Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

23.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59780

⸱

4 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Streszczenie

Edycja genomu za pomocą systemu CRISPR-Cas znacznie zwiększyła możliwości precyzyjnej edycji genomów różnych organizmów. W kontekście komórek ssaków technologia ta stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu w badaniach genomiki funkcjonalnej. Biblioteki przewodnikowych RNA (sgRNA) ukierunkowane na wszystkie otwarte ramki odczytu pozwalają na łatwe generowanie tysięcy zaburzeń genetycznych w jednej puli komórek, które mogą być badane pod kątem określonych fenotypów, aby implikować funkcję genów i procesy komórkowe w sposób bezstronny i systematyczny. Ekrany CRISPR-Cas zapewniają naukowcom prostą, wydajną i niedrogą metodę odkrywania genetycznych planów fenotypów komórkowych. Co więcej, analiza różnicowa badań przesiewowych przeprowadzonych w różnych liniach komórkowych i pochodzących z różnych typów nowotworów może zidentyfikować geny, które są kontekstowo niezbędne w komórkach nowotworowych, ujawniając potencjalne cele dla określonych terapii przeciwnowotworowych. Przeprowadzanie badań przesiewowych całego genomu w komórkach ludzkich może być zniechęcające, ponieważ wiąże się z obsługą dziesiątek milionów komórek i wymaga analizy dużych zestawów danych. Szczegóły tych ekranów, takie jak charakterystyka linii komórkowych, rozważania dotyczące biblioteki CRISPR oraz zrozumienie ograniczeń i możliwości technologii CRISPR podczas analizy, są często pomijane. Poniżej znajduje się szczegółowy protokół pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych opartych na CRISPR-Cas9 dla całego genomu.

Wprowadzenie

CRISPR-Cas, skrót od zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych i nukleazy związanej z CRISPR, składa się z pojedynczego białka nukleazy (np. Cas9) w kompleksie z syntetycznym przewodnikiem RNA (sgRNA). Ten kompleks rybonukleoproteinowy jest ukierunkowany na enzym Cas9, aby indukować dwuniciowe pęknięcia DNA w określonym locus1. Dwuniciowe pęknięcia mogą być naprawione poprzez naprawę kierowaną homologią (HDR) lub, częściej, przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), podatny na błędy mechanizm naprawy, który powoduje insercję i/lub delecje (INDELS), które często zakłócają funkcję genu1. Wydajność i prostota CRISPR umożliwia wcześniej nieosiągalny poziom celowania genomowego, który znacznie przewyższa poprzednie technologie edycji genomu [tj. nukleazy palca cynkowego (ZNF) lub nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALENS), z których obie cierpią z powodu zwiększonej złożoności projektu, niższej wydajności transfekcji i ograniczeń w edycji genów multipleksowych2].

Podstawowa aplikacja badawcza do edycji genomu opartego na pojedynczym przewodniku RNA CRISPR pozwoliła naukowcom efektywnie i niedrogo badać funkcje poszczególnych genów i topologię genetycznych sieci interakcji. Zdolność do wykonywania funkcjonalnych badań przesiewowych całego genomu została znacznie zwiększona dzięki zastosowaniu systemu CRISPR-Cas, szczególnie w porównaniu z wcześniejszymi technologiami zaburzeń genetycznych, takimi jak interferencja RNA (RNAi) i mutageneza pułapek genowych. W szczególności RNAi cierpi z powodu silnych efektów off-target i niepełnego knockdownu, co skutkuje niższą czułością i swoistością w porównaniu z CRISPR3,4,5, podczas gdy metody pułapek genowych są możliwe tylko w komórkach haploidalnych do badań przesiewowych utraty funkcji, ograniczając zakres modeli komórkowych, które można przepytać6. Zdolność CRISPR do generowania całkowitego nokautu genów zapewnia bardziej biologicznie solidny system do badania zmutowanych fenotypów, z niskim poziomem szumów, minimalnymi efektami niepożądanymi i stałą aktywnością we wszystkich odczynnikach5. Biblioteki sgRNA CRISPR-Cas9, które celują w cały ludzki genom, są obecnie szeroko dostępne, umożliwiając jednoczesne generowanie tysięcy nokautów genów w jednym eksperymencie3,7,8,9.

Opracowaliśmy unikalne biblioteki lentiwirusowe sgRNA CRISPR-Cas9 dla całego genomu, zwane bibliotekami Toronto Knock-out (TKO) (dostępne przez Addgene), które są kompaktowe i zoptymalizowane pod kątem sekwencji, aby ułatwić badania przesiewowe genomiki funkcjonalnej w wysokiej rozdzielczości. Najnowsza biblioteka, TKOv3, jest ukierunkowana na ~18 000 ludzkich genów kodujących białka z 71 090 przewodnikami zoptymalizowanymi pod kątem wydajności edycji przy użyciu danych empirycznych10. Dodatkowo, TKOv3 jest dostępny jako jednoskładnikowa biblioteka (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) wyrażająca Cas9 i sgRNA na pojedynczym wektorze, łagodząc potrzebę generowania stabilnych komórek eksprymujących Cas9, umożliwiając nokaut całego genomu w szerokim zakresie typów komórek ssaków. TKOv3 jest również dostępny w wektorze bez Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID# 125517) i może być używany w komórkach, które wyrażają Cas911.

