Artykuł metodologiczny

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60017

⸱

17 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, 2Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, 3Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Streszczenie

Enzymy ATPazy wykorzystują wolną energię zgromadzoną w trifosforanie adenozyny do katalizowania szerokiej gamy endergonicznych procesów biochemicznych in vivo, które nie zaszłyby spontanicznie. Białka te mają kluczowe znaczenie dla zasadniczo wszystkich aspektów życia komórkowego, w tym metabolizmu, podziału komórek, reakcji na zmiany środowiskowe i ruchu. Przedstawiony tutaj protokół opisuje test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH), który został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów ATPazy. Test został zastosowany do miozyny II serca i mięśni szkieletowych, dwóch molekularnych ATPaz motorycznych na bazie aktyny, jako dowód zasady. Hydroliza ATP jest sprzężona z utlenianiem NADH w reakcjach enzymatycznych w teście. Po pierwsze, ADP generowany przez ATPazę jest regenerowany do ATP przez kinazę pirogronianową (PK). PK katalizuje równolegle przemianę fosfoenolopirogronianu (PEP) w pirogronian. Następnie pirogronian jest redukowany do mleczanu przez dehydrogenazę mleczanową (LDH), która katalizuje równolegle utlenianie NADH. Zatem spadek stężenia ATP jest bezpośrednio skorelowany ze spadkiem stężenia NADH, po którym następuje zmiana wewnętrznej fluorescencji NADH. Dopóki PEP jest dostępny w układzie reakcyjnym, stężenie ADP pozostaje bardzo niskie, co pozwala uniknąć hamowania enzymu ATPazy przez jego własny produkt. Co więcej, stężenie ATP pozostaje prawie stałe, co daje liniowe przebiegi czasowe. Fluorescencja jest monitorowana w sposób ciągły, co pozwala na łatwe oszacowanie jakości danych i pomaga odfiltrować potencjalne artefakty (np. wynikające z wytrącania się związków lub zmian termicznych).

Wprowadzenie

Miozyny to mechanochemiczne przetworniki energii, które hydrolizują trifosforan adenozyny (ATP) w celu wygenerowania kierunkowego ruchu wzdłuż włókien cytoszkieletu aktyny u eukariontów1,2. Są one zarówno strukturalnie, jak i kinetycznie przystosowane do różnych funkcji wewnątrzkomórkowych, takich jak transport organelli, skurcz mięśni czy generowanie napięcia cytoszkieletu1,2. Nadrodzina miozyny jest reprezentowana przez ~40 genów miozyny należących do ~12 różnych klas miozyny w ludzkim genomie3,4. Członkowie klas miozyny odgrywają różne role w bardzo zróżnicowanym zestawie zaburzeń, takich jak kilka nowotworów, zaburzenia neurologiczne, miopatie szkieletowe i kardiomiopatia przerostowa5,6. Biorąc pod uwagę dużą liczbę fizjologicznych i patologicznych funkcji tych silników molekularnych, nie jest zaskakujące, że stają się one coraz częściej rozpoznawane jako cele leków w różnych stanach7. Ostatnio poczyniono znaczne postępy w odkrywaniu nowych inhibitorów miozyny8,9,10 i activators11, oraz w ulepszaniu właściwości istniejących12,13,14,15.

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) od dawna jest używany do pomiaru aktywności ATPazy różnych enzymów, takich jak pompa ATPase2+ class="xref">16, ATPaza naprawy DNA Rad5417, AAA+ ATPase p9718 lub kinezyna silnika mikrotubuli 19. Test wykorzystuje cykl regeneracji ATP. Difosforan adenozyny (ADP) wytwarzany przez ATPazę jest regenerowany do ATP przez kinazę pirogronianową (PK), która równolegle przekształca jedną cząsteczkę fosfoenolopirogronianu (PEP) w pirogronian. Następnie pirogronian jest redukowany do mleczanu przez dehydrogenazę mleczanową (LDH). To z kolei utlenia jedną cząsteczkę NADH do NAD. Dlatego spadek stężenia NADH w funkcji czasu jest równy szybkości hydrolizy ATP. Cykl regeneracji ATP utrzymuje stężenie ATP prawie stałe, a stężenie ADP niskie tak długo, jak długo PEP jest dostępny. Skutkuje to liniowymi przebiegami czasowymi, co ułatwia określenie początkowych szybkości reakcji i pomaga uniknąć zahamowania produktu przez ADP19. Chociaż test ATPazy sprzężony z NADH został już dostosowany do formatu 96-dołkowego20, wysokie objętości reakcji (~150 μL) sprawiają, że jest on stosunkowo drogi ze względu na duże zapotrzebowanie na odczynniki, co czyni go mniej podatnym na szybkie badania przesiewowe dużej liczby związków. Alternatywne metody, takie jak test zieleni malachitowej19,21, które opierają się na wykrywaniu fosforanu wytwarzanego przez enzym ATPazę, okazały się bardziej odpowiednie do miniaturyzacji i wysokoprzepustowych badań przesiewowych22,23,24. Jednak bardziej prawdopodobne jest, że na test końcowy wpłynie kilka artefaktów (omówionych poniżej), które mogą pozostać nieodkryte w przypadku braku kursów w pełnym wymiarze godzin.

