Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59845

⸱

5 listopada 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu. Protokół jest odmianą szeroko stosowanej metody hodowli plastrowej z wykorzystaniem wkładek membranowych. Jest prosty, opłacalny i zalecany do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem.

Streszczenie

Kultury organotypowe, czyli warstwowe, były szeroko stosowane do modelowania aspektów funkcjonowania ośrodkowego układu nerwowego in vitro. Pomimo potencjału kultur warstwowych w neurobiologii, badania wykorzystujące dorosłą tkankę nerwową do przygotowania takich kultur są nadal rzadkie, szczególnie te pochodzące od ludzi. Wykorzystanie tkanek dorosłych ludzi do przygotowania kultur plastrów jest szczególnie atrakcyjne dla lepszego zrozumienia ludzkich neuropatologii, ponieważ posiadają one unikalne właściwości typowe dla dojrzałego ludzkiego mózgu, których brakuje w wycinkach wytwarzanych z tkanki nerwowej gryzoni (zwykle noworodków). Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać tkankę mózgową pobraną od żywych dawców ludzkich poddanych resekcyjnej operacji mózgu w celu przygotowania krótkoterminowych, swobodnie unoszących się kultur warstwowych. Przedstawiono również procedury utrzymania i wykonywania testów biochemicznych i biologicznych z wykorzystaniem tych kultur. Reprezentatywne wyniki pokazują, że typowa ludzka laminacja korowa jest zachowana w postaci plastrów po 4 dniach in vitro (DIV4), przy oczekiwanej obecności głównych typów komórek nerwowych. Co więcej, plastry w DIV4 ulegają silnej śmierci komórkowej pod wpływem bodźca toksycznego (H2O2), co wskazuje na potencjał tego modelu do służenia jako platforma w testach śmierci komórki. Metoda ta, prostsza i tańsza alternatywa dla powszechnie stosowanego protokołu wykorzystującego wkładki membranowe, jest zalecana głównie do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem. Wreszcie, chociaż protokół poświęcony jest wykorzystaniu tkanki korowej pobranej od pacjentów poddanych leczeniu chirurgicznemu farmoopornej padaczki płata skroniowego, argumentuje się, że tkanka pobrana z innych regionów/stanów mózgu powinna być również brana pod uwagę jako źródło do produkcji podobnych swobodnie pływających kultur warstwowych.

Wprowadzenie

Wykorzystanie próbek ludzkich w badaniach jest zdecydowanie świetną opcją do badania patologii ludzkiego mózgu, a nowoczesne techniki otworzyły nowe sposoby na solidne i etyczne eksperymenty z wykorzystaniem tkanek pochodzących od pacjenta. Metody takie jak hodowle organotypowe/warstwowe przygotowane z dorosłego ludzkiego mózgu są coraz częściej stosowane w paradygmatach takich jak optogenetyka1, electrophysiology2,3,4,5, plasticity6,7,8,9, neurotoksyczność/neuroprotekcja10,11,12,13, terapia komórkowa14, badanie przesiewowe leków15,16,17, genetyka i edycja genów12,18,19,20, między innymi, jako strategia lepszego zrozumienia chorób neurologicznych w wieku dorosłym.

Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw patologii ludzkiego mózgu zależy od strategii eksperymentalnych, które wymagają dużej liczby badanych. I odwrotnie, w przypadku kultur warstwowych, chociaż dostęp do próbek ludzkich jest nadal utrudniony, możliwość wygenerowania do 50 wycinków z jednej próbki korowej częściowo omija wymóg rekrutacji wielu ochotników poprzez zwiększenie liczby powtórzeń i wykonanych testów na pobraną tkankę21.

Opisano kilka protokołów dla kultur organotypowych/warstwowych mózgu, począwszy od klasycznych oculo drafts22,23 do rury rolkowej24,25,26, interfejs membran półprzepuszczalnych27,28,29,30, oraz swobodnie pływające slices31,32. W zależności od specyfiki projektu eksperymentalnego, każda technika ma swoje zalety i wady. Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury wycinków z mózgów dorosłych ludzi jest w niektórych przypadkach korzystniejsze niż metoda stosowana przez Stoppini et al.27, jeśli weźmie się pod uwagę fakt, że chociaż długoterminowe przeżycie komórek in vitro jest zwykle głównym problemem przy ocenie metody hodowli, w wielu eksperymentach potrzebne są tylko krótkie okresy czasu w hodowli12, 31,32,33,34,35. W tych warunkach zastosowanie kultur swobodnie pływających ma tę zaletę, że jest prostsze i bardziej opłacalne, a także dokładniej przypomina pierwotny stan tkanki ludzkiej niż plastry trzymane w kulturze przez 2-3 tygodnie.

