Artykuł metodologiczny

Mikrofragmentacja ludzkiej tkanki tłuszczowej do fenotypowania komórek i charakterystyki sekretomu

DOI:

10.3791/60117

⸱

20 października 2019

 ,  ,  ,  , 
1MRC Center for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2Dept. of Morphology, Surgery and Experimental Medicine, Section of General Pathology, University of Ferrara, 3Italian Image Institute, 4Orthopaedic Hospital Research Center and Broad Stem Cell Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy mikrofragmentację ludzkiej tkanki tłuszczowej bez enzymów przy użyciu urządzenia systemu zamkniętego. Ta nowa metoda pozwala na uzyskanie submilimetrowych skupisk tkanki tłuszczowej nadających się do przeszczepu in vivo, hodowli in vitro oraz dalszej izolacji i charakterystyki komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatniej dekadzie, przeszczepy tkanki tłuszczowej były szeroko stosowane w chirurgii plastycznej i ortopedii w celu zwiększenia uzupełniania i/lub regeneracji tkanek. W związku z tym techniki pozyskiwania i przetwarzania ludzkiej tkanki tłuszczowej rozwinęły się w celu szybkiego i skutecznego pozyskiwania dużych ilości tkanki. Wśród nich technologia systemu zamkniętego stanowi innowacyjny i łatwy w użyciu system do pobierania, przetwarzania i ponownego wstrzykiwania rafinowanej tkanki tłuszczowej w krótkim czasie i przy tej samej interwencji (śródoperacyjnej). Tkanka tłuszczowa jest pobierana metodą liposukcji, myta, emulgowana, płukana i mielona mechanicznie na skupiska komórek o wielkości od 0,3 do 0,8 mm. Autologiczny przeszczep mechanicznie rozdrobnionej tkanki tłuszczowej wykazał niezwykłą skuteczność w różnych wskazaniach terapeutycznych, takich jak medycyna estetyczna i chirurgia, chirurgia ortopedyczna i ogólna. Charakterystyka mikrofragmentacji tkanki tłuszczowej ujawniła obecność nienaruszonych małych naczyń w skupiskach adipocytów; W związku z tym nisza okołonaczyniowa pozostaje niezakłócona. Klastry te są wzbogacone w komórki okołonaczyniowe (tj. przodków mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC)), a analiza in vitro wykazała zwiększone uwalnianie czynników wzrostu i cytokin zaangażowanych w naprawę i regenerację tkanek w porównaniu z MSCs pochodzenia enzymatycznego. Sugeruje to, że wyższy potencjał terapeutyczny mikrofragmentacji tkanki tłuszczowej tłumaczy się wyższą częstotliwością przypuszczalnych MSCs i zwiększoną aktywnością wydzielniczą. Nie wiadomo, czy te dodane perycyty bezpośrednio przyczyniają się do wyższej produkcji czynnika wzrostu i cytokin. Ta klinicznie zatwierdzona procedura pozwala na przeszczepienie przypuszczalnych MSCs bez konieczności ekspansji i/lub leczenia enzymatycznego, omijając w ten sposób wymagania wytycznych GMP i zmniejszając koszty terapii opartych na komórkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka tłuszczowa, od dawna stosowana jako wypełniacz w chirurgii rekonstrukcyjnej i kosmetycznej, ostatnio stała się bardziej popularna w medycynie regeneracyjnej, kiedyś uznawana za źródło mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC)1. Lipoaspiraty zdysocjowane enzymatycznie do zawiesin jednokomórkowych dają wolną od adipocytów frakcję naczyniową zrębu (SVF), która jest stosowana w niezmienionej postaci u pacjenta lub, częściej, jest hodowana przez kilka tygodni w MSCs2.

