makroskopu epifluorescencyjnego przy użyciu wielopasmowej kostki filtra, przestrajalnego źródła światła LED i wysokowydajnej kamery CMOS10. Te zestawy są w stanie rozdzielić PVS do 1-2 mm poniżej powierzchni czaszki i mogą wykryć fluorofory do 5-6 mm poniżej powierzchni kory mózgowej, pozostawiając czaszkę całkowicie nienaruszoną10. Wielopasmowe filtry i diody LED, które mogą szybko dostroić długość fali wzbudzenia, umożliwiają użycie wielu fluoroforów, co pozwala na znakowanie płynu mózgowo-rdzeniowego znacznikami o różnej masie cząsteczkowej i właściwościach chemicznych w tym samym eksperymencie.

Ta procedura wymaga prostej, minimalnie inwazyjnej operacji odsłonięcia czaszki i umieszczenia lekkiej płytki na głowę, aby ustabilizować głowę podczas sesji obrazowania. Znaczniki mogą być dostarczane do CM bez wiercenia w czaszce lub penetrowania tkanki korowej za pomocą pipet lub kaniuli9,20. Zarówno kaniule CM, jak i płytki głowicy pozostają stabilne przez kilka dni do tygodni i ułatwiają bardziej złożone projekty eksperymentalne w porównaniu z klasyczną wizualizacją punktu końcowego. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przezczaszkowe obrazowanie makroskopowe jest wykorzystywane do badania funkcji układu limfatycznego po ostrym lub przewlekłym wstrzyknięciu fluorescencyjnego znacznika płynu mózgowo-rdzeniowego do CM znieczulonych/śpiących lub obudzonych myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Uniwersytecki Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych (UCAR, Protokół nr 2011-023) na Uniwersytecie w Rochester i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie kaniuli cisterna magna, płyty na głowę i uchwytu na głowę

  1. Przed zabiegiem wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i płytki głowy.
    UWAGA: Znaczniki fluorescencyjne są dostarczane bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego za pośrednictwem kaniulacji cisterna magna. Szczegółowe instrukcje dotyczące tej procedury można znaleźć w Xavier et al9.
  2. Krótko, za pomocą wkrętaka do igieł, złamij końcówkę igły o wymiarach 30G x 12.7 mm (1/2 cala), 3/4 drogi w dół i umieść koniec igły w jednym końcu rurki z polietylenu 10 (PE10) (o długości około 45 cm). Upewnij się, że tylko skos wystaje z krawędzi rurki PE10.
  3. Odłam 1/4 skośnego końca kolejnej igły 30G i umieść koniec pozostałej igły na drugim końcu rurki PE10, z nadal założonym plastikowym zamkiem Luer-lock.
  4. Napełnij szklaną strzykawkę o pojemności 100 μl sterylnym, sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM glukozy i 26 mM NaHCO3).
  5. Przymocuj strzykawkę do końca żyłki i napełnij ją płynem CSF, aż dotrze do końcówki skośnej igły. Ważne jest, aby strzykawka była wypełniona płynem mózgowo-rdzeniowym, a nie powietrzem, ponieważ kolumna powietrzna jest bardziej podatna na zmienne objętości infuzji.
  6. W przypadku eksperymentów przewlekłych pozostaw linię wypełnioną aCSF i pomiń krok 1.7.
  7. W przypadku ostrych eksperymentów należy umieścić strzykawkę na pompie infuzyjnej i pobrać około 5 mm powietrza, co zapobiegnie mieszaniu. Następnie należy pobrać całkowitą objętość znaczników, która jest pożądana w eksperymencie (zaleca się 20% więcej ze względu na straty martwej przestrzeni).
    UWAGA: Rurka PE10 powinna być na tyle długa, aby pęcherzyk powietrza nie dostał się do plastikowego mankietu szklanej strzykawki podczas ładowania znacznika. W typowym eksperymencie w protokole wykorzystuje się 10 μl albuminy surowicy bydlęcej sprzężonej z Alexa Fluor 647 (BSA-647) rozcieńczonej w CSF w stężeniu 0,5%.
  8. Upewnij się, że płyta głowicy pasuje do uchwytu na głowę i że ma odpowiedni rozmiar dla używanej myszy. Znaczniki anatomiczne, które to zapewniają, to: górna granica okna wyrównuje się z linią międzygałkową, a tylna granica opada rostralnie do grzebienia potylicznego.
    UWAGA: Głowice ze stali nierdzewnej można sterylizować i ponownie używać. Większość mieszanin cyjanoakrylanu można usunąć roztworem acetonu.