Pomimo potencjału kultur plasterkowych dla neuronauki, badania wykorzystujące dorosłą tkankę nerwową do przygotowania takich kultur są nadal rzadkie, szczególnie wśród ludzi. W artykule opisano protokół wykorzystania tkanki mózgowej pobranej od żywych dawców ludzkich poddanych resekcyjnej operacji mózgu w celu przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych. Procedury utrzymywania i przeprowadzania testów biochemicznych i biologii komórki z wykorzystaniem tych kultur są szczegółowe. Protokół ten okazał się przydatny do analizy żywotności i funkcji neuronów w badaniach nad mechanizmami neuropatologii związanych z dorosłością.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Żywe tkanki mózgu dorosłych zostały pobrane od pacjentów poddawanych neurochirurgii resekcyjnej w leczeniu farmakoopornej padaczki skroniowej (Rysunek 1A). Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną ze Szpitala Klinicznego w Szkole Medycznej Ribeirão Preto (17578/2015), a pacjenci (lub ich osoba prawna odpowiedzialna) zgodzili się i podpisali warunki świadomej zgody. Pobranie tkanki zostało wykonane przez zespół neurochirurgów w Centrum Chirurgii Padaczki (CIREP - Clinics Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Brazylia).

1. Sterylizacja materiałów

UWAGA: Wszystkie materiały i roztwory muszą być wysterylizowane przed użyciem.

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i wibratomiowy materiał do krojenia (uchwyt noża, krążek próbki, taca buforowa) w suchym piecu sterylizacyjnym przez 4 godziny w temperaturze 180 °C.
  2. Sterylizuj materiały lub urządzenia wrażliwe na temperaturę za pomocą promieniowania UV lub gamma.
  3. Sterylizuj media i roztwory przez autoklawowanie lub filtrację przez membrany porowe 0,22 μm.

2. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj 15-20 ml roztworu transportowego: 50% v/v Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) pH 7,4, 50% v/v podłoże podstawowe do utrzymania neuronów mózgowych po urodzeniu i u dorosłych (tabela materiałów), uzupełniony 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (Hepes), 3 mg/ml glukozy i 33 μg/ml gentamycyny.
    UWAGA: Roztwór transportowy musi być schłodzony i natleniony (bulgoczący gazem karbogenowym) przez co najmniej 20 minut przed pobraniem próbki.
  2. Przygotuj 300 ml roztworu do krojenia (HBSS uzupełniony 10 mM HEPES i 3 mg/ml glukozy) i schłodzić go w zamrażarce do punktu początkowego tworzenia się kryształów.
  3. Przygotuj 20 ml pożywki hodowlanej: podstawowej pożywki do utrzymania neuronów mózgowych po urodzeniu i dorosłych (tabela materiałów) uzupełnionej 1% pochodną L-glutaminy (tabela materiałów), 2% suplementem do hodowli neuronalnej (tabela materiałów), 1% penicyliną/streptomycyną i 0,25 μg/ml amfoterycyny B.

3. Ustawianie urządzenia do krojenia

UWAGA: Ten protokół jest idealnie wykonywany z pomocą kolegi ze względu na logistykę pobierania próbek na sali operacyjnej.

  1. W wiadrze z lodem z dodatkiem soli pozostaw roztwór do krojenia pod bulgoczącą mieszanką karbogeniczną (95% O2, 5% CO2 ) przez co najmniej 20 minut przed użyciem.
  2. Przygotuj blok 3% agarozy (około 2 cm x 2 cm x 2 cm) i przyklej go do krążka próbki wibratomu, aby stworzyć dodatkowe mechaniczne wsparcie dla próbki tkanki podczas krojenia (Rysunek 1E).
  3. Ustaw wibratomium do krojenia: grubość przekroju 200 μm, częstotliwość drgań 100 Hz i prędkość krojenia w zakresie 0,5-1,0 mm/s.
  4. Zablokuj tackę buforową wibratomu na podstawie wibratomu i dodaj lód, aby utrzymać ją w lodówce przed otrzymaniem roztworu do krojenia i próbki oraz przez całą procedurę krojenia.

