Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59830

⸱

17 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University, 2The Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, 3School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 4Department of Tissue and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Hubei Provincial Key Laboratory of Developmentally Originated Disease, Wuhan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Streszczenie

Interakcje białko-kwas nukleinowy odgrywają ważną rolę w procesach biologicznych, takich jak transkrypcja, rekombinacja i metabolizm RNA. Eksperymentalne metody badania interakcji białko-kwas nukleinowy wymagają użycia znaczników fluorescencyjnych, izotopów promieniotwórczych lub innych znaczników do wykrywania i analizowania określonych cząsteczek docelowych. Biotyna, nieradioaktywny znacznik kwasu nukleinowego, jest powszechnie stosowana w testach przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), ale nie jest regularnie stosowana do monitorowania aktywności białek podczas procesów kwasów nukleinowych. Protokół ten ilustruje użyteczność znakowania biotyną podczas reakcji enzymatycznych in vitro, wykazując, że etykieta ta dobrze współpracuje z szeregiem różnych testów biochemicznych. W szczególności, zgodnie z wcześniejszymi odkryciami przy użyciu radioizotopowych substratów 32znakowanych P, potwierdzono za pomocą EMSA znakowanego biotyną, że MEIOB (białko specyficznie zaangażowane w rekombinację mejotyczną) jest białkiem wiążącym DNA, że MOV10 (helikaza RNA) rozwiązuje znakowane biotyną struktury dupleksowe RNA i że MEIOB rozszczepia jednoniciowe DNA znakowane biotyną. Badanie to pokazuje, że biotyna jest zdolna do podstawiania 32P w różnych testach biochemicznych związanych z kwasami nukleinowymi in vitro.

Wprowadzenie

Interakcje białko-kwas nukleinowy są zaangażowane w wiele istotnych procesów komórkowych, takich jak naprawa DNA, replikacja, transkrypcja, przetwarzanie RNA i translacja. Interakcje białek ze specyficznymi sekwencjami DNA w obrębie chromatyny są wymagane do ścisłej kontroli ekspresji genów na poziomie transkrypcji1. Precyzyjna regulacja potranskrypcyjna licznych kodujących i niekodujących RNA wymaga rozległych i skomplikowanych interakcji między dowolnym białkiem a RNA2. Te warstwy mechanizmu regulacji ekspresji genów obejmują kaskadę dynamicznych zdarzeń międzycząsteczkowych, które są koordynowane przez interakcje czynników transkrypcyjnych/epigenetycznych lub białek wiążących RNA z ich celami kwasów nukleinowych, a także interakcje białko-białko. Aby zbadać, czy białka in vivo są bezpośrednio lub pośrednio związane z kwasami nukleinowymi oraz w jaki sposób takie powiązania zachodzą i osiągają kulminację, przeprowadza się testy biochemiczne in vitro w celu zbadania powinowactwa wiązania lub aktywności enzymatycznej białek będących przedmiotem zainteresowania na zaprojektowanych substratach DNA i/lub RNA.

Opracowano wiele technik wykrywania i charakteryzowania kompleksów kwas-białko nukleinowe, w tym test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), określany również jako test opóźnienia żelu lub test przesunięcia pasma3,4,5. EMSA to wszechstronna i czuła metoda biochemiczna, która jest szeroko stosowana do badania bezpośredniego wiązania białek z kwasami nukleinowymi. EMSA opiera się na żelowym przesunięciu elektroforetycznym w pasmach, które są rutynowo wizualizowane za pomocą chemiluminescencji w celu wykrycia etykiet biotyny6,7, fluorescencja etykiet fluoroforowych8,9, lub autoradiografia radioaktywnych etykiet 32P10,11. Innymi celami badań biochemicznych są identyfikacja i charakterystyka aktywności białek w zakresie przetwarzania kwasów nukleinowych, takich jak reakcje oparte na nukleazach w celu oceny produktów rozpadu z substratów kwasów nukleinowych12,13,14 oraz testy odwijania struktury DNA/RNA w celu oceny aktywności helikazy15,16,17.

