Elektrokardiografia powierzchniowa in vivo u dorosłych danio pręgowanych

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy niezawodną, minimalnie inwazyjną i opłacalną metodę rejestrowania i interpretacji elektrokardiogramów u żywych, znieczulonych dorosłych ryb pręgowanych.

Streszczenie

Przebiegi elektrokardiogramu dorosłego danio pręgowanego i ludzkiego są niezwykle podobne. Te podobieństwa do elektrokardiogramu zwiększają wartość danio pręgowanego nie tylko jako modelu badawczego dla elektrofizjologii serca i miopatii człowieka, ale także jako modelu zastępczego w wysokoprzepustowych farmaceutycznych badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych kardiotoksyczności dla ludzi, takich jak wydłużenie odstępu QT. W związku z tym elektrokardiografia in vivo u dorosłych ryb danio pręgowanego jest elektrycznym narzędziem do fenotypowania, które jest niezbędne, jeśli nie niezbędne, do przekrojowych lub podłużnych charakterystyk elektrofizjologicznych in vivo. Jednak zbyt często brak niezawodnej, praktycznej i opłacalnej metody rejestracji pozostaje głównym wyzwaniem, które uniemożliwia łatwiejszy dostęp do tego narzędzia do diagnostyki in vivo. W tym miejscu opisujemy praktyczne, proste podejście do elektrokardiografii in vivo u dorosłych danio pręgowanego przy użyciu łatwego w utrzymaniu, opłacalnego i kompleksowego systemu, który zapewnia spójne, wiarygodne zapisy. Ilustrujemy nasz protokół na przykładzie zdrowych dorosłych samców danio pręgowanego w wieku 12-18 miesięcy. Wprowadzamy również strategię szybkiej interpretacji w czasie rzeczywistym w celu walidacji jakości, aby zapewnić dokładność i solidność danych na wczesnym etapie procesu rejestracji elektrokardiogramu.

Wprowadzenie

Serce danio pręgowanego (Danio rerio) znajduje się przednio-brzusznie do klatki piersiowej między wieczkiem a obręczą piersiową. Serce jest dość luźno zamknięte w worku osierdziowym w kolorze srebrnym. Anatomicznie serce danio pręgowanego różni się od czterokomorowych serc ludzi i innych ssaków ze względu na jego drobną skalę (100-krotnie mniejszą niż ludzkie serce) i dwukomorową strukturę składającą się tylko z jednego przedsionka i jednej komory. Niemniej jednak przebiegi elektrokardiogramu (EKG) i czas trwania odstępu QT u obu gatunków są niezwykle podobne (Ryc. 1). W związku z tym danio pręgowany stał się popularnym modelem do badania dziedzicznych u ludzi arytmii^1,2,3 oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków pod kątem potencjalnych kardiotoksyczności u ludzi^4,5, takich jak wydłużenie odstępu QT.

W rutynowej ocenie chorób serca u ludzi, EKG na powierzchni ciała stało się najpowszechniej stosowanym narzędziem diagnostycznym pierwszej linii od czasu jego wynalezienia przez Einthovena w 1903 roku. W przeciwieństwie do tego, od czasu pierwszej adaptacji metody zapisu EKG powierzchni ciała dla dorosłych danio pręgowanego w 2006 roku⁶ i kilku późniejszych modyfikacji⁷, technika ta pozostała w dużej mierze niedostępna dla wielu badaczy w tej dziedzinie, pomimo popularności tego modelu zwierzęcego. W przypadku innych badaczy, którzy przeprowadzili badanie EKG in vivo u dorosłych danio pręgowanego, duże różnice między operatorami doprowadziły do niespójności w wynikach EKG z różnych badań. Najczęstszymi przyczynami są uciążliwe i drogie specjalistyczne urządzenia i oprogramowanie, niski stosunek sygnału do szumu oraz zamieszanie dotyczące umieszczenia elektrod, a wszystko to dodatkowo pogarsza niepełne zrozumienie cech EKG dorosłego danio pręgowanego i leżących u ich podstaw mechanizmów tkankowych. Biorąc pod uwagę, że EKG in vivo jest jedynym narzędziem diagnostycznym do elektrycznej fenotypu żywego danio pręgowanego, istnieje wyraźna potrzeba opracowania ustandaryzowanej metody w celu poprawy czułości i swoistości, odtwarzalności i dostępności.

Tutaj prezentujemy praktyczne, niezawodne i sprawdzone podejście do rejestrowania i interpretacji elektrokardiogram danio pręgowanego in vivo (Rysunek 2). Używając pojedynczego przewodu dwubiegunowego w płaszczyźnie czołowej, zbadaliśmy zmiany w przebiegach EKG i czasie trwania interwałów żywych, znieczulonych, zdrowych dorosłych dorosłych AB typu dzikiego.

Protokół

Wszystkie eksperymenty w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z amerykańskim Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dla opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie protokoły na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UCLA.

1. Przygotowanie zestawu eksperymentalnego

1. Utrzymuj danio pręgowanego w przepływowych systemach akwariowych w świetle przez 14 godzin i 10 godzin ciemnego fotoperiodu w temperaturze 28 °C ± 0,5 °C. Codziennie karmić pokarmem w postaci płatków i żywymi krewetkami solankowymi (Artemia nauplii) dwa razy dziennie. Danio pręgowany w tym badaniu był utrzymywany i karmiony przez UCLA Zebrafish Core.
2. W dniu eksperymentu przetransportuj danio pręgowanego z akwarium do laboratorium.
3. Skonfiguruj system zapisu EKG in vivo, podłączając niezbędne elementy wyposażenia i wkładając trzy oznaczone kolorami elektrody ze stali nierdzewnej do trzech dopasowanych kolorystycznie portali dostępowych wzmacniacza (Rysunek 3). Uruchomić system na początku sesji zapisu i/lub analizy EKG.
4. Zaopatrz się w niezbędne narzędzia, takie jak minutnik/stoper, mokra gąbka ze szczeliną do przytrzymywania ryby, kleszcze, nożyczki, pipety Pasteura i szalki do hodowli zwierząt (100 mm x 20 mm).

