Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60039

⸱

23 sierpnia 2019

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Streszczenie

Organizacja i struktura domen chromatyny są unikalne dla poszczególnych linii komórkowych. Ich nieprawidłowa regulacja może prowadzić do utraty tożsamości komórkowej i/lub choroby. Pomimo ogromnych wysiłków, nasza wiedza na temat powstawania i propagacji domen chromatyny jest nadal ograniczona. Domeny chromatyny badano w warunkach ustalonych, które nie sprzyjają śledzeniu początkowych zdarzeń podczas ich powstawania. W tym miejscu przedstawiamy metodę indukowalnej rekonstrukcji domen chromatyny i śledzenia ich powstawania w funkcji czasu. Chociaż, po raz pierwszy zastosowany w przypadku represyjnego tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2, można go łatwo dostosować do innych domen chromatyny. Modyfikacja i/lub połączenie tej metody z technologiami genomiki i obrazowania dostarczy nieocenionych narzędzi do bardzo szczegółowego badania tworzenia domen chromatyny. Wierzymy, że ta metoda zrewolucjonizuje nasze zrozumienie tego, jak powstają i oddziałują na siebie domeny chromatyny.

Wprowadzenie

Genomy eukariotyczne są wysoce zorganizowane, a zmiany w dostępności chromatyny bezpośrednio kontrolują transkrypcję genów1. Genom zawiera różne typy domen chromatyny, które korelują z aktywnością transkrypcyjną i czasem replikacji2,3. Te domeny chromatyny mają wielkość od kilku kilozasad (kb) do ponad 100 kb i charakteryzują się wzbogaceniem w wyraźne modyfikacje histonów4. Główne pytania brzmią: jak powstają te domeny i jak się rozprzestrzeniają?

Jedna z najlepiej scharakteryzowanych domen chromatyny jest wspierana przez aktywność kompleksu represyjnego Polycomb 2 (PRC2). PRC2 jest kompleksem wielopodjednostkowym złożonym z podzbioru grupy Polycomb (PcG) białek5,6 i katalizuje mono-, di- i trimetylację lizyny 27 histonu H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8,9,10. H3K27me2/me3 są związane ze stanem represyjnym chromatyny, ale funkcja H3K27me1 jest niejasna6,11. Jeden z podstawowych składników PRC2, rozwój ektodermy embrionalnej (EED), wiąże się z produktem końcowym katalizy PRC2, H3K27me3, poprzez jego klatkę aromatyczną, a ta cecha powoduje allosteryczną stymulację PRC212,13. Aktywność enzymatyczna PRC2 ma kluczowe znaczenie dla zachowania tożsamości komórkowej podczas rozwoju, ponieważ niewłaściwa ekspresja niektórych genów rozwojowych, które są przeciwwskazane dla określonej linii, byłaby szkodliwa5,6. W związku z tym rozwikłanie mechanizmów, za pomocą których PRC2 sprzyja tworzeniu represyjnych domen chromatyny u ssaków, ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia tożsamości komórkowej.

Wszystkie poprzednie eksperymentalne systemy zaprojektowane do badania tworzenia domen chromatyny, w tym domen chromatyny za pośrednictwem PRC2, były wykonywane w warunkach stanu ustalonego, które nie są w stanie śledzić wydarzeń związanych z tworzeniem się domeny chromatyny w komórkach. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół generowania indukowalnego systemu komórkowego, który monitoruje początkową rekrutację i propagację domen chromatyny. W szczególności skupiamy się na śledzeniu tworzenia represyjnych domen chromatyny za pośrednictwem PRC2, które zawierają H3K27me2 / 3. Ten system, który może uchwycić mechanistyczne szczegóły tworzenia domen chromatyny, może być przystosowany do włączenia innych domen chromatyny, takich jak szeroko badane domeny zawierające H2AK119ub lub H3K9me. W połączeniu z technologiami genomiki i obrazowania, podejście to ma potencjał, aby skutecznie odpowiedzieć na różne, kluczowe pytania w biologii chromatyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Generacja indukowalnych mESC ratunkowych EED