Jednak dysocjacja enzymów rozrywa mikrośrodowiska tkanek, izolując sąsiednie komórki regulatorowe od przypuszczalnych komórek regeneracyjnych, które stają się znacznie zmodyfikowane przez hodowlę in vitro. Aby uniknąć takich eksperymentalnych artefaktów i wynikających z nich zmian funkcjonalnych, podjęto próby przetworzenia tkanki tłuszczowej do użytku terapeutycznego, zachowując jej natywną konfigurację tak nienaruszoną, jak to tylko możliwe3,4. Warto zauważyć, że mechaniczne rozerwanie tkanek zaczęło zastępować dysocjację enzymatyczną. W tym celu mikrofragmenty zamkniętego systemu w pełnym zanurzeniu lipoaspirują do submilimetrowych, wolnych od krwi i oleju klastrów tkanek (np. Lipogems) poprzez sekwencję filtracji sitowej i zakłócenia wywołane marmurem stalowym3. Autologiczny przeszczep mikrofragmentacji tkanki tłuszczowej, przy użyciu tej technologii systemu zamkniętego, odniósł sukces w wielu wskazaniach, obejmujących kosmetykę, ortopedię, proktologię i ginekologię4,5,6,7,8,9,10,11,12,13.

Porównanie ludzkiej mikrofragmentacji tkanki tłuszczowej (MAT) uzyskanej za pomocą urządzenia systemu zamkniętego i izogenicznego SVF wykazało, że w odniesieniu do rozmieszczenia komórek naczyniowych/zrębowych i aktywności wydzielniczej w hodowli, MAT zawiera więcej perycytów, które są przypuszczalnymi MSCs14, i wydzielają większe ilości czynników wzrostu i cytokin15.

Niniejszy artykuł ilustruje bezenzymatyczną mikrofragmentację ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej za pomocą urządzenia systemu zamkniętego oraz dalsze przetwarzanie takiej mikronizowanej tkanki tłuszczowej do hodowli in vitro, immunohistochemii i analizy FACS, w celu identyfikacji obecnych typów komórek i wydzielanych czynników rozpuszczalnych (Rysunek 1). Opisana metoda w bezpieczny sposób generuje submilimetrowe organoidy pochodzące z tkanki tłuszczowej zawierające żywotne populacje komórek tkanki tłuszczowej w nienaruszonej niszy, nadające się do dalszych zastosowań i badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etyczne zatwierdzenie dla wykorzystania tkanek ludzkich w tym badaniu zostało uzyskane od Komitetu Etyki Badań Naukowych Południowo-Wschodniej Szkocji (nr referencyjny: 16/SS/0103).

1. Podskórne pobieranie tkanki tłuszczowej w jamie brzusznej

UWAGA: Wszystkie instrumenty używane w procedurze ręcznej lipoaspiracji są dostarczane przez producenta urządzenia do mikrofragmentacji.

  1. Utrzymuj sterylność wszystkich płynów, pojemników, instrumentów i obszaru operacyjnego przez cały czas trwania eksperymentu.
  2. Umieść próbkę abdominoplastyki (pobraną przez zespół chirurgiczny w sterylnej torbie bez żadnego roztworu) na wierzchu tkaniny chirurgicznej ze skórą skierowaną do góry. Nie jest wymagane pranie. W celu optymalnego wykorzystania należy utrzymać próbkę w temperaturze 4 °C i przetworzyć próbkę tkanki tłuszczowej w ciągu 16 godzin od pobrania.
  3. Wstrzyknąć od 50 do 100 ml 0,9% roztworu NaCl o temperaturze 37 °C, w zależności od wielkości próbki tkanki (użyć 50 ml na maksymalnie 15cm2 powierzchni tkanki tłuszczowej i odpowiednio zwiększyć objętość), używając jednorazowej kaniuli do infiltracji tkanek, do podskórnej tkanki tłuszczowej. Trzymaj próbkę za część skórną.
  4. Podłącz strzykawkę Luer lock o pojemności 10 ml do jednorazowej kaniuli do liposukcji.
  5. Ostrożnie wprowadź kaniulę do wnętrza tkanki tłuszczowej od krawędzi. Po wejściu do środka należy wytworzyć podciśnienie wewnątrz strzykawki, pociągając za tłok. Trzymaj tłok ręcznie w odpowiedniej pozycji, aby zabezpieczyć ssanie podciśnienia.
  6. Wykonuj ruchy promieniste wewnątrz próbki tkanki tłuszczowej, aż strzykawka będzie pełna lipoaaspiratu. Ostrożnie wyjmij kaniulę z tkanki i odłącz strzykawkę. Podłączyć nową, pustą strzykawkę.
  7. Powtarzaj procedurę, aż zostanie pobranych 60 ml lipoaspiratu.
    nuta: Maksymalna ilość lipoaspiratu, która może być przetworzona, zmienia się w zależności od rodzaju używanego urządzenia. Proszę zapoznać się z instrukcją producenta (tabela materiałów).