4. Pobieranie próbek

UWAGA: W tym protokole, ludzka tkanka kory nowej została pobrana na sali operacyjnej i przetransportowana do laboratorium.

UWAGA: Podczas pracy z próbkami ludzkimi, postępuj zgodnie z odpowiednimi protokołami bezpieczeństwa ustalonymi przez instytucję.

  1. Ustaw aparaturę transportową (Rysunek 1C), która składa się z: przenośnej butli gazowej z mieszaniną karbogenu podłączonej do zaworu ciśnienia/strumienia, który kontroluje wydatek gazu, podłączonego do silikonowej rurki łączącej wylot gazu ze zbiornikiem transportowym; naczynia transportowego, zwykle stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z perforowaną pokrywą do wprowadzania gazu, zawierające roztwór transportowy; oraz lód do chłodzenia próbki podczas transportu.
  2. Zbierz i przetransportuj próbkę (Rysunek 1B) natychmiast do laboratorium. Zanurzyć próbkę w zimnym roztworze transportowym (stale bąbelkowanym mieszaniną karbogenu).

5. Krojenie

  1. Przenieść próbkę na szalkę Petriego (100 mm x 20 mm) zawierającą roztwór do krojenia i za pomocą precyzyjnych narzędzi chirurgicznych ostrożnie usunąć jak najwięcej pozostałych opon mózgowych w próbce (Rysunek 1D).
  2. Wybierz najlepszą orientację próbki do produkcji plastrów o szczególnych cechach projektu eksperymentalnego, a za pomocą ostrza skalpela nr 24 przytnij płaską powierzchnię, która będzie podstawą przyklejoną do krążka próbki.
  3. Za pomocą jednorazowej plastikowej łyżki i delikatnych pędzli należy zebrać fragment z szalki Petriego i osuszyć nadmiar roztworu za pomocą bibuły filtracyjnej (wysuszyć kapilarno i unikać dotykania fragmentu tkanki papierem).
  4. Za pomocą superglue przymocuj tkankę do krążka próbki wibratomu, aż mocno przylgnie do dysku i zetknie się z blokiem agarozy (Rysunek 1E).
  5. Umieść krążek próbki wibratomu (z prawidłowo przymocowaną tkanką) na tacce buforowej wibratomu wypełnionej roztworem do krojenia, który musi bulgotać podczas całego procesu.
  6. Zablokuj uchwyt noża na miejscu, gdy żyletka jest mocno zamocowana.
  7. Roztwór do krojenia musi pokryć zarówno próbkę, jak i ostrze, dopiero wtedy rozpocznij krojenie ( Rysunek 1F).
  8. Pokrój próbkę w plastry o grubości 200 μm.
    UWAGA: Chociaż niektóre wibratory tną próbki automatycznie, dokładna obserwacja i drobne korekty prędkości krojenia podczas tego procesu mogą pomóc w uzyskaniu lepszych plastrów. Odrzuć początkowe nieregularne plasterki.
  9. Przenieś plastry z tacki buforowej na szalkę Petriego z roztworem do krojenia i przytnij luźne brzegi i nadmiar białej masy do proporcji około 70% kory mózgowej/30% masy białej.

6. Kultura

UWAGA: Wykonaj ten krok w komorze z przepływem laminarnym w sterylnym środowisku.

  1. Dodać 600 μl pożywki do hodowli na basenik (na płytce 24-dołkowej) i inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze 36 °C i 5% CO2 przed posiewem plastrów.
  2. Ułóż jeden plasterek na dołek za pomocą pędzla ( Rysunek 1G).
  3. Jeśli na płytce znajdują się jakieś niewykorzystane studzienki, napełnij je 400 μl sterylnej wody.
  4. Inkubować płytkę w temperaturze 36 °C, 5% CO2,
    UWAGA: Pierwsza wymiana podłoża musi być wykonana w ciągu 8-16 godzin po poszyciu, w zależności od wielkości plastra.
  5. Uzupełnić 10 ml wcześniej przygotowanej pożywki o 50 ng/ml neurotroficznego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF).
    UWAGA: W ciągu pierwszych 8-16 godzin plastry inkubuje się w 600 μl podłoża, aby uniknąć niedoboru składników odżywczych i zakwaszenia, ponieważ zużycie pożywki w tej fazie jest przyspieszone. Od następnego kroku objętość pożywki na studzienkę dostosowuje się do 400 μl.
  6. Usunąć 333 μl kondycjonowanej pożywki z każdej studzienki i dodać 133 μl świeżej pożywki uzupełnionej BDNF.
  7. Powtarzaj proces wymiany pożywki co 24 godziny, zastępując jedną trzecią kondycjonowanej pożywki świeżą pożywką uzupełnioną BDNF.