W takich testach aktywności enzymatycznej, kwasy nukleinowe znakowane radioizotopem lub fluoroforem są często używane jako substraty ze względu na ich wysoką czułość. Analiza zdjęć rentgenowskich reakcji enzymatycznych z udziałem radioznaczników znakowanych 32znakami P okazała się czuła i odtwarzalna18. Jednak w coraz większej liczbie laboratoriów na świecie stosowanie izotopów promieniotwórczych jest ograniczone lub nawet zabronione ze względu na zagrożenia dla zdrowia związane z potencjalnym narażeniem. Oprócz obaw o bezpieczeństwo biologiczne, inne wady to wymagany niezbędny sprzęt do prowadzenia pracy z izotopami promieniotwórczymi, wymagana licencja na radioaktywność, krótki okres półtrwania wynoszący 32P (około 14 dni) oraz stopniowe pogarszanie się jakości sondy z powodu radiolizy. W związku z tym opracowano alternatywne metody nieizotopowe (tj. znakowanie sondy fluoroforami umożliwia detekcję za pomocą obrazowania fluorescencyjnego19). Jednak w przypadku korzystania z sond znakowanych fluorescencyjnie potrzebny jest system obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Biotyna, powszechnie stosowana etykieta, łatwo wiąże się z makrocząsteczkami biologicznymi, takimi jak białka i kwasy nukleinowe. System biotyna-streptawidyna działa wydajnie i poprawia czułość wykrywania bez zwiększania niespecyficznego tła20,21. Oprócz EMSA, biotyna jest szeroko stosowana m.in. do oczyszczania białek i ściągania RNA22,23,24.

Ten protokół z powodzeniem wykorzystuje znakowane biotyną kwasy nukleinowe jako substraty do testów biochemicznych in vitro, które obejmują EMSA, oprócz reakcji enzymatycznych, w których biotyna nie była powszechnie stosowana. Domena MEIOB OB jest skonstruowana, a dwie mutanty (skrócenie i mutacja punktowa) są wyrażone jako białka fuzyjne GST25,26,27, a także rekombinowane białko fuzyjne FLAG myszy MOV1016. Niniejszy raport podkreśla skuteczność tego połączonego protokołu w oczyszczaniu białek i testach znakowanych biotyną do różnych celów eksperymentalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Preparat białkowy

