Artykuł metodologiczny

Produkcja trójwymiarowych ludzkich hepatosfer bez surowicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59965

⸱

20 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 3Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health and Life Sciences, Brunel University London, 4School of Biochemistry and Immunology, Trinity Biomedical Sciences Institute, Trinity College Dublin

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje podejście do produkcji hepatosfer z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu hodowli i samoorganizacji komórek. Protokół ten jest powtarzalny w wielu liniach komórkowych, jest opłacalny i pozwala na produkcję stabilnych ludzkich hepatosfer do zastosowań biomedycznych.

Streszczenie

Rozwój odnawialnych źródeł tkanki wątroby jest niezbędny do poprawy modelowania opartego na komórkach i opracowania tkanki ludzkiej do przeszczepu. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) stanowią obiecujące źródła ludzkich sfer wątrobowych. Opracowaliśmy wolną od surowicy i zdefiniowaną metodę różnicowania komórkowego w celu wygenerowania trójwymiarowych ludzkich kul wątrobowych utworzonych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Potencjalnym ograniczeniem technologii jest wytwarzanie gęstych kul z martwym materiałem w środku. Aby obejść ten problem, zastosowaliśmy technologię mikrostudzienek agarozowych przy określonych gęstościach komórek, aby kontrolować rozmiar kulek 3D, zapobiegając generowaniu się rdzeni apoptotycznych i / lub nekrotycznych. Warto zauważyć, że sfery wygenerowane przez nasze podejście wykazują funkcję wątroby i stabilny fenotyp, stanowiąc cenny zasób dla podstawowych i stosowanych badań naukowych. Wierzymy, że nasze podejście może zostać wykorzystane jako technologia platformowa do opracowywania kolejnych tkanek do modelowania i leczenia chorób ludzkich, a w przyszłości może pozwolić na generowanie ludzkich tkanek o złożonej architekturze tkankowej.

Wprowadzenie

Zdolność ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do samoodnawiania się, przy jednoczesnym zachowaniu pluripotencji, daje możliwość produkcji ludzkich typów komórek i tkanek na żądanie. hPSC zostały efektywnie zróżnicowane w komórki podobne do hepatocytów (HLC) przy użyciu dwuwymiarowych (2D) adherentnych systemów hodowli1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Systemy te zostały wykorzystane do skutecznego modelowania chorób monogenowych, cyklu życia wirusa, polekowego uszkodzenia wątroby (DILI), narażenia płodu na toksyny i niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD)11,12,13,14,15. Modele te mają jednak pewne wady, które ograniczają ich rutynowe użytkowanie. Należą do nich ekspresja markerów płodowych, niestabilny fenotyp i słaba architektura tkanki16,17,18,19, co może również ograniczyć ekstrapolację na funkcję narządów in vivo.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano platformy trójwymiarowego (3D), które naśladują architekturę tkanek in vivo. Chociaż jest to możliwe, podejścia te opierają się na wykorzystaniu produktów i matryc pochodzenia zwierzęcego do sterowania genezą tkanek20,21,22, ograniczając skalowanie i powszechne zastosowanie.

Tutaj szczegółowo opisujemy procedury generowania dużych ilości hepatosfer 3D z hPSC przy użyciu zdefiniowanych materiałów i samoorganizacji komórek. Warto zauważyć, że tkanka wytworzona przez naszą procedurę pozostaje funkcjonalna przez ponad rok w hodowli komórkowej i jest zdolna do wspierania funkcji wątroby in vivo23.

Podsumowując, nasze zdefiniowane podejście do różnicowania pozwala na generowanie stabilnych ludzkich hepatosfer zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Uważamy, że opisana procedura stanowi znaczący przełom w generowaniu hepatosfer 3D do podstawowych i stosowanych badań naukowych.

Protokół

1. Przygotowanie form do mikropłytek z agarozy

UWAGA: Pożywki używane do tych eksperymentów muszą być sterylne i mieć temperaturę pokojową (RT) do hodowli komórek.