7. Ocena zdrowia, morfologii i funkcji w hodowanych wycinkach

UWAGA: Aby wywołać śmierć komórki, dla celów ilustracji w reprezentatywnych wynikach, niektóre wycinki poddano 24-godzinnej obróbce induktorem stresu oksydacyjnego H2O2. Kroki 7.1.2 i 7.1.3 opisują zastosowanieH2O2do wywołania śmierci komórki.

  1. Żywotność komórki
    UWAGA: Prostą, nieskomplikowaną metodą oceny neurotoksyczności/neuroprotekcji w kulturach prowokowanych plastrów jest test 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowy (MTT)36, który mierzy procent aktywnych metabolicznie komórek w normalnych warunkach w porównaniu z próbkami poddanymi działaniu substancji.
    1. W komorze z przepływem laminarnym zastąp jedną trzecią pożywki świeżą.
    2. Z 30% roztworu podstawowego H2O2 dodać objętośćH2O2na studzienkę, aby osiągnąć zamierzone stężenie końcowe (30 mM lub 300 mM).
      UWAGA: H2O2 dodawano po codziennej zmianie podłoża, aby zagwarantować prawidłowe zaopatrzenie w świeże składniki odżywcze przed wyzwaniem.
    3. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 36 °C, 5% CO2,
      UWAGA: Po podaniu H2O2 (lub innego bodźca toksycznego będącego przedmiotem zainteresowania), poniższe kroki opisują oznaczanie żywotności komórek za pomocą testu MTT.
    4. Dodać 40 μl roztworu MTT do końcowego stężenia 0,5 mg/ml do każdego dołka w płytce.
    5. Inkubować płytkę w temperaturze 36 °C, 5% CO2 przez 3 godziny.
    6. Umyj plastry solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i przenieś do mikroprobówki.
    7. Ostrożnie usunąć pozostały roztwór, pipetując.
    8. Zważyć mikroprobówki zawierające plasterki, aby określić masę każdej próbki (jest to kluczowe dla normalizacji uzyskanych odczytów absorbancji).
      UWAGA: W razie potrzeby próbki można na tym etapie zamrozić (-20 °C) w celu późniejszego przetworzenia.
    9. Homogenizować plastry w 200 μl izopropanolu/HCl za pomocą zmotoryzowanego tłuczka.
    10. Wirować w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 minuty przy 2600 x g.
    11. Zebrać supernatant i zmierzyć absorbancję przy 540 nm.
  2. Depolaryzacja neuronalna wywołana przez KCl
    UWAGA: Fosforylacja kaskadowego białka kaskadowego sygnalizacji kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), a następnie western blotting, może być wykorzystana do ilościowego określenia odpowiedzi neuronalnej na depolaryzację wywołaną przez KCl37 .
    1. W komorze przepływowej zastąpić pożywkę hodowlaną 300 μl HBSS uprzednio zrównoważoną do 36 °C.
    2. Zastąp HBSS 300 μl świeżego HBSS uprzednio zrównoważonego do 36 °C.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 36 °C, 5% CO2 przez 15 minut.
    4. Zastąp HBSS świeżym HBSS lub 80 mM roztworem depolaryzującym KCl (oba w temperaturze 36 °C) i inkubuj w temperaturze 36 °C, 5% CO2 przez 15 minut.
    5. Przenieś plastry z płytki do mikroprobówek. Na tym etapie plastry można przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszej obróbki.
    6. Przygotować ekstrakty tkankowe w 150 μl buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% niejonowy środek powierzchniowo czynny; 0,1% dodecylosiarczan sodu; pH 7,5). Odwirować ekstrakty w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 16000 x g, zebrać supernatant i oznaczyć całkowite stężenie białka metodą Bradforda.
    7. Załaduj 30 μg białka całkowitego na elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z 12% dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE).
    8. Po elektroforezie przenieść zawartość żelu na membranę nitrocelulozową.
    9. Po zablokowaniu błony 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w TBS plus 0,1% Tween, inkubować z mysim anty-pERK (1:1 000) przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Po umyciu inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z króliczym anty-ERK1/2 (1:1 000).
    10. Inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w RT przez 1 godzinę.
    11. Odsłonięcie z preferowanym podłożem HRP.
  3. Ocena morfologiczna
