Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie i analiza RNA pojedynczych komórek ludzkich wysp trzustkowych

15.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59866

⸱

18 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regeneron Pharmaceuticals, Inc

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wysokiej jakości, wielkoskalowych danych transkryptomu pojedynczych komórek z izolowanych ludzkich wysp trzustkowych przy użyciu technologii sekwencjonowania mikroprzepływowego jednokomórkowego RNA opartej na kropelkach.

Streszczenie

Wyspy trzustkowe składają się z komórek endokrynnych o charakterystycznych wzorcach ekspresji hormonalnej. Komórki endokrynne wykazują różnice funkcjonalne w odpowiedzi na normalne i patologiczne warunki. Celem tego protokołu jest wygenerowanie wysokiej jakości, wielkoskalowych danych transkryptomowych każdego typu komórek endokrynnych przy użyciu technologii sekwencjonowania mikroprzepływowego jednokomórkowego RNA opartej na kropelkach. Takie dane można wykorzystać do zbudowania profilu ekspresji genów każdego typu komórek endokrynnych w normalnych lub specyficznych warunkach. Proces ten wymaga starannego obchodzenia się, dokładnych pomiarów i rygorystycznej kontroli jakości. W tym protokole opisujemy szczegółowe etapy dysocjacji ludzkich wysp trzustkowych, sekwencjonowania i analizy danych. Reprezentatywne wyniki około 20 000 ludzkich pojedynczych komórek wysp trzustkowych wskazują na skuteczne zastosowanie protokołu.

Wprowadzenie

Wyspy trzustkowe uwalniają hormony endokrynne regulujące poziom glukozy we krwi. Pięć typów komórek endokrynnych, które różnią się funkcjonalnie i morfologicznie, jest zaangażowanych w tę istotną rolę: komórki α wytwarzają glukagon, β komórki insuliny, somatostatyna δ komórek, polipeptyd trzustki komórek PP i ε komórki greliny1. Profilowanie ekspresji genów jest użytecznym podejściem do charakteryzowania komórek endokrynnych w normalnych lub specyficznych warunkach. Historycznie rzecz biorąc, całe profilowanie ekspresji genów wysp trzustkowych zostało wygenerowane przy użyciu mikromacierzy i sekwencjonowania RNA nowej generacji2,3,4,5,6,7,8. Chociaż cały transkryptom wysp trzustkowych jest pouczający w identyfikacji specyficznych dla narządu transkryptów i genów kandydujących na chorobę, nie odkrywa heterogeniczności molekularnej każdego typu komórek wysp trzustkowych. Technika mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM) została zastosowana do bezpośredniego uzyskania określonych typów komórek z wysepek9,10,11,12, ale nie zapewnia czystości docelowej populacji komórek. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zastosowano sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do wyboru określonych populacji komórek endokrynnych, takich jak komórki α i β13,14,15,16,17,18. Co więcej, Dorrell i in. zastosowali podejście do sortowania FACS oparte na przeciwciałach, aby sklasyfikować komórki β do czterech subpopulacji19. Komórki wysp trzustkowych posortowane metodą FACS można również posiać w celu sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek; Jednak metody oparte na płytkach napotykają wyzwania związane ze skalowalnością20,21,22.

Aby wygenerować wysokiej jakości, wielkoskalowe dane transkryptomiczne każdego typu komórek endokrynnych, zastosowaliśmy technologię mikroprzepływową do ludzkich komórek wysp trzustkowych. Platforma mikroprzepływowa generuje dane transkryptomowe z dużej liczby pojedynczych komórek w sposób o wysokiej przepustowości, wysokiej jakości i skalowalny23,24,25,26,27. Wysoce skalowalna platforma mikroprzepływowa nie tylko ujawnia cechy molekularne typu komórek wychwyconych w dużej ilości, ale także umożliwia identyfikację rzadkich typów komórek, gdy dostępna jest wystarczająca liczba komórek. W związku z tym zastosowanie platformy do ludzkich wysp trzustkowych umożliwiło profilowanie komórek ε wydzielających grelinę, rzadkiego typu komórek endokrynnych o mało znanej funkcji ze względu na jego rzadkość28. W ostatnich latach opublikowaliśmy kilka badań, w których wraz z innymi podmiotami opracowaliśmy dane transkryptomiczne na dużą skalę ludzkich wysp trzustkowych przy użyciu technologii29,30,31,32,33. Dane te są publicznie dostępnymi i użytecznymi zasobami dla społeczności wysp trzustkowych do badania heterogeniczności komórek endokrynnych i jej wpływu na choroby.