  1. Przygotuj 2% foremki agarozowe.
    1. Rozpuść 2 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 100 ml wysterylizowanej wody destylowanej. Ostrożnie podgrzej w kuchence mikrofalowej z przerywanym wstrząsaniem, aby całkowicie się rozpuścić.
    2. Dodaj 520 μl stopionej agarozy do formy formatu 256-dołkowego i pozostaw do zestalenia.
    3. Przenieść każdą mikropłytkę agarozy do pojedynczego dołka na płytce 12-dołkowej.
    4. Dodaj 1,5 ml 1x buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco z Ca2+/Mg2+ do każdej studzienki i usuń pęcherzyki powietrza z mikrostudzienek, delikatnie pipetując kilkakrotnie w górę iw dół za pomocą końcówki do pipety P1000. Ma to na celu zapewnienie równomiernego wysiewu komórek.
      nuta: Mikropłytki agarozy można przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C w 1x DPBS.

2. Umieszczanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na płytkach mikrostudzienkowych agarozy

  1. Przygotowanie zawiesiny komórek
    1. Odessać pożywkę z niezróżnicowanej kultury hPSC, jak opisano wcześniej8.
      UWAGA: hPSC są hodowane na LN-521 w mTeSR1 z pożywką zmienianą co 24 godziny i regularnie pasażowane, gdy komórki osiągną 75% do 85% konfluencji, jak opisano wcześniej8.
    2. Przepłukać komórki 5 ml RT 1x DPBS bez Ca2+/Mg2+ i usunąć bufor.
    3. Dodać 5 ml 1x odczynnika do dysocjacji komórek (tabela materiałów) do komórek i umożliwić dysocjację komórek poprzez inkubację komórek w temperaturze 37 °C przez 6-8 min.
      nuta: Aby zatrzymać reakcję, zbadaj oderwanie komórek pod mikroskopem. Komórki powinny być częściowo oderwane od płytki. Przedłuż inkubację o dodatkowe 1-2 minuty, jeśli wymagany jest dłuższy czas.
    4. Zatrzymaj reakcję, usuwając odczynnik dysocjacji komórek i dodaj do komórek 5 ml świeżej pożywki mTeSR1 uzupełnionej inhibitorem 10 μM kinazy związanej z Rho (ROCK) Y27632. Dysocjacja komórek poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety P1000.
    5. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i wykluczenia barwienia błękitem trypanowym. Następnie należy przygotować zawiesinę komórek o wymaganym stężeniu.
    6. Oblicz całkowitą liczbę potrzebnych komórek. Aby zróżnicować hepatosferę 3D, zasiej 3,84 x 105 komórek na mikropłytkę agarozy, aby wygenerować sferoidy o średnicy 100-150 μm.
    7. Przenieś żądaną liczbę komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml lub 50 ml i odwiruj probówkę o stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.
    8. Odessać i odrzucić komórki supernatantu i ponownie zawiesić w pożywce mTeSR1 plus 10 μM inhibitor ROCK Y27632. Rozcieńczyć osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki do końcowego stężenia 2,1 x 106 komórek/ml.
  2. Wysiewanie komórek na przygotowane mikropłytki agarozy
    UWAGA:     W przypadku korzystania z mikropłytek agarozowych przechowywanych w lodówce, należy umieścić je w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C na co najmniej godzinę przed użyciem i odessać 1x DPBS ze studzienki przed wysiewem komórek.
    1. Dodać 190 μl zawiesiny komórkowej do mikrostudzienki agarozowej.
    2. Po wysianiu należy umieścić płytki z powrotem w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 godziny, aby komórki mogły się osadzić.
    3. Po 2 godzinach dodać 1 ml świeżej i ciepłej pożywki mTeSR1 uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK Y27632 do każdej studzienki.
    4. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny, a następnego dnia zbadać formowanie się kulek, aby umożliwić połączenie komórek.