2. Zabieg chirurgiczny

  1. Zważyć i znieczulić mysz (np. ketamina/ksylazyna; 100 mg/kg ketaminy, 10 mg/kg ksylazyny; i.p.).
  2. Gdy mysz przestanie reagować na uszczypnięcie palca u nogi, zwilż szyję i głowę sterylną wodą i ogol się maszynką do strzyżenia. Po ogoleniu obszaru ponownie przetrzyj go wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć wszelkie resztki włosów.
    UWAGA: Zwilżenie sierści przed strzyżeniem radykalnie zmniejsza ilość włosów w okienku obrazowania po nacięciu.
  3. Umieść mysz w ramce stereotaktycznej na podkładce o kontrolowanej temperaturze i nałóż maść oftalmiczną z wazeliny na oczy myszy, aby upewnić się, że nie wyschną.
  4. Oczyść odsłoniętą skórę wacikiem z chlorheksydyną. Po 2 minutach usuń chlorheksydynę wacikiem nasączonym alkoholem. Na koniec nałóż roztwór jodu, który można pozostawić do wyschnięcia.
  5. Wstrzyknąć podskórnie środek przeciwbólowy (0,25% chlorowodorku bupiwakainy) w górną część czaszki i szyję.
  6. Zaczynając od części szyi, która zakrywa grzebień potyliczny, wykonaj nacięcie linii środkowej w leżącej nad nią skórze i kontynuuj rostralnie w kierunku linii międzyoczodołowej. Naciąć bocznie do granicy, w której mięsień skroniowy wchodzi do czaszki. Usuń całą skórę z wrzecionowatego nacięcia, aby odsłonić zarówno kość czołową, jak i ciemieniową.
    UWAGA: Zatoka zadoczodołowa leży ogonowo do oczu, a duże gałęzie tylnej żyły twarzowej leżą rostralnie do małżowiny usznej. Zachowaj ostrożność podczas wykonywania nacięcia, aby oszczędzić te struktury. Jeśli tak się stanie, zatrzymaj krwawienie, utrzymując hemostazę sterylnym wacikiem przez kilka minut i kontynuuj.
  7. Przepłucz czaszkę sterylną solą fizjologiczną i oczyść powierzchnię za pomocą bawełnianych wacików, aby była wolna od zanieczyszczeń i włosów, ponieważ będą one zakłócać jakość obrazu. Przezroczystość czaszki jest najlepiej zachowana, pozostawiając nienaruszoną okostną i leżącą nad nią powięź.
    UWAGA: Jeśli te struktury zostaną przypadkowo usunięte, czaszka może z czasem stać się sucha i nieprzezroczysta. Ponownie zwilż płynem mózgowo-rdzeniowym lub użyj mieszaniny oleju parafinowego i glicerolu, aby zmniejszyć współczynnik odbicia czaszki w ostrych eksperymentach21.
  8. Przejdź do zakładania kaniuli cisterna magna - szczegóły chirurgiczne tej procedury można znaleźć w Xavier et al9.