Populacja komórek edytowanych przez CRISPR-Cas9 w całym genomie może być narażona na różne warunki wzrostu, z obfitością sgRNA w czasie określaną ilościowo przez sekwencjonowanie nowej generacji, dostarczając odczytu do oceny wypadania lub wzbogacania komórek z identyfikowalnymi perturbacjami genetycznymi. Biblioteki nokautujące CRISPR można wykorzystać do identyfikacji genów, które po perturbacji powodują defekty sprawności komórkowej, umiarkowaną wrażliwość na leki (np. geny wrażliwe lub oporne), regulują ekspresję białek (np. reporter) lub są wymagane do określonej funkcji szlaku i stanu komórkowego12,13,14. Na przykład badania przesiewowe sprawności różnicowej w linii komórek nowotworowych mogą zidentyfikować zarówno zubożenie lub zmniejszenie onkogenów, jak i wzbogacenie lub zwiększenie liczby genów supresorów nowotworów3,14,15. Podobnie, stosowanie pośrednich dawek leków terapeutycznych może ujawnić zarówno oporność na leki, jak i geny uczulenia16,17.

Dostarczony tutaj jest szczegółowy protokół przesiewowy do badania przesiewowego CRISPR-Cas9 w skali genomu przy użyciu bibliotek Toronto Knock-out (TKOv1 lub v3) w komórkach ssaków od generowania biblioteki, wydajności przesiewowej do analizy danych. Chociaż protokół ten został zoptymalizowany pod kątem badań przesiewowych przy użyciu bibliotek Toronto Knock-out, może być stosowany i skalowalny do wszystkich bibliotek puli CRISPR sgRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane poniżej eksperymenty powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi biura ds. ochrony środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa danego instytutu.

1. Amplifikacja plazmidowej biblioteki lentiwirusem sgRNA CRISPR w puli

  1. Rozcień gotową bibliotekę plazmidowego DNA CRISPR sgRNA do stężenia 50 ng/μL w buforze TE (np. TKOv3).
  2. Przeprowadź elektroporację biblioteki przy użyciu komórek elektrokompetentnych. Przygotuj łącznie cztery reakcje elektroporacji zgodnie z poniższym opisem.
    1. Do schłodzonych kuwet (1,0 mm) na lodzie dodaj 2 μL biblioteki TKO (50 ng/μL) do 25 μL rozmrożonych komórek elektrokompetentnych.
    2. Wykonaj elektroporację, stosując optymalne ustawienia sugerowane w protokole producenta. W ciągu 10 s od impulsu dodaj do kuwety 975 μL pożywki regeneracyjnej (Recovery Medium lub pożywki SOC).
    3. Przenieś elektroporowane komórki do probówki hodowlanej i dodaj 1 mL pożywki regeneracyjnej. Inkubuj probówki w inkubatorze z wytrząsaniem przy 250 rpm przez 1 h w temperaturze 37 °C.
  3. Przygotuj płytkę do rozcieńczeń w celu miareczkowania biblioteki i oszacowania wydajności transformacji.
    1. Połącz wszystkie 8 mL zregenerowanych komórek i dokładnie wymieszaj. Przenieś 10 μL połączonych komórek do 990 μL pożywki regeneracyjnej, aby uzyskać rozcieńczenie 800-krotne, i dokładnie wymieszaj.
    2. Wysiej 20 μL rozcieńczenia na uprzednio ogrzaną płytkę agarową 10 cm LB + karbenicylina (100 µg/L). Daje to 40 000-krotne rozcieńczenie transformantów, które zostanie wykorzystane do obliczenia wydajności transformacji.
    3. Wysiej po 400 μL zregenerowanych komórek na każdą z łącznie 20 uprzednio ogrzanych płytek agarowych 15 cm LB + karbenicylina. Inkubuj płytki przez 14–16 h w temperaturze 30 °C.
      UWAGA: Hodowla w tej niższej temperaturze minimalizuje rekombinację między długimi powtórzeniami końcowymi (LTR)18.
    4. Aby obliczyć wydajność transformacji, policz liczbę kolonii na płytce z rozcieńczeniem 40 000-krotnym (krok 1.3.2). Pomnóż liczbę policzonych kolonii przez 40 000, aby uzyskać całkowitą liczbę kolonii na wszystkich płytkach. Kontynuuj procedurę, jeśli całkowita liczba kolonii odpowiada pokryciu biblioteki wynoszącemu minimum 200 kolonii na sgRNA (najbardziej optymalnie 500-1000x).
      1. Na przykład minimalna liczba kolonii dla biblioteki TKOv3 (71 090 sgRNA) wynosi 1,4 x 107, co odpowiada 200 koloniom na sgRNA. Jeśli reprezentacja kolonii jest niewystarczająca, zwiększ liczbę elektroporacji w kroku 1.2 na podstawie liczby kolonii na płytce do rozcieńczeń, aby osiągnąć minimalne pokrycie biblioteki.
  4. Zbiór kolonii przeprowadź zgodnie z poniższym opisem:
    1. Do każdej płytki 15 cm dodaj 7 mL pożywki LB + karbenicylina (100 µg/L), a następnie zeskrob kolonie za pomocą rozpylacza do komórek. Za pomocą pipety 10 mL przenieś zeskrobione komórki do sterylnej kolby stożkowej lub butelki o pojemności 1 L.
    2. Ponownie przepłucz płytkę 5 mL pożywki LB + karbenicylina i przenieś roztwór do butelki.
    3. Powtórz czynność dla wszystkich płytek, aby połączyć komórki z 20 płytek w jednej sterylnej butelce.
  5. Mieszaj zebrane komórki za pomocą mieszadła magnetycznego przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT), aby rozbić skupiska komórek. Przenieś komórki do wcześniej zważonych butelek do wirowania i wiruj przy 7 000 x g, aby uzyskać pellet bakterii, a następnie odlej pożywkę.
  6. Zważ mokry pellet komórkowy i odejmij masę butelki do wirowania, aby określić końcową masę mokrego pelletu. Oczyść plazmidowe DNA przy użyciu zestawu do oczyszczania plazmidów w skali maxi lub mega, w zależności od ilości pelletu bakteryjnego, jaką może przetworzyć każda kolumna.