3. Różnicowanie hPSC na hepatosfery 3D na mikrostudzienkach agarozowych

  1. Przygotowanie studzienek pokrytych poli-2-hydroksyetylometakrylanem (poli-HEMA)
    1. Rozpuścić 2 g poli-HEMA w 100 ml 95% etanolu. Mieszać roztwór przez noc, używając płyty grzejnej w temperaturze 55 °C. Dodać 250 μl roztworu poli-HEMA do dołka na płytce 24-dołkowej i suszyć przez noc w temperaturze 60 °C w suszarce.
  2. Przygotowanie pożywki różnicującej
    1. Przygotuj 1,000x roztwór podstawowy ludzkiej aktywiny A, rozpuszczając ludzkie liofilizowane białko aktywiny A w sterylnym 0,2% albuminie surowicy bydlęcej (BSA)/DPBS do końcowego stężenia 100 μg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w małych porcjach. Użyj w stosunku 1:1,000.
    2. Przygotować 1,000x roztwór podstawowy Wnt3a, rozpuszczając liofilizowane białko myszy Wnt3a w sterylnym 0,2% BSA/DPBS do końcowego stężenia 10 μg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w małych porcjach. Użyj o 1:200.
    3. Przygotować 1,000x roztwór podstawowy ludzkiego czynnika wzrostu hepatocytów (HGF), rozpuszczając ludzkie liofilizowane białko HGF w sterylnym 0,2% BSA/DPBS do końcowego stężenia 10 μg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w małych porcjach. Użyj w stosunku 1:1,000.
    4. Przygotować 1000-krotny roztwór podstawowy onkostatyny M (OSM), rozpuszczając OSM w sterylnym 0,2% BSA/DPBS do końcowego stężenia 20 μg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w małych porcjach. Użyj w stosunku 1:1,000.
    5. Przygotuj 1000-krotny roztwór podstawowy nabłonkowego czynnika wzrostu (EGF), rozpuszczając liofilizowane białko w sterylnym 0,2% BSA/DPBS do końcowego stężenia 10 μg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w małych porcjach. Użyj w stosunku 1:1,000.
    6. Przygotować 1,000x roztwór podstawowy podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), rozpuszczając liofilizowane białko w sterylnym 0,2% BSA/DPBS do końcowego stężenia 10 μg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w małych porcjach. Użyj w stosunku 1:1,000.
    7. Przygotować 1000-krotny roztwór podstawowy czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF), rozpuszczając liofilizowane białko w 0,2% BSA/DPBS do końcowego stężenia 10 μg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w małych porcjach. Użyj w stosunku 1:1,000.
    8. Sporządzić pożywkę do różnicowania endodermy składającą się z podłoża bazowego Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) uzupełnionego 2% suplementem B27 (50x, bez insuliny) i 1% penicyliny/streptomycyny (końcowe stężenia: odpowiednio 100 IU/ml i 100 μg/ml). O ile nie jest to wskazane, przy każdej zmianie pożywki uzupełnij wymaganą objętość Wnt3a i aktywiną A w końcowym stężeniu odpowiednio 50 ng/ml i 100 ng/ml.
      nuta: Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu dwóch tygodni.
    9. Sporządzić pożywkę różnicującą hepatoblast składającą się ze zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco (KO-DMEM) z 20% zamiennikiem surowicy nokautującej (KOSR) i uzupełnionej 0,5% alternatywnego suplementu do L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 0,1 mM beta-merkaptoetanolu, 1% dimetylosulfotlenku (DMSO) i 1% penicyliny/streptomycyny (stężenia końcowe przy 100 IU/ml i 100 μg/ml, odpowiednio). Filtruj pod próżnią.
      nuta: Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu dwóch tygodni.
    10. Przygotować pożywkę do dojrzewania hepatocytów składającą się z pożywki dla hepatocytów uzupełnionej 1% alternatywnego suplementu dla L-glutaminy, 10 μM soli sodowej 21-hemibursztynianu hydrokortyzonu (HCC), 1% penicyliny/streptomycyny (końcowe stężenia odpowiednio przy 100 j.m./ml i 100 μg/ml). Dla każdej zmiany pożywki należy uzupełnić wymaganą objętość OSM i HGF (stężenia końcowe odpowiednio 20 ng/ml i 10 ng/ml).
      nuta: Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu dwóch tygodni.
    11. Przygotować pożywkę podtrzymującą hepatocyty składającą się z pożywki E Williama uzupełnionej 10% zamiennikiem surowicy nokautującej, składającej się z 1% alternatywnego suplementu L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny (końcowe stężenia odpowiednio 100 j.m./ml i 100 μg/ml). Dla każdej zmiany pożywki należy uzupełnić wymaganą objętość HGF, EGF, bFGF i VEGF (końcowe stężenie każdego czynnika wzrostu przy 10 ng/ml).
      nuta: Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu dwóch tygodni.
  3. Sprawdź tworzenie się hepatosfery 24 godziny po wysiewie i zainicjuj różnicowanie hepatocytów. Ostrożnie usunąć pożywkę mTeSR1 i zastąpić ją 1 ml świeżej pożywki różnicującej endodermę uzupełnioną 100 ng/ml aktywiny A i 50 ng/ml Wnt3a.
  4. Zmieniaj uzupełnioną pożywkę gruntującą endodermę co 24 godziny przez 3 dni w przypadku hESC. W przypadku pracy z hiPSC należy przedłużyć ten etap o kolejne 2 dni, uzupełniając pożywkę samą aktywiną A (100 ng / ml).
  5. Po ostatecznej indukcji endodermy, należy zmienić pożywkę na pożywkę różnicującą hepatoblasty dla specyfikacji hepatoblastów na 5 dni, wymieniając pożywkę co 2 dni i przeprowadzić ostatnią zmianę w ostatnim dniu specyfikacji hepatoblastów.
  6. Przenieś hepatosfery do studzienek pokrytych poli-HEMA.
    1. Umyj komórki raz pożywką do dojrzewania hepatocytów bez suplementów po usunięciu pożywki KSR/DMSO i dodaj 1 ml pożywki do dojrzewania hepatocytów uzupełnionej 10 ng / ml HGF i 20 ng / ml OSM.
    2. Za pomocą pipety P1000 podnieś hepatosfery z mikropłytki agarozowej, kilkakrotnie pipetując roztwór w górę i w dół.
    3. Przenieś pożywkę zawierającą hepatosfery do studzienki pokrytej poli-HEMA.
    4. Umyj mikropłytkę agarozy za pomocą 1 ml pożywki do dojrzewania hepatocytów uzupełnionej 10 ng/ml HGF i 20 ng/ml OSM i przenieś pożywkę do dobrze pokrytego poli-HEMA.
    5. Powtórz krok 3.6.4 tyle razy, ile to możliwe, aby przenieść wszystkie hepatosfery z mikropłytki agarozy.
      nuta: Bardzo ważne jest, aby dokładnie pipetować w górę i w dół roztwór zawierający hepatosfery, aby uniknąć ich uszkodzenia.
  7. Ostrożnie odessać nadmiar pożywki bez usuwania hepatosfer za pomocą pipety P100, aż ~1 ml pożywki zawierającej hepatosfery pozostanie w dobrze pokrytej poli-HEMA.
  8. Zmieniaj podłoże co 48 godzin przez 12 dni.
  9. W 20. dniu w przypadku pracy z hESC lub w 22. dniu w przypadku pracy z hiPSC należy zmienić pożywkę na pożywkę podtrzymującą hepatocyty.
    1. Usuń pożywkę do dojrzewania hepatocytów i przemyj komórki raz pożywką podtrzymującą hepatocyty bez suplementów. Dodać 1 ml pożywki podtrzymującej hepatocyty uzupełnionej 10 ng/ml HGF, EGF, FGF i VEGF.
  10. Zmieniaj pożywkę na świeżą pożywkę do konserwacji hepatocytów co 48 godzin.

