Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

DOI:

10.3791/60135

⸱

17 stycznia 2020

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy i sprawdzamy metodę konsekwentnego generowania silnych ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych i charakteryzujemy ich funkcję. Techniki te mogą pomóc w opracowaniu mechanistycznego wglądu w szlaki sygnałowe, zapewnić platformę do badań przesiewowych leków na dużą skalę i niezawodnie modelować choroby serca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (iPSC-CMs) stanowią cenne źródło dla ludzi do studiowania podstawowej nauki o szlakach obchodzenia się z wapniem (Ca2+) i szlakach sygnałowych, a także wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i testach toksyczności. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy opis metodologii stosowanych do generowania wysokiej jakości iPSC-CM, które mogą konsekwentnie odtwarzać cechy molekularne i funkcjonalne w różnych liniach komórkowych. Dodatkowo opisano metodę pozwalającą na wiarygodną ocenę ich charakterystyki funkcjonalnej poprzez ocenę właściwości manipulacyjnychCa2+. Warunki niskiego poziomu tlenu (O2), selekcja mleczanu i wydłużony czas w hodowli wytwarzają kardiomiocyty podobne do komór o wysokiej czystości i wysokiej jakości. Podobnie jak izolowane kardiomiocyty dorosłych szczurów (ARCM), 3-miesięczne iPSC-CM wykazują wyższą amplitudę Ca2 +, szybsze tempo wychwytu zwrotnego Ca2 + (decay-tau) i dodatnią odpowiedź lusytropową na stymulację β-adrenergiczną w porównaniu z iPSC-CM 30 dnia. Strategia jest technicznie prosta, opłacalna i powtarzalna. Stanowi solidną platformę do modelowania chorób serca i badań przesiewowych leków na dużą skalę w celu zwalczania białek Ca2+.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (iPSC-CMs) są atrakcyjną platformą opartą na ludziach do modelowania wielu różnych chorób serca in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. Co więcej, iPSC-CM mogą być wykorzystywane do przewidywania reakcji pacjentów na nowe lub istniejące leki, do badań przesiewowych trafionych związków i opracowywania nowych spersonalizowanych leków9,10. Jednak pomimo znacznego postępu, podczas korzystania z iPSC-CMs11 należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń i wyzwań. W związku z tym metody mające na celu poprawę protokołów różnicowania serca, zwiększenie wydajności i dojrzewania iPSC-CMs oraz generowanie określonych podtypów kardiomiocytów (komorowych, przedsionkowych i węzłowych) były intensywnie badane i doprowadziły już do opracowania licznych strategii hodowlanych w celu pokonania tych przeszkód12,13,14,15.

Pomimo solidności tych protokołów, głównym problemem dla stosowania iPSC-CMs jest powtarzalność długich i skomplikowanych procedur w celu uzyskania wysokiej jakości kardiomiocytów, które mogą zapewnić taką samą wydajność i powtarzalne wyniki. Odtwarzalność ma kluczowe znaczenie nie tylko przy porównywaniu linii komórkowych o różnym pochodzeniu genetycznym, ale także przy powtarzaniu porównań komórkowych i molekularnych tej samej linii komórkowej. Zmienność komórek, taka jak różnice w gęstości iPSC między osobami zdrowymi, może wpływać na różnicowanie serca, powodując niską wydajność i niską jakość kardiomiocytów. Komórki te mogą być nadal wykorzystywane do przeprowadzania eksperymentów, które nie wymagają czystej populacji CM (np. podczas wykonywania pomiarów przejściowychCa2+). Rzeczywiście, podczas wykonywania analizy elektrofizjologicznej osoby niebędące CM nie będą bić, ani spontanicznie, ani pod wpływem stymulacji elektrycznej, więc łatwo będzie je wykluczyć z analizy. Jednak ze względu na niską jakość, iPSC-CM mogą wykazywać zmienione cechy elektrofizjologiczne (np. nieregularny stan przejściowyCa2+, niska amplitudaCa2+), które nie wynikają z ich składu genetycznego. Dlatego, szczególnie w przypadku stosowania iPSC-CM do modelowania choroby serca, ważne jest, aby nie mylić wyników CM niskiej jakości z fenotypem choroby. Przed przystąpieniem do badań elektrofizjologicznych wymagane są staranne badania przesiewowe i procesy wykluczania.

