Method Article

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

DOI:

10.3791/59875

⸱

June 21st, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami została opracowana do użytku w połączeniu z jednosondowym zestawem spektrometrii mas do analizy on-line pojedynczych komórek zawiesinowych w warunkach otoczenia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas pojedynczej komórki (SCMS) umożliwia czułe wykrywanie i dokładną analizę szerokiego zakresu gatunków komórkowych na poziomie pojedynczej komórki. Pojedyncza sonda, urządzenie do pobierania próbek i jonizacji w mikroskali, może być sprzężona ze spektrometrem mas do szybkiej analizy on-line składników komórkowych SCMS w warunkach otoczenia. Wcześniej technika SCMS z pojedynczą sondą była stosowana przede wszystkim do pomiaru komórek unieruchomionych na podłożu, co ograniczało typy komórek do badań. W obecnym badaniu technologia SCMS z pojedynczą sondą została zintegrowana z systemem manipulacji komórkami, zwykle używanym do zapłodnienia in vitro. Ta zintegrowana platforma do manipulacji i analizy komórek wykorzystuje sondę selekcyjną do wychwytywania zidentyfikowanych pojedynczych komórek pływających i przenoszenia komórek do końcówki pojedynczej sondy w celu lizy w mikroskali, a następnie natychmiastowej analizy spektrometrii mas. Ten proces wychwytywania i przenoszenia usuwa komórki z otaczającego roztworu przed analizą, minimalizując wprowadzanie cząsteczek matrycy do analizy spektrometrii mas. Ta zintegrowana konfiguracja jest zdolna do analizy SCMS docelowych izolowanych przez pacjenta komórek obecnych w próbkach płynów ustrojowych (np. moczu, krwi, śliny itp.), co pozwala na potencjalne zastosowania analizy SCMS w medycynie ludzkiej i biologii chorób.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologia człowieka, zwłaszcza biologia chorób, jest coraz częściej rozumiana jako wynik działań na poziomie pojedynczych komórek, ale tradycyjne metody analityczne, takie jak chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCMS), są zazwyczaj używane do analizy próbek przygotowanych z populacji komórek, podczas gdy uzyskane informacje molekularne nie mogą dokładnie reprezentować procesów chemicznych na poziomie pojedynczej komórki. Te standardowe, tradycyjne metody nie są w stanie dostrzec wpływu niejednorodności komórkowej na pomiar analityczny, a proces niszczenia i mieszania komórek w celu przygotowania lizatu potencjalnie prowadzi do zmiany lub utraty składników komórkowych1,2. Te ograniczenia tradycyjnych metod są szczególnie ważne w analizie komórek pacjentów, w których uzyskane próbki mogą zawierać złożoną mieszaninę wielu różnych typów komórek. Aby przezwyciężyć te braki, metody analizy molekularnej pojedynczych komórek, w tym metody spektrometrii mas pojedynczych komórek (SCMS), są coraz częściej opracowywane i stosowane w bioanalizie, zwłaszcza metabolitów komórkowych i biomolekuł o niskiej masie cząsteczkowej3,4.

Pierwsze opracowane techniki SCMS wykorzystywały techniki oparte na próżni do przeprowadzania analiz w warunkach niezwiązanych z otoczeniem2,5,6,7,8,9,10,11. Techniki SCMS bez otoczenia są w stanie analizować lipidy komórkowe i metabolity, ale wymagają wstępnej obróbki próbki w sztucznych warunkach, a zatem nie nadają się do analizy w czasie rzeczywistym. Proces przygotowania próbki do analizy poza otoczeniem obejmuje dodanie składników matrycy, a przygotowanie to może zmienić składniki komórkowe z ich naturalnego środowiska12. Dlatego techniki spektrometrii mas otoczenia (MS), które nie wymagają próżni w środowisku próbkowania, są wykorzystywane do analizy komórek w środowisku zbliżonym do natywnego. Brak środowiska próżniowego pozwala na wszechstronność w projekcie eksperymentalnym; Można dodać kamery w celu monitorowania procesu komórkowego, a bardziej miękkie techniki jonizacji można połączyć z technikami separacji, aby uzyskać lepsze informacje z każdego eksperymentu na pojedynczej komórce4,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42.

