Przewlekłe zwłóknienie jelit wywołane zakażeniem Salmonellą

Podsumowanie

Ten protokół opisuje mysi model zwłóknienia jelit wywołanego przez Salmonellę, który przypomina kluczowe patologiczne cechy choroby Leśniowskiego-Crohna, w tym przezścienne zapalenie i zwłóknienie. Metoda ta może być stosowana do oceny czynników gospodarza, które zmieniają wyniki zwłóknienia przy użyciu zmutowanych myszy utrzymywanych na tle genetycznym C57Bl/6.

Streszczenie

Zwłóknienie tkanek charakteryzujące się patologiczną akumulacją macierzy zewnątrzkomórkowej, takiej jak kolagen, jest wynikiem uporczywego stanu zapalnego i rozregulowanej naprawy. W nieswoistym zapaleniu jelit (IBD) zwłóknienie prowadzi do nawracających zwężeń, dla których nie ma skutecznej terapii innej niż resekcja chirurgiczna. Ze względu na jego późny początek, procesy napędzające zwłóknienie są mniej zbadane i w dużej mierze nieznane. Dlatego powikłania zwłóknieniowe stanowią poważne wyzwanie w IBD. W tym protokole opisano solidny model zwłóknienia jelit in vivo, w którym wstępne leczenie streptomycyną myszy C57Bl / 6, a następnie zgłębnik doustny mutantem Salmonella Typhimurium ΔAroA klasy szczepionkowej prowadzi do trwałej kolonizacji patogenu i zwłóknienia jelita ślepego. Wyjaśniono metodologie przygotowania S. Typhimurium ΔAroA do inokulacji, ilościowego określania ładunków patogenów w jelicie ślepym i śledzionie oraz oceny odkładania się kolagenu w tkankach jelitowych. Ten eksperymentalny model choroby jest przydatny do badania czynników gospodarza, które albo nasilają, albo nasilają zwłóknienie jelit podobne do CD.

Wprowadzenie

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) i choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) to dwie główne formy IBD i są charakteryzowane jako przewlekłe i nawracające choroby zapalne przewodu pokarmowego 1^,2. Zaburzenia te mają duży wpływ na jakość życia pacjentów. Objawy IBD obejmują ból brzucha, biegunkę, nudności, utratę masy ciała, gorączkę i zmęczenie³. Ostatnie badania zidentyfikowały czynniki genetyczne i środowiskowe, które przyczyniają się do patogenezy choroby; Uważa się, że takie czynniki ryzyka przyczyniają się do przerwania bariery nabłonkowej, co skutkuje translokacją lub nadpróbkowaniem antygenów luminalnych⁴. W konsekwencji inicjuje to nieprawidłową reakcję zapalną na florę komensalną, w której pośredniczą jelitowe komórki odpornościowe⁴. Cechy powikłań związanych z IBD mogą rozciągać się na miejsca poza przewodem pokarmowym, wpływając na różne narządy, w tym stawy, skórę i wątrobę^1,2. Cechy charakterystyczne WZJG obejmują ciężkie i rozlane zapalenie zwykle zlokalizowane w okrężnicy¹. Patologia choroby wpływa na błonę śluzową i podśluzówkę jelita, powodując powierzchowne owrzodzenia błony śluzowej¹. W przeciwieństwie do tego, CD może wpływać na dowolną część przewodu pokarmowego, chociaż dowody choroby są powszechnie znajdowane w okrężnicy i dystalnym odcinku jelita krętego². Co więcej, stan zapalny w CD jest przezścienny, dotyczy wszystkich warstw ściany jelita².