2. Mikrofragmentacja lipoaspiratu

UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony wyłącznie do celów badawczych. Mikrofragmentacja odbywa się za pomocą dostępnego na rynku urządzenia (Tabela Materiałów).

  1. Wyjmij urządzenie z opakowania i sprawdź, czy jednostka główna jest podłączona do worka na odpady. Umieść worek na odpady na ziemi i upewnij się, że zawory są przymocowane do zaślepek jednostki procesowej.
  2. Podłącz kolec zaciskowy przewodu wejściowego do worka z solą fizjologiczną, przebijając port przyłączeniowy worka. Trzymaj worek z solą fizjologiczną wyżej niż jednostka przetwarzająca.
    nuta: Dla typu urządzenia używanego w tym protokole zalecany jest worek sterylnego soli fizjologicznej o pojemności 2 000 ml.
  3. Sprawdź, czy wszystkie 5 clamps podłączonych do rurek obwodów są otwarte. Ustaw jednostkę przetwarzającą w pozycji pionowej szarą nasadką do góry.
  4. Pozwól, aby roztwór soli fizjologicznej wypełnił jednostkę przetwarzania. Sprawdź, czy przepływ dociera do worka na odpady. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza z jednostki przetwarzającej, potrząsając nią.
    nuta: Wszystkie poniższe przejścia muszą być wykonywane przy braku powietrza w jednostce przetwarzającej.
  5. Umieść jednostkę przetwarzającą w pozycji pionowej z niebieską nasadką do góry i zamknij zacisk obok linii wejściowej.
  6. Wstrzykiwanie lipoaspiratu należy rozpocząć od podłączenia strzykawki do samozamykającego się zaworu niebieskiej nasadki wejściowej. Podczas tej procedury utrzymuj jednostkę roboczą pionowo i powoli pociągaj tłok strzykawki, aż cały lipoaspirat zostanie przeniesiony do urządzenia. Powtarzaj proces, aż cały lipoaspirat znajdzie się w jednostce przetwarzającej.
    UWAGA: W przypadku jednostki przetwarzającej użytej w filmie dodaj jednocześnie maksymalnie 30 ml lipoaspiratu. Zabieg można wykonać maksymalnie dwukrotnie, aż do przetworzenia 60 ml lipoaspiratu.
  7. Otwórz wejście clamp, aby przywrócić przepływ soli fizjologicznej.
  8. Energicznie potrząsaj jednostką przetwarzającą przez co najmniej 2 minuty, regularnie sprawdzając przepływ roztworu soli fizjologicznej do worka na odpady.
  9. Gdy roztwór soli fizjologicznej w jednostce przetwarzającej stanie się przezroczysty, po około 2 minutach wstrząsania umieść urządzenie szarą nasadką do góry i zamknij zacisk znajdujący się na odpływie w pobliżu szarej nasadki. Przetworzona tkanka będzie unosić się na górze.
  10. Napełnij strzykawkę Luer lock o pojemności 10 ml roztworem soli fizjologicznej i podłącz ją do zaworu ładującego niebieskiej nasadki. Zamknij zacisk znajdujący się w pobliżu niebieskiej nasadki. Podłączyć pustą strzykawkę o pojemności 10 ml typu Luer lock z całkowicie włożonym tłokiem do zaworu szarej nasadki.
    nuta: Używać wyłącznie strzykawek typu Luer Lock.
  11. Mocno wstrzyknij sól fizjologiczną do jednostki przetwórczej z niebieskiej nasadki. Upewnij się, że strzykawka podłączona do szarego zaworu jest konsekwentnie napełniana przetworzoną tkanką. Po wstrzyknięciu całej soli fizjologicznej ostrożnie wyjąć obie strzykawki.
  12. Powtarzać kroki 2.10 i 2.11, aż cała przetworzona tkanka zostanie pobrana.
    nuta: Średnia wydajność MAT wynosi 30 ml z 60 ml manualnego lipoaspiratu. Część tkanki pozostanie wewnątrz jednostki przetwarzającej, a niektóre grudki mogą być obecne przyczepione do niebieskiej krawędzi wewnątrz jednostki.
  13. Po zakończeniu przetwarzania wyjmij wszystkie strzykawki, zamknij wszystkie zaciski, odłącz worek z solą fizjologiczną i zutylizuj urządzenie zgodnie z lokalnymi protokołami.
    nuta: Urządzenie przetwarzające nie może być ponownie użyte.