Metoda SCMS z pojedynczą sondą to technika otoczenia, która analizuje żywe, rakowe linie komórkowe ssaków w środowisku zbliżonym do natywnego21,43,44,45,46. Ponadto urządzenie z pojedynczą sondą było używane do innych zastosowań spektrometrii mas, w tym do analizy cząsteczek zewnątrzkomórkowych w sferoidach wielokomórkowych i obrazowania MS tkanek47,48,49,50,51,52. Ponieważ jednak w tej metodzie wymagane jest unieruchomienie komórek na substratach, komórki zawiesinowe nie mogą być bezpośrednio analizowane przy użyciu tej techniki3,53. W związku z tym system SCMS z pojedynczą sondą nie mógł być bezpośrednio używany do pobierania próbek pojedynczych komórek, które nie przylegają, takich jak nieprzylegające linie komórkowe lub komórki zawiesinowe wyizolowane z krwi pacjenta lub innych płynów ustrojowych54. W tej pracy zintegrowana platforma manipulacji komórkami (ICMP) jest sprzężona z techniką SCMS z pojedynczą sondą do analizy żywych, zawieszonych komórek on-line przy minimalnym przygotowaniu próbki ( Rysunek 1) 46. ICMP składa się z odwróconego mikroskopu do monitorowania wyboru komórek, szklanej sondy selekcyjnej komórek, mikrowtryskiwacza do wychwytywania pojedynczych pływających komórek, podgrzewanej płytki do utrzymywania temperatury komórkowej, dwóch systemów manipulacji komórkami do kontrolowania ruchów przestrzennych zarówno szklanej sondy selekcyjnej, jak i pojedynczej sondy oraz mikroskopu cyfrowego do obserwacji transferu komórek z końcówki sondy selekcyjnej do końcówki pojedynczej sondy. Produkcja pojedynczej sondy jest szczegółowo opisana w poprzednich publikacjach i nie będzie omawiana tutaj21,48. System ICMP/pojedynczej sondy jest sprzężony ze spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości. Ta zintegrowana konfiguracja pozwala na pobieranie próbek zidentyfikowanych pojedynczych komórek ze złożonych próbek biologicznych przy minimalnym wpływie cząsteczek matrycy.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja sondy do selekcji komórek szklanych

  1. Przekształć szklaną rurkę z pojedynczym otworem w stożkową sondę z ostrą końcówką.
    1. Umieść szklaną rurkę z pojedynczym otworem (ID: 0.3 mm, OD: 1.1. mm) w clamps pionowego uchwytu na pipety, centrując szkło w stosunku do wężownicy grzewczej i dokręć, aby zabezpieczyć rurkę na miejscu. Wężownica grzewcza składa się z drutu oporowego niklowo-chromowego o średnicy 18 mm (o długości ~60 mm) nawiniętego wokół metalowego pręta (średnica = 3,90 mm) 2,5 razy.
    2. Ustaw szklaną rurkę z programem temperatury 19.5 (jednostka producenta). Ten parametr może być modyfikowany dla konkretnego instrumentu.
    3. Ustawić tłok elektromagnesu na 4 (jednostka producenta). Ten parametr może być modyfikowany dla konkretnego instrumentu.
    4. Uruchom elektrozawór, aby pociągnąć szklaną rurkę. Ten krok tworzy dwie sondy połączone na końcówce.
    5. Za pomocą pęsety odetnij ~1 mm od końcówki każdej sondy, tworząc otwór o średnicy ~10 μm na końcówce sondy.
  2. Zegnij szklaną sondę, aby łatwo połączyć ją z konfiguracją ICMP/SCMS z pojedynczą sondą.
    1. Umieść wyciągniętą szklaną sondę w mikrokuźni, umieszczając końcówkę ~3 mm nad platynowym drutem grzejnym.
    2. Zwiększ temperaturę na platynowym przewodzie do 30% temperatury maksymalnej.
    3. Zegnij sondę o ~45° od pierwotnej pozycji (Rysunek 2).

2. Zintegrowany zespół platformy do manipulacji komórkami

  1. Umieść odwrócony mikroskop, mikrowtryskiwacz i dwa systemy manipulacji komórkami na zmotoryzowanym stole, aby łatwo połączyć się ze spektrometrem masowym.
    1. Zmodyfikuj jeden z systemów manipulacji komórkami, aby dostosować go do pojedynczej sondy, zastępując koniec zaciskiem ramienia.
    2. Za pomocą plastikowej strzykawki z igłą napełnić mikrowstrzykiwacz olejem mineralnym. Unikaj pęcherzyków w rurce, ponieważ wpłynie to na ssanie.
    3. Zastąp wkład stolika mikroskopu odwróconego podgrzewaną płytką. Ustawić podgrzewaną płytę w temperaturze 37 °C przed analizą.
  2. Skonfiguruj urządzenie do wyboru szklanych komórek.
    1. Włóż szklaną sondę wyboru komórek do metalowego uchwytu mikrowtryskiwacza, umieszczając dłuższą (niewygiętą) stronę w uchwycie kapilary i dokręcając, aby zamocować sondę na miejscu. Ustaw końcówkę sondy pod kątem równolegle do podgrzewanej płyty.
      UWAGA: Szklana sonda jest bardzo ostra i delikatna i łatwo pęka. Chroń oczy i zachowaj szczególną ostrożność podczas wkładania sondy do mikrowtryskiwacza.
    2. Zamocuj metalowy uchwyt mikrowtryskiwacza w systemie manipulacji komórkami. Umieść końcówkę sondy w pobliżu środka odwróconego światła mikroskopu.