Ta metoda obejmuje zoptymalizowane protokoły do generowania kardiomiocytów o wysokiej czystości i jakości oraz do oceny ich funkcji poprzez wykonywanie pomiarów przejściowych Ca2+ za pomocą systemu akwizycji i analizy wapnia i kurczliwości. Technika ta jest prostym, ale skutecznym sposobem na rozróżnienie między preparatami iPSC-CM o wysokiej i niskiej wydajności oraz zapewnia bardziej fizjologicznie istotną charakterystykę ludzkich iPSC-CM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty z użyciem kardiomiocytów dorosłych szczurów w tym badaniu zostały przeprowadzone z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Icahn School of Medicine w Mount Sinai. Kardiomiocyty dorosłego szczura wyizolowano z serc szczurów Sprague Dawley metodą opartą na Langendorffie, jak opisano wcześniej16.

1. Przygotowanie mediów

  1. Przygotuj nośnik hiPSC.
    1. Zrównoważyć suplement i podłoże podstawowe do temperatury pokojowej (RT). Upewnij się, że suplement całkowicie się rozmroził. Wymieszać 400 ml podłoża podstawowego i 100 ml suplementu i przefiltrować za pomocą filtra próżniowego o wielkości 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zrównoważyć do temperatury pokojowej przed użyciem.
  2. Przygotuj RPMI + B27.
    1. Zrównoważyć suplement B27 i podłoże podstawowe (RPMI 1640) do RT. Upewnij się, że suplement całkowicie się rozmroził. Wymieszaj 490 ml podłoża podstawowego i 10 ml suplementu 50x i przefiltruj za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zrównoważyć do temperatury pokojowej przed użyciem.
  3. Przygotuj insulinę RPMI + B27 (-).
    1. Zrównoważyć suplement insuliny B27 (-) i podłoże podstawowe (RPMI 1640) do RT. Upewnij się, że suplement całkowicie się rozmroził. Wymieszaj 490 ml podłoża podstawowego i 10 ml suplementu 50x i przefiltruj za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zrównoważyć do temperatury pokojowej przed użyciem.
  4. Przygotuj pożywkę selekcyjną (RPMI (-) glukoza + B27 + mleczan).
    1. Zrównoważyć suplement witaminy B27 i podłoże podstawowe (RPMI 1640 (-) glukoza) do RT. Upewnij się, że suplement całkowicie się rozmroził. Wymieszaj 490 ml podłoża podstawowego i 10 ml suplementu 50x, dodaj 4 mM mleczanu sodu rozpuszczonego w sterylnej wodzie i przefiltruj za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zrównoważyć do temperatury pokojowej przed użyciem.
  5. Przygotuj RPMI 20.
    1. Zrównoważyć podłoże podstawowe (RPMI 1640) z RT. Wymieszać płodową surowicę bydlęcą (FBS) (20% stężenie końcowe) i RPMI. Przefiltrować za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zrównoważyć do temperatury pokojowej.
  6. Przygotować pożywkę pasażacyjną, dodając związany z Rho, zwinięty inhibitor kinazy białkowej (ROCK) (stężenie końcowe 2 μM) do pożywki hiPSC.
  7. Przygotować pożywkę D0, dodając inhibitor GSK-3, CHIR 99021 do pożywki z insuliną RPMI + B27 (-) (10 μM final).
  8. Przygotować pożywki D3 i D4, mieszając pożywki insulinowe RPMI + B27 (-) z IWR-1 (5 μM final).
    UWAGA: Pożywki D1 i D5 składają się z insuliny RPMI + B27 (-). Media D7 składają się z RPMI + B27.
  9. Przygotować bufor blokujący (2% albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 2% FBS, 0,05% NP-40 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS]): W stożkowej probówce o pojemności 50 ml dodać 1 g BSA, 1 ml FBS, 49 ml PBS i 250 μl NP-40. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.

2. Przygotowanie płytek i szkiełek nakrywkowych z wykorzystaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC)

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki pod wysterylizowanym kapturem do hodowli tkankowej.