Tutaj opisujemy protokół sekwencjonowania RNA mikroprzepływowego pojedynczej komórki oparty na kropelkach, który został użyty do uzyskania danych transkryptomu około 20 000 ludzkich komórek wysp trzustkowych, w tym komórek α, β, δ, PP, ε, oraz mniejszego odsetka komórek nieendokrynologicznych32. Przepływ pracy rozpoczyna się od izolowanych ludzkich wysepek i przedstawia etapy dysocjacji komórek wysp trzustkowych, przechwytywania pojedynczych komórek i analizy danych. Protokół wymaga użycia świeżo odizolowanych wysepek i może być stosowany do wysepek pochodzących od ludzi i innych gatunków, takich jak gryzonie. Korzystając z tego przepływu pracy, można zbudować bezstronny i kompleksowy atlas komórek wysp trzustkowych w warunkach wyjściowych i innych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Dysocjacja ludzkich wysepek

  1. Uzyskać ludzkie wyspy trzustkowe wyizolowane od dawców narządów obu płci, w wieku od 15 do 80 lat, bez wcześniej istniejących chorób, chyba że do celów badania wymagane są wysepki od dawców o określonych cechach demograficznych.
    1. Po odizolowaniu odizolowane wyspy trzustkowe należy przechowywać w zakładzie hodowli tkankowej przez 2-3 dni u dostawcy. Często potrzeba więcej niż 1 dnia, aby uszkodzenia wysepek stały się widoczne.
    2. Umieść wysepki w butelce i zanurz je całkowicie w podłożu z wysepkami. Dostarcz go do laboratorium przesyłką z dnia na dzień.
    3. Należy uzyskać równoważną ilość wysepek (IEQ) wysłanych wysepek od dostawcy wysepek.
  2. Odzyskaj wysepki z przesyłki w dniu przybycia wysepek. Wykonaj ten krok za pomocą okapu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.
    1. Schłodzić całe podłoże z wysp trzustkowych (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x Pen-Strep, 2 mM glutamina) w lodówce.
    2. Przenieść wysepki z butelki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    3. Do opróżnionej butelki dodać 10 ml wstępnie schłodzonej, kompletnej pożywki z wysepek, aby wypłukać pozostałe wysepki. Przenieś pożywkę do stożkowej rurki.
    4. Odwirować probówkę o masie 200 x g przez 2 minuty, aby odzyskać wysepki. Odessać supernatant pozostawiając około 1-2 ml pożywki z osadem.
    5. Ponownie zawiesić wysepki za pomocą wstępnie schłodzonego, kompletnego podłoża wysepkowego. W oparciu o IEQ dostarczony przez dostawcę, dodaj 12 ml pożywki na 5000 IEQ.
    6. Wlać wysepki do pożywki na 10 cm niepoddane działaniu metody hodowli tkankowej. Inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% stężeniem CO2 w powietrzu atmosferycznym.
  3. Oddziel wysepki, jak pokazano poniżej. Wykonaj ten krok po całonocnej inkubacji.
    1. Wstępnie podgrzane kompletne podłoże z wyspami trzustkowymi i roztwór dysocjacji komórek.
    2. Przygotować 1x PBS zawierający 0,04% BSA w temperaturze pokojowej.
    3. Policz i ręcznie wybierz 200-300 wysepek za pomocą pipety P200 i przenieś wysepki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki z wysepek.
    4. Zebrać wysepki przez odwirowanie przy 200 x g przez 2 min. Delikatnie zassać supernatant, nie naruszając osadu na dnie.
    5. Dodać 1,0 ml wstępnie podgrzanego roztworu do dysocjacji komórek i rozbić osad, delikatnie pipetując w górę iw dół. Inkubować wysepki w temperaturze 37 °C przez 9-11 minut. Co 3 minuty powoli pipetuj w górę i w dół przez 10 sekund, aby zdysocjować komórki na pojedyncze komórki.
    6. Gdy komórki wysp trzustkowych są dobrze zdysocjowane, a roztwór staje się mętny, dodaj 9 ml kompletnej pożywki z wyspami trzustkowymi i przefiltruj przez sitko komórkowe 30 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    7. Umyj probówkę i sitko komórkowe 2 ml kompletnej pożywki z wysepek, aby zebrać pozostałe wysepki i dodać do tej samej probówki.
    8. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut.
    9. Delikatnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml 1x PBS zawierającym 0,04% BSA (PBS-BSA).
    10. Przefiltrować przez nowe sitko o wielkości 30 μm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w celu zebrania komórek.
    11. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200-300 μl 1x roztworze PBS-BSA.
    12. Zmierz stężenie komórek i dostosuj objętość do końcowego stężenia 400-500 komórek/μl.