3. Stwórz przedłużoną rurkę do transferu jonów dla wlotu spektrometru masowego

  1. Użyj noża do metalu, aby wyciąć kawałek rurki ze stali nierdzewnej (OD: 0.0625 (1/16) cala, ID: 0.021 cala) o długości ~250 mm.
  2. Zmierz 135 mm od końca i umieść metal dziki tak, aby ~135 mm było wystawione na działanie atmosfery, a ~115 mm znajdowało się wewnątrz spektrometru masowego. Zabezpiecz dzikusa za pomocą dwóch kluczy, aby go dokręcić.

4. Sprzężenie ICMP z konfiguracją z jedną sondą

  1. Zamocuj szklany suwak zawierający pojedynczą sondę w ramieniu clamp systemu manipulacji komórkami.
    UWAGA: Pojedyncze sondy są wytwarzane zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem48 z dwiema drobnymi zmianami w obecnym badaniu: emiter nano-ESI jest wydłużony, aby ułatwić sprzężenie ze spektrometrem masowym, a pojedyncze sondy są przyklejone do szklanej strony po prawej stronie, aby uniknąć zakłócania ruchu przestrzennego urządzenia do selekcji szklanych komórek (Rysunek 2).
  2. Podłącz kapilarnę dostarczającą rozpuszczalnik do złącza przewodzącego, umieszczając kapilar w tulei (1/16 x 0,005 cala) plastikowej tulejki i dokręcając złączkę palcami.
    1. Podłącz drugą stronę złączki przewodzącej do kapilary (ID: 40 μm, OD: 150 μm), która jest podłączona do strzykawki zawierającej rozpuszczalnik do pobierania próbek, umieszczając kapilar w tulei (1/32 x 0,007 cala) i dokręcając złączkę. W tych eksperymentach należy użyć acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym jako rozpuszczalnika do pobierania próbek.
      UWAGA: Rozpuszczalnik do pobierania próbek jest elastyczny, ale powinien zawierać przede wszystkim acetonitryl (lub acetonitryl z kwasem mrówkowym dla lepszej jonizacji) w celu szybkiej lizy komórek w mikroskali.
    2. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej na spektrometrze masowym.
    3. Umieść przewód napięcia jonizacji na drucie miedzianym przymocowanym do złącza przewodzącego.
  3. Umieść emiter nano-ESI ~1 mm do otworu przedłużonej rurki przesyłowej jonów.
    1. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby kontrolować ruchy przestrzenne pojedynczej sondy i umieść emiter nano-ESI centralnie przed przedłużoną rurką do przesyłu jonów.

5. Przygotowanie próbki z zawieszonych komórek

  1. Dzień przed analizą (~18-24 h) wysiać komórki do badania w kolbie do hodowli komórkowej (T25). Ludzkie komórki białaczki szpikowej K562 są używane jako modele w tym badaniu.
    1. Podgrzewać 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnioną 10% syntetyczną płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną w temperaturze 37 °C przez 30 min.
    2. Nasiona ~ 1 x 106 komórek o łącznej objętości 10 ml poprzez połączenie komórek z ciepłym podłożem. Ogólnie rzecz biorąc, za pomocą pipety o pojemności 10 ml umieść 8 ml pożywki RPMI w kolbie do hodowli komórkowych. Następnie użyj pipety o pojemności 2 ml, aby umieścić 2 ml zlewających się komórek K562 na pożywce dla ~1 x 106 komórek.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do czasu analizy.
  2. Przygotuj komórki do analizy.
    1. Pipetować komórki z kolby do hodowli komórkowych do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    2. Wirować komórki w temperaturze 400 x g i temperaturze 37 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    3. Zawiesić komórki w 4 ml pożywki RPMI zawierającej związek leczniczy o pożądanym stężeniu poddanym działaniu substancji.
      UWAGA: W celu analizy komórek kontrolnych ponownie zawieś komórki w 4 ml pożywki RPMI i przejdź do kroku 6.
    4. Inkubować komórki przez cały czas trwania zabiegu w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    5. Obracać komórki w temperaturze 400 x g i temperaturze 37 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.
    6. Komórki zawiesza się ponownie w 10 ml PBS i wiruje w temperaturze 400 x g i temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok 3 razy, aby zminimalizować wykrywanie leku ze składników zewnątrzkomórkowych.
    7. Ponownie zawiesić komórki w 4 ml PBS w celu analizy.