  9. Po wprowadzeniu kaniuli CM nałóż mieszaninę cementu dentystycznego z klejem cyjanoakrylowym na brzuszną stronę płytki głowy wokół granicy i umieść ją na czaszce tak, aby przednia granica płytki głowy zrównała się z tylnym końcem kości nosowej, a tylna granica wyrównała się z przednią częścią kości międzyciemieniowej, upewnienie się, że szew strzałkowy (linia środkowa) jest wyśrodkowany i prosty w stosunku do okna (Rysunek 1B).
  10. Napraw położenie płyty czołowej za pomocą kilku kropli akceleratora kleju. Pozostałe szczeliny wypełnić mieszanką cementową i utwardzić przyspieszaczem.
    UWAGA: Upewnij się, że cyjanoakrylan nie styka się z oczami myszy ani nie zasłania okienka obrazowania.
  11. Przyklej kaniulę CM do płyty głównej, aby upewnić się, że nie odczepią się one podczas transportu lub gdy mysz się obudzi.
  12. W przypadku ostrych eksperymentów przejdź do kroku 2.16.
  13. W przypadku eksperymentów przewlekłych nałóż cienką warstwę schnącego kleju cyjanoakrylowego na odsłoniętą czaszkę, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków, ponieważ będą one zakłócać obrazowanie. Klej zapewnia ochronę czaszki i nie zakłóca obrazowania. Upewnij się, że klej pokrywa odsłoniętą czaszkę aż do skóry na granicy nacięcia.
  14. Użyj hemostatu clamp, aby przytrzymać rurkę PE10 wypełnioną CSF w odległości 2-3 cm od CM i przeciąć linię za pomocą końcówki kauteryzującej o wysokiej temperaturze. Po oddzieleniu spłaszcz stopioną rurkę PE10, aby uszczelnić kaniulę.
    UWAGA: Upewnij się, że nie zwalniasz zacisku, dopóki kaniula nie zostanie uszczelniona i upewnij się, że nie ma wycieków w rurce, aby zapobiec przetoce płynu mózgowo-rdzeniowego.
  15. Podawać karprofen (5 mg/kg mc. co 24 godziny przez 3 dni; i.p. lub s.c.) i umieścić mysz z powrotem w jednoosobowej klatce o kontrolowanej temperaturze i pozwolić jej dojść do siebie przez co najmniej 24 godziny przed obrazowaniem. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek. Nienaruszone okna czaszki pozostają stabilne przez kilka tygodni.
    UWAGA: Chroniczny eksperyment można wstrzymać tutaj.
    UWAGA: Niektóre powikłania pooperacyjne to: głowokrwiak/krwiak podgalealny, przetoka płynu mózgowo-rdzeniowego i infekcja.
  16. W przypadku ostrych eksperymentów umieść mysz w uchwycie na głowę za pomocą płytki na głowę, tak aby czaszka znajdowała się w ustalonej pozycji. Upewnij się, że sprawdziłeś poziom znieczulenia i umieść poduszkę grzewczą pod myszką. Mysz jest teraz gotowa do przeniesienia do makroskopu.
    UWAGA: Ostrożnie przewieźć mysz wraz z pompą infuzyjną na wózku. Jeśli kaniulacja CM zostanie przemieszczona, spowoduje to spadek ciśnienia śródczaszkowego, a wszelkie nieszczelności płynu mózgowo-rdzeniowego zmienią wyniki eksperymentalne.

