Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59876

⸱

12 września 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Virology, School of Systems Biology, George Mason University, 2American Type Culture Collection (ATCC), 3ATCC Cell Systems, 4Ceres Nanosciences, Inc, 5Department of Immunology and Nano-medicine, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Streszczenie

Jedną z głównych przeszkód w dziedzinie badań nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV) jest obecnie możliwość uzyskania oczyszczonych preparatów EV w warunkach infekcji wirusowej. Przedstawiona metoda ma na celu odizolowanie EV od wirionów (tj. HIV-1), co pozwala na uzyskanie wyższej wydajności i wydajności w porównaniu z konwencjonalnymi metodami ultrawirowania. Nasz protokół składa się z trzech etapów: opadu EV, separacji gradientu gęstości i wychwytywania cząstek. Dalsze testy (tj. Western blot i PCR) można przeprowadzić bezpośrednio po wychwyceniu cząstek. Ta metoda jest korzystna w porównaniu z innymi metodami izolacji (tj. ultrawirowania), ponieważ pozwala na użycie minimalnych objętości początkowych. Co więcej, jest bardziej przyjazny dla użytkownika niż alternatywne metody izolacji EV wymagające wielu etapów ultrawirowania. Przedstawiona metoda jest jednak ograniczona w zakresie funkcjonalnych testów EV, ponieważ trudno jest wymyć nienaruszone EV z naszych cząstek. Co więcej, metoda ta jest dostosowana do warunków ściśle opartych na badaniach i nie byłaby komercyjnie opłacalna.

Wprowadzenie

Badania skoncentrowane wokół pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), a konkretnie egzosomów, rodzaju EV o długości 30-120 nm i charakteryzujące się obecnością trzech markerów tetraspaniny CD81, CD9 i CD63, zostały w dużej mierze ukształtowane przez rozwój metod izolowania i oczyszczania badanych pęcherzyków. Zdolność do analizy wieloaspektowych mechanizmów jest utrudniona ze względu na złożone i czasochłonne techniki, które generują próbki złożone z niejednorodnej populacji pęcherzyków generowanych różnymi szlakami o szerokim zakresie zawartości, rozmiarów i gęstości. Chociaż jest to problem dla prawie wszystkich badań nad pojazdami elektrycznymi, ma to szczególne znaczenie podczas badania pojazdów elektrycznych w kontekście infekcji wirusowej, ponieważ wiriony i cząsteczki wirusopodobne (VLP) mogą mieć średnicę podobną do badanych pęcherzyków. Na przykład ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) ma średnicę około 100 nm, czyli mniej więcej taką samą wielkość jak wiele typów EV. Z tego powodu zaprojektowaliśmy nowatorski przepływ pracy izolacji pojazdów elektrycznych, aby rozwiązać te problemy.

Obecnym złotym standardem izolacji EV jest ultrawirowanie. Technika ta wykorzystuje różne gęstości pęcherzyków, co pozwala na oddzielenie pęcherzyków przez odwirowanie z różnicową sedymentacją cząstek o większej gęstości w porównaniu z cząstkami o niższej gęstości na każdym etapie 1,2. Wymagane jest kilka etapów wirowania z niską prędkością, aby usunąć nienaruszone komórki (300-400 x g przez 10 minut), resztki komórek (~2,000 x g przez 10 min) i ciała apoptotyczne/duże pęcherzyki (~10,000 x g przez 10 min). Po tych wstępnych oczyszczaniach następuje ultrawirowanie z dużą prędkością (100 000-200 000 x g przez 1,5-2 godziny) do osadów EV. Etapy mycia są wykonywane w celu dalszego zapewnienia czystości EV, jednak powoduje to zmniejszenie liczby izolowanych EV, a tym samym obniżenie całkowitej wydajności 3,4. Użyteczność tej metody jest dodatkowo ograniczona przez wymóg dużej liczby komórek (około 1 x 108) i dużej objętości próbki (> 100 ml) w celu uzyskania odpowiednich wyników.