6. Wykonuj pomiary SCMS za pomocą konfiguracji ICMP/pojedynczej sondy

  1. Dostosuj parametry spektrometru mas do eksperymentu.
    1. Pod nagłówkiem Scan Mode (Tryb skanowania) oprogramowania instrumentu wybierz opcję Define Can (Definiuj skanowanie). Użyj rozdzielczości 60 000 m/∆ m przy m/z 400, 1 mikroskopu, maksymalnego czasu wtrysku 100 ms i włączonej automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC). Do eksperymentów wykorzystano zakres mas (m/z) 100-1000. Parametry mogą być modyfikowane w zależności od modelu urządzenia.
    2. W obszarze Pompa strzykawkowa wybierz natężenie przepływu 150 nL/min. Natężenie przepływu należy zoptymalizować dla każdego eksperymentu.
    3. Wybierz źródło NSI i przyłóż napięcie ~4,5 kV. Ten parametr należy również zoptymalizować dla każdego eksperymentu.
  2. Włącz odwrócony mikroskop (z 40-krotnym powiększeniem wybranym zarówno dla górnej, jak i dolnej soczewki) i podłącz go do portu USB laptopa, aby przechwytywać obraz na żywo. Włącz podgrzewaną płytę i ustaw ją na 37 °C.
  3. Na komputerze przejdź do karty Pobieranie danych i wybierz opcję Stale w obszarze Czas pobierania.
  4. Przygotować próbkę do analizy.
    1. Pobrać pipetą 2-3 ml próbki do pokrywki małej szalki Petriego (35 mm x 12 mm).
    2. 6.4.2 Umieścić próbkę w środku światła z odwróconego mikroskopu na górze podgrzewanej płytki.
  5. Przygotuj sondę wyboru szklanej komórki do analizy. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć sondę tak, aby jej końcówka była skupiona pod odwróconym mikroskopem w tej samej płaszczyźnie co komórki.
  6. Zaznacz pojedynczą komórkę do analizy.
    1. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć końcówkę sondy wyboru komórek do docelowej komórki. Proces ten jest monitorowany za pomocą odwróconego mikroskopu.
      UWAGA: Jeśli końcówka sondy wyboru komórek nie może być zogniskowana w tej samej płaszczyźnie co komórki, możliwe, że wygięta część sondy nie jest odpowiednio ustawiona. Dostosuj położenie sondy wyboru komórek, aż obie końcówki sondy będą mogły zostać ustawione ostrość wraz z komórkami pod mikroskopem.
    2. Delikatnie obróć uchwyt mikrowtryskiwacza, aby wyregulować położenie oleju mineralnego wewnątrz rurki. Mikroiniektor zapewnia delikatne ssanie, aby przymocować docelową komórkę do końcówki sondy wyboru komórek.
      UWAGA: Jeśli komórka nie może zostać przechwycona przez sondę wyboru komórek przez siłę ssania, sprawdź sondę wyboru komórek, aby upewnić się, że jest całkowicie włożona do uchwytu kapilary. Ponadto sprawdź poziom oleju mineralnego w mikrowtryskiwaczu i rurkach oraz usuń powietrze, jeśli takie jest.
    3. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć komórkę na końcówce sondy wyboru komórek do końcówki pojedynczej sondy, używając mikroskopu cyfrowego skoncentrowanego na końcówce pojedynczej sondy w celu monitorowania tego procesu. Po dotknięciu, mała kropelka acetonitrylu na końcówce pojedynczej sondy indukuje szybką lizę komórki, a następnie lizat komórkowy jest natychmiast jonizowany do analizy on-line MS.
      UWAGA: Ponieważ wybrana komórka jest przymocowana do końcówki sondy wyboru komórek poprzez delikatne zasysanie, ogniwo to może zostać potencjalnie odłączone podczas przesyłania do końcówki z pojedynczą sondą. Dlatego, jeśli sygnały jonowe typowych lipidów komórkowych (patrz reprezentatywne wyniki poniżej) nie zostaną zaobserwowane w ciągu 5 sekund, możliwe jest, że komórka została odczepiona i konieczne jest wybranie innej komórki.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po pierwsze, do opracowania metody eksperymentalnej używa się nieleczonych komórek K562. W typowym eksperymencie SCMS można zaobserwować oczywiste zmiany widm masowych po przeniesieniu komórki, podczas wykrywania zawartości komórkowej i po zakończeniu pomiaru (ryc. S1). Trzy typowe komórkowe piki lipidowe (fosfatydylocholina, PC), w tym PC(34:4) (m/z 754.536), PC(36:4) (m/z 782.567) i PC(38:5) (m/z 808.583), są monitorowane, aby upewnić się, że komórka została pomyślnie przeniesiona i wykryta została zawartość komórkowa (Rysunek S2)21,43,46,55,56. Jeśli piki lipidów nie są widoczne w ciągu 5 sekund, poziom oleju mineralnego w mikrowstrzykiwaczu jest zmieniany w celu zmniejszenia ssania utrzymującego komórkę na końcówce sondy selekcyjnej; Należy zachować ostrożność, aby olej mineralny nie został wypchnięty z sondy wyboru ogniw. Tożsamość wielu PC w zakresie mas m/z 750-850 została potwierdzona za pomocą MS/MS na próbkach lizatu komórkowego niepoddanych działaniu substancji (Rysunek 3, Rysunek S2, Tabela 1) < klasa sup = "xref">46.