4. Analiza funkcjonalna długoterminowej hodowli hepatosfer 3D

  1. Przełącz się na pożywkę do dojrzewania hepatocytów uzupełnioną 10 μM HCC, L-glutaminą, 1% penicyliną/streptomycyną (końcowe stężenia odpowiednio 100 IU/ml i 100 μg/ml) i 10 ng/ml HGF 48 godzin przed wykonaniem analizy funkcjonalnej.
  2. Analizuj funkcję metaboliczną hepatocytów za pomocą testów cytochromu (CYP) P450.
    1. Zastąp pożywkę 1 ml świeżej pożywki do dojrzewania hepatocytów uzupełnionej 50 μM substratem eteru lucyferyno-6'-pentafluoro-benzylowego (lucyferyna-PFBE) w celu wykrycia podstawowej aktywności CYP3A lub 100 μM substratu eteru metylowego lucyferyny (lucyferyna-ME) w celu wykrycia podstawowej aktywności CYP1A2 (liczba powtórzeń = 3). Stosować pożywki do hodowli tkankowych jako kontrolę ujemną.
      nuta: Aby uniknąć reaktywności krzyżowej, zaleca się, aby nie używać tych samych studzienek zawierających hepatosfery 3D do testowania różnych aktywności CYP P450, ale wykonywać je w indywidualnych studzienkach.
    2. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 ° C.
    3. Zebrać supernatanty za pomocą końcówki pipety P100 i przeprowadzić test zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Zmierz względne poziomy podstawowej aktywności i znormalizuj do białka na mg, zgodnie z testem kwasu bicinchoninowego (BCA).
  3. Przetestuj produkcję białka w surowicy za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).
    1. Zastąp pożywkę 1 ml świeżej pożywki do dojrzewania hepatocytów uzupełnionej 10 ng/ml HGF i 20 ng/ml OSM (liczba powtórzeń = 3). Stosować pożywki do hodowli tkankowych jako kontrolę ujemną.
    2. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 ° C.
    3. Zebrać supernatant za pomocą końcówki pipety P100 i zmierzyć względne poziomy produkcji białka w surowicy zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Normalizować do białka na mg zgodnie z testem BCA.