2. Produkcja lentiwirusów z biblioteki sgRNA CRISPR na dużą skalę

UWAGA: Wszystkie kroki w tej sekcji protokołu są wykonywane w placówce poziomu BSL2+ w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, typu A2.

  1. Obliczyć liczbę płytek 15 cm wymaganych do produkcji wirusa, przyjmując szacunek, że z jednej płytki 15 cm zazwyczaj pozyskuje się 18 mL wirusa.
  2. Przygotować komórki do transfekcji poprzez wysianie komórek pakujących HEK-293T w pożywce wzrostowej z niską zawartością antybiotyków (DMEM + 10% FBS + opcjonalnie: 0,1x pen/strep) w zagęszczeniu 8 x 106 komórek na płytkę 15 cm w 20 mL pożywki. Inkubować komórki przez noc w 37 °C, 5% CO2. Upewnić się, że w momencie transfekcji wysiane komórki osiągnęły 70%–80% konfluencji i są równomiernie rozłożone.
  3. Następnego dnia przygotować mieszaninę trzech plazmidów do transfekcji zgodnie z opisem w Tabeli 1 dla płytek 15 cm. Obliczyć ilość plazmidu potrzebną do jednej transfekcji i przygotować mieszaninę plazmidów dla wymaganej liczby płytek plus jedna dodatkowa do transfekcji.
  4. Przygotować lipidowy odczynnik do transfekcji dla każdej transfekcji zgodnie z opisem w Tabeli 2. Rozdzielić pożywkę z obniżoną zawartością surowicy do poszczególnych probówek mikrocentryfugowych 1,5 mL zgodnie z liczbą płytek przeznaczonych do transfekcji. Dodać odczynnik do transfekcji, delikatnie wymieszać i inkubować przez 5 min w RT.
  5. Po 5-minutowej inkubacji dodać do odczynnika do transfekcji ilość DNA wymaganą dla jednej transfekcji, aby uzyskać stosunek odczynnika do µg DNA wynoszący 3:1. Delikatnie wymieszać i inkubować przez 30 min w RT.
    UWAGA: Kolejne transfekcje można przygotowywać w zestawach po pięć lub mniej, w odstępach 5-minutowych, aby zoptymalizować czas i uniknąć zbyt długiej inkubacji.
  6. Po 30 min inkubacji ostrożnie przenieść każdą mieszaninę do transfekcji na każdą płytkę z komórkami pakującymi. Całą mieszaninę dodać za pomocą końcówki do pipety 1 mL kroplami, wykonując ruchy okrężne i zygzakowate, aby nie naruszyć monowarstwy komórek. Inkubować komórki w 37 °C przez 18 h przy 5% CO2.
  7. Przygotować pożywkę do zbioru wirusa: 500 mL pożywki DMEM + 32 mL roztworu stokowego BSA (20 g/100 mL, rozpuszczonego w DMEM, wysterylizowanego filtrem 0,22 µm) + 5 mL 100x pen/strep.
  8. Po 18 h usunąć pożywkę (stosować odpowiednie procedury postępowania z odpadami zawierającymi lentiwirusy, np. inkubację w 1% podchlorynie sodu przez 30 min przed utylizacją). Ostrożnie zastąpić ją 18 mL pożywki do zbioru wirusa na każdej płytce. Inkubować komórki w 37 °C przez 18 h przy 5% CO2.
  9. Po 24 h sprawdzić, czy komórki pakujące wykazują nieprawidłową morfologię oraz zrosty, co świadczy o prawidłowej produkcji wirusa. Następnie pozyskać lentiwirusa, zbierając cały nadsącz i przenosząc go do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej.
  10. Wirować pożywkę zawierającą wirusa z prędkością 300 x g przez 5 min w celu osadzenia komórek pakujących. Przenieść nadsącz do sterylnej probówki z polipropylenu, nie naruszając osadu.
  11. Przechowywać wirusa w 4 °C przez krótkie okresy (poniżej 1 tygodnia) lub natychmiast w -80 °C do długotrwałego przechowywania. W przypadku dużych przygotowań wirusa podzielić je na alikwoty o objętościach jednorazowych do długotrwałego przechowywania, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