Tutaj test ATPazy sprzężony z NADH został zoptymalizowany pod kątem półwysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów małych cząsteczek. Miozyna II mięśnia szkieletowego i mięśnia sercowego oraz inhibitory miozyny blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 i para-nitroblebbistatin12 są używane do zademonstrowania mocy testu, który opiera się na fluorescencji NADH jako odczycie. Protokół ten jest podatny na projekty przesiewowe skoncentrowane na dowolnych enzymach wytwarzających ADP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów zapasowych i odczynników

  1. Przygotować roztwór zapasowy ditiotreitolu (DTT), rozpuszczając krystaliczny DTT w wodzie destylowanej do stężenia końcowego 10 mM. Dostosować pH do 7,0 za pomocą roztworu 1 M NaOH. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować roztwór zapasowy ATP, rozpuszczając krystaliczny ATP w wodzie destylowanej do stężenia końcowego 10 mM. Dostosować pH do 7,0 za pomocą roztworu 1 M NaOH. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotować 10-krotny bufor NADH zawierający 70 mM kwasu 3-(N-morfolinopropanosulfonowego) (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mM kwasu etylenoglikol-bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA) oraz 3 mM NaN3. Dostosować pH do 7,0 za pomocą roztworu 1 M NaOH. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować 1-krotny bufor do miozyny zawierający 10 mM MOPS i 0,1 mM EGTA. Dostosować pH do 7,0 za pomocą roztworu 1 M NaOH. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem dodać albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i DTT do stężeń końcowych odpowiednio 0,1% (m/v%) i 1 mM.
  5. Przygotować 1-krotny bufor do aktyny zawierający 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2 oraz 3 mM NaN3. Dostosować pH do 7,0 za pomocą roztworu 1 M NaOH. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem dodać BSA i DTT do stężeń końcowych odpowiednio 0,1% (m/v%) i 1 mM.
  6. Przygotować roztwór zapasowy NADH, rozpuszczając krystaliczny NADH w 10-krotnym buforze NADH do stężenia końcowego 5,5 mM. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  7. Przygotować roztwór zapasowy PEP, rozpuszczając krystaliczny PEP w 10-krotnym buforze NADH do stężenia końcowego 50 mM. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  8. Przygotować roztwór zapasowy LDH, rozpuszczając liofilizowany proszek LDH w mieszaninie glicerolu i 10-krotnego buforu NADH (50%:50%) do stężenia końcowego 200 U/mL. Odwirować roztwór w celu usunięcia nierozpuszczonego białka (7,197 x g, 20 °C, 10 min). Ostrożnie przenieść nad precipitates do czystej probówki wirówkowej. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  9. Przygotować roztwór zapasowy PK, rozpuszczając liofilizowany proszek PK w mieszaninie glicerolu i 10-krotnego buforu NADH (50%:50%) do stężenia końcowego 10 U/mL. Odwirować roztwór w celu usunięcia nierozpuszczonego białka (7,197 x g, 20 °C, 10 min). Ostrożnie przenieść nad osad do czystej probówki wirówkowej. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  10. Rekonstytuować liofilizowane próbki miozyny II z mięśnia sercowego i szkieletowego, dodając 10 µL wody destylowanej w celu otrzymania roztworów zapasowych o stężeniu 10 mg/mL, co odpowiada odpowiednio stężeniom miozyny ok. 37,9 µM i ok. 40,8 µM (monomerycznej). Dalsze szczegóły znajdują się w instrukcjach producenta.
  11. Przygotować F-aktynę z proszku acetonowego mięśni królika zgodnie z opisem Pardee i Spudicha25.