  1. Konstrukcje wyrażeń MEIOB i MOV10
    1. Generuj konstrukty ekspresji cDNA kodujące mysie MEIOB-A, C i E (Rysunek 1A) i MOV10.
      1. Ustaw reakcje reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) dla każdego fragmentu. Wymieszać 1 μl mysiego cDNA (z jądra myszy C57BL/6), 1 μl dNTP, 2 μl 10 μM startera do przodu, 2 μL 10 μM startera wstecznego, 1 μL polimerazy DNA, 25 μL buforu 2x PCR i 18 μL podwójnie destylowanegoH2O(ddH2O) w końcowej objętości 50 μL.
        UWAGA: Startery do amplifikacji fragmentów genów Meiob i Mov10 są wymienione w Tabeli 1.
      2. Reakcje PCR należy przeprowadzić przy użyciu następujących programów: 95 °C przez 5 min, 35 cykli ogrzewania w temperaturze 95 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 64 °C przez 15 s, wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 20 s (2 minuty dla wydłużenia MOV10) i końcowe przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 7 min.
        UWAGA: Użyj pary starterów MEIOB-E (F1) i MEIOB-E-mut (R1) oraz MEIOB-E-mut (F2) i MEIOB-E (R2), aby amplifikować dwa segmenty zawierające zmutowaną sekwencję w nakładającej się sekwencji odpowiednio na końcach 3' i 5', aby wygenerować zmutowaną matrycę PCR.
    2. Przeanalizuj amplifikowane DNA PCR za pomocą elektroforezy żelowej, szybko odetnij pasmo o wymaganym rozmiarze z żelu pod lampą UV i umieść w probówce wirówkowej.
      UWAGA: Oczekiwane rozmiary produktów widoczne na żelu agarozowym dla MEIOB-A to 536 pz, MEIOB-C to 296 pz, MEIOB-E to 312 pz i 229 pz, a MOV10 to 3015 pz.
    3. Oczyść DNA PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.
      1. Dodać równą objętość rozpuszczalnego buforu do probówki wirówkowej z kroku 1.1.2 i stopić żel w łaźni wodnej o temperaturze 50-55 °C przez 5-10 minut, upewniając się, że kawałki żelu całkowicie się stopią. Odwirować na krótko, aby zebrać wszelkie kropelki ze ścianki probówki.
        UWAGA: Stężenie masowe/objętościowe żelu i buforu do rozpuszczania wynosi 1 mg/μL.
      2. Umieścić kolumnę adsorpcyjną w probówce zbiorczej, przenieść roztwór zawierający rozpuszczony fragment żelu do kolumny adsorpcyjnej i odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty.
      3. Wyrzucić filtrat znajdujący się na dnie probówek zbiorczych. Dodać 600 μl buforu do przemywania do kolumny, odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę i wyrzucić filtrat.
      4. Powtórz krok 1.1.3.3 jeden raz.
      5. Umieścić kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej i odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty, aby usunąć cały pozostały bufor do płukania.
      6. Umieścić kolumnę adsorpcyjną w wysterylizowanej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodać 50 μl ddH2O do środka kolumny adsorpcyjnej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min. Zmierzyć stężenie DNA w eluacie za pomocą spektrofotometru.
    4. Trawienie restrykcyjne plazmidów
      1. Traw wektor pGEX-4T-1 za pomocą BamHI i NotI. W tym celu należy zmieszać 4 μg wektora pGEX-4T-1, 5 μl 10x buforu do trawienia, 1 μl BamHI i 1 μL NotI i ddH2O do uzyskania końcowej objętości reakcji 50 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