1. Hodowla komórkowa

  1. Stosować mysie embrionalne komórki macierzyste (mESC) C57BL/6 posiadające stabilnie zintegrowany transgen CreERT2, który może przemieszczać się do jądra po podaniu 4-hydroksytamoksyfenu (4-OHT)13.
  2. Uprawiaj mESC w konwencjonalnym pożywce ESC14,15, uzupełnione 1000 U/ml LIF, 1 μM inhibitorem ERK PD0325901 i 3 μM inhibitorem GSK3 CHIR99021. W przypadku konwencjonalnej pożywki ESC należy użyć DMEM z nokautem zawierającym 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy, 1X penicyliny/streptomycyny i 0,1 mM 2-merkaptoetanolu.
  3. Do hodowli mESC należy używać płytek pokrytych 0,1% roztworem żelatyny.

2. Generacja klonalnych mESC z nokautem EED (KO)

  1. Przewodnik projektowania RNA (gRNA) w celu usunięcia eksonu 10 i eksonu 11 endogennej kopii EED w mESC za pomocą narzędzia do projektowania CRISPR w Benchling16. EED-KO-gRNA-1 celuje w intron bezpośrednio przed eksonem 10, a EED-KO-gRNA-2 celuje w intron bezpośrednio za eksonem 11. Jednoczesne zastosowanie tych gRNA usuwa zarówno ekson 10, jak i ekson 11 przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ).
  2. Sklonuj gRNA do pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) za pomocą instrukcji w Ran et al., 201317.
  3. W formacie płytki 6-dołkowej należy transfekować 2 x 105 mESC po 1 μg każdego EED-KO-gRNA-1 i EED-KO-gRNA-2 (patrz tabela materiałów) przy użyciu odczynnika do transfekcji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zmień pożywkę 24 godziny po transfekcji.
  4. Dwa dni po transfekcji wyizoluj komórki GFP dodatnie za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Spodziewaj się, że wydajność transfekcji będzie się wahać o około 10-30%. Posortuj około 5 x 105 komórek, aby wychwycić wystarczającą ilość komórek GFP dodatnich do posiewu.
  5. Izolowane mESC z dodatnim wynikiem GFP należy umieścić na 15-centymetrowych płytkach wstępnie pokrytych 0,1% żelatyną (10-20 x10,3 komórki na płytkę) w celu pobrania kolonii.
  6. Hoduj komórki w pożywce ESC przez około tydzień, aż widoczne będą pojedyncze kolonie. Zmieniaj nośnik co 2 dni.
  7. Pobrać co najmniej 48 kolonii za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 20 μl. Zeskrobać kolonię, jednocześnie zasysając do końcówki mikropipety. Nie rozbijaj kolonii na pojedyncze komórki. Przenieść kolonię do 96-dołkowej płytki zawierającej akutazę (20 μl).
  8. Inkubować kolonie przez 10 minut w temperaturze 37 °C, aż wszystkie komórki zostaną rozdzielone.
  9. Dodaj 200 μl pożywki ESC do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.
  10. Dobrze wymieszaj i umieść komórki na dwóch oddzielnych 96-dołkowych płytkach za pomocą pipety wielokanałowej.
  11. Użyj jednej z 96-dołkowych płytek do genotypowania i utrzymuj drugą w uprawie, aż genotypowanie zostanie zakończone. Użyj roztworu do ekstrakcji DNA, aby wyekstrahować DNA z płytki 96-dołkowej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  12. Użyj starterów genotypowania Gnt_EED-KO-up i Gnt_EED-KO_down, które obejmują usunięte miejsce i wykonaj genotypowanie PCR z polimerazą DNA Taq zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Inne rodzaje polimeraz DNA mogą być również używane do genotypowania, jednak polimeraza DNA Taq oferuje wygodę, ponieważ reakcja PCR może być bezpośrednio załadowana na żel, gdy używany jest jego kolorowy bufor reakcyjny.
    1. Obserwować produkt DNA o mniejszej masie cząsteczkowej w komórkach z homozygotyczną delecją w stosunku do przypadku typu dzikiego (WT).
      UWAGA: Aby wygenerować komórki zerowe PRC2, homozygotyczna delecja eksonów 10 i 11 jest niezbędna do destabilizacji i degradacji EED, niezbędnej podjednostki rdzenia PRC213. Skuteczność kierowania CRISPR wynosi około 10
      2. %.
  13. Zwaliduj delecję eksonu 10 i 11 EED oraz utratę białka EED odpowiednio przez sekwencjonowanie Sangera i Western blot.
  14. Potwierdź zubożenie EED i H3K27me2/me3 z chromatyny w komórkach EED KO za pomocą ChIP-seq przy użyciu przeciwciał przeciwko H3K27me2/me3 i EED. Użyj protokołu podanego w Oksuz et al., 201715 dla eksperymentów ChIP-seq.