2. Kontrola jakości zawiesiny jednokomorowej

  1. Określ stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek opartego na fluorescencji34.
    1. Wymieszaj 10 μl komórek z 0,5 μL AO/DAPI. Dokładnie wymieszać pipetą. Załaduj 10,5 μl na szkiełko i uruchom test liczby komórek, aby określić liczbę i żywotność.
    2. W razie potrzeby rozcieńczyć i/lub przefiltrować zawiesinę komórek w zależności od liczby komórek.

3. Partycjonowanie pojedynczych komórek za pomocą układu mikroprzepływowego. Postępuj zgodnie z protokołem producenta chipów mikroprzepływowych35.

  1. Doprowadź 3' kulki żelowe i odczynniki do odwrotnej transkrypcji (RT) do temperatury pokojowej (>30 min). W razie potrzeby należy rozpuścić starter RT w buforze TE.
  2. Przygotować główną mieszankę RT w probówce o niskim stopniu wiązania, jak opisano w Tabeli 1.
  3. Określ liczbę komórek, które mają być wprowadzone dla każdej próbki. Obliczyć objętość zawiesiny komórek (X) niezbędną do dostarczenia żądanej docelowej liczby komórek. Obliczona objętość wody wolnej od nukleaz, którą należy dodać do każdej próbki, wyniesie 33,8-X μl.
  4. Dla każdej próbki, która ma zostać podzielona na części, dodaj 33,8 X μl wody wolnej od nukleaz do 0,2 ml probówki z paskiem PCR. Następnie dodaj 66,2 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki paskowej. W tym momencie nie dodawaj komórek do probówki z paskiem. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać. Umieść przygotowane tubki z paskami na lodzie.
  5. Umieść chip mikroprzepływowy w obudowie chipa. Ustaw pojemnik na chipsy tak, aby szyby naftowe (rząd oznaczony jako 3) znajdowały się najbliżej osoby wykonującej eksperyment.
  6. Jeśli przeprowadzasz mniej niż 8 próbek, użyj 50% glicerolu, aby wypełnić nieużywane kanały w następującej kolejności:
    1. Dodaj 90 μl 50% glicerolu do studzienek w rzędzie 1 dla wszystkich nieużywanych kanałów.
    2. Dodaj 40 μl 50% glicerolu do studzienek w rzędzie 2 dla wszystkich nieużywanych kanałów.
    3. Dodaj 270 μl 50% glicerolu do studzienek w rzędzie 3 dla wszystkich nieużywanych kanałów.
  7. Zatrzaśnij kulki żelu w wirze. Wir z pełną prędkością przez 30 s. Stuknij kilka razy w pasek na blacie stołu, aby zebrać koraliki. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
  8. Dodaj X μl komórek do przygotowanych probówek z paskami. Odpipetować do wymieszania 5 razy. Nie wyrzucając końcówek pipet, przenieś 90 μl mieszaniny komórek do rzędu 1 chipa.
  9. Odczekaj 30 sekund, a następnie załaduj 40 μl kulek żelowych do rzędu 2. Na tym etapie pipetować bardzo powoli. Dozować 270 μl oleju rozdzielającego do studzienek w rzędzie 3.
  10. Zaczepić uszczelkę wióra na zaczepach uchwytu wiórów. Umieść zmontowany uchwyt na wióry w jednokomórkowym urządzeniu do partycjonowania i naciśnij przycisk uruchamiania.
  11. Po zakończeniu pracy należy natychmiast wyjąć zmontowany uchwyt na wióry.
  12. Wyjmij uszczelkę chipa z uchwytu, otwórz obudowę chipa pod kątem 45° i usuń 100 μl emulsji z chipa do niebieskiej plastikowej płytki 96-dołkowej.