2. Pomiar aktywności ATPase i efektów hamujących małych cząsteczek inhibitorów

  1. Przygotuj płytkę z substancjami badawczymi.
    1. Rozpuść interesujące substancje w wysokiej jakości dimetylosulfotlenku (DMSO).
    2. Wykonaj piętnastostopniowe rozcieńczenia seryjne 1:2, zaczynając od stężenia substancji 10 mM w DMSO.
    3. Przenieś próbki do polipropylenowej płytki 384-dołkowej w trzech powtórzeniach (po 12,5 µL każda) za pomocą pipety wielokanałowej. W celu zminimalizowania liczby dołków potencjalnie narażonych na efekty brzeżne, wykorzystaj dwa rzędy na płytce z substancjami dla jednej substancji (zamiast trzech kolumn). Trzy ostatnie dołki w drugim rzędzie dla każdej substancji wykorzystaj jako kontrolę negatywną (sam DMSO). Nie używaj pierwszego ani ostatniego rzędu płytki do rozcieńczania substancji.
    4. Przenieś czysty DMSO do dołków pierwszego rzędu (zarezerwowanego do kalibracji NADH).
    5. Ostatni rząd wykorzystaj jako kontrolę pozytywną.
      UWAGA: W tym celu zastosowano para-aminoblebbistatynę o stężeniu 4 mM w DMSO.
  2. Przygotuj 450 µL rozcieńczonego roztworu aktyny o stężeniu 20 µM dla każdej płytki analitycznej (czarna polistyrenowa mikropłytka 384-dołkowa), rozcieńczając roztwór stokowy aktyny w buforze do aktyny. Dokładnie wymieszaj roztwór, pipetując go 30 razy w górę i w dół za pomocą pipety 5 mL, aby zmniejszyć lepkość i niejednorodność poprzez rozrywanie filamentów aktyny. Odwiruj roztwór, aby usunąć obecne wytrącone białka (7,197 x g, 20 °C, 10 min). Ostrożnie przenieś supernatant do czystej probówki do wirowania.
  3. Przygotuj master mix zawierający enzymy LDH i PK („mieszanina enzymatyczna”). Dla każdej płytki analitycznej połącz w 15 mL stożkowej probówce do wirowania 171,4 µL roztworu LDH, 171,4 µL roztworu PK oraz odpowiednio 3189,3 µL lub 3252,9 µL buforu do miozyny dla analiz obejmujących miozynę II mięśnia sercowego lub szkieletowego. Na tym etapie nie dodawaj miozyny, aby uniknąć agregacji i wytrącania.
  4. Przygotuj master mix zawierający wszystkie substraty („mieszanina substratów”). Dla każdej płytki połącz w 15 mL stożkowej probówce do wirowania 162,1 µL ATP, 162,1 µL PEP i 324,1 µL roztworu NADH. Na tym etapie nie dodawaj aktyny, aby uniknąć agregacji i wytrącania.
  5. Wykonaj siedmiostopniowe rozcieńczenia seryjne 1:2 NADH do kalibracji, zaczynając od 250 µM.
    1. Wymieszaj 12,3 µL roztworu stokowego NADH z 257,7 µL buforu do miozyny w probówce do mikrodośrodkowka 1,5 mL.
    2. Odważ 135 µL buforu do miozyny do siedmiu probówek do mikrodośrodkowka 1,5 mL.
    3. Przenieś 135 µL roztworu z pierwszej probówki do drugiej i wymieszaj poprzez pipetowanie. Powtarzaj, aż do osiągnięcia 7mej probówki.
    4. Ostatnią probówkę wykorzystaj jako kontrolę bez NADH (sam bufor).
  6. Za pomocą pipety 8-kanałowej przenieś 20 µL roztworów kalibracyjnych NADH do pierwszego rzędu płytki analitycznej w trzech powtórzeniach.
  7. Dodaj 68 µL miozyny II z mięśnia sercowego lub 4,2 µL miozyny II z mięśnia szkieletowego do mieszaniny enzymatycznej. Krótko wymieszaj na wortexie.
  8. Z wyjątkiem pierwszego rzędu, dozuj 8,4 µL przygotowanej mieszaniny miozyny i enzymów do każdego dołka płytki analitycznej za pomocą automatycznego dozownika.
  9. Przenieś 10 nL roztworów z płytki z substancjami na płytkę analityczną zawierającą mieszaninę enzymatyczną, używając automatycznego systemu obsługi cieczy wyposażonego w głowicę z pinem 10 nL.
  10. Wstrząsaj płytkę analityczną przez 1 min w temperaturze pokojowej przy 1200 rpm, używając wstrząsarki do mikropłytek.
  11. Dodaj 4,052 µL odwirConego roztworu aktyny do mieszaniny substratów. Krótko wymieszaj na wortexie.
  12. Dozuj 1,6 µL mieszaniny aktyny i substratów do każdego dołka płytki analitycznej (z wyjątkiem pierwszego rzędu), aby rozpocząć reakcję enzymatyczną, używając automatycznego dozownika.
  13. Wstrząsaj płytkę analityczną przez 1 min w temperaturze pokojowej przy 120 rpm, używając wstrząsarki do mikropłytek.
  14. Odwiruj płytkę analityczną przy 101 x g przez 30 s.
  15. Upewnij się, że temperatura wewnętrzna czytnika płytek ustabilizowała się na poziomie 25 ˚C. Włóż płytkę i wstrząsaj przez kolejne 30 s. Ten etap wstrząsania jest niezbędny, aby powierzchnia cieczy w każdym dołku była podobna i pozwala płytce osiągnąć temperaturę pomiarową.
  16. Rejestruj fluorescencję NADH przez 30 min, skanując płytkę w odstępach 45 s. Użyj filtra wzbudzenia 380 nm o szerokości pasma 10 nm oraz filtra emisji 470 nm o szerokości pasma 24 nm wraz z lustrem dichroicznym z odcięciem przy 425 nm. Przeprowadź pomiar w trybie wysokich stężeń. Przed wykonaniem analiz zoptymalizuj liczbę błysków, wzmocnienie detektora, wymiary płytki i wysokość pomiaru.
    UWAGA: Końcowe warunki analizy to 30 nM miozyny II z mięśnia sercowego/20 nM miozyny II z mięśnia szkieletowego, 10 µM aktyny, 40 U/mL LDH, 20 U/mL PK, 20 µM NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP w buforze zawierającym 10 mM MOPS (pH = 7,0), 2 mM MgCl2, 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO i 1 mM DTT. Objętość całkowita wynosi 20 µL/dołek. Najwyższe końcowe stężenie substancji wynosi 50 µM. Jako kontrolę pozytywną służy 20 µM para-aminoblebbistatyny w 0,5% DMSO, a jako kontrolę negatywną sam 0,5% DMSO. Wszystkie pomiary wykonuje się w trzech powtórzeniach.