5. Immunocytochemia

  1. Przygotowanie skrawków parafinowych zawierających hepatosfery.
    1. Umyj hepatosfery trzykrotnie 1x DPBS.
    2. Utrwal hepatosfery lodowatym metanolem przez 30 minut.
    3. Umyj trzy razy 1x DPBS.
    4. Zanurzyć hepatosfery w 300 μl odpuszczonego roztworu 2% agarozy rozpuszczonej wH2O, używając pustego dołka na 24-dołkowej płytce jako formy i pozostawić do zestalenia na 30 minut.
    5. Osadź agarozę zawierającą hepatosfery w parafinie.
    6. Przeciąć blok parafinowy zawierający stałe hepatosfery na odcinki o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu.
  2. Dewoskowanie i ponowne nawodnienie sekcji.
    UWAGA:     Używaj świeżych roztworów, gdy tylko jest to możliwe. Nie używaj roztworów, które znajdowały się na korycie barwiącym dłużej niż tydzień.
    1. Umieść sekcje w stojaku na slajdy.
    2. Zanurzyć stojak na szkiełka zawierające skrawki w korycie barwiącym zawierającym 300 ml ksylenu na 5 minut.
    3. Powtórz krok 5.2.2.
    4. Zanurz w absolutnym etanolu na 20 s.
    5. Zanurz w 95% etanolu na 20 s.
    6. Zanurz w 90% etanolu na 20 s.
    7. Zanurz w 80% etanolu na 20 s.
    8. Zanurz w 70% etanolu na 20 s.
    9. Nawadniaj sekcje wodą przez 5 min.
      nuta: Utrzymuj szkiełka w tym samym stojaku na szkiełka i przenoś je z jednej koryta do barwienia do następnej. Użyta objętość (zwykle ~300 ml) zależy od wielkości koryta do barwienia.
  3. Pobieranie antygenu z skrawków parafiny zawierających hepatosfery.
    1. Podgrzej odwoskowane i ponownie uwodnione sekcje w 1x roztworze buforowym Tris-EDTA (TE) pH 9,0 przez 15 minut w kuchence mikrofalowej o mocy 800 W.
    2. Schłodzić próbki, zanurzając je w wodzie z kranu na 5 minut.
  4. Barwienie immunologiczne.
    1. Szkiełka inkubować z roztworem blokującym wykonanym z PBS z 0,1% polisorbatem 20 (PBS/T)/10% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. Zastąpić roztwór blokujący odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w PBS/T/1% BSA i inkubować w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem przez noc.
    3. Myj komórki PBS/T przez 5 minut i powtórz trzy razy.
    4. Inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w PBS/T/1% BSA i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem.
      nuta: Zoptymalizowane przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe są wymienione w tabeli materiałów.
    5. Myj komórki PBS/T przez 5 minut i powtórz trzy razy.
    6. Dodaj 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) do komórek zgodnie z instrukcjami producenta i delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe, aby zredukować pęcherzyki powietrza. Utrzymuj stałe ogniwa w temperaturze 4 °C w ciemności. Obserwować barwienie pod mikroskopem z odpowiednim filtrem i świetlówką.
      UWAGA: Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu wykonania obrazu.