Kilka zidentyfikowanych genów podatności na IBD wskazywałoby, że dysregulacja bariery nabłonkowej lub odporności jest kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do postępu choroby⁵. Stwierdzono, że mutacje w domenie oligomeryzacji nukleotydów 2 (NOD2) wyrażane przez monocyty są związane ze zwiększoną podatnością na CD; Podkreśla to związek między zmienionym wrodzonym wykrywaniem immunologicznym składników bakteryjnych a chorobą6. Nowsze badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) ujawniły dodatkowe szlaki potencjalnie zaangażowane w patogenezę IBD, w tym wariacje genetyczne w: STAT1, NKX2-3, IL2RA, szlakach zależnych od IL23R związanych z odpornością adaptacyjną, MUC1, MUC19 i PTGER4 w utrzymaniu bariery jelitowej oraz autofagii za pośrednictwem ATG16L^7,8,9. Chociaż te populacyjne badania genetyczne poszerzyły naszą wiedzę na temat IBD, same allele podatności są prawdopodobnie niewystarczające do zainicjowania i podtrzymania choroby przewlekłej³. Inne czynniki niegenetyczne, w tym zmiany w składzie mikrobiomu jelitowego i zmniejszenie różnorodności, są związane z zapaleniem jelit. Nie jest jednak jasne, czy dysbioza jelitowa poprzedza, czy jest konsekwencją rozregulowanych odpowiedzi immunologicznych³. Chociaż etiologia IBD pozostaje niejasna, nasza wiedza na temat patogenezy choroby została poszerzona dzięki eksperymentalnym mysim modelom zapalenia jelit^10,11. Modele te same w sobie nie reprezentują w pełni złożoności ludzkiej choroby, ale są cenne dla wyjaśnienia szlaków patofizjologicznych, które mogą być istotne dla IBD oraz dla walidacji wstępnych strategii terapeutycznych^10,11. Takie modele myszy zazwyczaj opierają się na inicjacji stanu zapalnego przez indukcję chemiczną lub infekcję, transfer komórek odpornościowych lub manipulację genetyczną. Co więcej, strategie te często wiążą się z zaburzeniami integralności nabłonka lub modulacją odporności wrodzonej lub nabytej.

Serowiry Salmonella enterica to patogeny jelitowe, które mogą zarażać ludzi i myszy. Po spożyciu Salmonella może skolonizować jelita poprzez bezpośrednią inwazję nabłonka, komórek M lub komórek prezentujących antygen¹². Myszy zakażone doustnie S. Typhimurium powodują kolonizację głównie miejsc ogólnoustrojowych, takich jak śledziona i węzły chłonne krezkowe, ze stosunkowo niską liczebnością w przewodzie pokarmowym¹². Jednak wstępne leczenie myszy streptomycyną zwiększa skuteczność kolonizacji jelit przez Salmonellę poprzez zmniejszenie ochronnego działania gospodarza normalnej mikroflory¹³. Patologiczne cechy tego modelu obejmują przerwanie lub owrzodzenie bariery nabłonkowej, rekrutację granulocytów i ciężki obrzęk¹³. Alternatywnie, zakażenie mutantem S. Typhimurium ΔAroA klasy szczepionki prowadzi do przewlekłej kolonizacji jelita ślepego i okrężnicy, która utrzymuje się do 40 dnia po zakażeniu¹⁴. Szczep S. Typhimurium ΔAroA ma defekt w biosyntezie aminokwasów aromatycznych; To sprawia, że zmutowany szczep staje się awirulentem i może być wykorzystany jako wysoce skuteczna szczepionka¹⁵. Infekcja jamy ustnej u myszy prowadzi do odpowiedzi zapalnej związanej z cytokinami Th1 i Th17, rozległej przebudowy tkanek i odkładania kolagenu. Patologia tkanek jest związana z podwyższonym poziomem czynnika pro-fibrotycznego, takiego jak TGF-β1, CTGF i IGF¹⁴. Bliznowacenie zwłóknieniowe transmuralne zgłoszone w tym modelu przypomina zwężenia często obserwowane w IBD. Indukcja zwłóknienia przez Salmonellę wymaga zjadliwości kodowanej przez wyspy patogeniczności Salmonelli (SPI)-1 i 2 ¹². Co ważne, ten model infekcji S. Tymphimurium ΔAroA jest użytecznym systemem do badania odpowiedzi zwłóknieniowych u zmutowanych myszy utrzymywanych na tle C57/Bl6. Szczep C57/Bl6 jest niezwykle wrażliwy na zakażenie S. Typhiumurim SL1344 z powodu mutacji powodującej utratę funkcji w genie kodującym naturalne białko makrofagów związane z opornością (NRAMP)-1^16,17. Odkryliśmy, że wrodzone komórki limfoidalne zależne od IL-17A i RORα są ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do patogenezy w tym modelu¹⁸.