Aby rozwiązać rosnące problemy, w ostatnich latach użyteczną techniką stało się wytrącanie pęcherzyków za pomocą hydrofilowych polimerów. Glikol polietylenowy (PEG) lub inne pokrewne odczynniki do wytrącania pozwalają użytkownikowi na usunięcie pęcherzyków, wirusów i agregatów białkowych lub białko-RNA w próbce, po prostu inkubując próbkę z wybranym odczynnikiem, a następnie wykonując pojedyncze wirowanie z niską prędkością1,2,5. Wcześniej informowaliśmy, że użycie PEG lub pokrewnych metod do wytrącania EV w porównaniu z tradycyjnym ultrawirowaniem skutkuje znacznie wyższą wydajnością6. Ta strategia jest szybka, łatwa, nie wymaga dodatkowego drogiego sprzętu, jest łatwo skalowalna i zachowuje strukturę EV. Jednak ze względu na rozwiązły charakter tej metody, otrzymane próbki zawierają różnorodne produkty, w tym wolne białka, kompleksy białkowe, szereg EV i wirionów, co wymaga dalszego oczyszczania w celu uzyskania pożądanej populacji1,2,7,8.

Aby przezwyciężyć niejednorodność EV uzyskanych różnymi metodami opadów, stosuje się ultrawirowanie gradientu gęstości (DG) do lepszego oddzielania cząstek na podstawie ich gęstości. Metodę tę przeprowadza się przy użyciu gradientu krokowego przy użyciu podłoża o gradiencie gęstości, takiego jak jodiksanol lub sacharoza, co pozwala na oddzielenie EV od białek, kompleksów białkowych i cząstek wirusopodobnych lub wirusopodobnych (VLP). Należy zauważyć, że podczas gdy kiedyś sądzono, że DG pozwala na bardziej precyzyjne oddzielanie subpopulacji EV, obecnie wiadomo, że rozmiary i gęstości różnych pęcherzyków mogą się nakładać. Na przykład wiadomo, że egzosomy mają gęstość flotacji 1,08-1,22 g/ml9, podczas gdy pęcherzyki wyizolowane z Golgiego (COPI+ lub klatryna+) mają gęstość 1,05-12 g/ml, a te z osadu retikulum endoplazmatycznego (COPII+) 1,18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. Dodatkowo, jeśli ktoś chce porównać frakcje egzosomalne z frakcjami zawierającymi cząsteczki wirusa, może to stać się trudniejsze w zależności od gęstości wirusa, który jest przedmiotem zainteresowania - istnieją wirusy inne niż HIV-1, które prawdopodobnie równoważą się w tych samych gęstościach co egzosomalne frakcje dodatnie2.

Na koniec, wzbogacenie przygotowań do EV do dalszej wizualizacji i testów funkcjonalnych jest niezbędne dla badań nad EV. Zastosowanie nanocząstek wzbogacających EV, w szczególności wielofunkcyjnych cząstek hydrożelu o średnicy 700-800 nm, jest kluczowym krokiem w osiągnięciu skoncentrowanych przygotowań EV. Posiadają aromatyczną przynętę o wysokim powinowactwie, która jest zamknięta w porowatej zewnętrznej skorupie sitowej, aby promować selektywność. Nanocząstki wykorzystane w tym badaniu obejmują dwa odrębne preparaty z różnymi przynętami rdzeniowymi (Reactive Red 120 NT80; i Cibacron Blue F3GA NT82), które wykazały zwiększenie wychwytywania EV z różnych odczynników i płynów biologicznych (patrz Tabela Materiałów)6,10,11,12,13,14,15. Cząstki umożliwiają łatwe wzbogacenie EV z wielu materiałów wyjściowych, w tym frakcji jodoksanalu, supernatantu z hodowli komórkowych, a także płynów biologicznych pacjenta, takich jak osocze, surowica, płyny mózgowo-rdzeniowe (CSF) i mocz6,13.

Przedstawiona tutaj metoda poprawia efektywność obecnych technik oczyszczania EV poprzez połączenie kilku technologii; Wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek w celu usprawnienia przepływu pracy, zmniejszenia wymagań dotyczących próbek i zwiększenia wydajności w celu uzyskania bardziej jednorodnej próbki EV do wykorzystania we wszystkich badaniach EV. Metoda ta jest szczególnie przydatna w badaniu EV i ich zawartości podczas infekcji wirusowej, ponieważ obejmuje etap filtracji 0,22 μm w celu wykluczenia dużych, niepożądanych pęcherzyków i VLP oraz oddzielenia całkowitej populacji EV na podstawie gęstości, aby skutecznie wyizolować EV od wirionów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Filtracja i wytrącanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs)