3. Przygotowanie myszy do obrazowania

UWAGA: Protokół różni się w zależności od tego, czy eksperyment obrazowania będzie wykonywany na znieczulonej (początek w kroku 3.1) czy na jawie (początek w kroku 3.2) myszy.

  1. Znieczulone myszy
    1. Umieść uchwyt głowicy na stoliku makroskopu, upewniając się, że nie ma załamań w przewodzie od pompy strzykawkowej do kaniuli CM i że nie jest napięty, ponieważ może to wpłynąć na infuzję znacznika.
    2. Obserwuj częstość oddechów i różowe zabarwienie błon śluzowych, co wskazuje na dobre natlenienie. W razie potrzeby wstrzyknąć sól fizjologiczną podskórnie, aby zapewnić poziom nawodnienia. Sprawdź, czy zwierzę jest wystarczająco znieczulone i w razie potrzeby ponownie dozuj.
    3. Włącz kamerę makroskopu i diodę LED i uruchom tryb LIVE.
    4. Potwierdź powiększenie pola obrazowania tak, aby szew nosowo-czołowy na górze pola i szew lambdoidalny na dole mogły być wyraźnie uwidocznione, przy czym szew strzałkowy jest równoległy i wyśrodkowany do środka obrazu (Rysunek 1C). Po umieszczeniu na miejscu przymocuj uchwyt głowicy do stolika makroskopu za pomocą taśmy.
    5. Ustaw ostroskop makroskopu na odsłoniętej czaszce. Pomimo tego, że makroskopy mają stosunkowo dużą głębię ostrości, krzywizna czaszki myszy pozwala na ustawienie ostrości tylko na określonym obszarze. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy płaszczyzna ogniskowa znajduje się po bocznych stronach kości ciemieniowych za szwami koronalnymi.
      UWAGA: Jest to lokalizacja tętnic środkowych mózgu (MCA), w której występuje większość napływu płynu mózgowo-rdzeniowego (Rysunek 1D,E)10.
  2. Obudź się myszy
    1. Przed sesją obrazowania pozwól zwierzętom dojść do siebie przez co najmniej 24 godziny po operacji płytki głowy. Zalecane są również dłuższe okresy rekonwalescencji (5-7 dni). W tym czasie trenuj mysz tak, aby była zamocowana na stoliku w rurze przytrzymującej przez 0,5-1 godziny dziennie przez cały okres rekonwalescencji.
      UWAGA: Habituacja pozwala na przymocowanie myszy do uchwytu głowy bez znieczulenia i zmniejsza stres i niepokój podczas właściwego eksperymentu. Jeśli nie jest to wykonalne, a znieczulenie nie przeszkadza w eksperymencie, można użyć dawki indukcyjnej wziewnego środka znieczulającego (np. izofluranu 2% przy natężeniu przepływu 1-2 l/minO2) w celu szybkiego przymocowania myszy do stopnia głównego.
    2. Po przymocowaniu myszy do uchwytu na głowę i w rurze przytrzymującej wykonaj kroki 3.1.1-3.1.5.

4. Napar fluorescencyjnych znaczników płynu mózgowo-rdzeniowego

  1. Ostra kaniulacja CM
    1. Ponieważ znacznik został już załadowany do kaniuli przed umieszczeniem go w cisterna magna w kroku 1.6, ustaw pompę infuzyjną na żądaną szybkość i objętość. Rutynowo stosowane paradygmaty infuzji to 5-10 μl przy 1-2 μl/min, ale parametry te można dostosować w zależności od konkretnego eksperymentu lub wielkości i wieku zwierzęcia.
  2. Przewlekła kaniulacja CM
    1. Przed rozpoczęciem sesji obrazowania należy postępować zgodnie z krokami 1.2-1.7 w przypadku ostrych eksperymentów w celu przygotowania linii infuzyjnej do dostarczenia znaczników.
    2. Po przygotowaniu linii, za pomocą zacisku hemostatu odetnij uszczelniony koniec przewlekłej kaniuli CM. Weź igłę z żyłki przygotowanej w kroku 4.2.1 i delikatnie włóż ją do kaniuli. Zwolnij zacisk i za pomocą pompy strzykawkowej przesuń znacznik płynu mózgowo-rdzeniowego z żądaną szybkością infuzji (np. 2 μl/min) na potrzeby eksperymentu, aż znacznik dotrze do wszczepionej igły w CM.
      UWAGA: Jeśli igła przebije się przez rurkę podczas podłączania linii, wyjmij igłę, odetnij przebity segment i powtórz ten krok. Każde rozdarcie rurki PE10 spowoduje nieszczelność i wpłynie na wyniki eksperymentu.

5. Konfiguracja sesji obrazowania

  1. Na podstawie podawanego znacznika fluorescencyjnego określ długość fali wzbudzenia i czas ekspozycji dla każdego kanału. Wybierz najkrótszy czas naświetlania niezbędny do wizualizacji znacznika, aby zmaksymalizować rozdzielczość czasową obrazowania poklatkowego. Ten czas ekspozycji zostanie wykorzystany we wszystkich kolejnych eksperymentach mających na celu porównanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego między różnymi zwierzętami.
    UWAGA: Jedną wskazówką jest użycie znacznika na linii CM w celu dostosowania czasu ekspozycji. Chociaż jest to przydatne pierwsze podejście, z czasem powinno zostać zoptymalizowane.
  2. Wybierz czas trwania eksperymentu i interwały, w których obrazy będą rejestrowane. Eksperymenty trwają zwykle od 30 do 60 minut, w zależności od tego, jaka faza transportu glimfatycznego jest przedmiotem zainteresowania. Liczba klatek na sekundę wynosząca 1 klatkę/min i większa jest wystarczająca w przypadku większości eksperymentów.
  3. Ustaw nazwę pliku i katalog zapisu.
  4. Jeśli obrazowanie będzie wykonywane dodatkowo z jednoczesną akwizycją innych zmiennych (np. elektrokardiogramu, ciśnienia tętniczego krwi, elektrofizjologii), makroskop i pompę można zaprogramować tak, aby były wyzwalane za pomocą oprogramowania do akwizycji danych. Sprawdź, czy funkcja wyzwalania w makroskopie jest poprawna przed przejściem do następnego kroku.