2. Indukcja znieczulenia

1. Przygotuj znieczulenie zanurzeniowe w celu kontroli bólu i unieruchomienia ryb, aby uniknąć artefaktów ruchu podczas pozyskiwania danych EKG. Większość laboratoriów stosuje trikainę zanurzeniową (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanu, MS-222).
   1. Aby przygotować 0,4% roztwór podstawowy tricainy, połącz następujące elementy w zakręcanej butelce z ciemnego szkła: 400 mg proszku trikainy, 98 ml podwójnie destylowanej wody i 2 ml 1 M Tris (pH 9). Dostosuj do pH 7,0 za pomocą 1 N NaOH lub 1 N HCl w zależności od potrzeb⁸.
   2. Aby przygotować końcowy roztwór zanurzeniowy tricaine, określ minimalne stężenie, które jest odpowiednie dla wieku danio pręgowanego⁹, rozmiar, stan metaboliczny, szczep, model choroby, cele naukowe i czas trwania procedury.
   3. Przeprowadzić badanie stężenie-odpowiedź trikainy, miareczkując w górę lub w dół od zalecanego stężenia 168 mg/L (lub 0,0168%)⁹ jeśli to konieczne, aby osiągnąć 4 poziom znieczulenia w ciągu 3 minut przy jak najmniejszej toksyczności krążeniowo-oddechowej. Na przykład w tym badaniu zanurzenie danio pręgowanego AB typu dzikiego w wieku 12-18 miesięcy w 0,02-0,04% roztworze tricainy wywoła 4. poziom znieczulenia w ciągu 3 minut
      UWAGA: Na poziomie 4 znieczulenia równowaga i napięcie mięśniowe są całkowicie utracone, a szybkość ruchów operkularnych jest zmniejszona⁸.
   4. W razie potrzeby należy skonsultować się z lekarzem weterynarii w Komitecie ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Stosowania (IACUC) w celu uzyskania dodatkowych wskazówek dotyczących stosowności wyboru środka znieczulającego (środków znieczulających) i drogi podawania.
2. Zanurz dorosłego danio pręgowanego w naczyniu zawierającym roztwór tricainy o najniższym z góry określonym i zatwierdzonym przez IACUC stężeniu (np. 0,02-0,04% w tym badaniu), aby wywołać 4 poziom znieczulenia w ciągu 3 minut (Rysunek 2).
   1. W przypadku protokołu EKG dotyczącego przeżycia sesja zapisu EKG powinna być jak najkrótsza (poniżej 10 minut). W przypadku krótkich sesji zapisu EKG trwających krócej niż 15 minut nie jest konieczne podtrzymywanie znieczulenia.
   2. W przypadku długich, wielogodzinnych sesji zapisu EKG należy użyć długo działającego domięśniowego paralityka i doustnego systemu perfuzyjnego, aby zapewnić wystarczające nawilżenie i dotlenienie⁶.

3. Umieszczenie elektrod EKG

1. Gdy danio pręgowany utrzyma 4 poziom znieczulenia przez 3 sekundy, użyj pary kleszczy, aby natychmiast przenieść rybę na wilgotną szczelinę z gąbki tak, aby jej brzuszna powierzchnia była skierowana do góry w celu umieszczenia elektrod oprowadzających EKG (Rysunek 4).
2. Delikatnie włóż trzy elektrody odprowadzające EKG do mięśni ryby na głębokość około 1 mm, aby ustanowić dwubiegunowy przewód w płaszczyźnie czołowej, który jest równoległy do lewej ogonowo-prawej orientacji czaszkowej głównej osi serca.
3. Umieść dodatnią (czerwoną) elektrodę w brzusznej linii środkowej na poziomie bulbus arteriosus, tj. 1-2 mm powyżej wyimaginowanej linii łączącej dwie dolne krawędzie wieczków (Rysunek 4A).
4. Umieść ujemną (czarną) elektrodę doogonowo i 0,5-1,0 mm w lewo w lewo od elektrody dodatniej, w odległości większej niż maksymalna długość wierzchołka podstawy dorosłej komory zebry (Rysunek 4A).
5. Ustawić elektrodę odniesienia (zieloną) doogonowo, w pobliżu okolicy odbytu.
   UWAGA: Ponieważ główna oś serca różni się nieco w zależności od ryby, aby zmaksymalizować amplitudy fal R i T, dostosuj pozycje odprowadzenia, dokonując tylko niewielkich, systematycznych zmian metodą prób i błędów. Na przykład zmieniaj jedną elektrodę (dodatnią lub ujemną) zamiast obu elektrod na raz i wykonuj stopniowe zmiany w jednym określonym kierunku przed zmianą na inny, zamiast dokonywać nieregularnych zmian w losowych kierunkach.