3. Analiza danych

  1. Należy wykreślić zależność obserwowanej intensywności fluorescencji od czasu dla każdej dołki.
  2. Wykonaj prostą regresję liniową, aby wyznaczyć nachylenie i punkt przecięcia dla odpowiedzi fluorescencyjnych w każdej studzience. Nachylenie jest proporcjonalne do szybkości zużycia ATP (NADH), natomiast punkt przecięcia jest proporcjonalny do stężenia NADH na początku pomiaru (t = 0 s).
  3. Stwórz krzywą kalibracyjną dla NADH, nanosząc na wykres wartości odczytów uzyskane dla pierwszego rzędu płytki w funkcji stężenia NADH. Upewnij się, że odczyty są liniowo zależne od stężenia NADH.
    UWAGA: Punkty przecięcia osi szacują rzeczywiste intensywności fluorescencji w czasie t = 0 s z znacznie większą pewnością niż średnia z surowych odczytów intensywności fluorescencji w czasie t ≈ 0 s.
  4. Przeprowadź prostą regresję liniową, aby wyznaczyć nachylenie i punkt przecięcia z osią rzędnych linii kalibracyjnej NADH.
    UWAGA: Punkt przecięcia opisuje sygnał tła fluorescencji (przy braku NADH), natomiast nachylenie odpowiada ekstrapolowanej/teoretycznej intensywności fluorescencji roztworu NADH o stężeniu 1 M w danym eksperymencie.
  5. Aby przeliczyć zmiany fluorescencji na szybkości zużycia ATP, należy podzielić nachylenie odpowiedzi fluorescencyjnej uzyskane dla pozostałych studzienek przez nachylenie linii kalibracyjnej NADH.
  6. Nanieś na wykres szybkości zużycia ATP w funkcji stężenia inhibitora.
  7. Aby wyznaczyć stałe hamowania, należy wykorzystać odpowiednie oprogramowanie statystyczne w celu dopasowania danych z testu dawka-odpowiedź do następującego równania kwadratowego, odpowiadającego prostemu modelowi równowagi wiązania w stosunku jeden do jednego:
    Równanie powinowactwa wiązania dla oddziaływania ligand-białko; wyrażenie matematyczne; analiza naukowa.
    gdzie Y jest szybkość zużycia ATP, Ymin jest to szybkość zużycia ATP w obecności inhibitora, Ymaks. jest teoretyczna szybkość zużycia ATP przy 10% inhibicji, KI jest stałą inhibicji, [E]t i [I]t odpowiadają odpowiednio całkowitemu stężeniu enzymu (miozyny) oraz inhibitora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Typowy schemat rozmieszczenia na płytce stosowany w eksperymentach przesiewowych przedstawiono na Rysunku 1. Pierwszy i ostatni rząd są zarezerwowane odpowiednio dla kalibracji NADH oraz kontroli pozytywnej (20 µM para-aminoblebbistatyny, 0,5% DMSO). Pozostałe rzędy (B do O) służą do badania aktywności hamującej związków. Przygotowuje się piętnastostopniowe rozcieńczenia seryjne 1:2, zaczynając od stężenia związku 10 mM w DMSO, a następnie przenosi s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytyczne kroki w protokole