Głównym powikłaniem CD jest rozregulowane i nadmierne odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), w tym kolagenu^2,19. Chociaż przewód pokarmowy ma stosunkowo dużą zdolność do regeneracji, zwłóknienie bliznowacenia może powstać z powodu nierozwiązanych reakcji gojenia się ran, które są związane z przewlekłym i ciężkim stanem zapalnym^20,21. W przypadku CD powoduje to szkodliwy wpływ na architekturę tkanki, prowadząc do znacznego upośledzenia narządów^21,22. Przezścienny charakter stanu zapalnego obserwowanego w CD ostatecznie poprzedza pogrubienie ściany jelita związane z objawowym zwężeniem lub powstawaniem zwężeń²¹. Około jedna trzecia pacjentów z CD wymaga resekcji jelita z powodu tego powikłania²². Nie ma skutecznych terapii przeciwzwłóknieniowych w IBD, biorąc pod uwagę, że stosowanie leków immunosupresyjnych, takich jak azatiopryna lub leki biologiczne anty-TNFα, nie ma wpływu lub tylko nieznacznie zmniejsza zapotrzebowanie na interwencje chirurgiczne^19,23. Podczas gdy zwłóknienie jest uważane za konsekwencję przewlekłego stanu zapalnego, komórki pochodzenia mezenchymalnego, takie jak fibroblasty i perycyty, są uważane za główne komórkowe źródła ECM w bliznowaceniu zwłóknieniowym^21,24. Przewlekłe zakażenie S. Typhimurium ΔAroA to solidny mysi model zwłóknienia jelit, który może dostarczyć informacji na temat patogenezy cech podobnych do CD.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.

1. Przygotowanie kultur Salmonella Typhimurium ΔAroA do doustnego podawania myszy.

1. Z zamrożonego bulionu glicerolu S. Typhimurium ΔAroA przygotować płytkę smugową przy użyciu agaru LB zawierającego 100 μg/ml streptomycyny ze sterylną pętlą zaszczepiającą. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Płytki smugowe można przechowywać do tygodnia w temperaturze 4 °C.
2. Na dzień przed zakażeniem należy przygotować antybiotyk, rozpuszczając 0,5 g streptomycyny w 2,5 ml wody. Po wysterylizowaniu roztworu streptomycyny metodą filtracyjną, należy doustnie pobrać zgłębnik myszy za pomocą igły do zgłębnika 22G z końcówką gruszki i strzykawki o pojemności 1 ml ze 100 μl roztworu streptomycyny (20 mg streptomycyny / dawkę). Za pomocą pętli zaszczepiającej zaszczepić 3 ml bulionu LB (50 μg/ml streptomycyny) w probówce hodowlanej z pojedynczą kolonią. Inkubować kulturę Salmonelli w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
3. W dniu zakażenia należy przygotować ostateczną dawkę zakażenia, wykonując 2 kolejne rozcieńczenia 1/10 nocnych kultur Salmonelli w sterylnym PBS. Otrzymałoby to inokulum o objętości 100 μl zawierające około 3 x 10⁶ jtk.
4. Za pomocą igły do zgłębnika 22G i strzykawki o pojemności 1 ml należy wstrzyknąć do każdej myszy 100 μl przygotowanego preparatu Salmonella.
   UWAGA: Przygotuj kultury Salmonelli przy użyciu technik aseptycznych. Końcowe stężenie zaszczepiania Salmonelli można zweryfikować przez posiew seryjnych rozcieńczeń na agarze LB ze streptomycyną. Szczep S. Typhimurium ΔAroA można uzyskać, kontaktując się z profesorem McNagny (kelly@brc.ubc.ca).

2. Ocena obciążenia tkankami Salmonellą

1. Przygotuj 2 ml mikroprobówek z okrągłym dnem z 1 ml sterylnego PBS i autoklawizowanym koralikiem ze stali nierdzewnej. Wstępnie zważ probówki przed pobraniem tkanki.
2. Wyciąć tkanki jelita ślepego i śledziony od myszy poddanych eutanazji przez ekspozycję na dwutlenek węgla. Zbierz tkankę od poszczególnych zwierząt w oddzielnych probówkach. Zważ probówki, aby określić masę tkanki.
3. Homogenizować za pomocą aparatu do mielenia mieszającego przez 15 minut przy 30 Hz. Przenieść 900 μl PBS na studzienkę do 96-dołkowego megabloku o pojemności 2 ml. Odpipetować 100 μl homogenatów tkankowych do pierwszego dołka, dobrze wymieszać i przeprowadzić seryjne rozcieńczenia, dodając 100 μl do kolejnych studzienek, aż do uzyskania rozcieńczenia ^10-6. Umieścić 10 μl każdego rozcieńczenia w trzech porcjach na agarze LB zawierającym 100 μg/ml streptomcyiny.
4. Policz i pomnóż średnią jtk przez współczynnik 100, ponieważ 10 μl próbki 1000 μl zostało platerowane i odpowiedni współczynnik rozcieńczenia. Podziel całkowitą masę tkanki przez masę tkanki, aby określić jtk na gram tkanki.
   UWAGA: Podczas przetwarzania tkanek wszystkie próbki należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Używaj końcówek do pipet z szerokim otworem podczas wykonywania seryjnych rozcieńczeń homogenatami tkankowymi. Przygotuj wcześniej 96-dołkowy megablok zawierający PBS.