  1. Rozmrażać roztwór podstawowy matrycy z kwalifikacją hESC przez noc na lodzie w temperaturze 4 °C. Zapoznaj się z kartą specyfikacji produktu w celu określenia odpowiednich podwielokrotnych objętości, ponieważ mogą się one różnić w zależności od materiału wyjściowego. Przechowywać te podwielokrotności w temperaturze -20 °C w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  2. W celu użycia matrycy do powlekania płytek lub szklanych szkiełek nakrywkowych, należy najpierw rozmrozić podwielokrotność matrycy kwalifikowanej do wytworzenia komórek macierzystych w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  3. Podwielokrotność 24 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco: mieszanina składników odżywczych F-12 (DMEM/F:12) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  4. Wymieszaj zimne podłoże DMEM/F:12 ze szklaną pipetą o pojemności 2 ml w celu schłodzenia powierzchni pipety.
  5. Za pomocą tej samej pipety pobrać około 500−700 μl zimnego DMEM/F:12 i wymieszać z podwielokrotnością matrycy zakwalifikowaną do hESC w samej probówce mikrowirówkowej.
  6. Po prawidłowym wymieszaniu przenieść roztwór do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej zimny DMEM/F:12 i ponownie wymieszać.
  7. W przypadku standardowej płytki 6-dołkowej dodaj 1 ml tej mieszaniny do każdego dołka. Upewnij się, że studnia jest całkowicie zakryta. Pozostawić płytki w temperaturze pokojowej pod kapturem do hodowli tkankowych na co najmniej 30 minut. W razie potrzeby przechowywać w temperaturze 4 °C bezpośrednio po posianiu przez okres do 1 tygodnia i równoważyć do temperatury pokojowej przez 30 minut przed użyciem.
  8. W celu wykorzystania płytek należy odessać matrycę i zastąpić ją odpowiednimi mediami. Zużyć natychmiast.
  9. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w sterylnym środowisku (np. w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych).
  10. Przed powlekaniem przetrzyj każde szkiełko nakrywkowe 70% etanolem. Po wyschnięciu szkiełka nakrywkowego umieść je w studzience sterylnej płytki 6-dołkowej.
  11. Weź 250−300 μl roztworu matrycowego z kwalifikacją hESC i ostrożnie dozuj go bezpośrednio na środek szklanego szkiełka nakrywkowego. Pozostaw szkiełka nakrywkowe w temperaturze RT pod kapturem do hodowli tkankowych na co najmniej 30 minut przed użyciem.

3. Przygotowanie małych cząsteczek

UWAGA: Rozpuść wszystkie małe cząsteczki i modulatory Wnt w DMSO, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Przygotować 10 mM porcji po 25 μl IWR-1 i CHIR 99021 i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Rozpuścić 10 mM podwielokrotności po 50 μl tiazowiwiny (inhibitora ROCK) i przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Konserwacja i przechodzenie iPSC

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki pod sterylnym kapturem do hodowli tkankowej.

  1. Utrzymuj iPSC w standardowych płytkach 6-dołkowych i wykonuj wszystkie kroki w sterylnych warunkach. Utrzymuj komórki z 2 ml pożywki hiPSC na studzienkę. Zmieniaj nośnik co drugi dzień. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C, 6%O2, 5% CO2 . Przejdź komórki, gdy są w 70-80% zlewające się.
  2. Zrównoważyć PBS bez Ca2+ i Mg2+ do RT.
  3. Aby rozpocząć proces pasażowania, dodaj 1 ml PBS bez Ca2+ i Mg2+ do studzienki, która ma zostać przepuszczona. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 7-10 min. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że leczenie PBS nie spowodowało całkowitej dysocjacji monowarstwy.
  4. Usuń PBS i zastąp 1 ml pożywki pasażowej. Użyj podnośnika do komórek, aby delikatnie zeskrobać i podnieść komórki z powierzchni studni.
  5. Mechanicznie zdysocjuj komórki za pomocą sterylnej szklanej pipety o pojemności 2 ml. Powtarzaj, aż komórki zostaną dobrze równomiernie zdysocjowane na małe kolonie, gdy są obserwowane pod mikroskopem.
  6. Gdy komórki zostaną wystarczająco zdysocjowane, dodaj 5 ml pożywki pasażowej, aby podzielić komórki w stosunku 1:6. Dostosuj ilość dodanego nośnika pasażowego, aby dopasować go do preferowanego współczynnika podziału.
  7. Odessać matrycę z kwalifikacją do zakażenia wirusem ESC z płytki pokrytej matrycą zakwalifikowaną do ESC i zastąpić ją 1 ml pożywki pasażującej na dołek. Dodaj 1 ml zdysocjowanych komórek do dołka.