    UWAGA: Oprócz oceny przeżycia komórek i funkcjonalnej ważna jest analiza morfologii tkanek. Należy pamiętać, że resekcja wyhodowanego wycinka jest ważnym krokiem do wyprodukowania jak największej ilości wysokiej jakości materiału do analizy morfologicznej.
    1. Mocowanie, krioochrona i resekcja plastrów
      1. Przenieść wycinki z dołków z pożywką hodowlaną na nową 24-dołkową płytkę zawierającą PBS.
      2. Usuń PBS i dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Ważne jest, aby plastry były płaskie przed dodaniem PFA. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      3. Ostrożnie usuń roztwór PFA i dodaj 1 ml 30% roztworu sacharozy. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.
      4. Ustawić mikrotom zamrażania na -40 °C.
      5. Przygotuj bazę sacharozy na etapie mikrotomu, w którym należy umieścić plastry (Rysunek 2A). Pozwól mu całkowicie zamrozić i ostrożnie pokrój część zamrożonej sacharozy, aby uzyskać płaską powierzchnię, na której zostanie umieszczony plasterek.
      6. Umieść każdy plasterek na rozciągniętej folii z tworzywa sztucznego i użyj pędzla, aby spłaszczyć chusteczkę.
      7. Przenieś rozciągnięty plasterek na zamrożoną bazę sacharozy jednym ruchem.
        UWAGA: Nie ma możliwości przesunięcia plastra po jego przekroczeniu nad zamrożoną bazą sacharozy. Wykonaj ten krok przenoszenia ostrożnie.
      8. Odstaw plasterek na 5-10 minut, aby zapewnić prawidłowe zamrożenie.
      9. Pokrój plasterek na kawałki o grubości 30 μm.
      10. Przenieść skrawki 30 μm na szalkę Petriego zawierającą PBS.
      11. Przejdź do protokołu histologicznego bardziej odpowiedniego do projektu eksperymentalnego.
        UWAGA: Skrawki 30 μm mogą być łatwo wykorzystane do swobodnej immunohistochemii, zamontowane na szkiełkach mikroskopowych w celu dalszej histologii lub przechowywane w roztworze niezamarzającym w temperaturze -20 °C.
    2. Immunohistochemia
      UWAGA: Standardowe protokoły immunohistochemii i immunofluorescencji różnią się w zależności od laboratorium. Aby uzyskać szczegółową wersję używanego tutaj protokołu, zapoznaj się z Horta et al.38. Pierwszorzędowe przeciwciała używane do barwienia immunologicznego przedstawione w Rycina 2 obejmują jądra neuronalne (NeuN), zdrowy marker dojrzałego neuronu, kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP), marker astorcytów, zjonizowany łącznik wiążący wapń (Iba-1) i marker mikrogleju.
      1. Plastry inkubować w roztworze blokującym (np. 2% normalnej surowicy osła w PBS) przez 40 minut.
      2. Inkubować przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym w łagodnym mieszaniu w temperaturze 4 °C.
      3. Po przemyciu PBS inkubować przez 120 minut z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym pod łagodnym wzburzeniem w temperaturze pokojowej.
      4. Po przemyciu PBS inkubować w temperaturze pokojowej przez 120 minut ze sprzężonym peroksydazą awidyny (tabela materiałów).
      5. Odsłonięcie z DAB + 0,04% niklu amonowego.
      6. Zamontuj zabarwione skrawki na szkiełkach mikroskopowych pokrytych żelatyną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Odwodnić w etanolu, przepłukać w ksylenie, wykończyć podłożem montażowym (tabela materiałów), przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obrazem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kluczowym aspektem oceny jakości i stanu zdrowia hodowanych przekrojów jest obecność i typowa morfologia oczekiwanych typów komórek nerwowych: neuronów oraz komórek glejowych. Typową architekturę laminacji kory ludzkiej zaobserwowano w przekroju w dniu DIV4, co wykazało neuronalne znakowanie immunologiczne (Ryc. 2D). Ponadto stwierdzono oczekiwaną obecność mikrogleju i astrogleju (Ryc. 2B,C). Wyniki te dowodzą, że architektura t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten protokół produkcji swobodnie pływających, krótkoterminowych kultur warstwowych jest alternatywną metodą hodowli wycinków kory nowej dorosłego człowieka. Taki protokół dla kultur warstwowych może być podatny na badania nad (ale nie tylko) optogenetyką 1,44,45, elektrofizjologią 2,3,4,5, plastycznością krótkotrwałą