4. Amplifikacja cDNA pojedynczej komórki. Postępuj zgodnie z protokołem producenta chipów mikroprzepływowych35.

  1. Odwrotna transkrypcja.
    UWAGA: Wykonaj ten krok pod czystym kapturem tylko do PCR, aby zapobiec zanieczyszczeniu mikrobiologicznemu i innym nieamplifikowanym cDNA.
    1. Uszczelnij 96-dołkową niebieską płytkę uszczelką foliową na podgrzewanym uszczelniarce do płyt
      2. .
    2. Przeprowadzić reakcję odwrotnej transkrypcji w termocyklerze w następujący sposób: 53 °C przez 45 min à 85 °C przez 5 min à 4 °C przytrzymać.
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania. Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 72 godzin.
  2. Oczyszczanie po RT
    1. Przynieś kulki magnetyczne wiążące kwas nukleinowy i kulki magnetyczne wyboru wielkości kwasu nukleinowego do temperatury pokojowej i wiruj, aby ponownie zawiesić. W tym momencie rozmrozić bufor do czyszczenia próbki przez 10 minut w temperaturze 65 °C. Doprowadzić wszystkie inne odczynniki do temperatury pokojowej i zawirować.
    2. Przygotować zgodnie z tabelami 2 i tabelami 3.
  3. Chemicznie rozbić emulsję i oczyść.
    1. W tym celu należy delikatnie zdjąć uszczelkę foliową z płytki.
    2. Do każdej emulsji należy dozować 125 μl różowego odczynnika do rozbijania emulsji. Odczekaj 1 minutę, a następnie przenieś całą objętość do czystej probówki z paskiem o pojemności 0,2 ml. Upewnij się, że w tubce z paskami znajduje się warstwa przezroczystego i różowa.
    3. Usunąć 125 μl różowej warstwy z dna tubki z paskiem, nie naruszając przezroczystej warstwy. To normalne, że niewielka objętość (~15 μl) różowej warstwy pozostaje w probówce.
    4. Dodać 200 μl mieszanki czyszczącej z tabeli 2 do probówki z paskiem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    5. Przenieś probówkę z paskiem na stojak magnetyczny i poczekaj, aż roztwór się oczyści. Usunąć supernatant i wyrzucić, a następnie dwukrotnie umyć kulki 80% etanolem. Pozostaw koraliki do wyschnięcia na 1 minutę.
    6. Wyjmij rurkę z paskiem z magnesu i dodaj 35,5 μl roztworu elucyjnego z tabeli 3 do kulek. Odpipetować do ponownego zawieszenia kulek w roztworze. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    7. Przenieś probówkę z paskiem na stojak magnetyczny i poczekaj, aż roztwór się oczyści. Usuń oczyszczone cDNA z probówki z paskiem i dozuj ją do czyszczenia probówek z paskami o pojemności 0,2 ml.
  4. Amplifikacja cDNA.
    1. Przygotuj główny miks amplifikacji w tabeli 4 poniżej.
    2. Do każdej próbki dodać 65 μl cDNA Amplification Master Mix. Umieść rurkę paskową w termocyklerze i uruchom następujący program: 98 °C 3 min à 15 cykli [98 °C 15 s à 67 °C 20 s à 72 °C 1 min] à 72 °C 5 min à 4 °C hold
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4°C do 72 godzin.
    3. Oczyść amplifikowane cDNA za pomocą 0,6x kulek magnetycznych o wyborze wielkości kwasu nukleinowego. Przemyć dwukrotnie 80% etanolem i wymyć 40,5 μl.
    4. Uruchom kontrolę jakości cDNA za pomocą zautomatyzowanej elektroforezy żelowej i testu ilościowego DNA opartego na fluorescencji36,37.
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 72 godzin lub w temperaturze -20°C przez czas nieokreślony.