3. Charakterystyka linii komórkowych do screeningu

  1. Wybierz pożądaną linię komórkową.
    1. Zmierz i zapisz przybliżony czas podwojenia komórek.
    2. Określ optymalną gęstość wysiewu komórek dla hodowli co 3–4 podwojenia w wybranym naczyniu do hodowli tkanek (np. płytkach do hodowli tkanek 15 cm).
  2. W wybranej linii komórkowej określ stężenie puromycyny do selekcji bibliotek TKO zawierających marker oporności na puromycynę w następujący sposób:
    1. Wysiej komórki na płytkę 12-dołkową z gęstością wymaganą do osiągnięcia konfluencji po 72 h, a następnie inkubuj przez noc (37 °C, 5% CO2).
    2. Następnego dnia wymień pożywkę na taką, która zawiera zakres rozcieńczeń stężeń puromycyny od 0 μg/mL do 10 μg/mL, w przyrostach 0,5 μg/mL. Inkubuj komórki przez 48 h.
    3. Po 48 h zmierz żywotność komórek za pomocą liczenia komórek lub barwienia alamarBlue.
    4. Określ najniższe stężenie, które zabija 100% komórek w ciągu 48 h. Stężenia tego użyj do selekcji populacji komórek transdukowanych biblioteką CRISPR w krokach 4.6 i 5.2.6.
      UWAGA: W przypadku linii komórkowych o dłuższym czasie podwojenia dopuszczalna jest dłuższa inkubacja z puromycyną. W takich sytuacjach wyznacz krzywą zabijania dla czasu inkubacji wymaganego dla <3 podwojeń komórek. Zminimalizuj czas selekcji, aby uniknąć utraty genów niezbędnych przed rozpoczęciem screeningu.
  3. Sprawdź wrażliwość komórek na bromek heksadymetryny (do 8 μg/mL), wykonując krzywą zależności od dawki tą samą metodą, która była stosowana do pomiaru wrażliwości na puromycynę (krok 3.2). Jeśli zaobserwowano toksyczność przy stężeniu <8 μg/mL bromku heksadymetryny, nie należy go stosować.

4. Funkcjonalna miareczkowanie połączonej biblioteki lentiwirusów CRISPR w celu określenia MOI

  1. Rozmrozić świeżą alikwotę połączonego lentiwirusa z biblioteką CRISPR sgRNA (np. LCV2::TKOv3) i przechowywać w lodzie.
  2. Zaplanować serię objętości wirusa do przetestowania w zakresie 0–2 mL (tj. 0 mL, 0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL oraz 2 mL).
  3. Zebrać komórki docelowe i wysiać je na płytkach 15 cm z gęstością wymaganą do osiągnięcia konfluencji w ciągu 72 h.
  4. Dla każdej testowanej objętości wirusa przygotować płytki w duplikacie. Dodać komórki, wirusa, bromek heksadymetryny (8 µg/mL) i pożywkę do uzyskania objętości końcowej 20 mL. Dokładnie wymieszać zawartość płytek, ustawić je poziomo w inkubatorze i inkubować przez 24 h (37 °C, 5% CO2).
  5. Po 24 h usunąć pożywkę zawierającą wirusa i zutylizować ją (stosując środki ostrożności biologicznej przy obchodzeniu się z odpadami lentiwirusowymi). Opcjonalnie delikatnie wypłukać płytkę ciepłym PBS, aby usunąć nadmiar wirusa.
  6. Dla każdego warunku z wirusem, w jednej płytce powtórzonej zastąpić pożywkę 20 mL pożywki zawierającej puromycynę w stężeniu wyznaczonym do uśmiercenia komórek w sekcji 3. Do drugiej płytki dodać 20 mL świeżej pożywki bez puromycyny. Inkubować przez 48 h (37 °C, 5% CO2).
  7. Po 48 h sprawdzić, czy wszystkie niezakażone komórki (warunek 0 mL wirusa) traktowane puromycyną obumarły. Zebrać zawartość wszystkich płytek oddzielnie i zdysocjować komórki poprzez wielokrotne delikatne pipetowanie.
  8. Policzyć komórki ze wszystkich płytek i obliczyć MOI dla każdej objętości wirusa, porównując liczbę komórek po selekcji puromycyną z liczbą komórek bez puromycyny (tj. +/- puromycyna).
  9. Przedstawić wyniki na wykresie, aby określić objętość wirusa, która prowadzi do 30%–40% przeżywalności komórek przy selekcji puromycyną w porównaniu z brakiem puromycyny. Użyć tej objętości wirusa, aby osiągnąć MOI 0,3–0,4 podczas przesiewu w tych samych warunkach hodowli tkankowej.