3. Immunohistochemia fluorescencji

  1. Przenieś 300-500 μl MAT do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 ml 4% buforowanego paraformaldehydu (PFA), delikatnie wymieszać ręcznie (bez wirowania) i pozostawić w temperaturze 4 °C na noc (od 16 do 24 godzin).
  2. Zebrać próbkę i przenieść do czystej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml PBS. Powtórz ten krok dwukrotnie, aby usunąć nadmiar PFA.
  3. Przenieść próbkę w 15% (w/v) sacharozie w roztworze PBS i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc (od 16 do 24 godzin)
  4. Przenieść próbkę do studzienki na płytce 24-dołkowej i dodać roztwór do zatapiania sporządzony z 15% sacharozy i 7% żelatyny (w/v) w PBS. Napełnij studnię do połowy. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  5. Przenieść próbki do temperatury 4 °C. Po 2-4 godzinach, aby żelatyna stężała, napełnić studzienkę roztworem do zatapiania i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
  6. Usunąć próbki ze studzienek. Usuń nadmiar masy do zatapiania i zamroź na suchym lodzie. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Ciąć odcinki o grubości 8-10 μm za pomocą kriostatu. W celu optymalnego podziału na sekcje należy używać kriostatu w temperaturze -30 °C. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C.
  8. Przed przystąpieniem do immunofluorescencji należy utrwalić skrawki w 4% PFA przez 7 minut. Usunąć PFA i dwukrotnie przemyć letnim PBS (37 °C) w celu usunięcia żelatyny z skrawków.
  9. Zablokuj niespecyficzne wiązanie przeciwciał poprzez inkubację szkiełek z 10% surowicą kozią w PBS (v/v) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w rozcieńczalniku przeciwciała lub 0,2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS (w/v): mysi anty-ludzki NG2 (1:100, zapas 0,5 mg / ml), królik anty-ludzki PDGFRβ (1:100, zapas 0,15 mg / ml).
  11. Usunąć roztwór blokujący i dodać rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    nuta: Od teraz wykonuj wszystkie kroki inkubacji w ciemności.
  12. Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć 3 razy PBS przez 10 minut za każdym razem.
  13. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w rozcieńczalniku przeciwciał lub 0,2% (w/v) BSA w PBS: kozie anty-mysie- 555 (1:300), kozie anty-królicze- 647 (1:300). Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  14. Usunąć przeciwciała drugorzędowe i przemyć trzy razy PBS przez 10 minut za każdym razem.
  15. Jeśli stosuje się lektynę sprzężoną z biotyną, należy użyć zestawu blokującego awidynę/biotynę. Inkubować przez 10 minut z każdym odczynnikiem wyposażonym w dwa przemycia PBS.
  16. Powtórz etap blokowania, inkubując szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 10% kozim surowicą w PBS.
  17. Dodać biotynylowaną lektynę, biotynylowaną lektynę Ulex europaeus (1:200, zapas 2 mg/ml), rozcieńczoną w 0,2% BSA (w/v) w PBS lub rozcieńczalniku przeciwciał. Inkubować 1 h i 30 min w temperaturze pokojowej.
  18. Usuń nadmiar biotynylowanej lektyny i przemyj trzy razy PBS przez 10 minut za każdym razem.
  19. Dodać drugorzędowe przeciwciało sprzężone ze streptawidyną rozcieńczone w 0,2% (w/v) BSA w PBS lub rozcieńczalniku przeciwciała. Inkubować przez 1 godzinę.
  20. Usunąć przeciwciało drugorzędowe i przemyć je trzykrotnie PBS przez 10 minut za każdym razem.
  21. Jądra barwnika przeciwstawnego 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI, 1:500, zapas 5 mg/ml), rozcieńczone w 0,2% BSA (w/v) w PBS, przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  22. Usuń roztwór DAPI i przemyj dwukrotnie PBS, za każdym razem po 10 minut.
  23. Zamontuj szkiełka za pomocą wodnego środka montażowego. Pozostawić do całkowitego wyschnięcia, albo na noc na ławce w ciemności, albo na 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  24. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności i uzyskiwać obrazy pod mikroskopem epifluorescencyjnym.