5. Budowa biblioteki sekwencjonowania

  1. Znakowanie i oczyszczanie cDNA38.
    1. Normalizuj cDNA do 50 ng w 20 μl całkowitej objętości. Na tym etapie kluczowe znaczenie ma dokładna ocena ilościowa.
    2. Przygotować mieszaninę znakowania z tabeli 5 i podwielokrotność 30 μl na każde 20 μl próbki cDNA na lodzie. Umieścić próbki w termocyklerze i uruchomić protokół znakowania: 55 °C 5 min à 10 °C hold.
    3. Wykonaj czyszczenie oznakowanego cDNA za pomocą columns38. Do każdej próbki dodać 180 μl buforu wiążącego DNA. Przenieść 230 μl do kolumny wirowej.
    4. Wirować przy 1300 x g przez 2 minuty i odrzucić przepływ.
    5. Przemyć dwukrotnie 300 μl buforu do przemywania DNA. Odwirować dodatkowe 2 minuty przy 1300 x g, aby zapewnić usunięcie etanolu.
    6. Elutować oczyszczone, oznakowane cDNA przez dodanie 31 μl buforu elucyjnego do kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    7. Wirować przez 2 minuty przy 1300 x g w celu odzyskania oczyszczonego produktu.
  2. Wskaźnik próbki PCR.
    1. Wybierz kody kreskowe, które nie nakładają się na siebie podczas sekwencjonowania multipleksowego.
    2. Wykonać główną mieszankę PCR o wskaźniku próbki, jak pokazano w tabeli 6.
    3. Dodać 60 μl mieszanki wzorcowej PCR o wskaźniku próbki do 30 μl oczyszczonej próbki.
    4. Do każdej próbki należy dodać 10 μl 4-oligowinowej próbki o wskaźniku 20 μM (zastosowano indeks rekordowy). Całkowita objętość reakcji wynosi teraz 100 μL.
    5. Umieść w termocyklerze z pokrywką ustawioną na 105 °C. Uruchom następujący program: 98 °C 45 s à 12-14 cykli [98 °C 20 s à 54 °C 30 s à 72 °C 20 s] do 72 °C 1 min à 4 °C przytrzymaj.
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania. Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 72 godzin.
  3. Oczyszczanie bibliotek za pomocą podwójnego czyszczenia ściegów.
    1. Dodać do próbki 100 μl kulek magnetycznych do wyboru wielkości kwasu nukleinowego i dokładnie wymieszać pipetą. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    2. Przenieś na magnes i odstaw, aż roztwór się usunie. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
    3. Umyć dwukrotnie 200 μl 80% etanolu.
    4. Suszyć koraliki na magnesie przez 2 minuty. Wyjmij z magnesu i dodaj 50,5 μl buforu EB do granulki kulki. Odpipetować, aby ponownie zawiesić kulki w buforze.
    5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Przenieść na magnes i odstawić na 2 minuty. Przenieść 50 μl eluowanej próbki do czystej probówki z paskiem.
    6. Dodać 40 μl kulek magnetycznych do wyboru wielkości kwasu nukleinowego do próbki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Przenieść na magnes i pozostawić roztwór do klarowności. Usunąć i odrzucić supernatant.
    7. Umyć dwukrotnie 125 μl 80% etanolu.
    8. Suszyć koraliki na magnesie przez 2 minuty. Wyjmij z magnesu i dodaj 60,5 μl buforu EB do granulki kulki. Odpipetować, aby ponownie zawiesić kulki w buforze.
    9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Przenieść do magnesu i odstawić na 2 minuty. Przenieść 50 μl eluowanej próbki do czystej probówki paskowej. To jest ostatnia biblioteka.
    10. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 72 godziny lub w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony. Należy pamiętać, że jest to bezpieczny punkt zatrzymania.
  4. Określ ilościowo i przeprowadź kontrolę jakości bibliotek końcowych za pomocą zautomatyzowanej elektroforezy żelowej i testu ilościowego DNA opartego na fluorescencji36,37. Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:10 przed rozpoczęciem kontroli jakości.

