Artykuł metodologiczny

Inwazyjna ocena hemodynamiczna układu prawej komory i tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego niedotlenieniem u myszy

DOI:

10.3791/60090

⸱

24 października 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Centre for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Laboratory Animal Center, Peking University, 3Center of Cardiac Surgery for Adults, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Centre for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia inwazyjnej oceny hemodynamicznej prawej komory i tętnicy płucnej u myszy przy użyciu metody chirurgicznej na otwartej klatce piersiowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tętnicze nadciśnienie płucne (PAH) jest przewlekłą i ciężką chorobą krążeniowo-oddechową. Myszy są popularnym modelem zwierzęcym używanym do naśladowania tej choroby. Jednak ocena ciśnienia w prawej komorze (RVP) i ciśnienia w tętnicy płucnej (PAP) pozostaje wyzwaniem technicznym u myszy. RVP i PAP są trudniejsze do zmierzenia niż ciśnienie w lewej komorze ze względu na różnice anatomiczne między lewym i prawym układem serca. W tym artykule opisano stabilną metodę pomiaru hemodynamicznego prawego serca i jej walidację przy użyciu zdrowych myszy i PAH. Metoda ta opiera się na operacji otwartej klatki piersiowej i wspomaganiu wentylacji mechanicznej. Jest to skomplikowana procedura w porównaniu z zabiegami z zamkniętą klatką piersiową. Chociaż do tej operacji wymagany jest dobrze wyszkolony chirurg, zaletą tej procedury jest to, że może generować zarówno parametry RVP, jak i PAP w tym samym czasie, więc jest to preferowana procedura do oceny modeli PAH.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tętnicze nadciśnienie płucne (PAH) to przewlekła i ciężka choroba krążeniowo-oddechowa z podwyższonym ciśnieniem w tętnicy płucnej (PAP) i ciśnieniem w prawej komorze (RVP), która jest spowodowana proliferacją komórkową i zwłóknieniem małych tętnic płucnych1. Cewniki do tętnic płucnych, zwane również cewnikami Swana-Ganza2, są powszechnie stosowane w klinicznym monitorowaniu RVP i PAP. Ponadto klinicznie zastosowano bezprzewodowy system monitorowania PAP3,4,5. Aby naśladować chorobę do badań na myszach, stosuje się środowisko hipoksyjne do symulacji ludzkich objawów klinicznych PAH6. W ocenie PAP u zwierząt, duże zwierzęta są stosunkowo łatwe do monitorowania za pomocą cewników do tętnic płucnych przy użyciu tej samej techniki, co u ludzi, ale małe zwierzęta, takie jak szczury i myszy, są trudne do oceny ze względu na ich mały rozmiar ciała. Pomiar hemodynamiczny prawego układu komorowego u myszy jest możliwy za pomocą cewnika Fr o ultramałym rozmiarze 1 Fr7. Metoda pomiaru RVP i PAP u myszy została opisana w literaturze8,9, ale metodologia ta nie ma szczegółowego opisu. RVP i PAP są trudniejsze do zmierzenia niż ciśnienie w lewej komorze ze względu na różnice anatomiczne między lewym i prawym układem serca.

Aby uzyskać parametry PAP i RVP w tej samej myszy, opisujemy podejście oparte na operacji otwartej klatki piersiowej do pomiarów hemodynamicznych prawego serca, jego walidację u zdrowych myszy i myszy z PAH oraz jak uniknąć generowania sztucznych danych podczas skomplikowanej operacji na otwartej klatce piersiowej. Chociaż ta technika jest najlepiej wykonywana przez dobrze wyszkolonego chirurga, ma tę zaletę, że jest w stanie ocenić PAP i RVP w tej samej myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół dla zwierząt został sprawdzony i zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Fuwai, Chińskiej Akademii Nauk Medycznych, Peking Union Medical College (NO.0000287). Zwierzęta doświadczalne były trzymane i karmione zgodnie z wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt w Chinach.