4. Zapis EKG

1. Otwórz program do akwizycji danych EKG. Wybierz żądane ustawienie z menu rozwijanych dla zakresu, dolnoprzepustowego i górnoprzepustowego. Na przykład, następujące ustawienie w systemie rejestracji EKG in vivo użytym w tym eksperymencie daje stały, zadowalający stosunek sygnału do szumu dla normalnego dorosłego danio pręgowanego: zakres "2 mV", dolnoprzepustowy "120 Hz" i górnoprzepustowy "0,03 s".
2. Naciśnij Start, aby rozpocząć ciągły zapis EKG bez przerw przy częstotliwości próbkowania 1 kHz.
3. Aby zoptymalizować pozycjonowanie przewodów w celu uzyskania maksymalnego stosunku sygnału do szumu, naciśnij przycisk Stop, aby zatrzymać zapis EKG i przejrzyj zapis EKG wkrótce po pierwszej próbie zapisu dla każdego serca. Aby zdiagnozować, że EKG dorosłego danio pręgowanego jest prawidłowe, upewnij się, że spełnione są wszystkie następujące cztery kryteria walidacji (Rysunek 1):
   1. Kryterium 1: Upewnij się, że wszystkie krzywe EKG (P, QRS i T) są wyraźne i łatwo widoczne.
   2. Kryterium 2: Upewnij się, że fala P jest dodatnia.
   3. Kryterium 3: Upewnij się, że netto kompleks QRS jest dodatni (tj. amplituda fali R jest większa niż suma amplitud fal Q i S).
   4. Kryterium 4: Upewnij się, że fala T jest dodatnia.
4. Jeśli spodziewane jest prawidłowe EKG, zmień położenie elektrod (najpierw wypróbuj elektrodę ujemną), jeśli to konieczne, aż zostaną spełnione wszystkie cztery kryteria walidacji.
5. Jeśli spodziewany jest normalny załamek T, ale załamek T jest zbyt mały, zmień położenie elektrod, aby zmaksymalizować amplitudę fali T.
6. Wznów zapis EKG po zoptymalizowaniu pozycjonowania elektrody. Zapisz przemiatanie EKG do późniejszej analizy.

5. Rekonwalescencja po znieczuleniu

1. Pod koniec sesji zapisu EKG ostrożnie wyjmij elektrody, nie raniąc ryby. Przenieść rybę do świeżej, natlenionej wody dla ryb wolnej od tricainy.
2. Aby ułatwić powrót do zdrowia po znieczuleniu, energicznie spryskuj skrzela wodą za pomocą pipety Pasteura, aż ryba wznowi regularne ruchy skrzeli lub pływanie.
3. Monitoruj rybę pod kątem pełnego wyzdrowienia po znieczuleniu (zwykle 1-2 min), na co wskazuje zdolność ryby do pływania w pozycji wyprostowanej przez co najmniej 5 sekund.