6. Sekwencjonowanie biblioteki

  1. Znormalizować każdą próbkę, która ma być zsekwencjonowana, do 2 ng/μl i zebrać razem 3 μl każdej znormalizowanej próbki.
  2. Zmierz stężenie w puli za pomocą testu ilościowego DNA opartego na fluorescencji37.
  3. Rozcieńczyć pulę do 0,25 ng/μl.
  4. Denaturacja puli w następujący sposób: 12 μl rozcieńczonej próbki zbiorczej (0,25 ng/μl) + 1 μl kontroli DNA (1 nM), 2 μl buforu EB + 5 μl NaOH (0,4N). Pozostaw do inkubacji przez 5 minut, a następnie dodaj 10 μl 200 mM Tris pH 8,0.
  5. Załaduj 4,05 μl do 1345,95 μl HT1. Załaduj 1,3 ml do kartridża sekwensera i uruchom zgodnie z wytycznymi producenta39 używając przepisu sekwencjonowania z 26 cyklami (odczyt 1) + 8 cykli (indeks i7) + 0 cykli (indeks i5) + 55 cykli (odczyt 2).

7. Odczyt wyrównania (Plik uzupełniający 1)

  1. Uruchom narzędzie Cell Ranger (wersja 2.0.0), aby zdemultipleksować pliki nieprzetworzonych wywołań podstawowych (BCL) wygenerowane przez sekwencjonowanie do plików FASTQ. Dopasuj pliki FASTQ do ludzkiego zespołu genomu B37.3 i modelu genu UCSC, aby uzyskać kwantyfikację ekspresji.
  2. Kontrola jakości osiowania.
    1. Generuj metryki wyrównania i sprawdzaj zasady Q30, prawidłowy ułamek kodu kreskowego, ułamek odczytu powiązany z komórką, zmapowaną frakcję odczytu i odczyty wykryte w każdej komórce.
    2. Sprawdź wykres rangi kodu kreskowego, aby upewnić się, że kody kreskowe powiązane z komórkami są oddzielone od tła.