      2. Trawić wektor pRK5 z BamHI i XhoI przez zmieszanie 4 μg wektora pRK5, 5 μl 10-krotnego buforu mineralizującego, 1 μL BamHI i 1 μL XhoI i ddH2O do końcowej objętości reakcji 50 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    5. Przeanalizuj DNA wektora za pomocą elektroforezy żelowej, szybko odetnij pożądany rozmiar pasma z żelu za pomocą skalpela pod lampą UV i umieść go w probówce wirówkowej.
    6. Oczyścić DNA wektora za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu jak w ppkt 1.1.3 zgodnie z instrukcją producenta.
      UWAGA: Długość zlinearyzowanych plazmidów: pGEX-4T-1, 4,4 kb; pRK5, 4.7 kb.
    7. Ustawić standardową reakcję ligacji rekombinowanej, łącząc 0,03 pmol zlinearyzowanego wektora, 0,06 pmol fragmentu cDNA, 2 μl ligazy i 4 μl 5x buforu ligazy i ddH2O w końcowej objętości reakcji 10 μL.
      UWAGA: Sklonuj MEIOB-A, C i E do wektora pGEX-4T-1 i MOV10 do wektora pRK5.
    8. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie natychmiast schłodzić reakcję przez 5 minut na lodzie. Przekształć rekombinowane plazmidy MEIOB w bakterie BL21 i rekombinowane plazmidy MOV10 w bakterie DH5α.
      UWAGA: Sprawdź wszystkie rekombinowane konstrukty za pomocą sekwencjonowania Sangera.
    9. Przygotować zapasy glicerolu w kulturach bakteryjnych zawierających zweryfikowane rekombinowane plazmidy, dodając równą objętość 50% glicerolu do płynnych kultur i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W każdym kolejnym eksperymencie wyrzuć bakterie z wywaru glicerolu na świeżą płytkę agarową i użyj pojedynczej kolonii do ekspansji, jak opisano w kroku 1.2.
  2. Ekstrakty białkowe MEIOB z bakterii
    1. Wybierz jedną kolonię każdego szczepu BL21 transfekowaną pustym lub rekombinowanym plazmidem pGEX-4T-1 zweryfikowanym przez sekwencjonowanie i zaszczepij w 3 ml LB zawierającym 100 μg/ml ampicyliny. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
    2. Zaszczepić 300 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny z 3 ml nocnej hodowli (od kroku 1.2.1). Hodować kultury przez wytrząsanie w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aż OD600 osiągnie 0,5-1,0.
    3. Indukować ekspresję białka przez dodanie beta-D-tiogalaktopiranozydu izopropylu (IPTG) do końcowego stężenia 0,2 mM. Inkubować kultury przez dodatkowe 3 godziny, wytrząsając przy 180 obr./min i w temperaturze 18 °C.
    4. Odwirować kulturę bakteryjną w temperaturze 3 500 x g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    5. Zawiesić osad w 20 ml lodowatego buforu soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco. Sonikuj zawiesinę bakteryjną na lodzie przez 25 cykli w krótkich seriach po 10 sekund (moc wyjściowa 20%), a następnie 2-3 s odpoczywając na lodzie.
    6. Odwirować lizat w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut. Przenieść cały supernatant do świeżej probówki.
    7. Koraliki do prania wstępnego.
      1. Dodaj 300 μl kulek glutationu i sefarozy do świeżej probówki o pojemności 15 ml i umyj kulki 10 ml lodowatego buforu PBS.
      2. Wirować w temperaturze 750 x g i temperaturze 4 °C przez 1 minutę, aby granulki zostały zebrane i wylać roztwór myjący.
    8. Dodać lizat do umytych kulek i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny. Wirować przy 750 x g i 4 °C przez 1 minutę w celu osadzenia kulek. Opłucz kulki w 10 ml lodowatego PBS 8x.