4. Trawienie mikrofragmentacji tkanki tłuszczowej i izolacja komórek

  1. Mikrofragment tkanki tłuszczowej należy przenieść do sterylnego pojemnika.
  2. Świeżo uzupełnić pożywkę wytrawiającą, rozpuszczając kolagenazę typu II w DMEM w stężeniu 1 mg/ml.
  3. Dodać taką samą objętość pożywki wytrawiającej do mikrorozdrobnionej tkanki tłuszczowej (tj. na 30 ml próbki dodać 30 ml pożywki wytrawiającej).
  4. Umieścić szczelnie zamknięty pojemnik w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i nastawionej na 120 obr./min na 45 minut. Należy pamiętać, że pojemnik powinien umożliwiać prawidłowe wstrząśnięcie próbką. Jeśli duży pojemnik nie jest dostępny, należy użyć dwóch probówek o pojemności 50 ml (w każdej po 30 ml mieszaniny próbki/pożywki wytrawiającej) ustawionych poziomo.
  5. Po inkubacji zablokować trawienie, dodając równą objętość roztworu blokującego (2% (v/v) FCS/PBS) i przefiltrować sekwencyjnie przez sitka do komórek 100 μm i 70 μm.
  6. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę przez 5 minut przy 200 x g. Odrzucić supernatant.
  7. Zawiesić osad w około 5 ml buforu do lizy erytrocytów (155 mM NH4Cl, 170 mM Tris, pH 7,65). Objętość buforu może się różnić w zależności od zanieczyszczenia erytrocytów obserwowanego w osadzie komórkowym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  8. Dodać równą objętość roztworu blokującego i przefiltrować przez sitko o wielkości 40 μm.
  9. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy sile 200 x g i odrzucić supernatant.
  10. Zawiesić osad w roztworze blokującym. Dobrze wymieszać przez pipetowanie. Policz żywotne komórki z wykluczeniem błękitu trypanowego na hemocytometrze.
    1. Wymieszać równą objętość zawiesiny komórek z niebieskim barwnikiem trypanowym. Odessać 10 μl roztworu i umieścić go na hemocytometrze.
    2. Policz liczbę żywych komórek (jasnych i okrągłych) obecnych w co najmniej 5 kwadratach i uzyskaj średnią liczbę komórek. Aby uwzględnić współczynnik rozcieńczenia barwienia, pomnóż średnią liczbę komórek przez 2. Aby uzyskać całkowitą liczbę żywych komórek na 1 ml próbki, pomnóż otrzymaną liczbę przez 104,
      UWAGA: Otrzymana zawiesina jednokomórkowa, a mianowicie frakcja naczyniowa zrębu (SVF), może być albo wysiana w ilości 20 000 komórek/cm2 w pożywce do wzrostu komórek okołonaczyniowych (DMEM uzupełniony 20% inaktywowanym termicznie FCS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy) lub wykorzystana do analizy i sortowania metodą cytometrii przepływowej. Średnia wydajność komórek jądrzastych w SVF wynosi około 3 x 104 komórek na ml MAT. Eksperymenty sortowania wymagają co najmniej 8 x 105 komórek, aby uzyskać wystarczającą ilość komórek okołonaczyniowych do hodowli.