5. Pierwotny przesiew zakażeń, selekcja i pasażowanie komórek

  1. Wybierz stopień pokrycia biblioteki CRISPR sgRNA, który ma zostać utrzymany przez cały czas trwania przesiewu (zalecane minimum 200-krotne).
    1. Na podstawie pokrycia biblioteki określ liczbę komórek wymaganą do utrzymania tego pokrycia na jedno sgRNA oraz liczbę komórek wymaganą do infekcji przy MOI 0,3 (Tabela 3)).
    2. Określ liczbę płytek wymaganą do przeprowadzenia infekcji (Tabela 4)).
  2. Infekowanie komórek biblioteką CRISPR
    1. Zbierz komórki i wysiej wymaganą liczbę komórek na każdą płytkę 15 cm.
    2. Dodaj bromek heksadymetryny (8 µg/mL) do wszystkich płytek.
    3. Dodaj wirusa w objętości wymaganej dla MOI 0,3 do płytek przesiewowych oraz płytek Kontroli 2. W przypadku Kontroli 1 nie dodawaj wirusa, a objętość tę zastąp medium.
    4. Dokładnie wymieszaj zawartość płytek poprzez przechylanie. Umieść płytki w inkubatorze, upewniając się, że znajdują się w poziomie.
      UWAGA: Infekcje seryjne można przeprowadzić poprzez połączenie master mixu wirusa, medium i bromku heksadymetryny z komórkami w zawiesinie przed wysianiem.
    5. Usuń medium i zastąp je świeżym medium zawierającym puromycynę w stężeniu określonym w kroku 3.2.4 na płytkach przesiewowych i płytkach Kontroli 1, 24 h po infekcji wirusowej. Do płytki Kontroli 2 dodaj świeże medium bez puromycyny. Inkubuj komórki przez 48 h (37 °C, 5% CO2).
    6. 48 h po dodaniu puromycyny upewnij się, że wszystkie niezinfekowane komórki obumarły (Kontrola 1), aby potwierdzić aktywność puromycyny, a następnie zbierz zinfekowane komórki.
  3. Zbiór zainfekowanej populacji komórek i pasażowanie komórek
    1. Zbierz komórki wyselekcjonowane puromycyną ze wszystkich płytek przesiewowych do jednego sterylnego pojemnika. Komórki z każdej płytki kontrolnej zbierz oddzielnie. Rozdziel komórki poprzez delikatne, wielokrotne pipetowanie.
    2. Policz komórki z połączonej puli przesiewowej, Kontroli 1 i Kontroli 2 oddzielnie i oblicz liczbę komórek na 1 mL.
    3. Oblicz MOI oraz osiągnięty stopień pokrycia według następujących wzorów:
      Wzór na MOI: całkowita liczba komórek na płytce przesiewowej ÷ liczba komórek na płytce kontrolnej; metoda eksperymentu przesiewowego.
      Wzór na stopień pokrycia: (liczba zainfekowanych komórek × końcowe MOI) ÷ rozmiar biblioteki sgRNA, równanie.
    4. Pobierz trzy powtórzenia osadów komórkowych z połączonej puli komórek przy wybranym pokryciu biblioteki do ekstrakcji genomowego DNA. Centryfuguj komórki przy 500 x g przez 5 min. Przemyj PBS. Opisz probówki i liofilizuj osady komórkowe w temperaturze -80 °C (są to próbki referencyjne T0).
    5. Podziel pulę zainfekowanych komórek na trzy grupy powtórzeń (np. powtórzenie A, powtórzenie B, powtórzenie C), utrzymując pokrycie biblioteki w obrębie każdego powtórzenia. Wysiej komórki z taką samą gęstością wysiewu, jaka jest normalnie stosowana podczas ich namnażania. Użyj tej samej liczby komórek dla każdej płytki powtórzenia i tej samej całkowitej liczby komórek pomiędzy powtórzeniami.
    6. Kontynuuj pasażowanie komórek i zbieraj trzy powtórzenia osadów komórkowych z każdego powtórzenia połączonych komórek zainfekowanych jak opisano wyżej, co 3–8 dni w zależności od linii komórkowej, aż do 15–20 podwojeń komórek. Przy każdym pasażu łącz komórki ze wszystkich płytek w każdej grupie powtórzeń ze sobą (t.j. wszystkie komórki z płytek powtórzenia A są ponownie mieszane razem, wszystkie komórki z płytek powtórzenia B są ponownie mieszane razem itd.).
    7. Opisz każdy osad czasem (T) i oznaczeniem powtórzenia. Odpowiada to liczbie dni po T0, w których osad został zebrany (np. T3_A, T3_B, T3_C itd.).
  4. W przypadku przesiewów lekowych z selekcją negatywną pozwól komórkom na regenerację przez co najmniej jeden pasaż po T0 przed rozpoczęciem leczenia. W punkcie T3 lub T6 podziel komórki z każdej grupy powtórzeń (A, B, C) na populacje poddane działaniu leku i populacje kontrolne, stosując tę samą gęstość wysiewu, co w kroku 5.3.5.
    1. Oddzielnie połącz liczbę komórek wymaganą do pokrycia biblioteki dla każdego powtórzenia w grupie leczonej lekiem. Dodaj lek w stężeniach pośrednich (IC20-IC50). Wysiej komórki i inkubuj (37 °C, 5% CO2) do następnego pasażu.
    2. Oddzielnie połącz liczbę komórek wymaganą do pokrycia biblioteki dla każdego powtórzenia w grupie kontrolnej (nośnik). Dodaj kontrolę nośnika w tej samej objętości co lek (<0,5% v/v). Wysiej komórki i inkubuj (37 °C, 5% CO2) do następnego pasażu.
    3. Kontynuuj pasażowanie komórek i zbieraj osady komórkowe do izolacji genomowego DNA co 3 dni, zgodnie z opisem w kroku 5.3.5, odświeżając lek lub nośnik przy każdym pasażu.
  5. W przypadku przesiewów z selekcją pozytywną lub przesiewów oporności na leki podziel każdą grupę powtórzeń zgodnie z liczbą komórek wymaganą do pokrycia biblioteki. Dodaj stężenia leku IC90 do każdego powtórzenia. Przy IC90 większość komórek zostanie zabita. Pozwól populacjom opornym na wzrost i zbierz osady komórkowe (1–2 x 107 komórek) do ekstrakcji genomowego DNA.