6. Interpretacja EKG

1. Określ ustawienia analizy.
   1. Zapoznaj się z interfejsem oprogramowania (tabela materiałów), czytając instrukcję obsługi oprogramowania do analizy danych EKG.
      UWAGA: Chociaż poniższe wskazówki dotyczą specyficznego oprogramowania komercyjnego używanego w naszym laboratorium, podstawowe zadania do wykonania są zasadniczo takie same w każdym pakiecie oprogramowania do analizy EKG.
   2. Otwórz program do analizy danych EKG. Z menu Plik wybierz opcję Otwórz, aby otworzyć interesujący Cię plik EKG i wyświetlić pełny zapis EKG. Użyj myszy, aby przeciągnąć interesującą Cię sekcję w śladzie EKG do analizy.
   3. Z menu Analiza EKG wybierz Ustawienia EKG, aby otworzyć okno dialogowe do wstępnego zdefiniowania różnych ustawień parametrów dla automatycznej analizy programowej (Rysunek 5A).
2. Analizuj rytm i częstość akcji serca.
   UWAGA: Tętno zależy od kilku czynników, w tym wieku i szczepu danio pręgowanego, środków znieczulających (np. trikainy, izofluranu itp.) i stężenia, użycia znieczulenia (pojedynczy środek^5,7 vs. agenci połączeni⁵) oraz czas ekspozycji⁵. Na przykład w tym badaniu tętno 12-18-miesięcznego danio pręgowanego AB typu dzikiego po 3-5 minutach zanurzenia w 0,02-0,04% roztworze tricainy wynosiło 116 ± 17 uderzeń na minutę (n = 9), co jest zgodne z doniesieniami literaturowymi dotyczącymi częstości akcji serca dla tej grupy wiekowej i znieczula5^,7.
   1. Określ, czy rytm serca jest zatokowy, czy nie, regularny lub nieregularny.
      UWAGA: Obecność (lub brak) rytmu zatokowego opiera się na obecności (lub braku) pionowego załamka P poprzedzającego każdy zespół QRS o normalny interwał PR (np. 60-65 ms dla 10-12 miesięcznych ⁷ i 12-18 miesięcznych AB typu dzikiego w tym badaniu). Regularność (lub nieregularność) rytmu przedsionkowego i komorowego opiera się na regularności (lub nieregularności) następujących po sobie odstępów PP lub RR.
   2. Aby określić tętno, upewnij się, że oprogramowanie poprawnie identyfikuje wszystkie fale P i R. Na podstawie tych automatycznych identyfikacji (lub ręcznych korekt) załamków P i R, oprogramowanie automatycznie mierzy wszystkie interwały PP i RR w selekcji EKG, oblicza średnie interwały w celu wygenerowania częstości przedsionków i komór.
      UWAGA: Częstość przedsionków to średni odstęp PP, podczas gdy częstość komór to średni interwał RR. Aby określić tętno, kluczowa jest prawidłowa identyfikacja fal P i R.
   3. Popraw wszelkie błędy automatycznej identyfikacji, przesuwając zagubione kursory do odpowiednich fal P i R (Rysunek 5B).
      UWAGA: Jeśli serce jest w rytmie zatokowym, częstość przedsionków i częstość komór są takie same ze względu na zgodność jeden do jednego między załamkami zatokowymi P a zespołami QRS. Jednak w przypadku dysocjacji przedsionkowo-komorowej (np. w częstoskurczu komorowym lub bloku przedsionkowo-komorowym trzeciego stopnia) ta zgodność jeden do jednego między załamkami P a zespołami QRS zostaje utracona; Dlatego częstość akcji serca jest dwukierunkowa, ponieważ częstość przedsionków różni się od częstości komór.
   4. Określ tętno na podstawie co najmniej pięciu kolejnych pełnych cykli pracy serca, jeśli rytm serca jest regularny, lub paska trwającego co najmniej sześć sekund, jeśli rytm serca jest nieregularny.
3. Obliczanie interwałów i czasów trwania fal.
   1. Przejdź do Analizy EKG > Widoku uśredniania, aby połączyć n (np. 5) kolejnych cykli pracy serca w jeden średni sygnał (Rysunek 5C).
      UWAGA: Jeśli przebiegi EKG w pojedynczym cyklu pracy serca znacznie odbiegają od średniego sygnału, należy zbadać ten cykl serca oddzielnie bez konkatenacji.
   2. Upewnij się, że oprogramowanie poprawnie identyfikuje początek i koniec fali P, zespołu QRS i fali T wyświetlanych w oknie Widok uśredniania (Rysunek 5C). Na podstawie tych automatycznych identyfikacji (lub ręcznych poprawek) tych fal i interwałów, oprogramowanie automatycznie mierzy czas trwania zgodnie z konwencjonalną definicją.
      UWAGA: Interwał PR rozciąga się od początku załamka P do początku zespołu QRS (lub kompleksu RS, jeśli załamek Q nie jest widoczny). Czas trwania załamka Q rozciąga się od początku załamka Q (lub załamka R, jeśli załamek Q nie jest widoczny) do końca załamka S (tj. punktu J; Rysunek 1). Przedział QT rozciąga się od początku załamka Q (lub załamka R, jeśli załamek Q nie jest widoczny) do końca załamka T. Dlatego, aby obliczyć interwały i czasy trwania, kluczowa jest prawidłowa identyfikacja początku i końca załamka P, zespołu QRS i załamka R.
   3. Popraw wszelkie błędy automatycznej identyfikacji, przesuwając zagubione kursory w odpowiednie pozycje.
   4. Wybierz ujemny szczyt fali S jako koniec QRS complex⁷, ponieważ punkt J danio pręgowanego, który sygnalizuje koniec fali S, może być szczególnie trudny do dokładnej identyfikacji. Spowoduje to nieznaczne niedoszacowanie rzeczywistego czasu trwania QRS.
      UWAGA: Oprogramowanie do analizy EKG automatycznie koryguje odstęp QT do częstości komór (lub interwału RR) w celu wygenerowania skorygowanego odstępu QT QTc przy użyciu metody wstępnie wybranej przez użytkownika w kroku 6.1.3, na przykład Bazett (Rysunek 5A). Wzór Bazetta (1920) QTc = QT / √RR jest najpopularniejszą i pierwszą z kilku metod zaproponowanych do skorygowania ludzkiego odstępu QT dla częstości akcji serca. Ponieważ dokładność wzoru Bazetta została zakwestionowana, zapoznaj się z innymi metodami zaproponowanymi dla ludzi^10,11 i danio pręgowany⁶ (Rysunek 5D).
4. Zinterpretuj nieprawidłowości EKG, rozpoznając wyjątki dla czterech kryteriów walidacji w kroku 4.3.
   1. Rozpoznaj wyjątki dla kryterium 1. W przypadku braku załamków P (co wskazuje na brak rytmu zatokowego), polegaj na odstępach RR i czasie trwania QRS, aby zdiagnozować rytm serca. Na przykład, jeśli odstępy RR są nieregularnie nieregularne, zdiagnozuj migotanie przedsionków; jeśli odstępy RR są regularne, a zespół QRS jest normalnie wąski, należy zdiagnozować rytm ucieczki połączeniowej; z drugiej strony, jeśli odstępy RR są regularne, a QRS jest nienormalnie wydłużony, zdiagnozuj rytm ucieczki komorowej.
   2. Rozpoznaj wyjątki dla kryterium 2. Gdy załamek P jest ujemny (lub odwrócony), zdiagnozuj wsteczną aktywację przedsionków z rozrusznika ektopowego (takiego jak miejsce przedsionkowe za węzłem zatokowym, węzłem przedsionkowo-komorowym lub komorą).
   3. Rozpoznaj wyjątki dla kryterium 3. Gdy wysokie i wąskie fale Q występują z ujemnymi falami P i ujemnymi T, zdiagnozuj odwrócenie przewodu z powodu błędnej zamiany dodatnich i ujemnych pozycji elektrod, ponieważ te wysokie i wąskie fale Q były prawdziwymi falami R błędnie odwróconymi (Rysunek 6D). W przeciwieństwie do tego, gdy szerokie załamki Q występują z dodatnimi załamkami P po znacznym uszkodzeniu serca, zdiagnozuj zawał mięśnia sercowego, ponieważ te szerokie załamki Q są prawdziwymi patologicznymi załamkami Q.
   4. Rozpoznaj wyjątki dla kryterium 4. Gdy załamek T jest odwrócony, sprawdź aktywację komór, aby określić, czy nieprawidłowość repolaryzacji komór jest pierwotna czy wtórna. Polegaj na scenariuszu klinicznym, aby zawęzić prawidłową diagnozę na podstawie różnicowej listy pierwotnych nieprawidłowości repolaryzacji komór (z działania leku lub niedokrwienia mięśnia sercowego; Rysunek 6C) vs. wtórna nieprawidłowość repolaryzacji komór (spowodowana nieprawidłową aktywacją komór z powodu prepobudzenia, ektopii komorowej lub stymulacji komorowej).
5. Eksport wyników EKG.
   1. Wybierz opcję Table View (Widok tabeli), aby ponownieview wszystkie pomiary EKG. Wybierz interesujące Cię pomiary, które chcesz skopiować i wkleić do żądanego dokumentu (np. arkusza kalkulacyjnego Excel).
   2. Aby wyeksportować zapis EKG, podświetl interesujący Cię fragment przeciągnięcia EKG za pomocą ikony lupy. Skopiuj i wklej do żądanego dokumentu (np. Word lub PowerPoint).