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez FAPESP (Grant 25681-3/2017 dla AS), CAPES (Post-Doctoral fellowship PNPD/INCT-HSM dla A.F. i Pre-Doctoral fellowship dla N.D.M.) oraz FAEPA. G.M.A. posiada stypendium magisterskie z FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. posiada stypendium badawcze CNPq. Dziękujemy pacjentom i ich rodzinom za oddanie wyciętych tkanek do tego badania. Chcielibyśmy podziękować za wsparcie rezydentów, pielęgniarek, techników i zespołu CIREP ze Szpitala Klinicznego w Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, którzy pomogli na różnych etapach tego procesu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-PropanolMerck1096341000
Akrylamid/Bis-Akrylamid, 30% roztwórSigma AldrichA3449 
AgarozaSigma AldrichA9539
Nadsiarczan amonuSigmaA3678-25G
Amfoterycyna BGibco15290-018
Przeciwciało anty-ERK 2 (królik)Santa Cruz Biotecnologysc-154Rozcieńczenie 1:1,000 w BSA 2,5%
Przeciwciało anty-pERK (mysz)Santa Cruz Biotecnologysc-7383Rozcieńczenie 1:1,000 w BSA 2,5%
B27Gibco17504-044
BDNFSigma AldrichSRP3014
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA7906
Bradford 1x Odczynnik barwnikowyBioRad500-0205
EDTASigmaT3924Stosowany w buforze RIPA
GlukozaMerck108337
GlutamaxGibco35050-061
Zrównoważone sole HankaSigma AldrichH1387-10X1L
HepesSigma AldrichH4034
Kwas solnyMerck1003171000
Nadtlenek wodoru (H2O2)Vetec194
Mysz IgG, cały Ab sprzężony z HRP (anty-mysz)GENA931-1ML
NaClMerck1064041000Stosowany w buforze RIPA
Neurobasal AGibco10888-022
Odtłuszczone mleko w proszku (Molico)NestléSłuży do blokowania
błony PBS Bufor pH 7,2Laborclin590338
Penicylina / StreptomycynaSigma AldrichP4333
Chlorek potasuMerck1049361000
Prime Western Blotting Detection OdczynnikGERPN2232
IgG królika, cały Ab (anty-królik) sprzężony z HRPGENA934-1ML
SDSSigmaL5750Stosowany w buforze RIPA
TEMEM GE17-1312-01
Bromek tetrazolowy tiazolylu Blue (MTT)Sigma AldrichM5655
TrisSigma T-1378Używany w buforze RIPA
Triton x-100SigmaX100Używany w buforze RIPA
Ultrapure WaterMilliporeSterylna woda, pochodząca z systemu oczyszczania wody MiliQ
Sprzęt i materiał
24-dołkowe płytkiCorningCL S3526Płaskie dno z pokrywką
Amersham Potran Premium (membrana nitrocelulozowa) GE29047575
Carbogen MieszaninaWhite Martins95% O2, 5% CO2 CO2
InkubatorNew Brunswick ScientificCO-24Inkubacja plastrów 5% CO2, 36º C
Czytnik mikropłytekUrządzenia molekularne Mikroprobówki
Greiner0016081,5 ml
Zmotoryzowany tłuczekKimble Chase
Plastikowa łyżkaRozmiar łyżki deserowej
ŻyletkaBicChrome Platinum, używana do krojenia za pomocą wibratomu
OstrzeskalpelaBecton Dickinson (BD)Numer 24Służy do krojenia tkanki; zalecany ten sam rozmiar lub mniejszy
Superglue (Loctite Super Bonder)HenkelSkład: Etilcianoacrilato; Kwas 2-propenowy; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-krezol; homopolimer
Vibratome Leica14047235612 - VT1000S
Nazwa materiału/sprzętu do immunohistochemii
przeciwciało anty-NeuN (mysz)Millipore MAB377Rozcieńczenie 1:1,000 w buforze fosforanowym
Przeciwciało anty-GFAP (mysz)MerckMAB360Rozcieńczenie 1:1,000 w buforze fosforanowym
Przeciwciało anty-Iba1 (królik)AbcamEPR16588 - ab178846Rozcieńczenie 1:2,000 w buforze fosforanowym
Biotynylowane przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)VectorBA-9200
DABSigma AldrichD-9015
EntellanMerck107960
EtanolMerck1.00983.1000
Syntezatorżelatynowy00G1002.02.AEUżywany do powlekania szkiełek
MicrotomeLeicaSM2010RWyposażony w Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), ustawiony na -40º C
Normalna surowica osłaJackson Immuno Research017-000-121
ParaformaldehydSigma Aldrich158127
IgG królika, całe Ab (anty-królik) sprzężone z HRPGENA934-1ML
(Star Frost)Knittel GlaserSzkiełka pokryte żelatyną
SacharozaVetec60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (peroksydaza, standardowa)VectorPK-4000, zestaw standardowy
syntezatorksylenowy01X1001.01.BJ
Szkiełka