6. Eksperyment z przezczaszkowym obrazowaniem optycznym

  1. Infuzję znacznika i obrazowanie należy rozpocząć w tym samym czasie.
  2. Rutynowo sprawdzaj kaniulę CM i rurkę PE10 pod kątem oznak wycieku. W przypadku nieszczelności znacznika na CM należy wykluczyć wyniki tego eksperymentu.
    UWAGA: Jeśli znacznik zaczyna gromadzić się w móżdżku i nie przemieszcza się szlakiem limfatycznym MCA, jest prawdopodobne, że kaniula CM została wstrzyknięta do móżdżku. Dane te nie powinny być uwzględniane.
  3. W przypadku ostrych eksperymentów, po zakończeniu eksperymentu, wyjmij mysz z mikroskopu i sprawdź, czy jest nadal odpowiednio znieczulona. Szybko odetnij głowę myszy i zbierz tkankę mózgową. Zanurz mózg w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C.
    1. W przypadku eksperymentów przewlekłych, po zakończeniu obrazowania, wyjmij linię CM z kaniuli, przepłucz sterylnym aCSF i ponownie uszczelnij kaniulę CM za pomocą wysokotemperaturowej końcówki kauteryzacyjnej. Zdejmij mysz ze statywu i umieść ją z powrotem w klatce. Powtarzaj ten proces, aż dalsze obrazowanie nie będzie wymagane, a następnie postępuj zgodnie z krokiem 6.3.

7. Analiza danych

UWAGA: Analizy oparte na Matlabie, takie jak śledzenie frontu płynu mózgowo-rdzeniowego, mogą wyodrębnić duże ilości danych ilościowych z frontów śledzenia w tych zestawach danych obrazowania10,22. Jednak te typy plików można również łatwo importować i analizować w oprogramowaniu do analizy obrazów typu open source, takim jak Fiji23.