5. Różnicowanie kardiomiocytów

  1. Przed rozpoczęciem różnicowania serca należy stosować linie hiPSC, które są dobrze ugruntowane (ponad 20 pasaży) i wykazują jednorodną morfologię.
  2. Upewnij się, że iPSC są w około 70-80% zlewne.
  3. Umyj komórki 1x w PBS bez Ca2+ i Mg2+.
  4. Dodać 2 ml pożywki D0 (krok 1.7) do dołka i przenieść komórki z powrotem do inkubatora.
  5. Po 24 godzinach zastąp 3 ml pożywki D1 na studzienkę przez 48 godzin.
  6. W 3 dniu zastąp pożywkę 2 ml pożywki D3 na studzienkę. Powtórz z podłożem D4 w 4 dniu.
  7. W 5 dniu zastąp pożywkę 3 ml pożywki D5 na studzienkę.
  8. W dniu 7 zastąp pożywkę 3 ml pożywki D7 na studzienkę i przenieś do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i normalnym stężeniuO2 . Nośnik D7 (RPMI + B27) należy wymieniać co 2 dni.

6. Procedura wyboru i dysocjacja iPSC-CM

  1. Dziesięć dni przed wykonaniem pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ lub jakiejkolwiek analizy funkcjonalnej należy zastąpić pożywkę RPMI + B27 3 ml pożywki selekcyjnej na studzienkę przez 48 godzin.
  2. Zastąp pożywkę 3 ml pożywki selekcyjnej na kolejne 48 godzin.
  3. Wymień pożywkę na 2 ml pożywki RPMI + B27 na studzienkę przez 24 godziny.
  4. Pokryć standardowe płytki 6-dołkowe zgodnie z opisem w sekcji 2.
  5. Dodaj 1 ml sterylnej 0,25% trypsyny z EDTA do każdego dołka. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  6. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl mechanicznie rozdziel komórki, tak aby pojedyncze komórki były widoczne podczas obserwacji pod mikroskopem.
  7. Przenieś komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 2 ml pożywki RPMI 20 do dołka. Wirować przez 5 minut przy 800 x g.
  8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI + B27. Odessać matrycę z kwalifikacją hESC z płytek i zastąpić 1 ml pożywki RPMI + B27.
  9. Używając końcówki do pipety o pojemności 1 000 ml, mechanicznie zdysocjuj osad komórek, aż roztwór stanie się jednorodny.
  10. Przenieś około 500 000 komórek do każdej studzienki. Przeniesienie do inkubatora na 24 godziny.
  11. Zastąp pożywkę 3 ml pożywki selekcyjnej na dołek przez 48 godzin.
  12. Zastąp pożywkę 3 ml RPMI + B27 na dołek. Utrzymuj komórki w pożywce D7 (RPMI + B2 zmieniając pożywkę co 2 dni, aż będą gotowe do analizy funkcjonalnej.