Bibliografia

  1. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
  2. Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
  3. Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
  4. Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
  5. Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
  6. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
  7. Crain, S. M. Development of Specific Synaptic Network Functions in Organotypic Central Nervous System (CNS) Cultures: Implications for Transplantation of CNS Neural Cellsin Vivo. Methods. 16 (3), 228-238 (1998).
  8. He, S., Bausch, S. B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis. Neuropharmacology. 77, 379-386 (2014).
  9. Antonietta Ajmone-Cat, M., Mancini, M., De Simone, R., Cilli, P., Minghetti, L. Microglial polarization and plasticity: Evidence from organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 61 (10), 1698-1711 (2013).
  10. Noraberg, J., et al. Organotypic Hippocampal Slice Cultures for Studies of Brain Damage, Neuroprotection and Neurorepair. Current Drug Target - CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  11. Hoppe, J. B., et al. Amyloid-β neurotoxicity in organotypic culture is attenuated by melatonin: Involvement of GSK-3β, tau and neuroinflammation. Journal of Pineal Research. 48 (3), 230-238 (2010).
  12. Sebollela, A., et al. Amyloid-β oligomers induce differential gene expression in adult human brain slices. Journal of Biological Chemistry. 287 (10), 7436-7445 (2012).
  13. Chong, C. M., et al. Discovery of a novel neuroprotectant, BHDPC, that protects against MPP+/MPTP-induced neuronal death in multiple experimental models. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1057-1066 (2015).
  14. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Experimental Neurology. 248, 429-440 (2013).
  15. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (8), 659-666 (2008).
  16. Minami, N., et al. Organotypic brain explant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors. Cancer Medicine. 6 (11), 2635-2645 (2017).
  17. Magalhães, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 1-18 (2018).
  18. Wang, X., et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neuroscience. 10, 1-20 (2009).
  19. Di Pietro, V., et al. Transcriptomics of traumatic brain injury: gene expression and molecular pathways of different grades of insult in a rat organotypic hippocampal culture model. Journal of neurotrauma. 27 (2), 349-359 (2010).
  20. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  21. Jones, R. S. G., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2015).
  22. Hoffer, B., Seiger, A., Ljungberg, T., Olson, L. Electrophysiological and cytological studies of brain homografts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo. Brain Research. 79 (2), 165-184 (1974).
  23. Hoffer, B. J., Olson, L., Palmer, M. R. Toxic effects of lead in the developing nervous system: in oculo experimental models. Environmental Health Perspectives. 74, 169-175 (1987).
  24. Hogue, M. J. Human fetal brain cells in tissue cultures: Their identification and motility. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 85-107 (1947).
  25. Costero, I., Pomerat, C. M. Cultivation of neurons from the adult human cerebral and cerebellar cortex. American Journal of Anatomy. 89 (3), 405-467 (1951).
  26. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  27. Stoppini, L., Buchs, A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  28. Sanai, N., et al. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature. 427 (6976), 740-744 (2004).
  29. Eugène, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  30. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  31. Verwer, R. W. H., Dubelaar, E. J. G., Hermens, W. T. J. M. C., Swaab, D. F. Tissue cultures from adult human postmortem subcortical brain areas. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 6 (3), 429-432 (2002).
  32. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  33. Bruce, A. J., Malfroy, B., Baudry, M. beta-Amyloid toxicity in organotypic hippocampal cultures: protection by EUK-8, a synthetic catalytic free radical scavenger. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2312-2316 (1996).