Wyniki

Trójwymiarowe agregaty z linii embrionalnych komórek macierzystych (H9) lub linii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (P106) poddano różnicowaniu w kierunku linii hepatocytów zgodnie z naszą zdefiniowaną procedurą (Rysunek 1). Pluripotencjalne komórki macierzyste zostały najpierw przygotowane do różnicowania w kierunku ostatecznej endodermy przed specyfikacją hepatoblastów. Następnie hepatoblasty dojrzewały do postaci 3D hepatosfer, które mogły być utrzymywane w hodowli przez okres do jednego roku23.

W celu zbadania struktury sfer 3D, sfery pochodzące z hESC lub iPSC w wieku 30 dni poddano fiksacji, cięciu i barwieniu, aby wykryć obecność białek wykazujących ekspresję w hepatocytach i komórkach mezenchymalnych. Wykorzystano czynnik jądrowy hepatocytów 4 alfa (HNF4α) oraz marker mezenchymalny vimentynę, co ujawniło obecność zewnętrznej warstwy złożonej z komórek podobnych do hepatocytów, otaczającej rdzeń komórek mezenchymalnych (Rysunek 2). Następnie przeprowadzono analizę ekspresji białek charakterystycznych dla hepatocytów: albuminy, CYP3A oraz E-kadheryny. Barwienie immunocytochemiczne wykazało, że ekspresja tych białek była ograniczona do zewnętrznej warstwy sfer (Rysunek 3).

Analizy funkcjonalne hepatosfer przeprowadzono w hodowlach 30-dniowych. CYP1A2 i CYP3A są ważnymi enzymami w funkcjonalnych hepatocytach. Ich aktywność oceniono za pomocą uznanych testów. Hepatosfery pochodzące z linii H9 wykazały aktywność CYP3A na poziomie 220,375 ± 74514 RLU/mL/mg białka oraz aktywność CYP1A2 na poziomie 732,40 ± 3,30 RLU/mL/mg białka (Rysunek 4A). Aktywność CYP3A w hepatosferach pochodzących z linii P106 wynosiła 13217 ± 43,391 RLU/mL/mg białka, a aktywność CYP1A2 wynosiła 409,907 ± 121,723 RLU/mL/mg białka (Rysunek 4B). W porównaniu z dwiema partiami ludzkich pierwotnych hepatocytów, trójwymiarowe sfery wątrobowe wykazały satysfakcjonujące poziomy aktywności CYP10.

Analiza syntezy i sekrecji albuminy oraz alfa-fetoproteiny (AFP) wykazała, że hepatosfery pochodzące z linii H9 wydzielały odpowiednio 683,9 ± 84 oraz 159 ± 20 ng/mL/24 h/mg białka albuminy i alfa-fetoproteiny (Rycina 5A). Natomiast hepatosfery pochodzące z linii P106 wydzielały odpowiednio 497 ± 41 oraz 756 ± 24 ng/mL/24 h/mg białka albuminy i alfa-fetoproteiny (Rycina 5B).

Oś czasu procesu hodowli hepatocytów; etapy: sferoidy, endoderm, hepatoblasty, hepatosfery.
Rycina 1Procedura różnicowania etapowego w celu generowania trójwymiarowych (3D) hepatosfer z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC). Niebieskie nawiasy reprezentują dni różnicowania hiPSC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, wyróżnione struktury komórkowe, porównawcze badanie komórek, schemat.
Rycina 2Reorganizacja strukturalna hepatosfer 3D. Reprezentatywne obrazy ekspresji czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α – kolor zielony) oraz wimentyny (kolor czerwony) w (A) trójwymiarowe hepatosfery pochodzące z linii H9 oraz (B) trójwymiarowe hepatosfery pochodzące z linii P106 oraz odpowiadające im kontrole immunoglobulin G (IgG). Paski skali oznaczają 60 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia immunofluorescencyjna albuminy, CYP3A4 i E-kadheryny w próbkach komórkowych; ekspresja białek.
Rysunek 3Ocena ekspresji markerów wątrobowych w trójwymiarowych hepatosferach. Reprezentatywne obrazy ekspresji markerów hepatocytów – albuminy, CYP3A, E-kadheryny oraz odpowiadających im kontroli IgG w (A) H9- oraz (B) Hepatosfery 3D pochodzące z linii P106. Paski skali = 60 μm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie hepatosfer, aktywność CYP450; wykres słupkowy RLU/ml/mg białka dla enzymów CYP3A i CYP1A2.
Rycina 4Funkcja cytochromu P450 w trójwymiarowych hepatosferach. Pomiar aktywności cytochromu P450 1A2 i 3A w (A) 3D hepatosfery pochodne z linii H9 oraz (B) trójwymiarowe hepatosfery pochodne z linii P106. Dane przedstawiają średnią z trzech powtórzeń biologicznych, a słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe (SD). Aktywność podano w relatywnych jednostkach światła (RLU) na ml na mg białka. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

