Mysi model chirurgiczny miejscowego tętniaka aorty piersiowej wywołanego elastazą

Podsumowanie

Opisujemy protokół chirurgiczny mający na celu konsekwentne wywoływanie silnych tętniaków aorty piersiowej u myszy. Zabieg polega na tym, że torakotomia lewa strona, odsłonięcie aorty piersiowej i umieszczenie gąbki nasączonej elastazą trzustkową świni na ścianie aorty.

Streszczenie

Według Centrum Kontroli Chorób, tętniaki aorty (AA) były uważane za główną przyczynę zgonów u wszystkich ras i obu płci w latach 1999-2016. Tętniak powstaje w wyniku postępującego osłabienia i ewentualnego rozszerzenia aorty, która może pęknąć lub rozerwać się, gdy osiągnie krytyczną średnicę. Tętniaki aorty zstępującej w klatce piersiowej, zwane tętniakami aorty piersiowej zstępującej (dTAA), stanowią dużą część przypadków tętniaków w Stanach Zjednoczonych. Niekontrolowane pęknięcie dTAA jest prawie zawsze śmiertelne, a planowa naprawa ma wysoki wskaźnik zachorowalności i śmiertelności. Celem naszego modelu jest szczegółowe zbadanie dTAA, wyjaśnienie patofizjologii dTAA i poszukiwanie celów molekularnych, które zatrzymają wzrost lub zmniejszą rozmiar dTAA. Dysponując mysim modelem do precyzyjnego badania patologii klatki piersiowej, można opracować terapie celowane w celu specyficznego testowania dTAA. Metoda opiera się na umieszczeniu elastazy trzustkowej (PPE) świni bezpośrednio na zewnętrznej ścianie aorty mysiej po ekspozycji chirurgicznej. Powoduje to destrukcyjną i zapalną reakcję, która osłabia ścianę aorty i pozwala na tworzenie się tętniaków przez tygodnie lub miesiące. Chociaż modele mysie mają ograniczenia, nasz model dTAA wytwarza solidne tętniaki o przewidywalnej wielkości. Co więcej, model ten może być wykorzystany do testowania celów genetycznych i farmaceutycznych, które mogą hamować wzrost dTAA lub zapobiegać pęknięciu. U pacjentów takie interwencje mogą pomóc uniknąć pęknięcia tętniaka i trudnej interwencji chirurgicznej.

Wprowadzenie

Celem tej metody jest badanie rozwoju, patofizjologii i zmian strukturalnych w mysiej aorcie piersiowej zstępującej podczas powstawania tętniaka aorty. Nasz model oferuje powtarzalną i spójną metodę indukowania tętniaków aorty piersiowej (dTAA) u myszy, umożliwiając w ten sposób testowanie różnych inhibitorów genetycznych i farmakologicznych. Prace te mogą pomóc w identyfikacji leków i terapii genowych, które można przełożyć na realną strategię leczenia ludzi z chorobą dTAA.

dTAA powstają, gdy ściana aorty piersiowej staje się osłabiona i rozszerza się z czasem, aż osiąga krytyczną średnicę, gdy może dojść do rozdarcia lub pęknięcia. Klinicznie rzecz biorąc, dTAA może postępować w ciszy, zwiększając swój rozmiar, aż struktura ściany aorty zostanie tak zniekształcona, że w końcu zawiedzie, z katastrofalnymi konsekwencjami. Niepokojące jest to, że objawy zwykle rozwijają się dopiero wtedy, gdy tętniak osiągnął niebezpieczne rozmiary (100-150% poszerzenia) i jest narażony na wysokie ryzyko rozwarstwienia lub pęknięcia^1,2. Pęknięcie dTAA jest prawie zawsze śmiertelne³, a planowa naprawa chirurgiczna wiąże się ze znaczną zachorowalnością^4,5. Ponadto większość pacjentów ma rozpoznanie tętniaka aorty przez około 5 lat przed naprawą chirurgiczną^6,7. To okno stanowi dogodny moment na interwencję niechirurgiczną. W związku z tym potrzebne są terapie medyczne w celu leczenia lub spowolnienia postępu dTAA, które stanowiłyby znaczący postęp w dziedzinie badań nad tętniakami. Obecnie nie ma dostępnych metod leczenia dTAA, głównie z powodu niepełnego zrozumienia patogenezy dTAA.