6. Przygotowanie próbek CRISPR i sekwencjonowanie

  1. Oczyszczanie genomowego DNA
    1. Zamrożone osady komórkowe inkubować przez 5–10 min w RT w celu rozmrożenia.
    2. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL zawierającej osad komórkowy dodać 1,4 mL PBS. Mieszać na wirówce typu vortex przez 20 s w celu resuspensji komórek, a następnie pozostawić na 1 min. W razie potrzeby pipetować 15x za pomocą P1000, aby rozbić pozostałe aglomeraty komórkowe. W przypadku przenoszenia komórek z probówki 15 mL lub 1,5 mL, resuspender komórki w 1 mL PBS, następnie przenieść je do probówki 50 mL i wypłukać pierwotną probówkę 400 µL PBS.
    3. Do resuspenderowanych komórek dodać 5 mL roztworu do lizy jąder (Nuclei Lysis Solution). Za pomocą pipety 10 mL wymieszać próbkę, pipetując 5x w górę i w dół.
    4. Do lizatu jądrowego dodać 32 µL RNazy A (20 mg/mL; aby uzyskać stężenie końcowe 100 µg/mL) i wymieszać próbkę, odwracając probówkę 5x. Mieszaninę inkubować w temperaturze 37°C przez 15 min, a następnie pozwolić próbce ostygnąć przez 10 min w RT.
    5. Do lizatu dodać 1,67 mL roztworu do precypitacji białek (Protein Precipitation Solution) i intensywnie mieszać na vortexie przez 20 s. Po wymieszaniu mogą być widoczne małe grudki białek.
    6. Wirować przy 4 500 x g przez 10 min w RT.
    7. Za pomocą pipety 10 mL przenieść nadsącz do probówki wirówkowej 50 mL zawierającej 5 mL izopropanolu. Delikatnie wymieszać roztwór 10x poprzez odwracanie aż do zaobserwowania DNA.
      UWAGA: DNA może być widoczne jako białe, nitkowate pasma tworzące widoczną masę.
    8. Wirować przy 4 500 x g przez 5 min w RT, aby uzyskać osad DNA.
    9. Za pomocą pipety 10 mL ostrożnie usunąć nadsącz, unikając naruszenia osadu DNA. Do DNA dodać 5 mL 70% etanolu w RT. Delikatnie obracać probówką, aby wypłukać osad DNA oraz ścianki probówki wirówkowej.
    10. Wirować przy 4 500 x g przez 5 min w RT.
    11. Za pomocą pipety 10 mL ostrożnie usunąć 70% etanol, unikając naruszenia osadu DNA. Suszyć genomowe DNA na powietrzu przez 10 min w RT.
    12. Do probówki dodać 400 µL roztworu TE i pozwolić DNA rozpuścić się poprzez inkubację w 65 °C przez 1 h. Mieszać DNA, delikatnie potrząsając probówką co 15 min. Jeśli DNA nie rozpuści się całkowicie, inkubować probówkę w 65 °C przez dodatkową 1 h, delikatnie potrząsając nią co 15 min, a następnie pozostawić w 4 °C przez noc.
    13. Wirować przy 4 500 x g przez 1 min w RT i przenieść genomowe DNA do probówki 1,5 mL o niskim wiązaniu (low-binding).
    14. Oznaczyć ilość i czystość genomowego DNA zarówno za pomocą spektrofotometru (dla całkowitej zawartości kwasów nukleinowych), jak i fluorometru (dla zawartości dwuniciowego DNA).
  2. Opcjonalnie wyprecypitować genomowe DNA, jeśli wystąpią problemy z późniejszą amplifikacją PCR sgRNA, w następujący sposób:
    1. Przenieść 400 µL genomowego DNA do probówki mikrowirówkowej 1,5 mL.
    2. Dodać 18 µL 5 M NaCl (stężenie końcowe 0,2 M) oraz 900 µL 95% etanolu.
    3. Odwracać probówkę 10x aż do dokładnego wymieszania, a następnie wirować przy 16 000 x g przez 10 min w RT.
    4. Ostrożnie usunąć nadsącz, unikając naruszenia osadu DNA. Wypłukać osad DNA 500 µL 70% etanolu. Delikatnie obracać probówką, aby wypłukać osad DNA.
    5. Wirować przy 16 000 x g przez 5 min w RT.
    6. Ostrożnie usunąć nadsącz, unikając naruszenia osadu DNA. Suszyć genomowe DNA na powietrzu przez 10 min w RT.
    7. Dodać 300 µL TE, aby rozpuścić DNA, zgodnie z opisem w punkcie 6.1.12.
    8. Oznaczyć ilość i czystość genomowego DNA zgodnie z opisem w punkcie 6.1.14.
  3. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania CRISPR
    1. Przygotować reakcję PCR 1 zgodnie z Tabelą 5, używając łącznie 100 μg genomowego DNA. Dodać 3,5 μg genomowego DNA na 50 μL reakcji i przygotować identyczne reakcje 50 μL, aby uzyskać pożądany stopień pokrycia. Tabela 6 zawiera przykłady sekwencji starterów do amplifikacji bibliotek sekwencjonowania LCV2::TKOv3. Tabela 7 zawiera przykłady sekwencji starterów do amplifikacji bibliotek sekwencjonowania pLCKO2::TKOv3.
    2. Przeprowadzić amplifikację w reakcjach PCR 1 w termocyklerze zgodnie z programem opisanym w Tabeli 8.
    3. Sprawdzić amplifikację PCR 1, nanosząc 2 μL produktu PCR na 1% żel agarozowy. PCR 1 daje produkt o wielkości 600 bp.
    4. Połączyć wszystkie poszczególne reakcje 50 μL dla każdej próbki genomowego DNA i wymieszać na vortexie.
    5. Przygotować jedną reakcję PCR 2 (50 μL) dla każdej próbki zgodnie z Tabelą 9, używając 5 μL połączonego produktu PCR 1 jako matrycy. Dla każdej próbki zastosować unikalne kombinacje starterów indeksujących, aby umożliwić łączenie próbek biblioteki sekwencjonowania.
    6. Przeprowadzić amplifikację w reakcji PCR 2 w termocyklerze zgodnie z programem opisanym w Tabeli 10.
    7. Oczyścić sprzęt do żeli agarozowych za pomocą 0,1 N HCl przez 10 min przed odlaniem żelu w celu oczyszczenia produktów amplifikacji. Przygotować 2% żel agarozowy zawierający barwnik do DNA do oczyszczania produktów amplifikacji PCR 2.
    8. Rozdzielić produkt PCR 2 na 2% żelu agarozowym przy niskim napięciu (czas przebiegu 1,0–1,5 h). PCR 2 daje produkt o wielkości 200 bp.
    9. Wizualizować produkty PCR na transiluminatorze światła niebieskiego. Wyciąć prążek 200 bp i oczyścić DNA z wycinka żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu. Oznaczyć ilość i czystość biblioteki sekwencjonowania za pomocą spektrofotometru i fluorometru.
      UWAGA: Typowe stężenie oczyszczonej z żelu biblioteki sekwencjonowania mieści się w zakresie 5–10 ng/μL, a całkowita wydajność wynosi 150–300 ng.
  4. Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe
    1. Przeprowadzić sekwencjonowanie bibliotek CRISPR na sekwenatorach nowej generacji.
    2. Sekwencjonować próbki referencyjne T0 przy większej głębokości odczytu, zapewniając 400- do 500-krotne pokrycie biblioteki. Próbki z eksperymentalnych punktów czasowych dla przesiewów drop-out sekwencjonować przy minimalnej głębokości odczytu 200-krotnej. Dla silnych przesiewów selekcji pozytywnej wystarczająca do identyfikacji wzbogaconych sgRNA jest minimalna głębokość odczytu na poziomie 50-krotnego pokrycia.
      UWAGA: Kluczowe jest zsekwencjonowanie próbki T0 w celu określenia reprezentacji biblioteki dla danego przesiewu oraz jako punkt odniesienia do wyznaczania zmian krotności sgRNA w czasie.