  1. Zaimportuj stosy obrazów na Fidżi za pomocą narzędzia do importowania Bio-Formats. Ta funkcja zachowa metadane pliku, w tym czas i rozdzielczość pikseli. Zapisz stos obrazów jako plik .tiff.
  2. Ręcznie narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół czaszki lub obszaru zainteresowania za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów. Na przykład w Rysunek 1G ROI został narysowany oddzielnie dla półkuli ipsilateralnej i dla półkuli przeciwległej po urazowym uszkodzeniu mózgu. Upewnij się, że dodałeś ROI do Menedżera ROI (Analyze>Tools>ROI Manager) i zapisz go.
    UWAGA: Transport płynu mózgowo-rdzeniowego można określić ilościowo na dwa główne sposoby: 1) średnia intensywność fluorescencji w czasie lub 2) powierzchnia napływu wyrażona jako procent zwrotu z inwestycji lub całkowita powierzchnia (>mm2) po zastosowaniu progu. Ta ostatnia metoda (Rysunek 1H) zostanie opisana w kolejnych krokach.
  3. Ustaw próg na ramce z maksymalną fluorescencją (Wybierz obraz>Dostosuj próg>...). Zautomatyzowane metody progowe, takie jak Otsu, są zwykle dobre w wykrywaniu śledzenia płynu mózgowo-rdzeniowego. Zastosuj próg.
  4. Zanim przejdziesz dalej, upewnij się, że w polu Analizuj>ustaw pomiary są zaznaczone opcje Powierzchnia i Ułamek powierzchni. Następnie w Menedżerze zwrotu z inwestycji wybierz pozycję Więcej>Wiele miar
    5. .
  5. Przelicz wartość %Area na mm2, używając wartości Obszar ROI z wyjścia. Wartości %Area odzwierciedlają procent powierzchni kory grzbietowej ze znacznikiem płynu mózgowo-rdzeniowego.
  6. Wykreślić napływ znacznika płynu mózgowo-rdzeniowego w mm2 w funkcji czasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Napływ płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obrazuje się za pomocą makroskopu epifluorescencyjnego (Rysunek 1A), który umożliwia obrazowanie mezoskopowe transportu znacznika CSF w korze mysiej. Płytka mocowana do całej czaszki pozwala na wizualizację rostralnych kości nosowych, obu kości czołowych i ciemieniowych w centrum oraz rostralnej części kości międzyciemieniowej w kierunku ogonowym (Rysunek 1B). Podczas obrazowania można łatwo zidentyfikować szwy nosowo-czoło...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisaliśmy szczegółowy protokół wykonywania przezczaszkowego obrazowania płynu mózgowo-rdzeniowego u żywych myszy przy użyciu dostępnych na rynku makroskopów fluorescencyjnych i znaczników. Ta technika jest prosta i mało inwazyjna, a jednocześnie ilościowa. Obrazowanie in vivo dobrze koreluje z czułymi metodami, takimi jak zliczanie płynnych znaczników znakowanych radioaktywnie, w tym 3H-dekstranu i 14C-inuliny po dostarczeniu CM, oraz z kwantyfikacją ex vivo przekroju koronalnego1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke oraz National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 i RF1AG057575 do MN), Program Transatlantyckich Sieci Doskonałości Fondation Leducq oraz unijny program badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (grant nr 666881; SVDs@target). Chcielibyśmy również podziękować Dan Xue za fachową pomoc przy ilustracjach graficznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Bupiwakaina HClUniversity of Rochester Vivarium
100 &mikro; L Gazoszczelna strzykawka Model 1710 TLL, PTFE LuerLock Hamilton Company81020
AM Systems Cement dentystyczny w proszkuFisher ScientificNC9991371
CarprofenUniversity of Rochester Wiwarium
ChlorheksydynaPrevanticsB10800
Kamera CMOSHammamatsuORCA Flash 4.0
Płyta czołowaUniversity of RochesterBrak katalogu #Wykonane na zamówienie w warsztacie mechanicznym na Uniwersytecie w Rochester
Kauteryzacja wysokotemperaturowaBovie Medical CorporationAA01
Akcelerator Insta-setBob Smith IndustriesBSI-151
Izofluran - FlurisoVet One502017University of Rochester Vivarium
KetaminaStrong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy GlueElmer's Products, IncBrak katalogu #, zobacz link w komentarzachhttps://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Taśma chirurgiczna MicroporeFisher Scientific19-027-761
ParaformaldehydSigma-aldrichP6148
PE10 - Polietylen .011" x .024" na stopę, 100 ft. ciągłyBraintree ScientificPE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Podwójna strzykawkaAparat Harvard70-4501
PURALUBE MAŚĆ WETERYNARYJNADechra
Puritan Puritan Patyczki do czyszczenia z bawełnianą końcówkąFisher Scientific22-029-553
Mikroskop badawczy z zoomem makroOlympusMVX10
Prosta płyta mocująca głowę (dla myszy)Narishige International USA IncMAG-1
Igły jednorazowego użytku, BD MedicalVWRBD305106
Sterylne podkładki nasączone alkoholemFisher Scientific22-363-750
Przestrajalna dioda LEDPRIOR Lumen 1600-LED
KsylazynaWiwarium Uniwersytetu w Rochester

Bibliografia

  1. Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
  2. Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
  3. Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
  4. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
  5. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  6. Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
  7. Da Mesquita,, S,, et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  8. Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
  9. Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
  10. Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
  11. Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
  12. Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878(2018).
  13. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  14. Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
  15. Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
  16. Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
  17. Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
  18. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
  19. Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
  20. Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
  21. Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100(2016).
  22. Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Ren, Z., et al. Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
  25. Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
  26. Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434(2017).
  27. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  28. Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
  29. Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
  30. Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Układ glimfatycznyinfuzja znacznika CSFprzestrzenie okołonaczyniowekaniulacja cysterny wielkiejfiksacja płytki głowowejobrazowanie makroskopowe
Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.