W ciągu ostatnich 20 lat opracowano kilka modeli zwierzęcych dTAA, ale każdy z tych modeli różnił się od naszego i nie wytwarzał solidnych tętniaków. Mysi model dTAA najbardziej podobny do naszego został opracowany przez Ikonomidis et al.⁸, który obejmuje bezpośrednie zastosowanie CaCl₂ do przydanki aorty. Chociaż nasz model został zaadaptowany z wielu technik opracowanych przez Ikonomidis, nasz model jest wyjątkowy na trzy różne sposoby. Po pierwsze, w naszym modelu aorta jest wystawiona na działanie miejscowej elastazy przez 3-5 minut, w porównaniu do 15 minut ekspozycji na CaCl₂. Po drugie, rozszerzenie aorty następuje po 2 tygodniach, w porównaniu do 16 tygodni w modelu CaCl₂. Wreszcie, nasz model konsekwentnie wytwarza tętniaki o około 100% poszerzeniu, w porównaniu z poszerzeniami aorty wynoszącymi 20-30% wytwarzanymi przez aplikację CaCl₂ (których nie można naprawdę uznać za tętniaki, ponieważ definiuje się je jako wzrost średnicy aorty >50%). Istnieją inne niechirurgiczne mysie modele powstawania tętniaków, takie jak mysz z nokautem Apo E, które tworzą solidne tętniaki z infuzją angiotensyny II. Jednak u tych myszy rozwijają się tętniaki aorty nadnerkowej lub piersiowej wstępującej, a nie tętniaki, szczególnie w aorcie piersiowej zstępującej^9,10.

Uzasadnieniem dla tego protokołu jest posiadanie prostego, niedrogiego i odpowiedniego czasowo sposobu na badanie dTAA na mysim modelu. Model mysi daje wyjątkową okazję do wykorzystania wielu genetycznych i specyficznych dla komórek nokautów, które okazały się mieć wpływ na inne choroby naczyniowe. Użycie naszego specyficznego modelu TAA zostało dobrze przyjęte, a eksperymenty z jego wykorzystaniem zostały opublikowane w prestiżowych czasopismach^11,12. Do tej pory model był używany do badania możliwych genetycznych i farmakologicznych metod leczenia, które miały znaczący wpływ na mysie modele tętniaka aorty brzusznej (AAA); jednak w miarę rozszerzania zastosowania modelu dTAA nasze laboratorium znajdujemy cele unikalne dla tworzenia dTAA, które mogą być stosowane jako terapie celowane u ludzi.

Ten model jest najbardziej odpowiedni dla laboratoriów, które mają możliwości mikrochirurgiczne na myszach. Chociaż jest to wyzwanie techniczne, może być wykonywane konsekwentnie nawet przez badaczy bez wcześniejszego doświadczenia chirurgicznego. Dla badacza bez doświadczenia w chirurgii mysiej model można opanować w około 20 sesjach operacyjnych (lub około 50 myszach). Dla badacza z wcześniejszym doświadczeniem chirurgicznym model może zostać opanowany w ciągu 5 sesji operacyjnych (około 20 myszy). Wierzymy, że dzięki wysokiej jakości wideo czas do mistrzostwa może zostać jeszcze bardziej skrócony. Po osiągnięciu biegłości zabieg można zakończyć w ciągu 35 minut w przypadku operacji i 20 minut w przypadku końcowego zbioru. Chirurdzy w naszym laboratorium mogą wykonać 10-12 pełnych operacji dziennie, przy śmiertelności operacyjnej wynoszącej 5-10%. Najczęstszą przyczyną śmiertelności jest uraz płuc po wejściu do klatki piersiowej, toksyczność znieczulająca lub zerwanie aorty podczas rozwarstwienia. Oprócz badań nad dTAA, model ten służy również jako przewodnik po bezpiecznym i łatwym dostępie do aorty piersiowej i wnęki płuc dla naukowców badających inne interwencje w klatce piersiowej.