UWAGA: Ośmio- do 12-tygodniowe samce myszy C57BL były trzymane w środowisku o 12-godzinnym cyklu ciemności / 12 godzin światła. Myszy z TNP trzymano przez 4 tygodnie w stężeniu tlenu wynoszącym 10%, utrzymywanym w komorze hipoksji kontrolowanej tlenem w celu wywołania nadciśnienia płucnego, a myszy kontrolne trzymano w powietrzu pokojowym (21% tlenu) w identycznych warunkach. Pomiary RVP i PAP wykonano pod koniec 4-tygodniowej prowokacji hipoksją.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Namoczyć cewnik przetwornika ciśnienia (rozmiar: 1 Fr) w 0,9% soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut przed eksperymentem hemodynamicznym.
  2. Przefiltruj roztwór 2,2,2-tribromoetanolu z filtrem 0,22 μm i przechowuj w lodówce o temperaturze 4 stopni.
  3. Przygotuj oczyszczone narzędzia i materiały chirurgiczne, takie jak rękawiczki do operacji.
  4. Przygotuj 10 ml 1,0% roztworu enzymów trawiennych do czyszczenia cewnika.
  5. Podłączyć cewnik przetwornika ciśnienia do układu ciśnienie-objętość.
  6. Skalibruj przetwornik ciśnienia przed uzyskaniem pomiarów ciśnienia dla każdej myszy.
    1. Przekręć pokrętło kalibracji na 0 mmHg i 25 mmHg, aby wysłać sygnał ciśnienia weryfikacyjnego do oprogramowania do akwizycji danych i skonfigurować ustawienie kalibracji w oprogramowaniu.
    2. Przekręć pokrętło na Przetwornik i ustaw pokrętło Balance na linię bazową zera.
  7. Ustaw standardowy mikroskop stereoskopowy i stół chirurgiczny dla małych zwierząt z kontrolowaną temperaturą do utrzymania temperatury ciała podczas operacji.
  8. Skonfiguruj system oświetlenia świetlnego do mikrochirurgii, aby zapewnić wystarczającą ilość światła na obszarze operacyjnym.

2. Chirurgia na otwartej klatce piersiowej i pomiary hemodynamiczne

  1. Znieczulić myszy 250 mg/kg 2,2,2-tribromoetanolu we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.). W razie potrzeby należy powtórzyć dawki uzupełniające w ilości od 1/3 do 1/2 dawki pierwotnej podczas zabiegu.
  2. Usuń sierść na klatce piersiowej i szyi za pomocą golarki i balsamu do depilacji (Rysunek 1A, 2A).
  3. Zabezpiecz każdą mysz w pozycji leżącej na stole chirurgicznym dla małych zwierząt z kontrolowaną temperaturą, aby pomóc utrzymać temperaturę ciała (37 °C) podczas operacji.
  4. Oczyść miejsce operowane 70% octanalem.
  5. Po uruchomieniu znieczulenia potwierdź odpowiednią indukcję znieczulenia za pomocą szczypania palca u nogi.
  6. Wykonaj nacięcie w linii środkowej na skórze szyi (Rysunek 1A).
  7. Wypreparuj mięśnie szkieletowe za pomocą zakrzywionych kleszczy i odsłoń tchawicę (Rysunek 1B, 1C).
  8. Wykonać intubację przez usta za pomocą zmodyfikowanego cewnika dożylnego 22 G. Upewnij się, że rurka znajduje się w tchawicy za pomocą kleszczy (Rysunek 1D).
  9. Podłącz rurkę do respiratora dla małych zwierząt. Oblicz i ustaw częstość oddechów i objętość oddechową na podstawie masy ciała zgodnie z instrukcją obsługi respiratora10. Na przykład ustaw częstość oddechów na 133/min, a objętość oddechową na 180 μl dla myszy o wadze 30 g na podstawie opisanych obliczeń.
  10. Zabezpiecz rurkę do wentylacji za pomocą taśmy.
  11. Potwierdź odpowiednią indukcję znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
  12. Wykonaj nacięcie w linii środkowej na skórze klatki piersiowej i ostrożnie wypreparuj mięśnie klatki piersiowej za pomocą narzędzia do kauteryzacji (Rysunek 2B, 2C).
  13. Przetnij mostek nożyczkami przez środek i odsłoń klatkę piersiową (Rysunek 2D).
  14. Zapobiegaj krwawieniu za pomocą narzędzia do kauteryzacji podczas zabiegu chirurgii na otwartej klatce piersiowej.
  15. Odsłoń prawą komorę za pomocą zwijaczy (Rysunek 2E).
  16. Wprowadzić cewnik przetwornika ciśnienia nasączony solą fizjologiczną przez mały tunel utworzony za pomocą igły 25 G do prawej komory, aby zmierzyć RVP (Rysunek 2F i Rysunek 3A, 3C).
  17. Przytrzymaj cewnika i skrzyżuj zastawkę płucną w sposób koncentryczny z tętnicą płucną. Obserwuj przebieg ciśnienia i uzyskaj stabilny sygnał PAP (rysunek 3B, 3D).
  18. Rejestruj dane hemodynamiczne za pomocą systemu akwizycji danych i oprogramowania.
  19. Po końcowych pomiarach należy humanitarnie poddać myszy eutanazji poprzez wstrzyknięcie nadmiaru dawki roztworu 2,2,2-tribromoetanolu.
  20. Ostrożnie wyjmij cewnik z prawego układu sercowego i umieść go w strzykawce o pojemności 1 ml zawierającej 1% roztwór enzymów trawiennych.
  21. Użyj wody destylowanej do ciągłego ostrożnego przepłukiwania cewnika i przechowuj go w oryginalnym pudełku.