5. Etykietowanie i sortowanie komórek

  1. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 200 x g i ponownie zawiesić osad w podłożu blokującym o stężeniu 1 x 106 komórek na 100 μl.
  2. Podwielokrotność co najmniej 50 000 komórek do kontroli niebarwionej i kontroli fluorescencji minus jeden (FMO) do polistyrenowych probówek do cytometrii przepływu okrągłego dna. Użyj pozostałych komórek do barwienia wielokolorowego, umieszczając je w innej probówce.
    UWAGA: Po ustaleniu ustawień eksperymentu (tj. natężenie lasera, strategia bramkowania), liczba komórek używanych do niebarwionej kontroli i FMO może zostać zmniejszona, jeśli użyte przeciwciała są takie same.
  3. Dodaj przeciwciała CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) i CD146-BV711 (1:100) do zawiesiny jednokomórkowej w celu barwienia wielokolorowego. Dla regulatorów FMO należy dodać: dla równoważnych objętości FMO V450 CD34-PE i CD146-BV711 oraz kontroli izotypu V450; dla objętości równoważnych PE FMO CD31-V450, CD45-V450 i CD146-BV711 oraz kontroli izotypu PE; dla równoważnych objętości FMO BV711 CD31-V450, CD45-V450 i CD34-PE oraz kontroli izotypu BV711.
  4. Delikatnie odpipetować lub powoli przemieszać roztwór w probówce, aby wymieszać i inkubować probówki w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności.
  5. Przygotuj koraliki kontrolne kompensacji. Dodać 15 μl kulek dodatnich i 15 μl kulek ujemnych do 70 μl pożywki blokującej w 3 probówkach do cytometrii przepływowej z polistyrenu okrągłodennego. Dodaj przeciwciała CD34-PE, CD31-V450 lub CD45-V450 i CD146-BV711, po jednym na probówkę.
  6. Delikatnie pipetować lub powoli wirować, aby wymieszać przeciwciała z kulkami i inkubować wszystkie probówki w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności.
    UWAGA: Opisana procedura może być stosowana zarówno do analizy metodą cytometrii przepływowej, jak i do sortowania komórek.
  7. Przygotować probówki zbiorcze, wstępnie zwilżając wewnętrzną powierzchnię probówek pożywką do wzrostu śródbłonka (EGM), pozostawiając około 50 μl pożywki na dnie każdej probówki.
  8. Po inkubacji przeciwciał usuń nadmiar przeciwciała, przemywając komórki i kulki 2 ml pożywki blokującej.
  9. Usunąć roztwór, odwirowując probówki o stężeniu 200 x g przez 5 minut i ostrożnie zasysając supernatant. Powtórz etap mycia.
  10. Zawiesić komórki w podłożu blokującym w końcowym stężeniu 1 x 106 komórek na 250 μl. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl podłoża blokującego.
  11. Przenieś komórki do nowych polistyrenowych probówek do cytometrii przepływowej okrągłodennej z nasadką sitka komórkowego. Pozwoli to na przerwanie grudek komórek.
  12. Transportuj wszystkie zawiesiny komórek i kulek do sortownika komórek na lodzie w ciemności.
  13. Uruchom niezabarwione komórki kontrolne, aby ustalić fluorescencję tła i ustawić napięcia.
  14. Uruchom rurki sterujące kompensacją, aby ustawić kompensację fluorescencji.
  15. Użyj obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) i obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A), aby zidentyfikować komórki, a następnie użyj obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) i wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H), aby wybrać pojedyncze komórki.
  16. Dodaj DAPI, 1 μl roztworu 5 μg/ml na każdy ml próbki, do niebarwionej kontroli, aby ustawić bramkowanie dla martwych komórek (Rysunek 2). Po barwieniu DAPI nie jest wymagane mycie.
  17. Uruchom kontrolki izotypu, aby ustalić progi fluorescencji tła związane z niespecyficznym wiązaniem i ustawić bramkowanie.
  18. Uruchom wielokolorową próbkę. Wyklucz komórki krwiotwórcze i śródbłonka przez bramkowanie na komórkach ujemnych CD31 i CD45. Zbierz populacje perycytów (CD146+, CD34-) i komórek przybyszowych (CD146-CD34+) do probówek zbiorczych (Rycina 2).
    UWAGA: Optymalna wydajność żywotnych komórek wynosi około 2% całkowitej dysocjacji żywych komórek w przypadku perycytów i 1,5% w przypadku komórek przybyszowych.