Komórki K562 są również poddawane leczeniu różnymi związkami leczniczymi, aby zwiększyć wszechstronność metody. Komórki K562 inkubuje się z gemcytabiną (1 μM) i taksolem (1 μM) przez 1 godzinę i OSW-1 (100 nM, 1 μM) odpowiednio przez 4 godziny i 2 godziny. Komórki są następnie przemywane PBS, aby zminimalizować wykrywanie związków leków z treści zewnątrzkomórkowej. Udział matrycy (np. jonów z pożywki do hodowli komórkowych, PBS i rozpuszczalnika) w widmach masowych zawartości komórkowej można wyeliminować poprzez odejmowanie danych, ze względu na ich znacznie różne sygnały jonowe (ryc. S3). Wszystkie trzy związki lecznicze są wykrywane za pomocą konfiguracji ICMP/single-probe MS (Rysunek S4)46. Wyniki te sugerują, że metoda ta może być stosowana do badania wewnątrzkomórkowych lipidów, leków i metabolitów na poziomie pojedynczej komórki z komórek w roztworze w środowisku zbliżonym do natywnego.

figure-results-1
Rysunek 1. Zestaw eksperymentalny do eksperymentów ze stwardnieniem rozsianym z pojedynczą komórką zawiesinową. (A) Zintegrowana platforma manipulacji komórkami (ICMP) sprzężona ze spektrometrem masowym. (B) Schemat analizy ogniw zawieszonych. (C) Eksperymentalny widok komórek K562, które mają być wybrane za pomocą sondy wyboru komórek. Przedruk za zgodą Standke et al.46. Prawa autorskie 2019 Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Zdjęcia zmodyfikowanej pojedynczej sondy i sondy selekcyjnej wykorzystywanej do eksperymentów z pojedynczą komórką zawiesinową MS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Powiększone widmo masowe z pojedynczej komórki pokazujące reprezentatywne gatunki (m/z 750-850). Struktury chemiczne potwierdza się za pomocą analizy MS/MS (rys. S1). Przedruk za zgodą Standke et al46. Prawa autorskie 2019 Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. pkt. Szyldów Pręty pkt. szt. Pręty TGL pkt.
Cząsteczka leku*m/zBłąd masy (ppm)
[Gemcytabina + H]+264.076Godzina 11.32
[Taxol + Na]+Numer katalogowy 876.318Wynik 2,74
[OSW-1 + Na]+Numer katalogowy: 895.4450,89
Lipidy komórkowe
[PC(34:4) + H]+754.535Rejon 3,71
[PC(34:3) + H]+756.551Pytanie 3,44
[PC(34:2) + H]+758.5690,66
[PC(36:5) + H]+780.551Pytanie 3,07
[PC(36:4) + H]+782.568Informacja o tym, że 2,17
[PC(36:3) + H]+784.585 Cz.Czepny0,64
[PC(38:7) + H]+Numer katalogowy: 804.5514.1
[PC(38:6) + H]+Numer katalogowy: 806.567Godzina 2,48
[PC(38:5) + H]+Numer katalogowy: 808.583Wynik 2,72
[PC(38:4) + H]+Numer katalogowy 810.6010
[PC(40:7) + H]+Numer katalogowy: 832.5833.12

Tabela 1. Zidentyfikowano komponenty komórkowe przy użyciu konfiguracji ICMP/pojedynczej sondy. Wykrycie wszystkich związków leczniczych zostało potwierdzone poprzez porównanie wyników SM/MS ze związkiem wzorcowym.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zintegrowana platforma do manipulacji i analizy komórek została skonstruowana w celu rozszerzenia wszechstronności metody MS z pojedynczą sondą, umożliwiając szybką analizę on-line komórek nieprzylegających w środowisku zbliżonym do natywnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymagane jest minimalne przygotowanie próbki, więc komórki są analizowane w warunkach naśladujących ich standardowy stan. W szczególności poszczególne komórki będące przedmiotem zainteresowania mogą być wizualnie identyfikowane i wybierane, minimalizując wpływ efektu matrycy na wydajność jonizacji MS przy jednoczesnym utrzymaniu komórek w ich naturalnym środowisku, dzięki czemu wyniki są bardziej reprezentatywne dla natywnego statusu komórek (ryc. S3). Technika ta może być potencjalnie wykorzystana do badania komórek pacjentów zawieszonych w płynach biologicznych w przyszłych badaniach. Kolejną zaletą tej techniki jest elastyczny dobór rozpuszczalnika do pobierania próbek. Ważne jest, aby uwzględnić acetonitryl jako główny rozpuszczalnik do pobierania próbek, aby liza w mikroskali mogła przebiegać szybko. Potencjalnie wewnętrzne wzorce (np. znakowane izotopowo związki lecznicze) mogą być dodawane do rozpuszczalnika do pobierania próbek w celu ilościowego określenia cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania (np. cząsteczek leków) z pojedynczych komórek, w tym tych, które mogą odegrać kluczową rolę w zrewolucjonizowaniu personalizacji leczenia lekami w przyszłości54.