Wyniki

Rysunek 1 ilustruje znaczenie kliniczne zaprezentowanej tutaj metody. Powierzchniowa elektrokardiografia in vivo u dorosłych danio przebrzuchłych jest kluczowym narzędziem fenotypowania elektrycznego ze względu na niezwykłe podobieństwa między EKG danio przebrzuchłych a ludzkim, mimo ogromnych różnic anatomicznych. Serce danio przebrzuchłych posiada tylko jeden przedsionek i jedną komorę, w przeciwieństwie do serca człowieka z dwoma przedsionkami i dwiema komorami (górny rząd; odpowiednio po prawej i lewej stronie). Jednak mimo pozornej prostoty anatomicznej, serce danio przebrzuchłych wykazuje kilka cech EKG wspólnych z ludzkim sercem (dolny rząd; odpowiednio po prawej i lewej stronie). W związku z tym serce danio przebrzuchłych stało się modelem zastępczym dla ludzkiej elektrofizjologii serca^5,12,13. Rysunek 1 przedstawia małą, ale wyraźną załamkę Q u żywego, zdrowego, 14-miesięcznego osobnika danio przebrzuchłych. Jednak w EKG danio przebrzuchłych rozmieszczenie elektrod nie jest powszechnie optymalizowane w celu uwidocznienia załamki Q. Dlatego załamka Q jest zazwyczaj niewidoczna, a w EKG danio przebrzuchłych częściej obserwuje się kompleks RS niż pełny kompleks QRS.

Rycina 2 podsumowuje cztery kluczowe kroki niezbędne do przeprowadzenia małoinwazyjnej elektrokardiografii in vivo u dorosłych danio przebraniec. Po indukcji znieczulenia (krok 1) i umieszczeniu elektrod (krok 2), zarejestrowaliśmy sygnały ECG podstawowe (krok 3) u zdrowych ryb danio przebraniec typu dzikiego AB w wieku od 12 do 18 miesięcy (n = 9). Zastosowana technika wprowadzania elektrod była małoinwazyjna, ponieważ nie wymagała usuwania łusek ryb ani wykonywania perykardiotomii. Po akwizycji danych ręcznie przeanalizowano i zweryfikowano każde nagranie ECG (krok 4), aby uniknąć potencjalnych błędów w automatycznej analizie programowej.

Rysunek 3 przedstawia trzy niezbędne komponenty typowego systemu akwizycji i przetwarzania danych EKG: wysokowydajny sprzęt do akwizycji danych, różnicowy wzmacniacz o wysokim wzmocnieniu oraz komputer z zainstalowanym oprogramowaniem do akwizycji i analizy danych EKG. W naszym laboratorium dostosowaliśmy istniejący komercyjny system rejestracji EKG in vivo, pierwotnie zaprojektowany dla małych modeli ssaków (takich jak myszy, szczury i króliki), do zastosowania w modelu dorosłego danio pręgowanego.

Rysunek 4 pokazuje, że prawidłowe rozmieszczenie elektrod wymaga wyrównania elektrody z domniemaną główną osią serca. W przypadku rejestracji EKG in vivo u rybek zebrafish, ponieważ używana jest tylko jedna elektroda, właściwe rozmieszczenie w celu jednoczesnej maksymalizacji amplitud obu fal R i T jest kluczowe. Aby zmaksymalizować amplitudy fal R i T, wyrównaliśmy dodatnią i ujemną elektrodę z główną osią serca, prawdopodobnie w orientacji od lewej strony ogonowej do prawej czaszkowej. Po torakotomii i perykardiotomii w celu otwarcia worka osierdziowego i odsłonięcia serca, główna oś serca staje się widoczna (Rysunek 4B biała przerywana linia). W rzeczywistości perykardiotomia w celu odsłonięcia serca jest powszechnie stosowaną strategią zwiększania stosunku sygnału do szumu⁷, jednak odbywa się to kosztem przekształcenia rejestracji EKG z procedury małoinwazyjnej w wysoce inwazyjną.