Protokół

Protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Wirginijskiego (nr 3634).

1. Indukcja znieczulenia i intubacja

1. Umieść samca myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni w zamkniętej komorze z ciągłym przepływem mieszaniny 5% izofluranu i tlenu przez 5 min, aż do widocznego spowolnienia oddechów.
   UWAGA: W zależności od protokołu eksperymentalnego można zastosować różne szczepy, płcie i wiek myszy. Samice mogą być trudniejsze do intubacji ze względu na mniejszy rozmiar i w konsekwencji węższe drogi oddechowe.
2. Przeprowadź intubację myszy zgodnie z opisem Vandivorta i wsp.¹³.
   UWAGA: Etap intubacji jest najtrudniejszą częścią tego modelu, zarówno pod kątem nauki, jak i wykonania. Powyżsi autorzy w swoim materiale wideo w doskonały sposób wyjaśniają poszczególne kroki.

2. Mocowanie myszy do stołu operacyjnego

1. Podłącz rurkę endotrachealną (ET), potwierdź unoszenie się klatki piersiowej i ułóż mysz w pozycji bocznej prawej. Ustaw stężenie izofluranu na około 3% i nałóż środek nawilżający do obu oczu. Respirator powinien być ustawiony tak, aby zapewnić około 200 oddechów na minutę oraz objętość tidalną 225 µL.
   UWAGA: Toksyczność pojawia się szybko, jeśli stężenie izofluranu pozostanie na poziomie 5%. Ponieważ reakcja na izofluran jest zmienna, należy miareczkować przepływ środka anestetycznego w taki sposób, aby spontaniczne skurcze przepony występowały mniej więcej co 10-20 s, a utlenowanie wydawało się odpowiednie po oględzinach błon śluzowych i odsłoniętych tkanek.
2. Przymocuj rurkę ET do podkładki za pomocą taśmy. Wyprostuj prawą przednią kończynę w kierunku rostralnym, tak aby łapa znajdowała się w linii z nosem, i zabezpiecz ją taśmą.
3. Odciągnij ogon w kierunku kaudalnym, aby stworzyć linię napięcia między prawą kończyną a ogonem, co spowoduje wyprostowanie kręgosłupa.
   UWAGA: Zabezpieczenie ogona i prawej łapy w jednej linii zapobiega zbyt głębokiemu wprowadzeniu lub wysunięciu się rurki ET.
4. Przymocuj taśmą lewą tylną kończynę w jej naturalnej pozycji. Odsuń lewą przednią kończynę w kierunku ventralnym na zwiniętą gazę i przymocuj ją taśmą.

3. Przygotowanie do operacji

1. Ogolić lewy bok myszy za pomocą strzygarki elektrycznej, od lewego barku do lewego brzucha.
2. Za pomocą aplikatora z wacikiem nanieść roztwór betadyny na miejsce operacji. Użyć nowego aplikatora z wacikiem, aby nanieść 70% etanol na miejsce operacji. Pozostawić do wyschnięcia. Założyć sterylną obłożkę.
3. OSTRZEŻENIE: Przed kontynuacją należy upewnić się, że cały etanol całkowicie odparował, ponieważ stosowana jest elektrokoagulacja, która może spowodować zapłon etanolu.