3. Analiza danych dla hemodynamiki

UWAGA: Dane hemodynamiczne zostały zarejestrowane i przeanalizowane za pomocą oprogramowania analitycznego11 (Tabela materiałów).

  1. Dla każdej myszy wybierz co najmniej 10 ciągłych i stabilnych cykli bicia serca bez szumów, aby uzyskać średnie dane RVP lub PAP dla każdego parametru.
  2. Użyj testu t-Studenta, aby porównać normalne grupy kontroli powietrza i hipoksji. UWAGA: p < 0,05 uznano za statystycznie istotne. Dane są prezentowane jako średnia ± SD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cewnik przetwornika ciśnienia został wprowadzony do prawej komory (Rysunek 3A) przez tunel rozszerzony przez igłę 25 G, i uzyskano typowy przebieg RVP (Rysunek 3C). Cewnik był stale regulowany i powoli przesuwany i utrzymywany w tej samej osi co tętnica płucna podczas przechodzenia przez zastawkę płucną (Rysunek 3B). Po pomyślnym wprowadzeniu czujnika ciśnienia do tętnicy płucnej pojawił się typowy przebieg PAP ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intubacja tchawicy jest pierwszym ważnym krokiem w przypadku operacji na otwartej klatce piersiowej. Klasyczna metoda intubacji tchawicy u małych zwierząt, takich jak szczury czy myszy, polega na wykonaniu nacięcia w kształcie litery T na tchawicy i bezpośrednim wprowadzeniu rurki tchawicy typu Y do tchawicy. W praktyce okazuje się, że ta metoda nie jest łatwa podczas operacji. Rurka tchawicy typu Y jest zbyt duża dla małych zwierząt i tworzy kąt z tchawicą. W związku z tym trudno jest zamocować rurkę na miejscu. Dodatko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie jest wspierane przez Projekt Reformy Kształcenia Podyplomowego i Nauczania Peking Union Medical College (10023-2016-002-03), Fundusz Młodzieżowy Szpitala Fuwai (2018-F09) oraz Fundusz Dyrektora Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials (2018-PT2-ZR05).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,2,2-tribromoetanolSigma-AldrichT48402-5GDo znieczulenia
Regulator temperatury zwierzątPhysitemp Instruments, Inc.TCAT-2LVDo kontroli temperatury
Kleszcze preparacyjneFine Science Tools, Inc.11274-20Do operacji
System kauteryzacjiGeminiGemini GEM 5917Do operacji
Cewnik dożylny (22G)Angiocath BD381123Do intubacji
LabChart 7.3ADInstrumentsDo analizy danych
System oświetlenia świetlnegoOlympusDo operacji
Cewnik Mikro-TipMillar Instruments, Houston, TXSPR-1000Do pomiaru ciśnienia
Millar Systemy ciśnieniowo-objętościoweMillar Instruments, Houston, TXMVPS-300Do pomiaru ciśnienia
Kontroler O2 i komora hipoksjiBiospherixProOx 110Do przewlekłego niedotlenienia
System akwizycji danych PowerLabADInstrumentsPowerLab 16/30Do rejestracji danych
NożyczkiNarzędzia Fine Science Tools, Inc.14084-08Do chirurgii
Wentylator dla małych zwierzątHarvard ApparatusMini-Vent 845Do operacji
StereoskopOlympusSZ61Do operacji
Taśma chirurgiczna3MDo operacji
Enzym terg-a-zymeSigma-AldrichZ273287-1EADo czyszczenia cewnika