Zoptymalizuj układ płytek, uruchamiając kilka płytek tylko z kontrolą ujemną (reakcja ATPazy bez inhibitora). Dokładnie sprawdź wyniki pod kątem wzorców szybkości reakcji. Mogą one na przykład wynikać z efektów krawędziowych i/lub niedoskonałości hydrofilowej powłoki powierzchniowej "niewiążących" płyt. Jeśli zaobserwowany zostanie wzór, zmień typ płyty i/lub układ blachy, aby zminimalizować artefakty. Na przykład typowa krzywa dawka-odpowiedź (16 s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem z National Institute of Neurological Disorders and Stroke oraz National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
384-dołkowy polistyren z płaskim dnem z niskim kołnierzem Mikropłytka NBSCorning3575
ATP (hydrat soli disodowej adenozyno-5&-trifosforanu)SigmaA7699
Dozownik Aurora FRD-IBAurora Discovery, Inc.
Biomek NXP Wielokanałowa stacja robocza do automatyzacji laboratoriumBeckman CoulterA31841
BlebbistatynaAMRIN/ANiestandardowa
synteza BSA (albumina surowicy bydlęcej, wolna od proteazy)Akron BiotechAK1391 
Wirówka 5430 R, chłodzona, z rotorem FA-35-6-30Eppendorf022620663
Wirówka 5430, bez chłodzenia, z rotorem A-2-MTPEppendorf022620568
DMSO (dimetylosulfotlenek)  SigmaD2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  SigmaD5545
E1 Pipeta wielokanałowa ClipTip; format 384; 8-kanałowawielokanałowa Thermo Scientific
E1 ClipTip; 96-formatowa; 8-kanałowaThermo Scientific4672080
EGTA (Glikol-etylen-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy)  SigmaE3889
EnVision 2104 Multilabel Czytnik płytekPerkinElmer2104-0010
Glicerol  SigmaG2025
LDH (dehydrogenaza L-mlekowa z mięśni królika)SigmaL1254
MgCl2.6H2O (sześciowodny chlorek magnezu)  M2670
VWR  12620-926 
Mikropłytka, 384 dołk, PP, Mała objętość, Studnia głębinowa, NaturalGreiner Bio-One784201
MOPS (kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy)  SigmaM1254
Białko motoryczne miozyny (pełna długość) (mięsień sercowy bydła)Cytoszkielet MY03
Białko motoryczne miozyny (pełna długość) (mięśnie szkieletowe królika)Cytoszkielet MY02
NADH (β-dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowany hydrat soli disodowej)SigmaN8129
NaN3 (Azydek sodu)  Sigma71289
NaOH (wodorotlenek sodu)  Filtr optyczny SigmaS8045
CFP 470/24nm (emisja)PerkinElmer2100-5850Kod kreskowy 240
Filtr optyczny Fura2 380/10nm (wzbudzenie)PerkinElmer2100-5390Kod kreskowy 112
Moduł optyczny: Beta LaktamazaPerkinElmer2100-4270Kod kreskowy 418
Oprogramowanie OriginPro 2017OriginLabN/A
para-AminoblebbistatinAMRIN/ANiestandardowa synteza
para< / em>-NitroblebistatynaAMRIN/ANiestandardowa synteza
PEP (sól monopotasowa kwasu fosfo(enolu)pirogronowego)SigmaP7127
PK (kinaza pirogronianowa z mięśni królika)SigmaP9136
Aceton w proszku z mięśni królikaPel Freez Biologicals41995-2
00017425 pipeta 4672010 Wytrząsarka do mikropłytek Sigma

Bibliografia

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141(2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305(2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment? Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. Jr New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

sprz ganie NADHscreening miozyny IIrozcie czanie seryjnedetekcja fluorescencyjnaczytnik p ytekpipetowaniekrzywa kalibracyjnaodpowied na dawk

Powiązane artykuły