4. Wprowadzenie do klatki piersiowej

1. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonać nacięcie boczne o długości 1 cm w połowie klatki piersiowej. Użyć ręcznego elektrokoagulatora do rozdzielenia warstw mięśniowych, aż do momentu odsłonięcia żeber.
2. Bezpośrednio wypalić fragment żebra o szerokości 2 mm.
   UWAGA: Podczas stosowania elektrokoagulacji żebra należy obserwować częstotliwość oddechów spontanicznych. Jeśli u myszy wystąpi skurcz przepony podczas kauteryzacji, końcówka urządzenia może wniknąć do klatki piersiowej i przebić płuco, co w tym modelu zazwyczaj kończy się śmiercią zwierzęcia.
3. Używając zwilżonego, cienkiego aplikatora z bawełnianą końcówką w przestrzeni międzyżebrowej powyżej wypalonego fragmentu, obracać końcówką na tkance, aby przedostać się do jamy opłucnej. Umieścić w klatce piersiowej zwilżoną gąbkę o wymiarach 3 mm x 2 mm, aby wspomóc zapadnięcie się płuca.
   UWAGA: Do kontaktu z płucem należy dopuścić wyłącznie miękkie, wilgotne gąbki, ponieważ organ ten jest niezwykle delikatny.
4. Za pomocą nożyczek przeciąć tkankę wzdłuż górnej krawędzi wypalonego żebra, aż do momentu odsłonięcia przepony.

5. Ekspozycja aorty

1. Umieść rozieracze żeber i użyj ich do otwarcia nacięcia torakotomii. Ostrożnie usuń gąbkę z powierzchni płuca.
2. Umieść zwilżoną gąbkę o wymiarach 6 mm x 4 mm tak, aby pokrywała płuco, a jej końce były skierowane w stronę rostralną i kaudalną. Umieść (szeroki, płaski) rozieracz płuc na gąbce i delikatnie przesuń go brzusznie, aż zostanie odsłonięta zstępująca aorta piersiowa.
3. Użyj pęsety nr 7, aby oddzielić tkankę łączną i tłuszcz od aorty na odcinku około 5 mm.
   UWAGA: W poprzek aorty mogą przebiegać małe żyły; należy unikać ich przerwania podczas preparacji (użycie powiększenia co najmniej 14x może pomóc uniknąć tego powikłania).

6. Ekspozycja na elastazę

1. Nasyć gąbkę o wymiarach 0,5 mm x 1 mm 12 μL elastazy trzustkowej świni i umieść ją na odsłoniętej powierzchni aorty.
   UWAGA: Nie dopuść do tego, aby gąbka dotknęła przeciwległego płuca.
2. Po upływie ustalonego czasu (zazwyczaj 3-5 min) usuń gąbkę z elastazą za pomocą pęsety nr 7. Usuń retraktor płuca. Przepłucz jamę klatki piersiowej 1 mL sterylnej soli fizjologicznej.
   UWAGA: Usuń retraktor płuca przed płukaniem solą fizjologiczną, ponieważ pozwoli to gąbce do płuc nasiąknąć i zmiękczyć, co ułatwi jej usunięcie z powierzchni płuca.
3. Użyj zwiniętej gazy o wymiarach 2" x 2", aby wchłonąć pozostałą sól fizjologiczną z płukania. Zmniejsz stężenie izofluranu do 2%.

7. Zamknięcie klatki piersiowej

1. Usuń gąbkę z płuca. Usuń tylny retraktor płuca. Usuń przedni retraktor płuca.
2. Zastosuj 3 przerzerwane szwy niewchłanialne 6-0 w celu zbliżenia żeber; zawiąż luźny węzeł na każdym z nich, ale nie zaciśnij go. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie dotknąć płuca igłą chirurgiczną.
3. Ponownie napowietrz płuco, zamykając rurkę odpływową w respiratorze lub szybko wtłaczając 0,5-1,0 mL powietrza przez rurkę endotrachealną (ET) za pomocą kurka trójdrożnego.
   UWAGA: Aby uniknąć urazu ciśnieniowego (barotraumy), unikaj nadmiernego używania strzykawki z powietrzem i nie wstrzykuj więcej niż 1,0 mL powietrza.
4. Zaciśnij szwy niewchłanialne. Zbliż warstwy mięśniowe, stosując ciągły szew wieloniciowy wchłanialny 5-0. Zmniejsz stężenie izofluranu do 1%.
5. Zamknij skórę, stosując 7-10 przerwanych szwów niewchłanialnych 5-0. Wyłącz podawanie izofluranu (0%).