6. Hodowla komórkowa

  1. Wysiewać świeżo posortowane perycyty i komórki przybyszowe o gęstości od 30 000 do 40 000 komórek/cm2 na płytkach hodowlanych pokrytych żelatyną
  2. Aby pokryć płytki hodowlane, należy pokryć powierzchnię płytki sterylną 0,2% (m/v) żelatyną w roztworze PBS (około 100 μl roztworu nacm2). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut i usunąć roztwór. Świeżo posortowane komórki należy przechowywać na lodzie podczas powlekania płytki hodowlanej.
  3. Świeżo pobrane komórki należy odwirować w ilości 200 x g przez 5 minut i delikatnie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości pożywki do pomiaru śródbłonka (EGM). Jeśli liczba pobranych komórek jest bardzo niska, należy unikać wirowania i bezpośrednio podawać zebrane komórki na płytkę.
  4. Wysiewaj komórki na płytkach pokrytych żelatyną. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  5. Gdy komórki osiądą i przylgną do płytki (po co najmniej 72 godzinach), wymień EGM na okołonaczyniową pożywkę do wzrostu komórek (DMEM uzupełnioną 20% inaktywowanym termicznie FCS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy) zarówno dla perycytów, jak i komórek przybyszowych.
  6. Gdy perycyty i komórki przybyszowe osiągną 80%-90% konfluencji, zdysocjuj komórki za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA. Zebrać z 5% FCS/PBS, odwirować przy 200 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić w pożywce do wzrostu komórek okołonaczyniowych, a następnie przejść komórki w stosunku 1:3 do 1:5 (lub w około 7 000 komórek/cm2) na niepowlekane płytki lub kolby polistyrenowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechaniczna dysocjacja ręcznych lipoaspiratów doprowadziła do wytworzenia mikrofragmentacji tkanki tłuszczowej (MAT), składającej się z agregatu adipocytów otaczających sieć mikronaczyniową (Rysunek 3). Analiza immunofluorescencyjna MAT zatopionego w żelatynie i kriofiksowanego podkreśla tę strukturę, pokazując sieć naczyniową oznaczoną przez marker komórek śródbłonka receptor aglutyniny 1 Ulex europaeus 1 (UEA-1), składającą się głównie z małych, kapilarnych naczyń wł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano fizyczną frakcjonowanie ludzkiej tkanki tłuszczowej za pomocą urządzenia systemu zamkniętego na małe skupiska wykazujące prawidłową mikroanatomię tkanki tłuszczowej.

Ręcznie odsysana ludzka podskórna tkanka tłuszczowa i roztwór soli fizjologicznej są ładowane do przezroczystego plastikowego cylindra zawierającego duże metalowe kule w stylu pinballa, które po energicznym ręcznym potrząśnięciu urządzeniem rozbijają tłuszcz na submilimetrowe fragmenty. Dołączone filtry i wylot ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CT jest założycielem Lipogems.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Claire Cryer i Fionie Rossi z Uniwersytetu w Edynburgu za ich fachową pomoc w zakresie cytometrii przepływowej. Pragniemy również podziękować personelowi szpitala w Murrayfield, który przyczynił się do przekazania próbek tkanek.