Chociaż ten zintegrowany system może być wygodnie używany do analizy szerokiego zakresu komórek, ograniczeniem metody jest to, że ani sonda pojedyncza, ani sonda selekcyjna nie są dostępne na rynku; dyktowanie potrzeby optymalizacji wielu parametrów (np. natężenia przepływu, napięcia, długości między emiterem nano-ESI a rurką do przesyłu jonów itp.) przed każdym eksperymentem. Ponadto, ze względu na małą średnicę sondy pojedynczej sondy i sondy wyboru ogniw, zakłócenia środowiskowe (np. przepływ powietrza) mogą powodować trudności w ustaleniu połączenia między dwiema sondami. Krótkoterminowym rozwiązaniem jest zgięcie sondy selekcyjnej komórki blisko końca, aby zminimalizować długość zwężania. Przyszłe prace obejmują opracowanie obudowy, która otworzy krytyczne części instalacji w celu zminimalizowania wpływu na środowisko. Ze względu na ograniczoną ilość zawartości komórkowej i krótki czas pozyskiwania (~2-3 s) z komórki, analizę MS/MS można przeprowadzić tylko dla gatunków stosunkowo licznych. Inne czynniki wpływające na czułość detekcji to stłumiona skuteczność jonizacji spowodowana wprowadzeniem matrycy wraz z ogniwem oraz potencjalna utrata jonów przez przedłużoną rurkę transferu jonów.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Naga Rama Kothapalli za jej pracę w opracowywaniu przygotowania próbek zarówno do eksperymentów z zawiesinami, jak i lizatami komórkowymi. Dodatkowo autorzy dziękują NIH (R01GM116116 i R21CA204706) za dofinansowanie.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
acetontrylmillipore Co.AX0145-1Rozpuszczalnik do pobierania próbek
CellTram VarioEppendorf6221ICMP
Drut miedzianystores.ebay.com/jewelerheavenDead soft, okrągły, 20 gauge, 25 ftKonfiguracja złączy przewodzących
Cyfrowy mikroskop stereoskopowyShenzhen D& F Co.Supereyes T004Analysis
Jednorazowa mikropipeta, 1-5 i mikro; LRochester Scientific5065Produkcja sondy selekcyjnej komórek
Rurki kwarcowe z podwójnym otworem, 1,120 "x0,005" x12 "Friedrich & Dimmock, Inc.MBT-005-020-2QProdukcja pojedynczej sondy
Żywica epoksydowaDevconNr części 20945Produkcja pojedynczej sondy
System manipulacji komórkami Eppendorf EppendorfTransferman NK517800397-U.R.Icmp
Nakrętka zewnętrznaVALCO*CHEMINERTEN1Produkcja rurki jonowej
Kwas mrówkowySigma-Aldrich399388-500MLRozpuszczalnik do pobierania próbek
Kapilara z topionej krzemionki, ID: 40 µ m, OD: 100 i mikro; mPolymicro TechnologiesTSP040105Produkcja z pojedynczą sondą, konfiguracja złączy przewodzących
Kapilara z topionej krzemionki, ID: 50 i mikro; m, OD: 150 i mikro; mPolymicro Technologies1068150015Konfiguracja złączy przewodzących
HyClone Syntetyczna płodowa surowica bydlęca (FBS)Fischer SciSH3006603Hodowla komórkowa
Mikrofiltr liniowyIDEX Zdrowie i Science LLCM-520Konfiguracja złącza przewodzącego
Ściągacz laserowy SutterInstrument Co.Model P-2000Lampa UV LED z pojedynczą sondą
Foshan Liang Ya Dental EquipmentLY-C240Produkcja pojedynczej sondy
LTQ Spektrometr masowy OrbitrapThermo ScientificLTQ Orbitrap XLAnalysis
MicroforgeNarishige, Co.MF-9Produkcja sondy selekcyjnej
MicrounionIDEX Zdrowie i Science LLCM-539Przewodzące rurki
PEEK, 1/32x0,005x 5ftIDEX Health & Science LLC1576kondukcją złącza
, 1/32x0,007x 5ftIDEX Health & Science LLC1577Konfiguracja złącza przewodzącego
Penicylina/StreptomycynaGibco/Life Technologies15140-122Hodowla komórkowa
Petriego, 35x10 mmVWR25382-334Przygotowanie próbki
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)VWR0780-50LHodowla komórkowa
Drut platynowyNarishige, Co.Model PT-AMicroforge
ZasilaczNikonPSM-2120ICMP
RPMI, 1X z Corning glutagroCorning10-104-CVHodowla komórkowa
Rury jednootworoweBoralex5065Produkcja sondy wyboru komórek
Tuleje ze stali nierdzewnej, do 1/16" ODIDEX Zdrowie & Science LLCVHP-200-01xProdukcja rur do przenoszenia jonów
Rurki ze stali nierdzewnej, 1/32x 205 i mikro; m x30 cmIDEX Zdrowie & Science LLCU-1128do produkcji rurek do przenoszenia jonów
, 250 i mikro; LHamilton1725LTN250ULStrzykawka do pobierania próbek
Kolba T25CellStar690160Hodowla komórkowa
Thermo LTQ XL kołnierz interfejsu źródła jonówNowy obiektywPB5500Analiza
ThermoPlateTokaiHit55R30NICMP
TrypLE ExpressGibco12605-010Hodowla komórkowa
Obcinak do rur, do 1/16" stal nierdzewnaSUPELCO58692-UProdukcja rurek do przenoszenia jonów
Mikroskop fotografii cyfrowej USBdx.comSO2 25 ~ 500XAnaliza
żywica utwardzana promieniami UVPrime DentalNr artykułu 006.030Produkcja pojedynczej sondy
Pionowy ściągacz do pipetDavid Kopf InstrumentsModel 720Produkcja sondy wyboru komórek
Obudowa napięciowaInterfejs PicoChipPCH-A00120ICMP/MS
Przecinak do drutuRzemieślnik4 1/2 cala szczypce końcowejKonfiguracja złącza przewodzącego
Rurki PEEK z szalka Strzykawka