7. Analiza danych

  1. Wykonaj dopasowanie sekwencji za pomocą programów takich jak Bowtie, aby zmapować odczyty sekwencji do biblioteki referencyjnej, stosując następujące parametry: -v2 (dopuszczając dwa niedopasowania) oraz -m1 (odrzucając każdy odczyt zmapowany do więcej niż jednej sekwencji w bibliotece).
  2. Znormalizuj liczbę unikalnie zmapowanych odczytów dla każdego sgRNA dla danej próbki do 10 milionów odczytów na próbkę w następujący sposób:
    Równanie normalizacji odczytów sgRNA; formuła analizy odczytów, eksperyment molekularny.107
  3. Oblicz log2-krotność zmiany (log2 fold change) dla każdego sgRNA dla każdej repliki w każdym punkcie czasowym (Tn) w porównaniu z próbką T0 (Tn/T0). Do wszystkich liczb odczytów dodaj pseudo-liczbę (pseudo count) 0,5 odczytu, aby uniknąć nieciągłości wynikających z zer. Wyklucz z obliczeń krotności zmiany i dalszej analizy sgRNA, które mają <30 surowych odczytów w próbce T0.
  4. Przeanalizuj krotności zmian za pomocą algorytmu Bayesian Analysis of Gene Essentiality (BAGEL) , wykorzystując wcześniej zdefiniowane19 rdzenne zestawy treningowe genów niezbędnych i nie-niezbędnych dla przesiewów niezbędności genów (Tabela uzupełniająca S1) lub DrugZ dla przesiewów lekowych20.
  5. Oblicz precyzję i pełność (precision and recall) w celu oceny wydajności przesiewu, korzystając z wyników BF. Wykorzystaj zestaw genów niezbędnych z kroku 7.4 jako listę prawdziwie dodatnich dla funkcji precision_recall_curve z biblioteki Scikit-learn dla języka Python, wraz z powyższym podzbiorem wyników BF. Alternatywnie, wykonaj tę samą operację przy użyciu pakietu PRROC w języku R.
  6. Oblicz średnią krotność zmiany dla wszystkich przewodników (guides) dla każdego genu. Wygeneruj wykresy gęstości dla genów niezbędnych i nie-niezbędnych (patrz krok 7.4) w programie R lub równoważnym oprogramowaniu. W języku R, jeśli x.ess jest wektorem zawierającym wartości log-krotności zmiany dla genów niezbędnych, a x.nonEss zawiera geny nie-niezbędne, wykonaj wykres za pomocą następującego polecenia:
    plot( density( x.ess ), xlab=”mean logFC”,col=”red”,lwd=2 )
    lines( density( x.nonEss ), col=”blue”,lwd=2 )
    UWAGA: Szczegóły dotyczące wersji Pythona i użytych pakietów znajdują się w scikit-learn v0.19.1: (opublikowanym przez Pedregosa et al.21).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przegląd schematu badań przesiewowych CRISPR w skali całego genomu