3. Barwienie czerwienią Picrosirius i kwantyfikacja kolagenu.

1. Utrwal tkanki jelita ślepego przez noc w 10% buforowanej formalinie i przygotuj się do zatapiania w parafinie. Wytnij sekcje 5 μm dla barwienia Picrosirius Red, jak opisano wcześniej²⁵.
2. Uchwyć złożone obrazy całych przekrojów kątowych pod mikroskopem w jasnym polu.
3. Otwórz Fidżi (ImageJ) i przeciągnij i upuść plik obrazu .tif na pasek narzędzi.
4. Na pasku menu wybierz opcję Image > Type > RGB Stack (Typ obrazu stosu RGB), aby podzielić obraz na kanały czerwony, zielony i niebieski. Przesuń poziomy pasek u dołu panelu, aby ustawić kanał na zielony
.
5. Otwórz narzędzie Image > Dostosuj > próg. Dostosuj minimalne i maksymalne limity, aby wyeliminować wszelkie sygnały tła. Po ustawieniu żądanego progu zamknij narzędzie progu i przejdź do opcji Analizuj > ustaw pomiary. Zaznacz pola Powierzchnia, Ułamek powierzchni, Ograniczenie do progu i Wyświetl etykietę.
6. Bramkuj sekcję tkanki za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego lub zaznaczania wielokątów i zmierz dodatni obszar % dla kolagenu, klikając Analizuj > Zmierz.
7. Normalizuj obszar bezwzględny dodatni dla barwienia kolagenu do obszaru tkanki.
   UWAGA: Fidżi (ImageJ) to program typu open source, który można pobrać pod adresem https://fiji.sc. Obrazy o tych samych warunkach przechwytywania (tj. jasności i ostrości) muszą mieć identyczne limity progowe dla dokładnej kwantyfikacji. Jeśli w wybranej tkance występuje jakiekolwiek zabarwienie tła, zmierz powierzchnię bezwzględną i odejmij ją od obszaru dodatniego dla kolagenu z całej tkanki.

Wyniki

Leczenie streptomycyną, a następnie infekcja doustna szczepem S. Typhimurium ΔAroA prowadzi do silnego stanu zapalnego jelit i włóknienia, szczególnie w kątnicy (Rysunek 1). U zainfekowanych zwierząt można odzyskać typowe obciążenia patogenami rzędu 10⁸ do 10⁹ CFU na 1 g kątnicy oraz 10⁴ CFU na 1 g śledziony (Rysunek 2). Ocena włóknienia w przekrojach kątnicy barwionych czerwienią picrosirius wskazuje na szczyt włóknieni...

Dyskusja

Nasza wiedza na temat patogenezy IBD została znacznie poszerzona dzięki mysim modelom zapalenia jelit. Chociaż takie indywidualne modele nie oddają wszystkich cech złożonej i wieloczynnikowej choroby człowieka, są przydatne w identyfikacji kluczowych cech progresji choroby. Zwężenia zwłóknieniowe związane z IBD pozostają główną niezaspokojoną potrzebą kliniczną, ponieważ obecne metody leczenia są nieskuteczne w odwracaniu rozwoju choroby. Co więcej, zwłóknienie jelit jest trudne do zbadania w warunkach laboratoryjnych ze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2 ml okrągłe dno sejf z zamkiem	Eppendorf	22363344
Koraliki ze stali nierdzewnej	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Końcówki do pipet z dużym otworem	Fisher	2707134
2 mL Płytki megablokowe	Sarstedt	82.1972.002
Igły do zgłębników	FST	18061-22
Siarczan streptomycyny	Sigma	S9137
Młynek miksujący	Retsch	MM