Rycina 5 przedstawia kluczowe etapy analizy EKG. W pierwszej kolejności zdefiniowano uprzednio różne ustawienia parametrów dla automatycznej analizy programowej, korzystając z okna dialogowego ECG Settings (Rysunek 5A). Ponieważ wykorzystujemy istniejący sprzęt do zapisu EKG zaprojektowany dla modeli ssaków, aby dostosować go do dorosłych danio-ostrobłonkich, ustawienie Detekcji i Analizy dla danio-ostrobłonkich nie jest dostępne. Wybrano zamiast tego ustawienie Human Preset, biorąc pod uwagę niezwykłe podobieństwo EKG danio-ostrobłonkich do EKG człowieka (Rysunek 5A). Po drugie, ręcznie zweryfikowano automatyczną identyfikację szczytów załamka R (zaznaczonych na czarno) wykonaną przez oprogramowanie EKG i poprawiono (zaznaczono na czerwono) wszelkie błędy automatycznej identyfikacji załamka R przed wydaniem polecenia ponownego obliczenia średniej częstotliwości pracy komór przez oprogramowanie. Na przykład w Rycina 5Bduża załamka P w stosunku do załamki R spowodowała błędną identyfikację załamek R przez oprogramowanie, co doprowadziło do późniejszego automatycznego błędnego obliczenia odstępu RR lub częstotliwości pracy komór. Dlatego w analizie EKG kluczowa jest weryfikacja przeprowadzona przez człowieka oraz wprowadzenie odpowiednich korekt w razie potrzeby. Po trzecie, szybko oceniliśmy regularność rytmu i obliczyliśmy średni czas trwania załamek i odstępów za pomocą Widok uśredniania (Rycina 5C) w celu połączenia kilku następujących po sobie cykli pracy serca (zielony) w jeden pojedynczy sygnał uśredniony (czarny). Tutaj w Rycina 5Cpomijalna różnica między każdym z dziewięciu cykli serca a sygnałem średnim świadczy o doskonałej regularności rytmu serca tej danio przebr striped. Na koniec skonfigurowaliśmy oprogramowanie tak, aby automatycznie korygowało odstęp QT względem częstości akcji serca, stosując metodę Bazetta, jedną z siedmiu dostępnych metod (Rysunek 5D).

Rycina 6A-C pokazuje, jak głębokość umieszczenia elektrod wpływa na amplitudy sygnałów EKG. Gdy elektrody zostały błędnie wprowadzone zbyt płytko, do skóry właściwej (Rycina 6A), odprowadzenie miało charakter „pośredni” (ponad dwie średnice serca od serca, podobnie jak standardowe pośrednie odprowadzenia kończynowe I, II i III w EKG u ludzi), a sygnały napięcia były niewielkie. Po prawidłowym wprowadzeniu elektrod o 1 mm głębiej, do mięśni piersiowych (Rycina 6B), odprowadzenie stało się „półpośrednie” (w bliskim sąsiedztwie, ale nie w bezpośrednim kontakcie z sercem), a sygnały napięcia wzrosły. Kształty fal EKG stały się wyraźnie widoczne. Jednakże, gdy elektrody zostały błędnie wprowadzone jeszcze głębiej, bezpośrednio do komory (Rycina 6C), odprowadzenie stało się „bezpośrednie” (w bezpośrednim kontakcie z sercem), a sygnały napięcia wzrosły jeszcze bardziej. Amplituda załamka R na Rycynie 6C wzrosła ośmiokrotnie w porównaniu z Rycyną 6A i czterokrotnie w porównaniu z Rycyną 6B. Jednak zapis EKG na Rycynie 6C ujawnił nowe oznaki uszkodzenia mięśnia sercowego w obrębie komory, takie jak nowe obniżenie odcinka ST i nowa inwersja załamka T.

Rysunek 6D obrazuje, w jaki sposób nietypowe odwrócenia wszystkich załamków EKG (P, Q, R, S i T) powinny sygnalizować błąd polegający na zamianie odprowadzeń, w którym elektrody dodatnia i ujemna zamieniły się miejscami. Należy pamiętać, że z definicji załamki Q i S są zawsze ujemne, podczas gdy R jest zawsze dodatni.

Rysunek 6E-F pokazuje, w jaki sposób niewłaściwa głębokość znieczulenia może pogorszyć jakość zapisu EKG in vivo. Na Rysunku 6E niewystarczające znieczulenie (0,017% tricaine) doprowadziło do braku pełnej immobilizacji danio przełomywego. Powstałe artefakty ruchowe obniżyły stosunek sygnału do szumu, zarówno poprzez zanieczyszczenie sygnału (gwiazdka), jak i zwiększenie poziomu szumu (strzałki). W przeciwieństwie do tego, na Rysunku 6F przedawkowane znieczulenie (0,08% tricaine) wywołało ciężką bradyarytmię zatokową, a także zmiany w odcinku ST i załamku T.