Rysunek 1 przedstawia schemat przebiegu pracy w ramach wspólnego (pooled) screeningu CRISPR, rozpoczynającego się od infekcji komórek docelowych lentiwirusem zawierającym bibliotekę CRISPR przy niskim MOI, aby zapewnić pojedyncze zdarzenia integracji i odpowiednią reprezentację biblioteki (zazwyczaj 200- do 1000-krot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ze względu na prostotę użycia i wysoką giętkość, technologia CRISPR jest powszechnie stosowana jako narzędzie z wyboru do precyzyjnej edycji genomu. Zbiorcze badania przesiewowe CRISPR zapewniają metodę badania tysięcy zaburzeń genetycznych w jednym eksperymencie. W badaniach przesiewowych połączonych biblioteki sgRNA służą jako molekularne kody kreskowe, ponieważ każda sekwencja jest unikalna i jest mapowana do docelowego genu. Izolując genomowe DNA z populacji komórek, geny powodujące fenotyp będący przedmiotem zainter...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Genome Canada, Ontario Research Fund i Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 mikrona
30° Inkubator płytkowy
37° C inkubator
37° C, 5% CO2 inkubator
5 M NaClPromegaV4221
50X bufor TAEBioShopTAE222.4
6 N Roztwór kwasu solnegoBioShopHCL666.500
95% Etanol
Alamar niebieskiThermoFisher ScientificDAL1025
Nadajnik światła niebieskiegoThermoFisher ScientificG6600
Albumina surowicy bydlęcej, izolacja szoku cieplnego, frakcja V. Min. 98%, klasa biotechnologicznaBioshopALB001.250
Modyfikacja Dulbecco Orły Technologie ŚredniegoŻycia11995-065Pożywki do hodowli Cel
Kuwety do elektroporacjiBTX45-0134
ElektroporatorBTX45-0651
Ogniwa elektrokompetentne EnduraLucigen90293
Surowica bydlęcapłodu GIBCO12483-020
HEK293T komórki do pakowaniaATCCCRL-3216zalecany numer przejścia < 15
Bromek heksadimetryny (polibren)SigmaH9268Polimer kationowy zwiększający wydajność transdukcji
heksadimetryny (polibren)
LB z karbenicyliną
Pożywka LB z karbenicyliną
Drabinka DNA o niskiej masie cząsteczkowejNew England BiolabsN3233S
Spektrofotometr NanodropThermoFisher ScientificND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master MixNew England BiolabsM0544L
Opti-MEMLife Technologies31985-070Zredukowane podłoże surowicy
Zestaw do oczyszczania plazmidu maxiQiagen12963
pMD2.G (plazmid kopertowy)Addgene Plasmid #12259układ lentiwirusowy
psPAX2 (plazmid opakowania)AddgenePlasmid #12260układ lentiwirusowy
PuromycinBisent400-160-UG
QIAszybki zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704
Qubit dsDNA BRTest ThermoFisher ScientificQ32853
Fluorometr kubitowyThermoFisher ScientificQ33226
RNAzywa AInvitrogen12091021
pożywka regeneracyjna S.O.CInvitrogen15544034
SYRB Bezpieczne barwienie żelowe DNAThermoFisher ScientificS33102
Toronto KnockOut CRIPSR (TKOv3) - Cas9 w zestawieAddgeneAddgene ID #90203Biblioteka CRISPR obejmująca cały genom, zawiera Cas9, 71,090 sgRNA
Biblioteka Toronto KnockOut CRIPSR (TKOv3) - non-cas9AddgeneAddgene ID #125517Biblioteka CRISPR obejmująca cały genom, bez Cas9, roztwór 71 090 sgRNA
Tris-EDTA (TE), pH8.0
UltraPure agarozaThermoFisher Scientific16500500
Wizard zestaw do oczyszczania genomowego DNAOdczynnikA1120
X-tremeGENE 9Roche06 365 809 001Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów
Filtr Cz wytrząsaniem Płytki agarowe do transfekcji DNA Promega

Bibliografia

  1. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
  2. Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
  3. Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  4. Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
  5. Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  6. Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
  7. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  8. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  9. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
  12. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
  15. Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
  16. Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
  17. Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
  18. Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
  19. Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164(2016).
  20. Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
  21. Pedregosa, F. V., G,, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
  22. Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213(2011).
  23. Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
  24. Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
  25. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554(2014).
  26. Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
  27. Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
  28. Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiewy genetyczne CRISPRpo czone przesiewy CRISPRedycja genomugenomika funkcjonalnabiblioteki gRNAtransdukcja lentiwirusemsekwencjonowanie nowej generacjiknockout genuanaliza precyzji i pe no ci precision recall
Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.