  1. Aby przygotować supernatant hodowli z zakażonych lub transfekowanych komórek (tj. linii komórkowych i/lub komórek pierwotnych), należy hodować około 10 ml komórek późnego logu przez 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w odpowiedniej pożywce hodowlanej (tj. RPMI lub DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS]).
    nuta: Wszystkie odczynniki do pożywek hodowlanych powinny być wolne od EV i można je zakupić (patrz tabela materiałów) lub przygotować we własnym zakresie przez wstępne ultrawirowanie surowicy przy 100 000 x g przez 90 minut. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku kilku powszechnie używanych linii komórkowych, w tym: CEM, Jurkat, 293T, U937 (linie niezakażone), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (linie zakażone HIV-1 i HTLV-1), wielu transfekowanych komórek oraz pierwotnych komórek szpikowych i T (zarówno zakażonych, jak i niezakażonych); Jednak protokół ten może być stosowany dla dowolnego typu komórek, w tym tych, które wymagają specjalistycznych pożywek lub warunków hodowli. Gęstość komórek może wymagać optymalizacji dla różnych typów komórek. Zaleca się stosowanie najwyższej gęstości przy minimalnej śmierci komórek po 5 dniach.
  2. Odwirować kulturę przy 3 000 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki i wyrzucić osad.
  3. Przefiltrować supernatant hodowli za pomocą sterylnego filtra 0,22 μm i zebrać filtrat do czystej probówki.
  4. Dodać równą objętość odczynnika do wytrącania PEG (w stosunku 1:1) do przefiltrowanego supernatantu. Odwróć probówkę kilka razy, aby uzyskać jednorodną mieszaninę.
    nuta: NIE wirować.
  5. Mieszaninę inkubować w temperaturze 4 °C przez noc (O/N).
  6. Odwirować mieszaninę przy 1,500 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby uzyskać niejednorodny granulat EV.
    nuta: Pellet EV powinien mieć kolor biały lub białawy.
  7. Odrzucić supernatant kultury zubożony w EV.
  8. Zawiesić granulat EV w 150–300 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami bez wapnia i magnezu (PBS) i przechowywać na lodzie.

2. Budowa gradientu gęstości

  1. Wymieszaj pożywkę o gradiencie gęstości jodixanolu z 1x PBS, aby uzyskać 11 różnych frakcji o gęstości 1 ml od 6 do 18% jodiksanolu w krokach co 1,2% w oddzielnych probówkach do mikrowirówek, jak pokazano na Rysunek 1A.
  2. Zwiruj każdą tubkę, aby wymieszać.
  3. Frakcje gęstości warstw do wstępnie oczyszczonej i suchej wahadłowej probówki ultrawirówkowej z wiadrem wahadłowym, zaczynając od frakcji #18 i kończąc na frakcji #6, jak wskazano w Rysunek 1B.
    nuta: Wszystkie probówki należy zdezynfekować za pomocą 10% wybielacza w sprayu, a następnie spłukać 3x wodą dejonizowaną i ostatecznie przepłukać sterylną wodą dejonizowaną przed załadowaniem frakcji gradientowych.
  4. Dodaj zawieszony granulat EV (300 μl) na wierzch warstwowego gradientu w probówce ultrawirówkowej.
  5. Ultrawirować przy 100,00 x g w temperaturze 4 °C przez 90 min.
  6. Ostrożnie usunąć frakcje o pojemności 1 ml z probówki ultrawirówkowej i przenieść każdą frakcję do nowych probówek do mikrowirówek.

3. Wzbogacanie frakcji EV za pomocą nanocząstek

  1. Stwórz 30% zawiesinę nanocząstek, używając równych objętości NT80, NT82 i 1x PBS.
    nuta: Mieszaninę należy przed użyciem zwirować, aby zapewnić jednorodność.
  2. Dodać 30 μl zawiesiny do każdej probówki mikrowirówki zawierającej frakcje gęstości i kilkakrotnie odpipetować/odwrócić je do góry nogami w celu wymieszania.
  3. Obrócić probówki mikrowirówek O/N z frakcją gęstości wzbogacającą w energię elektryczną zawierającą nanocząstki w temperaturze 4 °C przy około 20 obr./min.
  4. Odwirować frakcję gęstości mikroprobówek o sile 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Wylej płyn i dwukrotnie umyj granulat EV 1x PBS.
    nuta: Granulki nanocząstek można zamrozić w temperaturze -20 °C lub natychmiast wykorzystać do różnych dalszych testów (tj. PCR, Western blot, spektrometria mas i inne testy).