Rycina 1: Porównanie anatomii i EKG serca człowieka oraz danio pręgowanego. W przeciwieństwie do serca człowieka, które posiada dwa przedsionki i dwie komory, serce danio pręgowanego ma tylko jeden przedsionek i jedną komorę (górny rząd). Skróty: RA – prawy przedsionek; LA – lewy przedsionek; RV – prawa komora; LV – lewa komora. Serce danio pręgowanego wykazuje kilka cech EKG wspólnych z sercem człowieka (dolny rząd). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Protokół małoinwazyjnej rejestracji EKG in vivo. Schematyczny wykres przepływu ilustruje cztery kluczowe kroki w przeprowadzaniu badania EKG in vivo: indukcję znieczulenia, umieszczenie elektrod odprowadzających EKG, rejestrację EKG oraz analizę zapisów EKG. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3: System akwizycji i przetwarzania danych EKG. Trzy kluczowe komponenty zintegrowanego systemu rejestracji EKG in vivo obejmują sprzęt do akwizycji danych, wzmacniacz oraz oprogramowanie komputerowe do akwizycji i analizy danych. Wzmacniacz jest wyposażony w trzy gotowe do użycia mikroelektrody ze stali nierdzewnej o rozmiarze 29-gauge. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4: Rozmieszczenie odprowadzeń EKG. Trzy kolorowo oznaczone elektrody ze stali nierdzewnej o rozmiarze 29G są stabilnie wprowadzone do mięśni ryby na głębokość około 1 mm. Rozmieszczenie elektrody ujemnej (czarnej) oraz dodatniej (czerwonej) tworzy odprowadzenie bipolarne w płaszczyźnie czołowej, w orientacji od lewej strony w kierunku ogonowym do prawej strony w kierunku czaszkowym. Skrót: ref, elektroda referencyjna Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5: Kluczowe etapy analizy EKG. (A) Wstępne zdefiniowanie różnych ustawień parametrów dla automatycznej analizy oprogramowania. (B) Ręczna korekta (kolor czerwony) dwóch błędnych identyfikacji automatycznych wykonanych przez oprogramowanie (kolor czarny) w odniesieniu do załamków P i R w celu skorygowania błędnego obliczenia przez program częstotliwości pracy przedsionków i komór. (C) Połączenie dziewięciu następujących po sobie cykli serca (kolor zielony) w jeden sygnał uśredniony (kolor czarny) w celu szybkiej oceny regularności/nieregularności rytmu oraz obliczenia średnich czasów trwania załamków i odstępów. (D) Korekta odstępu QT w zależności od częstości akcji serca przy użyciu jednej z dostępnych metod, np. wzoru Bazetta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6: Wpływ rozmieszczenia odprowadzeń i głębokości anestezji na sygnały EKG. Dwa najistotniejsze kroki determinujące sukces rejestracji EKG in vivo to rozmieszczenie odprowadzeń (A-D) oraz głębokość anestezji (E-F). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Podczas rejestrowania EKG in vivo u dorosłych ryb danio pręgowanego za pomocą pojedynczego odprowadzenia, jak wykazaliśmy w tym badaniu, istnieje szereg zastrzeżeń dotyczących jakości i ważności wyników zapisu EKG. Po pierwsze, wybierając odpowiednie środki znieczulające i określając minimalne potrzebne stężenie, głębokość i czas trwania znieczulenia, należy zrównoważyć kardiotoksyczność znieczulenia z krytyczną potrzebą tłumienia artefaktów ruchowych i determinacji a priori dla przeżycia w porównaniu z terminalnym projektem eksperymentalnym. Typowymi strategiami są wykorzystanie synergistycznej siły działania kombinacji wielu środków znieczulających z różnych klas leków ^5,14 i paralityków ^1,6 w celu obniżenia dawki poszczególnych środków⁵ lub podawanie niskiej dawki podtrzymującej po wyższej dawce indukcyjnej. Jednak pomimo dobrze znanej potencjalnej toksyczności krążeniowo-oddechowej, w tym zgonu⁸, trikaina jest nadal najczęściej stosowanym, najlepszym dostępnym i jedynym środkiem znieczulającym zatwierdzonym przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do znieczulenia danio pręgowanego. Trikaina jest powszechnie stosowana w zapisie EKG dorosłych ryb danio pręgowanego, zarówno jako pojedynczy środek, jak i w połączeniu z innymi środkami znieczulającymi lub paralitykami.

Po drugie, dokładność umieszczania odprowadzeń można zapewnić przynajmniej dla zdrowych, normalnych danio pręgowanego, korzystając z naszych czterech kryteriów walidacyjnych dla normalnego EKG dorosłego danio pręgowanego. Spośród czterech kryteriów walidacyjnych, które tutaj proponujemy, dwa ostatnie kryteria razem potwierdzają fundamentalną zgodność między biegunowością załamka R a biegunowością załamka T w normalnym EKG ^5,7,15. Ta zgodność fal R i T jest przypadkowym, ale krytycznym podobieństwem między danio pręgowanym a człowiekiem ^16,17 normalne EKG, które przyczynia się do klinicznego znaczenia modelu serca danio pręgowanego jako substytutu elektrofizjologii serca człowieka. Jednak kilka łagodnych lub złośliwych stanów może unieważnić którekolwiek z czterech kryteriów walidacyjnych. Na przykład zgodność załamków R i T jest tracona w niedokrwieniu mięśnia sercowego ^7,15. Ta utrata zgodności załamków R i T w niedokrwieniu mięśnia sercowego jest kolejnym uderzającym podobieństwem między danio pręgowanym a ludzkim EKG, które przyczynia się do klinicznego znaczenia modelu zawału mięśnia sercowego danio pręgowanego.

Na koniec zalecamy standardową praktykę w analizie EKG. Wraz z pojawieniem się technologii oprogramowanie do analizy EKG może generować automatyczną interpretację EKG. Zdecydowanie zalecamy jednak, aby przeszkolony człowiek zawsze ponownie interpretował i weryfikował wszystkie zapisy EKG w oparciu o odpowiedni scenariusz kliniczny prowadzący do zapisu EKG. Rutynowe nadmierne poleganie wyłącznie na automatycznej interpretacji przez oprogramowanie do analizy EKG jest niewskazane, szczególnie w przypadku typowych prawidłowych wariantów EKG, patologii serca lub nieoptymalnego umieszczenia elektrod.

Badanie to koncentruje się na minimalnie inwazyjnej metodzie krótkich sesji zapisu EKG. Jeśli jednak zajdzie potrzeba przeprowadzenia wielogodzinnych sesji zapisu EKG w terminalu, konieczne są modyfikacje w celu zapewnienia odpowiedniego natlenienia, nawodnienia i znieczulenia poprzez ciągłą perfuzję⁶.

Dodatkowo zwiększ stosunek sygnału do szumu na co najmniej jeden z trzech sposobów. Wybór mocniejszego wzmacniacza jest często kosztowną, jeśli nie niepraktyczną opcją. Otwarcie worka osierdziowego w celu zmniejszenia objętości przewodnika jest rozsądnym, choć inwazyjnym podejściem, które zostało przyjęte⁷. Strategiczne umieszczenie elektrody w celu wyrównania osi odprowadzenia w kierunku równoległym do głównej osi serca (ryc. 4B) zmaksymalizuje sygnały napięciowe EKG, ale może wymagać prób i błędów, szczególnie w przypadku braku perikardiotomii.