  34. Finley, M., et al. Functional validation of adult hippocampal organotypic cultures as an in vitro model of brain injury. Brain Research. 1001 (1-2), 125-132 (2004).
  35. Schoeler, M., et al. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury. BMC Neurology. 12, 20(2012).
  36. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  37. Maharana, C., Sharma, K. P., Sharma, S. K. Feedback mechanism in depolarization-induced sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in the hippocampus. Scientific Reports. 3, 1103(2013).
  38. Horta, J. D. A. C., López, D. E., Alvarez-Morujo, A. J., Bittencourt, J. C. Direct and indirect connections between cochlear root neurons and facial motor neurons: Pathways underlying the acoustic pinna reflex in the albino rat. Journal of Comparative Neurology. 507 (5), 1763-1779 (2008).
  39. Carmona-Fontaine, C., et al. Metabolic origins of spatial organization in the tumor microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2934-2939 (2017).
  40. McMurtrey, R. J. Analytic Models of Oxygen and Nutrient Diffusion, Metabolism Dynamics, and Architecture Optimization in Three-Dimensional Tissue Constructs with Applications and Insights in Cerebral Organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  41. Lossi, L., Alasia, S., Salio, C., Merighi, A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 88 (4), 221-245 (2009).
  42. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 42, 135-163 (2002).
  43. Sharma, S. K., Carew, T. J. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: Facilitatory effects and inhibitory constraints. Learning and Memory. 11 (4), 373-378 (2004).
  44. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-755 (2011).
  45. Takahashi, Y. K., et al. Neural Estimates of Imagined Outcomes in the Orbitofrontal Cortex Drive Behavior and Learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  46. Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a Cooperate in the Regulation of Epileptic and Synaptic Activity in the CA1 Region of the Hippocampus. Journal of Neuroscience. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  49. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  50. Jung, S., et al. Brain tumor invasion model system using organotypic brain-slice culture as an alternative to in vivo model. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 128 (9), 469-476 (2002).
  51. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 261-270 (2007).
  52. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  53. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 11 (11), 484-489 (1988).
  54. Walsh, K., Megyesi, J., Hammond, R. Human central nervous system tissue culture: A historical review and examination of recent advances. Neurobiology of Disease. 18 (1), 2-18 (2005).
  55. Gähwiler, B. H. Slice cultures of cerebellar, hippocampal and hypothalamic tissue. Experientia. 40 (3), 235-243 (1984).
  56. Bsibsi, M., et al. Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators. Glia. 53 (7), 688-695 (2006).
  57. González-Martínez, J. A., Bingaman, W. E., Toms, S. A., Najm, I. M. Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 628-635 (2008).
  58. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. The FASEB Journal. 16 (1), 54-60 (2002).
  59. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  60. Masamoto, K., Tanishita, K. Oxygen Transport in Brain Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 131 (7), 074002(2009).
  61. Hadjistassou, C., Bejan, A., Ventikos, Y. Cerebral oxygenation and optimal vascular brain organization. Journal of the Royal Society Interface. 12 (107), (2015).
  62. Qiu, C., Kivipelto, M., von Strauss, E. Epidemiology of Alzheimer's disease: occurrence, determinants, and strategies toward intervention. Dialogues in Clinical Neuroscience. 11 (2), 111-128 (2009).
  63. Stahl, K., Mylonakou, M. N., Skare, O., Amiry-Moghaddam, M., Torp, R. Cytoprotective effects of growth factors: BDNF more potent than GDNF in an organotypic culture model of Parkinson's disease. Brain Research. 1378, 105-118 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Laminacja korytesty biochemicznetesty biologii komórkiimmunohistochemiakrojenie w wibratomiepróba z nadtlenkiem wodorutest redukcji MTTfosforylacja ERK
Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.