8. Regeneracja

1. Podaj podskórnie 6 µg (0,02 mL zawiesiny o stężeniu 0,3 mg/mL) buprenorfiny. Usuń taśmę z prawej łapy, ogona i lewej przedniej łapy, a następnie z prawej przedniej łapy.
2. Gdy mysz zacznie poruszać kończynami, przeprowadź ekstubację, delikatnie pociągając za ogon, aby wysunęła się rurka intubacyjna (ET). Umieść zwierzę w pozycji grzbietnej w komorze grzewczej o wysokiej zawartości tlenu.
   UWAGA: Myszy można bezpiecznie przenieść z komory tlenowej do klatki, gdy będą w stanie samodzielnie obrócić się do normalnej pozycji stojącej. Ponadto w ciągu pierwszych 24–48 godzin po operacji należy często monitorować myszy pod kątem objawów bólu, stresu lub braku przyrostu masy ciała i w razie potrzeby podawać dodatkowe leki przeciwbólowe lub miękką karmę.

9. Odsłonięcie tętniaka aorty (procedura końcowego pobrania organów)

UWAGA: Zasadniczo pobieranie tkanek przeprowadza się w 14. dniu, ponieważ jest to okres maksymalnego rozszerzenia. Jednak w zależności od eksperymentu, procedurę pobierania można przeprowadzić w dowolnym czasie między 3. dniem a ponad 4. tygodniem.

1. Przeprowadź intubację i unieruchom mysz w polu operacyjnym zgodnie z powyższym opisem (sekcje 1-3). Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej od lewego boku do centralnej części brzucha, uważając, aby nie przebić otrzewnej.
2. Nacinaj skórę od grzbietowej części lewego boku w kierunku rostralnym do poziomu lewego barku. Następnie wykonaj nacięcie pod kątem 90° przez pachę do mostka.
   UWAGA: Nacięcie to powinno całkowicie otaczać pierwotne nacięcie skóry.
3. Za pomocą kauteryzatora odpreparuj płat skóry w kierunku brzusznej strony myszy, odsłaniając lewą połowę klatki piersiowej. Użyj nożyczek, aby dostać się do jamy brzusznej i naciąć wzdłuż lewego brzegu żebrowego od strony brzusznej do grzbietowej, aby odsłonić dolną powierzchnię lewej przepony. Może dojść do otwarcia najbardziej bocznej krawędzi przepony, co jest pożądanym efektem.
4. Jeśli nie stało się to w poprzednim kroku, nacinaj przeponę na jej najbardziej bocznej krawędzi. Umieść końcówkę kauteryzatora w tym otworze i wypal przeponę od brzegu żebrowego do wyrostka mieczowatego. Używając wilgotnego aplikatora z bawełnianą końcówką o cienkim czubku, delikatnie uwolnij płuco z zrostów ze ścianą klatki piersiowej i przesuń je w kierunku przyśrodkowym.
   UWAGA: Jeśli zrosty nie oddzielają się łatwo od ściany klatki piersiowej, użyj kauteryzatora do ich usunięcia; pomaga to uniknąć przerwania tkanki płucnej, co może spowodować silne krwawienie.
5. Wypal wnętrze ściany klatki piersiowej od pierwszego żebra do brzegu żebrowego, grzbietowo od linii środkowej pachowej, zachowując odległość co najmniej 2 mm od aorty. Przetnij ścianę klatki piersiowej wzdłuż linii kauteryzacji.
   UWAGA: Technika ta pozwala uniknąć krwawienia z tętnic międzyżebrowych.
6. Przetnij wzdłuż górnej krawędzi pierwszego żebra, a następnie w kierunku ogonowym wzdłuż bocznej krawędzi mostka, usuwając lewą część klatki piersiowej. Umieść rozszerzacze na płucach i odciągnij je przyśrodkowo. Umieść rozszerzacz na przeponie i odciągnij go w kierunku ogonowym, aby odsłonić jak największy odcinek aorty.
7. Użyj suchego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby usunąć zrosty z tętniaka aorty i nieobjętego zmianami odcinka dystalnego. Zmierzy średnicę nieobjętego zmianami odcinka kontrolnego oraz najszerszą część tętniaka leczonego elastazą, korzystając z mikrometrii wideo.
   UWAGA: Pomiary z mikrometrii wideo służą do obliczenia procentowego poszerzenia odcinka tętniakowego w stosunku do odcinka kontrolnego za pomocą równania 1. Wybierany jest odcinek kontrolny znajdujący się 0,5 mm dystalnie od odcinka tętniakowego 1.
   