3. Inżynieria mESC z nokautem EED w taki sposób, aby zawierały indukowaną ekspresję EED opartą na Cre-ERT2

  1. Zaprojektuj gRNA (indukowane przez EED-gRNA) w celu wprowadzenia cięcia w intronie po eksonie 9 EED za pomocą narzędzia do projektowania CRISPR w Benchling16 (patrz Tabela materiałów).
  2. Sklonuj gRNA do pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) za pomocą instrukcji w Ran et al., 201317.
  3. Zaprojektuj matrycę DNA dawcy, która składa się z sekwencji cDNA EED po eksonie 9 i znacznika C-końcowej flagi-HA przed sekwencją T2A-GFP, a wszystko to w odwrotnej orientacji w odniesieniu do endogennej sekwencji genu.
    1. Umieść kasetę z akceptorem splicingu i sekwencją poliadenylacji zagnieżdżoną między heterologicznymi odwróconymi miejscami loxP (lox66 i lox71)18.
    2. Uwzględnij co najmniej 500 pz ramion homologicznych z każdego końca. Podziel matrycę dawcy na 2 segmenty fragmentów genu gBlocks (patrz gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" i gBlock-2-cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") i złóż je w wektor PCR Blunt za pomocą klonowania Gibsona zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: gblock-2 zawiera resztę aromatyczną (Y365) w klatce EED, która jest ważna dla interakcji z H3K27me312. gBlock-2-Wt zawiera resztę typu dzikiego, podczas gdy gblock-2-cage-mutant zawiera mutant klatkowy EED (Y365A), niezdolny do wiązania się z H3K27me3. Indukowalne ratownictwo EED WT jest oznaczone jako i-WT-r, a indukowalne ratownictwo EED z mutacją w klatce jest oznaczone jako i-MT-r dla wygody.
  4. W formacie płytki 6-dołkowej należy przeprowadzić transfekcję 2 x 105 mESC z 1 μg gRNA (indukowane EED-gRNA) i 1 μg matryc dawcy (i-WT-r lub i-MT-r) za pomocą odczynnika do transfekcji i wyizolować komórki GFP dodatnie za pomocą FACS.
  5. Wykonaj kroki 2.3-2.11, aby wyizolować poszczególne kolonie gotowe do genotypowania w celu skutecznego celowania.
  6. Użyj starterów genotypowania Inducible_Genotype-FW-1 i Inducible_Genotype-REV-1, które obejmują włożoną kasetę i przeprowadzają genotypowanie PCR przy użyciu polimerazy DNA Taq.
    UWAGA: Skuteczność kierowania dla CRISPR wynosi około 10%.
    1. Potwierdź poprawną integrację kasety metodą PCR przy użyciu starterów Inducible_Genotype-FW-2 i Inducible_Genotype-REV-2, które znajdują się poza ramionami homologii.
      UWAGA: Homozygotyczna integracja kasety jest niezbędna do skutecznego ratowania EED. Należy zauważyć, że komórki z integracją homozygotyczną będą wytwarzać pojedynczy duży produkt DNA w porównaniu z WT EED, który będzie wytwarzał krótki produkt.
  7. Potwierdź integrację kasety przez sekwencjonowanie Sangera.
  8. Potwierdzić odwrócenie kasety i ekspresję EED i innych podstawowych składników PRC2 (np. EZH2 i SUZ12) po podaniu 4-OHT przez Western blot.
  9. Potwierdzić ekspresję T2A-GFP i procentową zawartość odwrócenia za pomocą cytometrii przepływowej. Należy zauważyć, że wyrażenie GFP wskazuje na odwrócenie kasety i wyrażenie EED.