7. Przygotowanie iPSC-CM do cytometrii przepływowej

  1. Gdy komórki osiągną pożądany wiek i zostaną poddane selekcji metabolicznej (sekcja 6), umyj komórki PBS bez Ca2+ i Mg2+.
  2. Dodać 1 ml trypsyny 0,25% na studzienkę i inkubować przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Odpipetować mieszaninę 5−10x końcówką P1000 w celu pojedynczej komórki i przenieść do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml RPMI 20.
  4. Wiruj komórki w temperaturze 600 x g przez 5 minut.
  5. Dodać 100 μl roztworu utrwalającego (4% PFA) do osadu komórkowego. Dodawać roztwór kroplami, ciągłe, delikatne wirowanie, a następnie odstawić na lód na 15 minut.
  6. Dodaj 1,5 ml PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać supernatant.
  7. Dla każdego eksperymentu należy uwzględnić jedną niebarwioną kontrolę na warunek fiksacji/przepuszczalności.
  8. Zawiesić komórki w 500 μl roztworu blokującego (2% FBS/2% BSA w PBS z 0,1% NP-40) na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Nie usuwając roztworu blokującego, dodać przeciwciało pierwszorzędowe MLC2V/MLC2A (5 mg/ml) i inkubować 45 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Przemyć buforem blokującym. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór.
  11. Dodać przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 555/488 (1:750) rozcieńczone w buforze blokującym przez 45 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  12. Dodaj 1,5 ml PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór.
  13. Zawieś komórki w 250−300 μl PBS. Użyj pipety P1000, aby zdezagregować komórki.
  14. Przygotuj probówki z okrągłym dnem z nasadką sitową z nylonowej siatki o grubości 35 μm. Wstępnie zwilż sitko komórkowe 50 μl PBS i umieść probówkę na lodzie.
  15. Przenieść roztwór z rozdrobnionymi komórkami do probówek z okrągłym dnem z nasadkami sitka do komórek. Pozwól, aby roztwór komórkowy spłynął naturalnie lub w razie potrzeby postukaj dnem rurki o płaską powierzchnię, aby zapewnić całkowity drenaż i zebranie komórek do probówki. Pamiętaj, aby jak najszybciej odłożyć rurkę z powrotem na lód.
  16. Przepłucz sitko komórkowe 250 μl PBS, aby odzyskać wszelkie resztki komórek.
  17. Utrzymuj probówki na lodzie i przykryj folią aluminiową do czasu analizy cytometrii przepływowej.

8. Posiewanie kardiomiocytów na szklanych szkiełkach nakrywkowych

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w sterylnym środowisku.

  1. Przygotować szklane szkiełka nakrywkowe zgodnie z opisem w krokach 2.10 i 2.11.
  2. Po wybraniu iPSC-CM i osiągnięciu pożądanego wieku wykonaj kroki 6.5−6.7, aby oddzielić iPSC-CM.
  3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w wystarczającej ilości pożywki RPMI 20, aby uzyskać około 300 000 komórek na 250 μl.
  4. Za pomocą szklanej pipety o pojemności 2 ml mechanicznie zdysocjuj osad komórkowy, aż roztwór stanie się jednorodny.
  5. Odessać matrycę z kwalifikacją hESC ze szkiełek nakrywkowych.
  6. Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl wymieszać i pobrać 250 μl roztworu z probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
  7. Powoli dozować 250 μl roztworu na szklane szkiełka nakrywkowe, zwracając szczególną uwagę, aby dodawać tylko do obszaru, w którym obecna jest powłoka matrycy z kwalifikacją hESC.
  8. Ostrożnie przenieść do inkubatora i pozostawić na noc, uważając, aby nie potrząsnąć ani nie rozprowadzić komórek na szkiełkach nakrywkowych. Następnego ranka delikatnie dodaj 2 ml pożywki D7 (RPMI + B27) do każdego dołka z szkiełkiem nakrywkowym. Wymieniaj nośnik po 24 godzinach, a następnie co 2 dni.

9. Naprawianie komórek

  1. Zapewnić, że odpowiednia ilość PBS z Ca2+ i Mg2+ jest zrównoważona do 4 °C.
  2. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) rozcieńczony w PBS zCa2+ i Mg2+ i wyrównać do 4 °C.
  3. Gdy iPSC-CM osiągną odpowiedni wiek, zostaną poddane selekcji metabolicznej (sekcja 6) i zostaną posiane na szkiełkach nakrywkowych (sekcja 8), przemyj komórki 3x 1 ml zimnego PBS z Ca2+ i Mg2+ na studzienkę.
  4. Dodaj 1 ml zimnego 4% PFA i pozostaw komórki w temperaturze RT pod kapturem na 15 minut.
  5. Umyj komórki zimnym PBS, aby usunąć nadmiar PFA.
  6. Dodać 2 ml PBS z Ca2+ i Mg2+ i przechowywać w temperaturze 4 °C.

10. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Usunąć PBS z komórek stałych i dodać 1 ml buforu blokującego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć bufor blokujący i dodać pierwszorzędowe przeciwciało (5 mg/ml) rozcieńczone w buforze blokującym. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. Myć 3x w PBS z Ca2+ i Mg2+ przez 5 min każdy.
  4. Dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w buforze blokującym 1:1 000.
  5. Przykryj płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Zachowaj folię aluminiową do kolejnych kroków.
  6. Umyć 3x w PBS z Ca2+ i Mg2+ po 5 min.
  7. Dodać wystarczającą ilość roztworu roboczego DAPI, aby całkowicie pokryć komórki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  8. Dokładnie przemyć próbkę PBS z Ca2+ i Mg2+ w celu usunięcia nadmiaru DAPI.
  9. Weź nowe szkiełka podstawowe i dodaj kroplę nośnika montażowego w środku. Użyj zakraplacza, aby równomiernie rozprowadzić nośnik montażowy. Połóż szkiełka nakrywkowe komórkami do dołu na szkiełkach.
    UWAGA: Ogniwa mogą być przechowywane przez 30 dni, jeśli są chronione przed światłem.

11. Ocena wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+

  1. Gdy iPSC-CM osiągną wiek co najmniej 3 miesięcy, zostaną poddane selekcji metabolicznej (sekcja 6) i zostaną posiane na szkiełkach nakrywkowych, należy je poddać działaniu 2 μl Fura-2, AM (stężenie końcowe: 1 μM) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 min.
    UWAGA: Fura-2 jest wrażliwa na światło. Wykonuj wszystkie procedury ładowania i eksperymenty w ciemności.
  2. Przygotuj system akwizycji i analizy wapnia i kurczliwości.
    1. Zasil system, upewniając się, że lampa łukowa jest uruchomiona (Rysunek 1B).
    2. Umieść komorę w systemie i podłącz rurki z pompy do odpowiednich wlotów i wylotów oraz przewód elektryczny od stymulatora do komory, jak pokazano na Rysunek 1C.
    3. Napełnij rurkę perfuzyjną biegnącą przez grzałkę fluidyczną wstępnie podgrzanym roztworem Tyrode'a o temperaturze 37 °C.
    4. Dostosuj wymiary przysłony aparatu i kadrowania, aby zminimalizować obszar tła.
  3. Zamontuj szklane szkiełko nakrywkowe z iPSC-CM w komorze i zamocuj.
  4. Delikatnie dodać 500 μl roztworu Tyrode'a bezpośrednio na przymocowane szklane szkiełko nakrywkowe i rozpocząć perfuzję w komorze (1,5 ml/min) roztworem Tyrode'a.
  5. Stymulacja pola iPSC-CM za pomocą stymulacji pola 1 Hz za pomocą stymulatora elektrycznego (10 V, 4 ms).
  6. Inkubować iPSC-CM w komorze ze stymulacją przez co najmniej 3-5 minut, aby komórki wypłukały barwnik Fura-2 i przystosowały się do środowiska oraz wypłukały barwnik fluorescencyjny.
  7. Dopasuj viewokienko do lewej górnej części szklanego szkiełka nakrywkowego.
  8. Rozpocznij nagrywanie.
  9. Po zebraniu spójnego strumienia 5-10 szczytów kliknij przycisk Wstrzymaj, aby tymczasowo zatrzymać nagrywanie.
  10. Upewnij się, że ani ostrość, ani wymiary viewokienko nie uległy zmianie, przesuń stolik mikroskopu do sąsiedniego obszaru, przesuwając się w kierunku przeciwnego końca i wznów nagrywanie.
  11. Powtórz kroki 11.9 i 11.10, aby zeskanować w poprzek szkiełka nakrywkowego, początkowo przesuwając się w lewo, a następnie w dół w sposób zygzakowaty, aby pokryć cały obszar szkiełka nakrywkowego. Składa się na to 80−100 pomiarów na szkiełko nakrywkowe.
    UWAGA: Ogranicz całkowity czas pomiaru do 10 minut, ponieważ czynniki wtórne powodują spadek stanu przejściowego Ca2+.