    9. Eluować kulki za pomocą 1 ml buforu elucyjnego (10 mM glutation w 50 mM Tris-HCl o pH 8,0) 6x, inkubując w temperaturze 4 °C przez 10 minut przed każdym etapem elucji. Wirować w temperaturze 750 x g i 4 °C przez 1 minutę w celu osadzenia kulek. Zbierz i połącz 6 frakcji.
    10. Uwolnione białka przenieść do filtra odśrodkowego i zagęścić przez odwirowanie przy 7 500 x g, aby uzyskać końcową objętość 100-200 μl.
  3. Ekstrakty białkowe MOV10 z komórek HEK293T
    1. Przejściowo ulega ekspresji białek MOV10 w hodowanych komórkach HEK293T.
      1. Przygotować plazmid MOV10-pRK5 o stężeniu >500 ng/μL.
      2. Nasiona HEK293T komórki w 15 cm szalkach. Gdy gęstość komórek osiągnie ~ 70%-90%, zastąp pożywkę do hodowli komórkowej świeżą zmodyfikowaną pożywką Dulbecco's Modify Eagle Medium (DMEM) zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny.
      3. W przypadku jednej transfekcji rozcieńczyć 60 μg plazmidowego DNA MOV10-pRK5 w 3 ml zredukowanej pożywki surowicy, a następnie dodać 120 μl odczynnika wzmacniającego transfekcję i dobrze wymieszać.
      4. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 90 μl odczynnika do transfekcji 3 ml zredukowanej pożywki surowicy (bez penicyliny-streptomycyny) i dobrze wymieszać.
      5. Dodać rozcieńczone DNA do każdej probówki z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
      6. Dodaj mieszaninę transfekcji do hodowli komórkowej i hoduj komórki przez ~36-48 godzin.
    2. Po 36-48 godzinach zebrać komórki z każdej płytki do probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć każdą osadkę 10 ml lodowatego PBS i zebrać komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy komórek zawierającego kompletny koktajl inhibitorów proteazy wolny od kwasu ehylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować przez 30 minut na lodzie. Odwirować lizat przy 20 000 x g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    4. Dodaj 100 μl kulek magnetycznych anty-FLAG na miskę komórek w probówce o pojemności 1,5 ml.
    5. Przemyj kulki magnetyczne 2x buforem K150 (50 mM HEPES przy pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
      1. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne w 1 ml lodowatego buforu K150.
      2. Inkubować kulki magnetyczne przez 2 minuty w temperaturze 4 °C z delikatnym obracaniem i granulować kulki magnetyczne za pomocą magnesu. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
    6. Dodać kulki magnetyczne do supernatantu lizatu komórkowego z etapu 1.3.3 i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
    7. Przemyć kulki magnetyczne związane z białkiem 3x buforem K150, następnie 2x K150 zawierającym 250 mM NaCl, a następnie 3x buforem K150 jak 1.3.5.
    8. Ponownie zawiesić kulki w 300 μl buforu elucyjnego FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl przy pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glicerolu), dodać peptyd FLAG do końcowego stężenia 0,5 μg/μL i inkubować z kulkami na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, a następnie granulować kulki magnetyczne za pomocą magnesu.
    9. Zebrać supernatant zawierający eluowane białka MOV10, oznaczyć stężenie i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