4. Po zarodkowaniu i rozprzestrzenianiu się aktywności PRC2 na chromatynie

  1. Potwierdzić, że mESC i-WT-r i i-MT-r nie mają nieszczelnej ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku nieszczelnej ekspresji GFP, przed rozpoczęciem eksperymentu należy wyizolować komórki GFP-ujemne za pomocą FACS.
  2. Rozbuduj mESC i-WT-r i i-MT-r na pięć płytek o średnicy 15 cm (5 x 10po 6 komórek na płytkę).
  3. Wywołać ekspresję WT lub EED z mutacją klatkową, podając 0,5 μM 4-OHT przez 0 godzin, 12 godzin, 24 godziny, 36 godzin i 8 dni (jedna 15 cm płytka na warunek). Zmień podłoże po 12 godzinach w przypadku zabiegów dłuższych niż 12 godzin. Wyizolować pomyślnie zrekombinowane komórki za pomocą FACS przy użyciu GFP. Dostosuj czas zabiegów tak, aby wszystkie warunki zostały zebrane jednocześnie.
  4. Wykonaj sekwencję ChIP dla H3K27me2, H3K27me3, aby zbadać ich czasowe osadzanie się na chromatynie w odpowiedzi na ponowną ekspresję WT lub EED z mutacją w klatce. Użyj protokołu ChIP-seq, w tym przygotowania biblioteki szczegółowo opisanego w Oksuz et al., 201715.
  5. Użyj kontroli skoków w każdej próbce, aby umożliwić ilościowe porównanie między różnymi punktami czasowymi19.
    1. Do kontroli skoków należy użyć chromatyny z Drosophila melanogaster (w stosunku 1:50 do chromatyny pochodzącej z mESC), a także przeciwciała H2Av specyficznego dla Drosophila (1 μl przeciwciała H2Av na 4 μg chromatyny Drosophila zgodnie z instrukcjami producenta) w każdej próbce.
    2. Przygotuj chromatynę z Drosophila w sposób podobny do tej z mESC, korzystając z protokołu opisanego w Oksuz et al., 201715.
  6. Mapuj odczyty sekwencji dla ChIP-seq do genomu mm10 za pomocą Bowtie 2 przy użyciu domyślnych parametrów20.
  7. Normalizuj odczyty myszy ChIP-seq do skoku Drosophila odczyt liczy21. Oblicz współczynnik normalizacji skoku za pomocą następującego wzoru: 1 x 106 / unikalna liczba odczytów Drosophila. Spodziewaj się, że uzyskasz około 1 x 106 odczytów Drosophila i 20 x 106 odczytów myszy na eksperyment.
    1. Nie należy uwzględniać chromatyny Drosophila podczas sekwencjonowania próbek wejściowych.
  8. Użyj narzędzia genomecov z bedtools, aby przekonwertować plik bam na bedgraph22. Następnie przekonwertuj bedgraph na plik bigwig za pomocą narzędzia bedGraphToBigWig z USCS23,24. Zobacz następujący skrypt:
    gen="ścieżka do genomu MM10"
    CHR="Ścieżka do rozmiarów chromosomów MM10"
    inp_bam="┼╝cie┼ka do pliku wejściowego bam "
    multiply="Oblicz współczynnik normalizacji skoku"
    bedtools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph
    >sort -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph
    >bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw
  9. Wizualizacja gęstości odczytu ChIP-seq poprzez przesłanie plików bigwig do przeglądarki genomu USCS24.