4. Zalecane przygotowanie granulek nanocząstek do dalszych testów

  1. Do izolacji RNA
    1. Zawiesić osad w 50 μl autoklawowanej wody dejonizowanej uzdatnionej 0,001% pirowęglanem dietylu (DEPC) przefiltrowanym przez filtr 0,2 μm i wyizolować RNA zgodnie z protokołem producenta zestawu.
  2. Do elektroforezy żelowej
    1. Zawiesić osad bezpośrednio w 15 μl buforu Laemmli.
    2. Podgrzewać próbkę 3x w temperaturze 95 °C przez 3 minuty. Delikatnie wirować i wirować między każdym cyklem ogrzewania.
    3. Odwirować próbkę przez 15 s przy 20 000 x g i załadować cały eluowany materiał bezpośrednio do żelu.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, ogranicz ilość cząstek załadowanych do żelu i uruchom żel pod napięciem 100 V, aby upewnić się, że wszelkie pozostałe cząstki zostały zatrzymane w studzienkach.
  3. Do trawienia trypsyny
    1. Zawiesić osad w 20 μl mocznika przed alkilowaniem i trypsynizacją próbki. Nanocząstki można granulować przez odwirowanie 14 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Próbkę zawierającą peptyd trypsynizowany można przenieść do czystej probówki zbiorczej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wytrącanie PEG zwiększa wydajność pozyskiwania EV
Nasze zintegrowane podejście do izolacji EV jest znacznie bardziej wydajne pod kątem odzysku EV w porównaniu z tradycyjną ultrawirówką, co potwierdza 90-procentowa redukcja objętości wymaganego materiału wyjściowego. Ultrawirówka, będąca obecnie złotym standardem w izolacji EV, wymaga około 100 mL nadsączu hodowli, aby uzyskać odpowiednią preparatykę EV do dalszych analiz, podczas gdy nasz nowy protokół wymaga jedyni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana metoda pozwala na zwiększenie wydajności EV i oddzielenie wirusa od EV przy użyciu kombinowanego podejścia do izolacji. Stosunkowo duże ilości materiału wyjściowego (tj. supernatantu komórkowego) można przefiltrować przed izolacją EV poprzez wytrącanie, separację DG i wzbogacanie nanocząstek, co daje końcową objętość ~30 μl, co pozwala na natychmiastowe zastosowanie w różnych dalszych testach. Zastosowanie wzbogacania nanocząstek jest niezbędne, ponieważ wykazano, że w porównaniu z tradycyjnym ultrawirowaniem te ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

B.L. jest powiązana z firmą Ceres Nanosciences Inc., która produkuje odczynniki i/lub instrumenty użyte w tym artykule. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium Kashanchi, szczególnie Gwen Cox. Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 i NS099029 do F.K.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CEM CD4+ CellsNIH AIDS Reagent Program117CEM
DPBS bez Ca i Mg (1x)JakośćBiologiczna114-057-101
ExoMAX Opti-EnhancerSystems BiosciencesEXOMAX24A-1Odczynnik do wytrącania PEG
zubożony w egzosomy FBSThermo Fisher ScientificA2720801
Surowica bydlęca płoduSzczytowa surowicaPS-FB3Surowica
zakażona HIV-1 Komórki U937 NIHAIDS Program odczynników165U1
Filtr strzykawkowy Nalgene 0,2 i mikro; m SFCAThermo Scientific723-2520
Nanopułapka (NT80)Ceres NanosciencesCN1030Reaktywna czerwona 120-rdzeniowa
nanopułapka (NT82)Ceres NanosciencesCN2010Cibacron Blue F3GA rdzeń
Optima XE-980 UltrawirówkaBeckman CoulterA94471
OptiPrep Gradient gęstości MediumSigma-AldrichD1556-250mLIodixanol
SW 41 Ti Rotor uchylno-kubełkowyRedlica Beckman 331362
Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mmRedlica Beckman 344059

Bibliografia

  1. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
  2. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  3. Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  5. Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
  6. DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653(2018).
  7. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  8. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  9. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  10. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  11. Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139(2016).
  12. Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
  13. Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765(2016).
  14. Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  15. Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24(2018).
  16. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  17. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  18. Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132(2015).
  19. Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
  20. Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542(2017).
  21. Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
  22. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695(2017).
  23. Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
  24. Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
  25. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396(2018).
  26. Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
  27. Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
  28. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169(2018).
  29. Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362(2018).
  30. Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
  31. Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
  32. Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156(2005).
  33. Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie p cherzyk w zewn trzkom rkowychseparacja wirus wwytr canie PEGseparacja w gradiencie g sto ciwzbogacanie nanocz steczekprotok ultrawirowaniaanaliza Western blotdetekcja PCRzwi kszanie wydajno ci EVkontaminacja HIV 1

Powiązane artykuły