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Humbert, M., et al. Advances in therapeutic interventions for patients with pulmonary arterial hypertension. Circulation. 130 (24), 2189-2208 (2014).
  2. Chatterjee, K. The Swan-Ganz catheters: past, present, and future: a viewpoint. Circulation. 119 (1), 147-152 (2009).
  3. Adamson, P. B., et al. CHAMPION trial rationale and design: the long-term safety and clinical efficacy of a wireless pulmonary artery pressure monitoring system. Journal of Cardiac Failure. 17 (1), 3-10 (2011).
  4. Abraham, W. T., et al. Wireless pulmonary artery haemodynamic monitoring in chronic heart failure: a randomised controlled trial. The Lancet. 377 (9766), 658-666 (2011).
  5. Adamson, P. B., et al. Wireless pulmonary artery pressure monitoring guides management to reduce decompensation in heart failure with preserved ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 7 (6), 935-944 (2014).
  6. Shatat, M. A., et al. Endothelial Kruppel-like Factor 4 modulates pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (3), 647-653 (2014).
  7. SPR-1000 Mouse Pressure Catheter. , Available from: https://millar.com/products/research/pressure/single-pressure-no-lumen/spr-1000 (2019).
  8. Tabima, D. M., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Measuring right ventricular function in the normal and hypertensive mouse hearts using admittance-derived pressure-volume loops. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (6), 2069-2075 (2010).
  9. Skuli, N., et al. Endothelial deletion of hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) alters vascular function and tumor angiogenesis. Blood. 114 (2), 469-477 (2009).
  10. Harvard Inspira Advanced Safety Ventilator User's Manual. , Available from: http://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Inspira_557058_9.pdf. (2019).
  11. LabChart. , Available from: https://www.adinstruments.com/products/labchart?creative=290739105773_keyword=labchart_matchtype=e_network=g_device=_gclid=CjwKCAjwxrzoBRBBEiwAbtX1n42I2S06KmccVncUHkmExU8KKOXXREyzx8bvTrxYMSze-ooE0atcbRoCliwQAvD_BwE (2019).
  12. Marius, M. H., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 62 (25), 42-50 (2013).
  13. Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
  14. Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
  15. Chen, W. C., et al. Right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice. Journal of Visualized Experiments. (71), 50023(2013).
  16. Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic characterization of rodent models of pulmonary arterial hypertension. Journal of Visualized Experiments. (110), 53335(2016).
  17. Chen, M. Berberine attenuates hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension via bone morphogenetic protein and transforming growth factor-β signaling. Journal of Cellular Physiology. , (2019).
  18. Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. Methods in Molecular Biology. vol 1816. Ishikawa, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ci nienie w prawej komorzeci nienie w t tnicy p ucnejchirurgia z otwart klatk piersiowcewnik z przetwornikiem ci nieniawsparcie wentylacj mechanicznakwizycja danych hemodynamicznychmodel przewlek ej hipoksjirespirator dla ma ych zwierz tkonfiguracja stereomikroskopukorekty analizy danych

Powiązane artykuły