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mao, S., et al. In Scatheless Cell Detachment Reveals Correlation between Adhesion Strength and Viability at Single-Cell Resolution. Angewandte Chemie International Edition. 57 (1), 236-240 (2017).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  3. Linwen, Z., Akos, V. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2017).
  4. Chen, X., et al. Single-cell analysis at the threshold. Nature Biotechnology. 34, 1111(2016).
  5. Fu, Q., Tang, J., Cui, M., Xing, J., Liu, Z., Liu, S. Application of porous metal enrichment probe sampling to single cell analysis using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Journal of Mass Spectrometry. 51, (2016).
  6. Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-Cell Lipidomics: Characterizing and Imaging Lipids on the Surface of Individual Aplysia californica Neurons with Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (4), 2231-2238 (2013).
  7. Passarelli, M. K., et al. Single-Cell Analysis: Visualizing Pharmaceutical and Metabolite Uptake in Cells with Label-Free 3D Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 87 (13), 6696-6702 (2015).
  8. Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary Ion MS Imaging To Relatively Quantify Cholesterol in the Membranes of Individual Cells from Differentially Treated Populations. Analytical Chemistry. 79 (10), 3554-3560 (2007).
  9. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  10. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. Journal of Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  11. Ong, T. -H., Tillmaand, E. G., Makurath, M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry-based characterization of endogenous peptides and metabolites in small volume samples. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 732-740 (2015).
  12. Yang, Y., Huang, Y., Wu, J., Liu, N., Deng, J., Luan, T. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  13. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip. 7 (4), 423-440 (2007).
  14. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  15. Fujii, T., et al. Direct metabolomics for plant cells by live single-cell mass spectrometry. Nature Protocols. 10, 1445(2015).
  16. Esaki, T., Masujima, T. Fluorescence Probing Live Single-cell Mass Spectrometry for Direct Analysis of Organelle Metabolism. Analytical Sciences. 31 (12), 1211-1213 (2015).
  17. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live Single-Cell Molecular Analysis by Video-Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 24 (5), 559-561 (2008).
  18. Mizuno, N., Harada, T., Masujima, T., T, H. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. , (2008).
  19. Phelps, M., Hamilton, J., Verbeck, G. F. Nanomanipulation-coupled nanospray mass spectrometry as an approach for single cell analysis. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 124101(2014).
  20. Phelps, M. S., Verbeck, G. F. A lipidomics demonstration of the importance of single cell analysis. Analytical Methods. 7 (9), 3668-3670 (2015).
  21. Pan, N., Rao, W., Kothapalli, N. R., Liu, R., Burgett, A. W. G., Yang, Z. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Gong, X., et al. Single Cell Analysis with Probe ESI-Mass Spectrometry: Detection of Metabolites at Cellular and Subcellular Levels. Analytical Chemistry. 86 (8), 3809-3816 (2014).
  23. Lorenzo Tejedor, M., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. In Situ Molecular Analysis of Plant Tissues by Live Single-Cell Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (12), 5221-5228 (2012).
  24. Shimizu, T., et al. Live Single-Cell Plant Hormone Analysis by Video-Mass Spectrometry. Plant and Cell Physiology. 56 (7), 1287-1296 (2015).
  25. Yamamoto, K., et al. Cell-specific localization of alkaloids in Catharanthus roseus stem tissue measured with Imaging MS and Single-cell MS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (14), 3891(2016).
  26. Date, S., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Direct Drug Metabolism Monitoring in a Live Single Hepatic Cell by Video Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 28 (3), 201(2012).
  27. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  28. Masuda, K., Abouleila, Y., Ali, A., Yanagida, T., Masujima, T. Live Single-Cell Mass Spectrometry (LSC-MS) for Plant Metabolomics. BT - Plant Metabolomics: Methods and Protocols. , 269-282 (2018).
  29. Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Single oocyte and single embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 29-33 (2012).