5. Monitorowanie powstawania i wzrostu ognisk H3K27me3 w jądrach mESC

  1. Płytka 1x 104 mESC do szkiełek 8-dołkowych wstępnie pokrytych 0,1% żelatyną.
  2. Następnego dnia zacznij wykonywać kolejne indukcje 4-OHT (0,5 μM) w celu zebrania komórek wykazujących ekspresję EED dla wskazanych punktów czasowych (0 h, 12 h, 24 h i 36 h). Zmień podłoże po 12 godzinach w przypadku zabiegów dłuższych niż 12 godzin.
  3. Utrwalić mESC za pomocą 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut.
  4. Przepuszczalność komórek za pomocą PBS/0,25% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  5. Zablokuj komórki PBS/5% surowicy osła/0,1% Triton X-100 (bufor blokujący) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  6. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe H3K27me3 w stosunku 1:500 w buforze blokującym i dodać do komórek.
  7. Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Następnego dnia wykonaj 3 prania z PBS/0,1% Triton X-100.
  9. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (Alexa fluor 595) w stosunku 1:1000 w buforze blokującym i dodać do komórek.
    1. Wykonuj wszystkie inkubacje w ciemności w następujących krokach, ponieważ przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor są wrażliwe na światło.
  10. Inkubować przeciwciało drugorzędowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  11. Wykonaj 3 prania z PBS/0,1% Triton X-100.
  12. Rozcieńczyć DAPI (1 mg/ml) w stosunku 1:4000 PBS/0,1% Triton X-100 i dodać do komórek.
  13. Inkubować komórki z DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  14. Zamontuj ogniwa za pomocą uchwytu Aqua.
  15. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej w 63-krotnym powiększeniu.
  16. Przetwarzaj i pseudokoloruj obrazy za pomocą rozkładu ImageJ, Fiji25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny schemat warunkowego systemu ratunku
Rycina 1 przedstawia schemat celowania w celu warunkowego uratowania komórek z knockoutem EED (EED KO) za pomocą EED typu dzikiego (WT) lub EED z mutacją w domenie cage (Y365A), eksprymowanych z endogennego locus EED. Po wyeliminowaniu EED, kluczowej podjednostki PRC2, niezbędnej dla jego stabilności i aktywności enzymatycznej, wprowadza się kasetę w obrębie intronu następującego po eksonie 9 genu EED (Rysun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Skutecznym podejściem do zrozumienia szczegółów mechanistycznych podczas tworzenia danej domeny chromatyny jest najpierw zakłócenie domeny, a następnie śledzenie jej rekonstrukcji w komórkach. Proces ten można wstrzymać w dowolnym momencie podczas rekonstrukcji, aby szczegółowo przeanalizować toczące się zdarzenia. Wcześniejsze badania nad domenami chromatyny nie były w stanie rozwiązać takich zdarzeń, ponieważ były one przeprowadzane w warunkach stanu ustalonego (np. porównując nokaut typu dzikiego i nokaut genu). W tym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