                Równanie 1
    
8. Chwyć aortę kleszczykami Harmsa, tuż dystalnie od leczonego odcinka. Użyj nożyczek, aby przeciąć aortę dystalnie od kleszczyków, a następnie odpreparuj aortę od kręgosłupa. Przetnij aortę proksymalnie od leczonego odcinka i usuń aortę z tętniakiem.
9. Używając strzykawki tuberkulinowej z igłą, wypłucz światło aorty solą fizjologiczną i przetwórz tkankę zgodnie z potrzebami.

Wyniki

Zastosowanie naszego protokołu prowadzi do powstania wyraźnych dTAA u myszy w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą sól fizjologiczną. Rozwinięte TAA mają kształt wrzecionowaty i występują wyłącznie w leczonym odcinku aorty (Rysunek 1 oraz Rysunek 2)¹¹. Rysunek 2 przedstawia przykład pomiaru mikrometrycznego wideo podczas pobierania tkanek. Korzystając z równania 1, rozszerzenie aorty w tym przykładzie wyn...

Dyskusja

Aorta piersiowa i brzuszna są komórkowo i embriologicznie różne, co ma znaczenie dla choroby tętniaka 14,15,16. Dlatego potrzebny jest specjalny model zwierzęcy do badania TAA. Chociaż inne mysie modele dTAA zostały opublikowane⁸, nasz model jest jedynym, który tworzy zstępujące poszerzenie aorty piersiowej, które można uznać za naprawdę tętniakowe (ponad 50% rozwarcia). Co więcej, nasz model jest stosunk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Angiocewnik (22G)
pęsety Dumont z rurką ET; Wzór #7 x2	Roboz	RS-4982
Kleszcze do tkanek Graefe	Roboz	RS-5158
Kleszcze Harms x2	Roboz	RS-5097
Uchwyt igły wewnątrzsercowe; Ekstra delikatny; Szczęki z węglików spiekanych; Źródło	Roboz	RS-7800
KL 1500 Leica		150-400
Mikroskop dyskcyjny M205A	Leica	CH 94-35
11 cm, Świat z węglika wolframu	Precyzyjne instrumenty	500216-G
Metalowa tablica			Używaj z zestawem zwijacza myszy
Zestaw zwijaczy myszy	Kent	SURGI-5001	Potrzebujesz 2 krótkich i 1 wysokiego stabilizatora
Wentylator myszy MiniVent Typ 845, 115 V, Zasilacz ze złączem US	Harvard Apparatus	73-0043	Wentylator MiniVent dla myszy (model 845), pojedyncze zwierzę, z kontrolowaną objętością
Sigma Aldrich	Elastase z trzustki świni	E0258-50MG	Można kupić w butelkach o różnych rozmiarach
Małe naczynie Zestaw kauteryzacyjny	Fine Science Tools	18000-00	Zaleca się używanie akumulatorów AA
Nożyczki sprężynowe, 10,5 cm	World Precision Instruments	14127
Sterylne waciki (gąbki)	Sugi	31603	Można przyciąć na wymiar
Platforma chirurgiczna Surgi Suite	Kent		Przymocuj do tablicy klipsów
Tech IV Isoflurane Vap	Jorgensen  Laboratoria	J0561A	Waporyzator anestezjologiczny

Używany do światła LED KL 1500 Nożyczki do irysa , z klipsem