8. Analiza danych (Plik uzupełniający 2)

  1. Kontrola jakości komórki i proces wstępny.
    1. Wyklucz komórki z < 500 wykrytymi genami, < 3000 całkowitą liczbą unikalnego identyfikatora molekularnego (UMI) > wynikiem żywotności 0,2, jak opisano wcześniej32. Dostosuj wartości odcięcia do typów tkanek i komórek.
    2. Usuń dublety.
      1. Oceń pięć genów hormonu endokrynnego (glukagon - GCG, insulina - INS, somatostatyna - SST, polipeptyd trzustki - PPY i grelina - GHRL) pod kątem bimodalnego wzorca ekspresji (tryb wysokiej i niskiej ekspresji) za pomocą pakietu R mclust40.
      2. Usuń komórki, które wyrażają więcej niż jeden gen hormonalny, tj. z dwoma lub więcej genami hormonalnymi w trybie wysokiej ekspresji.
    3. Normalizuj ekspresję genów przez całkowity UMI i pomnóż przez współczynnik skali 10 000 na poziomie komórki za pomocą pakietu R Seurat41.
    4. Usuń geny wykryte w mniej niż 3 komórkach.
    5. Wykrywanie zmiennych genów przy użyciu średniej ekspresji i dyspersji wszystkich komórek. Dostosuj odcięcia do typów tkanek i komórek.
  2. Przeprowadź analizę głównych składowych ze zmiennymi genami. Grupowanie komórek z wybraną liczbą składników głównych. Wyprowadź geny wzbogacone o klastry komórek, porównując jedną klaster komórek z resztą komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przebieg sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek składa się z trzech etapów: dysocjacji nienaruszonych ludzkich wysepek trzustkowych do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, wychwytywania pojedynczych komórek przy użyciu technologii opartej na kropelkach oraz analizy danych RNA-seq (Rysunek 1). W pierwszej kolejności pozyskane ludzkie wysepki inkubowano przez noc. Nienaruszone wysepki zbadano pod mikroskopem (Rysunek 2A). Int...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technologie jednokomórkowe opracowane w ostatnich latach stanowią nową platformę do charakteryzowania typów komórek i badania niejednorodności molekularnej w ludzkich wyspach trzustkowych. Przyjęliśmy protokół mikroprzepływowej izolacji pojedynczych komórek i analizy danych na podstawie kropelek w celu zbadania ludzkich wysp trzustkowych. W ramach naszego protokołu udało się uzyskać dane sekwencjonowania RNA z ponad 20 000 pojedynczych ludzkich komórek wysp trzustkowych ze stosunkowo niewielkimi różnicami w jakości sekwe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są pracownikami i udziałowcami firmy Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
30 &mikro; m Filtry do wstępnejseparacji Miltenyi Biotec130-041-407Sitko do komórek
8-komorowe szkiełkaChemometec102673-680Szkiełka testowe do liczenia firmy Dell
Bioanalizator Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626do kontroli jakości
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9647Nośniki jednokomórkowe
Chrom Jednokomórkowy 3' Biblioteka i Zestaw kulek żelowych v2, 16 rxns10X Genomics120237Odczynniki do pojedynczych komórek
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chipów)10X Genomics120236Chipy mikroprzepływowe
CMRL-1066ThermoFisher11530-037Kompletne podłoże wysepek
EB BuforQiagen19086Bufor elucyjny
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-dołkowa, niebieska, z półspódniczkąVWR47744-112Płytka emulsyjna
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher16000-036Kompletne podłoże dla wysp trzustkowych
Ludzkie wyspy trzustkoweProdo LabsHIRIzolowane ludzkie wyspy trzustkowe
L-glutamina (200 mM)ThermoFisher25030-081Kompletna pożywka dla wysp trzustkowych
Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera (96 próbek)Biblioteka IlluminaFC-121-1031 odczynniki przygotowawcze
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cykli)IlluminaFC-404-2005Sekwencjonowanie
penicyliny-streptomycyny (10 000 U/mL)ThermoFisher15140-122Kompletne podłoże wysepek
Qubit o wysokiej czułości dsDNA KitLife TechnologiesQ32854QC
18Chemometec103011-420Test zliczania komórek odczynnik
SPRISelect OdczynnikFisher ScientificB23318Koraliki oczyszczające
Naczynia do hodowli tkankowych (10 cm)VWR10861-594do hodowli wysp trzustkowych
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013Roztwór do dysocjacji komórek
Zymo DNA Clean & Koncentrator-5, 50 reakcjiVWR77001-152Kolumny czyszczące bibliotekę
do roztworu

Bibliografia

  1. Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
  2. Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552(2012).
  3. Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
  4. Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
  5. Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
  6. Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
  7. Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
  8. van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694(2015).
  9. Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
  10. Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  11. Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499(2010).
  12. Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  13. Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
  14. Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
  15. Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
  16. Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
  17. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
  18. Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756(2016).
  20. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  21. Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
  22. Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  23. Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
  24. Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367(2015).
  25. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  26. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  27. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
  28. Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
  29. Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  30. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  31. Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
  32. Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
  33. Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
  34. Chemometec. Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
  35. 10X Genomics. 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , 10X Genomics. (2017).
  36. Agilent Technologies. Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent Technologies. (2013).
  37. Thermo Fischer Scientific. Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , Thermo Fischer Scientific. (2015).
  38. Illumina. Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , Illumina. (2016).
  39. Illumina. llumina NextSeq 500 System Guide. , Illumina. (2018).
  40. Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
  41. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
  42. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
  43. DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
  44. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
  45. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
  46. Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
  47. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  48. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  49. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Dysocjacja komórekchip mikroprzepływowylicznik komórek oparty na fluorescencjiamplifikacja komplementarnego DNAprotokół tagmentacjianaliza głównych składowychklasteryzacja komórekanaliza t-SNE
Sekwencjonowanie i analiza RNA pojedynczych komórek ludzkich wysp trzustkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.