2. Przygotowanie kwasu nukleinowego

  1. Kupuj oligonukleotydy DNA i RNA z etykietami biotyny lub bez nich z odpowiedniego źródła. Rozcieńczyć każdy oligo w wolnym od RNaz ddH2O do 20 μM i utrzymywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
    UWAGA: Oligonuligationy substratów DNA/RNA użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 2.
  2. Przygotować następującą mieszaninę do reakcji wyżarzania dwuniciowego RNA (dsRNA) do oznaczania aktywności helikazy MOV10: zmieszać 60 mM kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-etanosulfonowego (HEPES) o pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 i ddH2O wolnym od RNaz w końcowej objętości reakcyjnej 20 μL.
  3. Oligonukleotydy wyżarzanego RNA tworzą dupleks RNA przez ogrzewanie mieszaniny górnej nici znakowanej biotyną (2 μM, stężenie końcowe) i 1,5-krotności jej nieznakowanej komplementarnej dolnej nici w buforze do wyżarzania (krok 2.2) w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie powoli schładzanie do temperatury pokojowej (RT).

3. Testy biochemiczne in vitro

  1. EMSA i reakcje enzymatyczne
    1. W teście MEIOB EMSA zmieszaj 50 mM Tris HCl przy pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM ditiotreitolu (DTT), 0,01% NP-40, 0,8 mM (lub inne istotne stężenia, jak pokazano w Rysunek 2 i Rysunek 3) białko MEIOB oraz 10 nM oligonukleotydów znakowanych biotyną i ddH2O w końcowej objętości reakcyjnej 20 μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut i dodać 5x bufor zatrzymujący (125 mM EDTA, 50% glicerolu) w celu zatrzymania reakcji.  
    2. Ustaw reakcje aktywności nukleazy MEIOB zgodnie z opisem w kroku 3.1.1, ale bez dodawania 10 mM EDTA.
    3. Do oznaczania aktywności helikazy MOV10 zmieszać 50 mM Tris-HCl przy pH 7,5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0,01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/μL inhibitora RNazy, 10 nM substratu RNA znakowanego biotyną, 2 mM trifosforanu adenozyny (ATP), pułapki 100 nM RNA oraz 20 ng białka MOV10 i ddH2O w końcowej objętości reakcji 20 μL. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 min, 30 min i 60 min. Dodaj 5-krotny bufor zatrzymujący, aby zatrzymać reakcję.
      UWAGA: Pułapka RNA, nieznakowany biotyną oligo z sekwencją, komplementarnością do znakowanego oligo, co zapobiega ponownemu wyżarzaniu odwiniętego dsRNA.
  2. Żele poliakrylamidowe
    1. Umyj płytki żelowe (16 cm x 16 cm) i grzebienie 1,5 mm. Zmontuj jednostki do elektroforezy żelowej.
    2. Aby przygotować 10% natywny żel poliakrylamidowy, wymieszaj 14 ml ddH2O, 1,25 ml 10x kwas tris-borowy EDTA (TBE), 8,3 ml 30% akrylamidu, 1,25 ml 50% glicerolu, 187,5 μl 10% świeżo przygotowanego nadsiarczanu amonu (APS) i 12,5 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).
    3. Aby przygotować 20% natywny żel poliakrylamidowy, wymieszaj 5,5 ml ddH2O, 1,25 ml 10x TBE, 1,25 ml 50% glicerolu, 16,7 ml 30% akrylamidu, 187,5 μl 10% APS i 12,5 μl TEMED.
    4. Roztwór akrylamidu należy natychmiast wlać do żelu i włożyć grzebień. Pozostaw mieszaninę do polimeryzacji przez około 30 minut.
  3. Bieganie w żelu
    1. Wyjmij grzebień, napełnij zbiorniki buforem do elektroforezy (0,5x TBE).
    2. Przepłukać studzienki próbki buforem 0,5x TBE, a następnie wstępnie uruchomić żel pod napięciem 100 V na lodzie przez 30 minut. Zastąp działający bufor nowym buforem 0,5x TBE.
    3. Załaduj 20-25 μl próbek do każdej studzienki.
    4. Do testów EMSA należy użyć 10% natywnego żelu akryloamidowego i 20% natywnego żelu akryloamidowego do testów enzymatycznych. Przeprowadzić elektroforezę pod napięciem 100 V w łaźni lodowej, aż niebieski marker bromofenolu przeniesie się do dolnej ćwiartki żelu.
  4. Zdemontuj płytki żelowe, przytnij żel, usuwając studzienki załadunkowe i nieużywane pasy. Umieść żel w 0,5 buforze TBE.
  5. Przyciąć bibułę filtracyjną i nylonową membranę do rozmiaru żelu. Wstępnie zwilż czystą bibułę filtracyjną i nylonową membranę.
  6. Złóż stos do przeniesienia.
    1. Umieść wstępnie zwilżoną membranę na wstępnie zwilżonej bibule filtracyjnej.
    2. Umieść żel na membranie.
    3. Przykryj żel kolejną warstwą wstępnie zwilżonej bibuły filtracyjnej.
    4. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza, zwijając czystą pipetę od środka do krawędzi.