D.R. jest współzałożycielem Constellation Pharmaceuticals i Fulcrum Therapeutics. Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy doktorom L. Valesowi, D. Ozacie i H. Mou za korektę rękopisu. Laboratorium DR jest wspierane przez Instytut Medyczny Howarda Hughesa oraz Narodowe Instytuty Zdrowia (R01CA199652 i R01NS100897).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(Z)-4-hydroksytamoksyfen (5 mg)SigmaH7904-5MGDo indukcji ekspresji EED
16% wodny roztwór paraformaldehydu (10x10 ml)Mikroskopia elektronowaSciences 15710Do immunofluorescencji
2-merkaptoetanoluLifeTechnologies21985-023Do hodowli mESC
2% Roztwór żelatynySigmaG1393-100mlDo mESC kultura
Accutase 500 MLInnovative Cell Tech/FISHERAT 104-500Do hodowli mESC
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresaerch711-585-152Do immunofluorescencji
Aqua-Mount Mounting MediumFISHER/VWR41799-008Do immunofluorescencji
KOMORA SLD TC PRMA 8-CHM 16 PKFisher Sci177445PKDo immunofluorescencji
DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek) - 10 mgLife TechD1306Do immunofluorescencji
inhibitora ERK, PD0325901Stemgent04-0006Do hodowli mESC
ESGRO Rekombinowane mysie białko LIFMillipore/FisherESG1107Do hodowli mESC
FBS Stem Cell QualifiedAtlantaS10250Do hodowli mESC
Gibson Assembly Master MixNEBE2611LDo klonowania matrycy dawcy
Inhibitor GSK3, CHIR99021Stemgent04-0004Do hodowli mESC
H3K27me2 (D18C8) królikmAB Sygnalizacja komórkowaPrzeciwciało 9728Sdla ChIP-seq
H3K27me3Sygnalizacja komórkowa9733SPrzeciwciało dla ChIP-seq
Histone H2Av przeciwciało (pAb)Motywaktywny39715Kontrola skoków dla ChIP-seq
Knockout DMEMInvitrogen10829-018Do hodowli mESC
L-glutaminaSigmaG7513Do hodowli mESC
Lipofectamine 2000LifeTech11668019Do transfekcji
MangoTaq DNA PolimerazaBiolineBIO-21079Do genotypowania PCR
Normalna surowica osła (10 ml)Jackson ImmunoResearch017-000-121Do immunofluorescencji
Penicylina-StreptomycynaSigma / RocheP0781Do hodowli mESC
pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458)Addgene48138Do klonowania gRNA
Roztwór do ekstrakcji DNA QuickExtractLucigenQE0905TDo genotypowania PCR
Triton X-100SigmaT8787-250ML
Zero Blunt PCR Zestaw do klonowaniaThermo FisherK270020do klonowania szablonów dawcy
Primers / gBlocks< / strong>
EED-KO-gRNA-1Sekwencja: ctctggctactgtcaactag. gRNA paruje się do nokautowania EED w C57BL / 6 ESC dla systemów i-WT-r i i-MT-r.
EED-KO-gRNA-2: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNA paruje się do nokautowania EED w C57BL/6 ESC dla układów i-WT-r i i-MT-r.
EED-gRNA: atggcaccccgaaattagaa. gRNA i dawca do generowania systemu i-WT-r w tle EED-KO.
i-WT-rhttps://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA i Dawca do wytworzenia układu i-WT-r w tle EED-KO.
EED-gRNA: atggcaccccgaaattagaa. gRNA i dawca do generowania systemu i-WT-r w tle EED-KO.
i-MT-rhttps://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA i Dawca do wytworzenia systemu i-MT-r w tle EED-KO.
Genotypping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1Sekwencja: ctgtaggctgccatctgtga. Allel typu dzikiego da produkt o wielkości 1,9 kb. Allel nokautujący da produkt o wartości 200 pz.
Gnt-EED-KO-REV-1Sekwencja: agccagggctacacagagaa. Allel typu dzikiego da produkt o wielkości 1,9 kb. Allel nokautujący da produkt o wartości 200 pz.
Inducible_Genotype-FW-1Sekwencja: tgcagtgaaacaaatttggaa. Po włożeniu kasety startery wytworzą 1863 pz. Allel typu dzikiego wytworzy produkt o wartości ~200 pz.
Inducible_Genotype-REV-1Sekwencja: gagaggggtggcactgtaaa. Po włożeniu kasety startery wytworzą 1863 pz. Allel typu dzikiego wytworzy produkt o wartości ~200 pz.
Inducible_Genotype-FW-2Sekwencja: ccccctctctttttttct. Po włożeniu kasety startery wytworzą 3200 pz. Allel typu dzikiego wytworzy produkt o wartości 1560 pz.
Inducible_Genotype-REV-2Sekwencja: atgcctgggtgaatgaaaaa. Po włożeniu kasety startery wytworzą 3200 pz. Allel typu dzikiego wytworzy produkt o wartości 1560 pz.
Sekwencja Sekwencja indukowana Dawca Sekwencja indukowana Dawca

Bibliografia

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  3. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  4. Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
  5. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  6. Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
  7. Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
  8. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
  9. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
  10. Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
  11. Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
  12. Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
  13. Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
  14. Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
  15. Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
  16. Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  18. Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90(2002).
  19. Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  21. Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
  22. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  23. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  24. UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  27. Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  28. Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie domen chromatynychromatyna regulowana przez PRC2knockout CRISPR-Cas9analiza cytometrii przepływowejanaliza ChIP-seqmikroskopia fluorescencyjnaembrionalne komórki macierzyste myszydelecja genu EEDindukcja 4-hydroksytamoksyfenemdepozycja H3K27me3
Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.