Przedstawiona przez nas metoda badania EKG in vivo u dorosłych ryb danio pręgowanego ma cztery główne zalety. Po pierwsze, nasze minimalnie inwazyjne podejście wymaga jedynie wprowadzenia elektrody, ale nie usunięcia rybiej łuski ani torakotomii i perikardiotomii. W związku z tym, minimalizując ból u ryb, nasze podejście umożliwia wielokrotne badania EKG w badaniach podłużnych dotyczących przeżycia. Po drugie, gdy środki znieczulające odpowiednio tłumią ruchy ryb, system zapisu EKG in vivo w naszym badaniu konsekwentnie zapewnia zadowalający stosunek sygnału do szumu przy wolnych od zakłóceń surowych sygnałach. Po trzecie, czterokryterialna walidacja jakości, którą tutaj proponujemy, zapewnia dokładność i solidność danych na wczesnym etapie pozyskiwania danych EKG oraz minimalizuje odchylenia zależne od operatora. Wreszcie, w szczególności, nasze ostatnie kryterium walidacyjne (normalny załamek T jest wyprostowany) zawiera w sobie zgodność załamka R i załamka T, ważną podobną do ludzkiej cechy normalnego EKG danio pręgowanego (ryc. 1).

Jednak nadal istnieją cztery główne ograniczenia obecnej metodologii EKG in vivo dla dorosłych danio pręgowanego przez naszą grupę i innych.

Po pierwsze, brak współpracy ze strony uczestników powoduje konieczność zastosowania znieczulenia, co ma ograniczające konsekwencje dla układu krążeniowo-oddechowego. W przypadku badania EKG in vivo, podczas gdy pacjenci nigdy nie potrzebują sedacji, danio pręgowany zawsze wymaga środków znieczulających lub paraliżujących, z których wszystkie powodują zmienną toksyczność krążeniowo-oddechową.

Po drugie, konieczność zabezpieczenia dołączonych przewodów EKG nieznacznie zwiększa inwazyjność nieinwazyjnej procedury, która w przeciwnym razie byłaby nieinwazyjna. Podczas gdy umieszczanie elektrod w zapisie EKG na powierzchni ciała ludzi jest całkowicie nieinwazyjne, ponieważ elektrody przylegają do ludzkiego naskórka, umieszczanie elektrod do zapisu EKG in vivo danio pręgowanego jest bardziej inwazyjne, ponieważ elektrody stalowe muszą co najmniej przebijać skórę ryby, aby zapewnić bezpieczne wprowadzenie do mięśni ryby.

Dwa ostatnie ograniczenia wynikają z anatomicznych ograniczeń klatki piersiowej i serca danio pręgowanego. Po trzecie, niewielki rozmiar serca dorosłego danio pręgowanego wymaga drastycznego zmniejszenia liczby odprowadzeń EKG. Podczas gdy ludzie z łatwością przyjmują dwanaście odprowadzeń w standardowym zapisie EKG, dorosłe danio pręgowane mogą zazwyczaj pomieścić tylko jeden przewód jednobiegunowy lub dwubiegunowy. Konsekwencja pojedynczego odprowadzenia EKG jest wyzwaniem polegającym na jednoczesnej optymalizacji amplitud wszystkich trzech załamków P, R i T. W związku z tym nie można przecenić znaczenia optymalnego i dokładnego umieszczenia elektrod w badaniu EKG danio pręgowanego. U danio pręgowanego fala T stanowi wyjątkowe wyzwanie detekcyjne, ponieważ często jest najmniejsza z tych trzech fal. W związku z tym amplituda fali T danio pręgowanego powinna otrzymać priorytet optymalizacji w stosunku do zazwyczaj większych fal P i R.

Po czwarte, wyznaczenie głównej osi serca danio pręgowanego w celu maksymalizacji amplitudy fali R może być trudne. Powodem jest to, że serce danio pręgowanego ma większą swobodę ruchu w luźnym worku osierdziowym w porównaniu z ludzkim sercem w dopasowanej osierdziu przypominającej rękawiczkę.

Ogólnie rzecz biorąc, ograniczenia te będą stymulować innowacje w zakresie metod w przyszłości. Wraz z pojawieniem się druku 3D i odkształcalnej elektroniki¹⁸ pojawiła się nadzieja na bezpośrednie wszczepienie odprowadzenia pewnego dnia u rozbudzonych, czujnych, pływających danio pręgowanych za pomocą "skarpety serca" z bezprzewodowych czujników elektrodowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynia hodowlane	Fisher Scientific	FB087571	100 mm x 20 mm
Kleszcze Dumont	Drobne narzędzia naukowe	11253-20	0,1 x 0,06 mm
FE136 Animal Bio Amp	AD Instruments	FE231
Kleszcze do tęczówki	Fine Sciense Tools	11064-07	0,6 x 0,5 mm
LabChart 8 Pro	AD Instruments Oprogramowanie		z modułem EKG
Elektrody igłowe do Animal Bio Amp	AD Instruments	MLA1213	29 gauge
Plastikowe jednorazowe pipety transferowe	Fisher Scientific	13-669-12	6 cali, 1,2 ml
PowerLab 4/35	AD Instruments	4//35
Nożyczki	Drobne narzędzia naukowe	15000-08	2,5 mm, 0,075 mm
Trikaina (metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu)	Sigma	E10521-10G	MS-222