poziomy sekrecji hepatosfer 3D; wykres słupkowy; albuminy vs AFP w ng/ml/24h/mg białka; analiza danych.
Rycina 5Analiza sekrecji białek przez hepatosfery. Analizowano wydzielanie albuminy oraz alfa-fetoproteiny (AFP) w (A) trójwymiarowe hepatosfery pochodne z linii H9 oraz (B) 3D hepatosfery pochodne od P106. Dane są reprezentatywne dla trzech powtórzeń biologicznych, a słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe (SD). Ilość wydzielonego białka podano jako nanogramy białka na ml na 24 h na mg białka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opracowanie zdefiniowanych i wolnych od ksenotypów systemów do produkcji ludzkich hepatosfer w 3D jest wymagane zarówno w przypadku prób in vitro, jak i in vivo. Obecnie większość podejść do różnicowania hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprowadza się w dwuwymiarowych hodowlach adherentnych. W tych środowiskach brakuje wielu wskazówek środowiskowych związanych z genezą i homeostazą tkanek, które obejmują; heterotypowe interakcje komórkowe, produkcja i przebudowa macierzy, co skutkuje słabym przełożeniem na biologię in vivo18,19.

W związku z tym badania skupiły się na alternatywnych podejściach do generowania hepatosfer z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Szereg badań 3D posunęło naprzód tę dziedzinę, ale są one zależne od produktów pochodzenia zwierzęcego 20,22,24 w celu zapewnienia wsparcia i/lub wymagają użycia tkanki ludzkiej21,22, co komplikuje skalowanie technologii i zagraża odtwarzalności i zastosowaniu eksperymentalnemu.

Procedura opisana w naszym artykule (ryc. 1) jest zdefiniowana, wydajna, wysoce powtarzalna i opłacalna, co pozwala na produkcję funkcjonalnych sfer wątrobowych, które pozostają funkcjonalne przez ponad rok in vitro i zapewniają krytyczne wsparcie wątroby in vivo14. Co ważne, platforma ta pozwala użytkownikowi kontrolować wielkość sfer wątroby 3D, ograniczając powstawanie gęstych centrów nekrotycznych i utratę fenotypu.

Przeniesienie hepatosfer 3D na płytki pokryte poli-HEMA stanowi krytyczny krok w tym protokole. Na tym etapie procedury ważne jest, aby delikatnie pipetować, aby uniknąć uszkodzenia kuli. Ponadto zmiany mediów muszą być wykonywane ostrożnie, aby uniknąć naprężeń ścinających i zniekształceń struktury kuli.

W tych badaniach hepatosfery 3D wykazywały zorganizowaną strukturę (ryc. 2 i ryc. 3), funkcję cytochromu P450 (ryc. 4) i wydzielane białka wątrobowe, w tym albuminę i alfa-fetoproteinę (ryc. 5). Procedura ta została z powodzeniem przeprowadzona w czterech liniach pluripotencjalnych komórek macierzystych z porównywalnymi wynikami. Patrząc w przyszłość, technologia ta może zostać wykorzystana jako platforma do opracowywania dalszych tkanek endodermalnych i mezenchymalnych o złożonej architekturze.

Oświadczenia

David C. Hay jest współzałożycielem i udziałowcem firm Stemnovate Ltd i HigherSteaks Ltd. Pozostali autorzy zaświadczają, że nie mają konfliktu interesów w odniesieniu do tematyki lub materiałów omawianych w tym artykule.