  7. Przenieść próbki z żelu na membranę w półsuchym aparacie elektroforetycznym o natężeniu 90 mA przez 20 minut.
  8. Przerwij przenoszenie, a następnie wysusz membranę na nowej bibule filtracyjnej przez 1 minutę.
  9. Sieciowanie próbek poprzez naświetlanie membrany napięciem 120 mJ/cm2 przez 45-60 s w sieciowniku wykorzystującym światło UV wyposażonym w żarówki o długości fali 254 nm (funkcja automatycznego sieciowania). Suszyć membranę na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  10. Detekcja chemiluminescencji
    1. Protokół 1: Użyj standardowej objętości komercyjnego zestawu do wykrywania chemiluminescencyjnych kwasów nukleinowych.
      1. Dodać 20 ml buforu blokującego do membrany i inkubować przez 15-30 minut, delikatnie wstrząsając rotatorem przy 20-25 obr./min.
      2. Przygotować sprzężony/blokujący roztwór buforowy, dodając 66,7 μl stabilizowanego koniugatu streptawidyny i peroksydazy chrzanowej do 20 ml buforu blokującego.
      3. Delikatnie usuń bufor blokujący i zastąp go buforem sprzężonym/blokującym. Inkubować przez 15 minut na rotatorze przy 20-25 obr./min.
      4. Umyj membranę 4x wstrząsając z prędkością 40-45 obr./min przez 5 min każde.
      5. Dodać 30 ml buforu równoważącego substrat do membrany. Inkubować membranę przez 5 minut, wytrząsając z prędkością 20-25 obr./min.
      6. Przygotować roztwór roboczy substratu, dodając 6 ml roztworu luminolu/wzmacniacza do 6 ml stabilnego roztworu nadtlenku. Unikaj światła.
      7. Pokryć całą powierzchnię membrany roztworem roboczym substratu i inkubować przez 5 minut.
      8. Skanuj membranę w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego przez 1-3 s.
    2. Protokół 2: Użyj 2x rozcieńczonego komercyjnego zestawu do wykrywania chemiluminescencyjnych kwasów nukleinowych i postępuj zgodnie z krokami 3.10.1.1-3.10.1.8.
    3. Protokół 3: Użyj samodzielnie przygotowanych odczynników6.
      1. Przygotować bufor blokujący: zmieszać 0,1 M Tris-HCl o pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2 i 3% albuminę surowicy bydlęcej frakcji V. Bufor AP 7,5: zmieszać 0,1 M Tris-HCl przy pH 7,5, 0,1 M NaCl i 2 mM MgCl2. Bufor AP 9,5: zmieszać 0,1 M Tris-HCl przy pH 9,5, 0,1 M NaCl i 50 mM MgCl2. Bufor TE: zmieszać 10 mM Tris-HCl przy pH 8,0, 1 mM EDTA przy pH 8,0.
      2. Namoczyć membranę w buforze blokującym w temperaturze 30 °C na 1 godzinę.
      3. Dodać 8,5 μl fosfatazy alkalicznej streptawidyny do 10 ml buforu AP 7,5. Delikatnie wstrząsać membraną w tym roztworze w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie przemyć membranę 2x w 15 ml buforu AP 7,5 przez 10 min.
      4. Przemyć membranę jeszcze raz w 20 ml buforu AP 9,5 przez 10 minut. Dodać 20 ml buforu TE, aby zatrzymać reakcję.
      5. Dodać 7,5 ml roztworu wywoływczego na membranę i skanować membranę w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego przez 1-3 s.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Struktura białkowa MEIOB oraz konstrukty ekspresyjne wykorzystane w niniejszym badaniu zostały przedstawione na Rysunku 1A. Fałdy OB w MEIOB to kompaktowe struktury przypominające beczki, które potrafią rozpoznawać i oddziaływać z jednoniciowymi kwasami nukleinowymi. Jedna z domen OB (aa 136-307, konstrukt A) wiąże jednoniciowe DNA (ssDNA); skrócone białko (truncacje aa 136-178, konstrukt C) oraz forma z mutacją punktową (mutacja R235A, konstrukt E) MEIOB nie wykazują aktywn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie interakcji białko-kwas nukleinowy ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnych procesów biologicznych. Na przykład MEIOB jest białkiem specyficznym dla jąder, niezbędnym do mejozy i płodności u ssaków 25,26,27. MEIOB zawiera domenę OB, która wiąże się z jednoniciowym DNA i wykazuje aktywność egzonukleazy od 3' do 5'26, co bezpośrednio wiąże się z jej f...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy P. Jeremy'emu Wangowi (University of Pennsylvania) za pomocne edycje i dyskusje. Dziękujemy również Sigrid Eckardt za redakcję językową. K. Z. był wspierany przez National Key R&D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) oraz National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81471502, 31871503) oraz Program Innowacyjny i Przedsiębiorczy Prowincji Jiangsu. J. N. był wspierany przez Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499). M. L. był wspierany przez granty National Natural Science Foundation of China (31771588) oraz 1000 Youth Talent Plan.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