  12. Po uzyskaniu stanów nieustalonych Ca2+ przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy śladów fluorescencji zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w Rysunek 1Wygenerowane wysoce czyste kardiomiocyty, które z czasem w hodowli nabywają fenotyp podobny do komorowego/dorosłego. Jak oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla izoform regulatorowego łańcucha lekkiego 2 miozyny przedsionkowej i komorowej (odpowiednio MLC2A i MLC2V), większość komórek wygenerowanych przez ten protokół była MLC2A-dodatnia w 30 dniu po indukcji różnicowania serca, podczas gdy MLC2V ulegała ekspresji w znacznie niższ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe etapy wykorzystania ludzkich iPSC-CM jako modeli eksperymentalnych to: 1) generowanie wysokiej jakości kardiomiocytów (CM), które mogą zapewnić stałą wydajność i powtarzalne wyniki; 2) umożliwienie komórkom dojrzewania w hodowli przez co najmniej 90 dni w celu właściwej oceny ich fenotypu; 3) wykonywanie badań elektrofizjologicznych, np. pomiarów przejściowych wapnia (Ca2+), w celu zapewnienia fizjologicznie istotnej charakterystyki funkcjonalnej ludzkich iPSC-CM. Opracowaliśmy metodę różnicowania opa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for Clinical and Translational Research Career Development KL2TR001435 (FS); NIH R00 HL116645 i AHA 18TPA34170460 (CC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-aktyna, &alfa;-Przeciwciało mięśni gładkich, Mysz monoklonalnaSigma AldrichA5228
Alexa Fluor 488 koza anty myszInvitrogenA11001
Alexa Fluor 555 koza anty królikInvitrogenA21428
B27 SuplementGibco17504-044
B27(-) insulina SuplementGibcoA18956-01
CHIR-99021SelleckchemS2924
Barwnik jądrowy DAPIThermoFisherD1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-Glutamina + 15mM HepesGibco11330-032
Dwustronny podnośnik komórek, płaskie ostrze i J-HookCelltreat229306
Falcon Multiwell Płytka do hodowli tkankowej, 6-dołkowaCorning
Podgrzewacz fluidycznyInline Instrument Live CellIL-H-10
Fura-2, AMInvitrogenF1221
matryca z kwalifikacją hESCCorning354277Matrigel Matrix
pożywka hPSCGibcoA33493-01StemFlex Basal Medium
IWR-1Sigma AldrichI0161
Komora do obrazowania żywych komórekInstrument do żywych komórekEC-B25
MLC-2A, monoklonalne przeciwciało myszySystemy synaptyczne311011
system wapnia i kurczliwości miocytówIonoptixISW-400
Przeciwciało o łańcuchu lekkim miozyny 2, poliklonalne królika (MLC2V)Proteintech10906-1-AP
Sterylne jednorazowe filtry Nalgene o szybkim przepływie z membranąPESThermoFisher124-0045
PBS z wapniem i magnezemCorning21-030-CV
PBS bez wapnia i MagensiumCorning21-031-CV
Szkiełka nakrywkowe PremiumLab Scientific7807
RPMI medium 1640 (-) D-glukoza (1X)Gibco11879-020
RPMI medium 1640 (1X)Gibco11875-093
L-mleczan soduSigma AldrichL7022
StemFlex SuplementGibcoA33492-01
TiazovivinTocris3845
Trypsyna-EDTA (0,25%)ThermoFisher25200056
Roztwór Tyrode'aBoston BioproductsBSS-355wDostosuj pH na 7,2. Dodaj 1,2 mM chlorku wapnia
353046

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955(2015).
  2. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  3. Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
  4. Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
  5. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
  6. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  7. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  8. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
  9. Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
  10. Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
  11. Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
  12. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12(2018).
  13. Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17(2014).
  14. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010(2014).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  16. Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  19. Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
  20. Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
  21. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
  24. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  25. Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
  26. Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50(2017).
  27. Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kardiomiocyty o fenotypie kom r kom r komorowychkardiomiocyty pochodz ce z iPSCwarunki niskiego poziomu tlenuselekcja mleczanemilo ciowe oznaczanie metod cytometrii przep ywowejbarwienie Fura 2 AMperfuzja roztworem Tyrode aekspresja izoform MLC2protok r nicowania serca

Powiązane artykuły