  30. Ferreira, C. R., Pirro, V., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Developmental phases of individual mouse preimplantation embryos characterized by lipid signatures using desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (10), 2915-2926 (2012).
  31. Lee, J. K., Jansson, E. T., Nam, H. G., Zare, R. N. High-Resolution Live-Cell Imaging and Analysis by Laser Desorption/Ionization Droplet Delivery Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (10), 5453-5461 (2016).
  32. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  33. Yin, L., Zhang, Z., Liu, Y., Gao, Y., Gu, J. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry. Analyst. 144 (3), 824-845 (2019).
  34. González-Serrano, A. F., et al. Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Reveals Lipid Metabolism of Individual Oocytes and Embryos. PLoS ONE. 8 (9), e74981(2013).
  35. Liu, Y., et al. Study on Variation of Lipids during Different Growth Phases of Living Cyanobacteria Using Easy Ambient Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (14), 7096-7102 (2014).
  36. Shrestha, B., et al. Subcellular Metabolite and Lipid Analysis of Xenopus laevis Eggs by LAESI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 9 (12), e115173(2014).
  37. Stolee, J. A., Shrestha, B., Mengistu, G., Vertes, A. Observation of Subcellular Metabolite Gradients in Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 51 (41), 10386-10389 (2012).
  38. Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  39. Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and analysis of small cell populations and single cells by consecutive laser pulses. Applied Physics A. 101 (1), 121-126 (2010).
  40. Stolee, J. A., Vertes, A. Toward Single-Cell Analysis by Plume Collimation in Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (7), 3592-3598 (2013).
  41. Zhang, L., Vertes, A. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  42. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6545 LP-6550 (2015).
  43. Liu, R., Pan, N., Zhu, Y., Yang, Z. T-Probe: An Integrated Microscale Device for Online In Situ Single Cell Analysis and Metabolic Profiling Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90 (18), 11078-11085 (2018).
  44. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using Dicationic Ion-Pairing Compounds To Enhance the Single Cell Mass Spectrometry Analysis Using the Single-Probe: A Microscale Sampling and Ionization Device. Analytical Chemistry. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  45. Sun, M., Tian, X., Yang, Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Analytical Chemistry. 89 (17), 9069-9076 (2017).
  46. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass Spectrometry Measurement of Single Suspended Cells Using a Combined Cell Manipulation System and a Single-Probe Device. Analytical Chemistry. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  47. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 986-993 (2015).
  48. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), 53911(2016).
  49. Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 124-134 (2016).
  50. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chemical Communications. 55 (5), 616-619 (2019).
  51. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic Studies of Live Single Cancer Stem Cells Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  52. Tian, X., Zhang, G., Shao, Y., Yang, Z. Towards enhanced metabolomic data analysis of mass spectrometry image: Multivariate Curve Resolution and Machine Learning. Analytica Chimica Acta. 1037, 211-219 (2018).
  53. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single Cell Isolation and Analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116(2016).
  54. Wu, C., Wu, P., Zhao, H., Liu, W., Li, W. Clinical Applications of and Challenges in Single-Cell Analysis of Circulating Tumor Cells. DNA and Cell Biology. 37 (2), 78-89 (2017).
  55. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single Cell Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  56. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews. 22 (5), 332-364 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell Mass SpectrometryCell Manipulation SystemSingle Probe SCMSSuspension Cell AnalysisMass Spectrometry AnalysisIntracellular Metabolite DetectionNanoelectrospray IonizationPatient Derived CellsDrug QuantificationCellular Heterogeneity

Related Articles