Ta praca była wspierana przez granty od British Heart Foundation i Lipogems, które dostarczyły zestawy do przetwarzania tkanki tłuszczowej. Próbki tkanek ludzkich dorosłych zostały pobrane za pełną zgodą etyczną Komitetu ds. Etyki Badań Naukowych w Południowo-Wschodniej Szkocji (numer referencyjny: 16/SS/0103).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% Buforowany paraformaldehyd (PFA)VWR chemikalia9317.901
0,9% roztwór NaClBaxter3KB7127
AlexaFluor 555 kozia anty-mysia IgG Life TechnologiesA21422
AlexaFluor 647 kozia anty-królicza IgGLife Technologies  A21245
Chemikalia rybnez chlorkiem amonu1158868
Antigent DiluentLife Technologies3218
Kompensacja przeciwciał przeciw myszym Ig, &kappa/kontroli negatywnej (BSA) PlusBD Biosciences560497
Zestaw blokujący awidynę/biotynęLife Technologies4303
BD LSR Fortessa 5-laserowy cytometr przepływowy& nbsp;BD BiosciencesLaser 405 nm (fioletowy)/375 nm (UV) & ndash; filtr V450/50 dla przeciwciał DAPI i V450; Laser 561nm (żółto-zielony) – filtr YG582/15 dla przeciwciał PE; Laser 405 nm (fioletowy) / 375 nm (UV) – filtr V710/50 dla przeciwciał BV711 
Biotynylowana lektyna Ulex europaeusVector LaboratoriesVector-B1065
BV711 Mysz IgG1, k Kontrola izotypuBD Biosciences563044
CD146-BV711BD Biosciences563186
CD31-V450BD Biosciences561653
CD34-PEBD Biosciences555822
CD45-V450BD Biosciences560367
DAPILife TechnologiesD1306stężenie magazynowe: 5 mg / ml
Jednorazowa kaniula do liposukcji (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18)  Kamienie tłuszczowe dostarczane w zestawie chirurgicznym Lipogems
Oprogramowanie Diva 306 (v.6.0)BD Biosciences
DMEM, wysoki poziom glukozy, GlutaMAX bez pirogronianu soduLife Technologies61965026
EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTMLonza CC-3156
Surowica cielęca płodu (FCS)Sigma-AldrichF2442
FlowJo (v.10.0)FlowJo
Fluoromount GSouthernBiotech0100-01
GelatinAcros Organics410870025
Lipogems Lipogems LG SK 60
Mysz anty człowiek-NG2BD Biosciences554275stężenie magazynowe: 0,5 mg / ml
PE Mysz IgG1 i kappa; Kontrola izotypuBD Biosciences555749
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD8537
Polistyrenowa probówka okrągłodenna 5 ml z zatrzaskiem sitkowym BD Biosciences352235, 25 sztuk w opakowaniu
Polistyren okrągłodenny probówka 5 mlBD Biosciences352003
Królik anty ludzki - PDGFRbAbcam32570stężenie magazynowe: 0,15 mg/ml
Streptawidyna sprzężona-488Life Technologies  S32354
SacharozaSigma-Aldrich84100-5kg
Kaniula do infiltracji tkanek (17 G x 185 mm-VG 17/18) Kamienie tłuszczowe dostarczane w zestawie chirurgicznym Lipogems
Tris basefisher chemicalsBP152-500
Type- II CollagenaseGibco17101-015
V450 Mouse IgG1 i kappa; Kontrola izotypuBD Biosciences560373
Szerokokątny obserwator ZeissZeissZastosowany obiektyw: Źródło światła LED Plan-Apo 20x/0,8
Zeiss Colibri7 (diody LED: 385, 475, 555, 590, 630 nm)ZeissDAPI: UV, wzbudzenie 385 nm; 488: Niebieski, wzbudzenie 475 nm;   555: Zielony, wzbudzenie 555 nm;   647:Czerwony, wzbudzenie 630 nm 
Zestaw chirurgiczny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
  2. Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
  3. Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
  4. Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
  5. Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
  6. Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
  7. Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
  8. Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
  9. Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
  10. Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
  11. Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
  12. Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
  13. Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
  15. Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
  16. Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
  17. Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

dysocjacja mechanicznanisza peryvaskularnamezenchymalne kom rki macierzysteanaliza cytometrycznabarwienie immunofluorescencyjneprotok izolacji kom rek

Powiązane artykuły