WirówkaEppendorf, Niemcy5242R
Chemiluminescencyjny system obrazowaniaTanon, Chiny5200
Digital soniferBranson, USABBV12081048A450 watów; 50/60 HZ
Półsucha bibuła elektroforetycznaHoefer, USATE77XP
Rewolwer rurowy Kryształ, USA3406051
światłem UVUVP, USACL-1000
Materiały
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4 Milipore, Stany ZjednoczoneUFC8010964 ml/10 K
Membrana nylonowaThermo Scientific, USATG263940A
Naczynie hodowlane z powłoką TCCorning, USA430167100 mm 
Naczynie hodowlane z powłoką TCCorning, USA430597150 mm 
Probówki do mikroprobówekAXYGEN, USAMCT-150-C1,5 mL 
ProbówkiCorning, USA43079115 mL
Odczynniki 
AmpicillinSunShine Bio, Chiny8h288h28
Koraliki magnetyczne Anti-FLAG M2Sigma, USAM8823
ATPThermo Scientific, Stany Zjednoczone591136
Zestaw do rozwoju koloru fosfatazy alkalicznej BCIP/NBTBeyotime, ChinyC3206
CelLyticTM M Liza komórek Odczynnik Sigma, Stany Zjednoczone107M4071V
Zestaw do klonowania jednoetapowego ClonExpress II Vazyme, ChinyC112
Zestaw do wykrywania chemiluminescencyjnych kwasów nukleinowychThermo Scientific, USAT1269950
dNTPSigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneDNTP100-1KT
DMEMGibco, Stany Zjednoczone10569044
Bufor DPBSGibco, USA14190-136
EDTAInvitrogen, Stany ZjednoczoneAM9260G0,5 m
Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTARoche, Stany Zjednoczone04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit Vazyme, Chiny 
DC202
FastPure Gel Mini zestaw do ekstrakcji DNAVazyme, ChinyDC301-01
FBSGibco, USA
FLAGSigma, USAF4799
GlicerolSigma, USASHBK3676
Zestaw zbiorczy GSTGE Healthcare, USA27-4570-01
Bufor HEPESSigma, Stany ZjednoczoneSLBZ28371 M 
IPTGThermo Scientific, USA34060
KoAcSangon Biotech, Chiny127-08-02
Odczynnik do transfekcji Lipofektaminy 3000Thermo Scientific, USAL3000001
MgCl2Invitrogen, USAAM9530G1 M
NaClInvitrogen, USAAM9759
 		5 M 
NP-40Amresco, Stany ZjednoczoneM158-500ML
Opti-MEM podłożeGibco, StanyZjednoczone 31985062
PBSGibco, Stany Zjednoczone10010023RNazy pH 7,4
Promega, USAN251B
Streptawidyna fosfataza alkalicznaPromega, USAV5591
TBEInvitrogen, USA15581044
Bufor Tris-HCI Invitrogen, USA155670271 M, PH 7,4
Bufor Tris-HCI Invitrogen, Stany Zjednoczone155680251 M, PH 8.0
Tween-20Sangon Biotech, ChinyA600560
Filtr sieciujący peptyd 10437028 Inhibitor

Bibliografia

  1. Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
  2. Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
  3. Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52(2015).
  4. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  5. Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
  6. Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
  7. Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143(2007).
  8. Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  9. Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
  10. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  11. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  12. Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
  13. Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
  14. Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
  15. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
  16. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
  17. Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
  18. Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
  19. Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
  20. Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
  21. Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
  22. Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
  23. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
  24. Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
  25. Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
  26. Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788(2013).
  27. Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Znakowanie biotynanaliza przesuni cia mobilno ci elektroforetycznej EMSAwi zanie DNA przez MEIOBaktywno helikazy MOV10kwasy nukleinowe znakowane biotyndetekcja chemiluminescencyjnaanaliza Western blotbarwienie b kitem Coomassie
Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.