Podziękowania

To badanie zostało wsparte nagrodami od Brytyjskiej Platformy Medycyny Regeneracyjnej (MRC MR/L022974/1) oraz Biura Głównego Naukowca (TCS/16/37).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hodowla komórkowa i testy funkcjonalne
AgaroseFisher Bioreagents10766834
suplement B27 Technologie życiowe 12587-010
beta-merkaptoetanolLife Technologies 31350
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich A2058 
DAPI InvitrogenD1306
DMSO Sigma-Aldrich D5879
DPBS, bez wapnia, bez magnezuThermoFisher 
DPBS z wapniem i magnezemThermoFisher 
Delikatny odczynnik do dysocjacji komórekSTEMCELL Technologies 7174
GlutaMax Technologie życiowe 35050
HepatoZYME-SFMTechnologie życia   17705021
Ludzka Aktywina A Peprotech 120-14E
Ludzka alfa fetoproteina ELISAAlfa Diagnostyka500
Ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibrobasltPeprotech 100-18B
Ludzki czynnik nabłonkowyPeprotech 236-EG
Ludzki czynnik wzrostu hepatocytówPeprotech 100-39
Onkostatyna ludzka M Peprotech 300-10
Ludzka rekombinowana Laminina 521 BioLamina LN521-02
Albumina ludzkiej surowicy ELISAAlpha Diagnostics1190
Ludzki czynnik wzrostu naczyń krwionośnychBio-techne293-VE
Hydrokortyzon 21-hemibursztynian sól sodowaSigma-Aldrich H4881
Nokaut DMEM Technologie życiowe 10829
Wymiana surowicy nokautującej Technologie życiowe 10828
Sferoidy mikropleśni Sigma-Aldrich 
mTeSR1 średni Technologie STEMCELL 5850
Aminokwasy endogenne Technologie życiowe 11140
System do oznaczania i badań przesiewowych P450-GLO CYP1A2 System oznaczania i badań przesiewowychPromegaV8771
P450-Glo CYP3A4 PromegaV8801
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Life Technologies 
poli-HEMA (metakrylan poli-2-hydorxyethylu) Sigma-Aldrich P3932
Mysz rekombinowana Wnt3a Bio-techne1324-WN-500/CF
RPMI 1640 Technologie życiowe 21875
Sprzęt
MikrofalówkaBosch
MicrotomeLeikaRM2125RT
PiekarnikThermoscientific
Przeciwciała
Przeciwciała pierwotne
Albumina Sigma-Aldrich A6684 1:100 (myszka)
CYP3A4Uniwersytet w DundeeUniwersytet w Dundee 1:200 (owce)
E-kadherynaAbcamab760551:200 (mysz)
HNF-4&alfa;Santa Cruzsc-89871:100 (królik)
IgGDAKOX09431:400
VimentinDAKOM07251:100 (owca)
1419025014040133Z76400015140122

Bibliografia

  1. Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
  2. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (34), 12301-12306 (2008).
  3. Hay, D. C., et al. Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo. STEM CELLS. 26 (4), 894-902 (2008).
  4. Hannan, N. R., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
  5. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14 (2), 237-252 (2014).
  6. Sullivan, G. J., et al. Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
  7. Si-Tayeb, K., et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  8. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).
  9. Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  10. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
  11. Zhou, X., et al. Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
  12. Lyall, M. J., et al. Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170362(2018).
  13. Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
  14. Lucendo-Villarin, B., et al. Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells. Archives of Toxicology. 91 (11), 3633-3643 (2017).
  15. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  16. Godoy, P., et al. Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. Journal of Hepatology. 63 (4), 934-942 (2015).
  17. Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4 (20), 3433-3442 (2016).
  18. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. Slas Discovery. 22 (5), 456-472 (2017).
  19. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  20. Gieseck, R. L., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLoS ONE. 9 (1), (2014).
  21. Takebe, T., et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols. 9 (2), 396-409 (2014).
  22. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
  23. Rashidi, H., et al. 3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
  24. Takebe, T., et al. Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ludzkie pluripotencjalne kom rki macierzystetworzenie hepatosferr nicowanie bezsurowiczetechnologia mikrowell z agarozytr jwymiarowe sfery w trobower nicowanie w kierunku endodermyr nicowanie hepatoblast waktywno cytochromu P450sekrecja albuminydo ki powlekane poli HEMA
Produkcja trójwymiarowych ludzkich hepatosfer bez surowicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.