Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Białka domeny J (JDP) tworzą największą i najbardziej zróżnicowaną rodzinę ko-opiekuńczą w komórkach eukariotycznych. Ostatnie odkrycia pokazują, że określeni członkowie rodziny JDP mogą tworzyć przejściowe heterokompleksy u eukariontów w celu precyzyjnego dostrojenia wyboru substratu dla białek opiekuńczych opartych na białku szoku cieplnego o mocy 70 kDa (Hsp70). Kompleksy JDP celują w zagregowane białka wywołane ostrym/przewlekłym stresem i przypuszczalnie pomagają w gromadzeniu disaggregazów poprzez rekrutację wielu Hsp70 na powierzchnię agregatów białkowych. Zakres sieci kontroli jakości białek (PQC) utworzonej przez te fizycznie oddziałujące JDP pozostaje w dużej mierze niescharakteryzowany in vivo. W tym miejscu opisujemy oparty na mikroskopii test interakcji białek in situ o nazwie test ligacji zbliżeniowej (PLA), który jest w stanie solidnie uchwycić te przejściowo utworzone kompleksy opiekuńcze w różnych przedziałach komórkowych komórek eukariotycznych. Nasza praca rozszerza zastosowanie PLA z komórek ludzkich na drożdże (Saccharomyces cerevisiae) i bakterie (Escherichia coli), tworząc w ten sposób ważne narzędzie do monitorowania dynamiki przejściowo formowanych zespołów białkowych zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych.
Wprowadzenie
Ogromna ilość informacji genomicznych pozostaje niemożliwa do zinterpretowania z powodu naszego niepełnego zrozumienia interaktomii komórkowych. Konwencjonalne metody wykrywania interakcji białko-białko, takie jak koimmunoprecypitacja białek z lub bez chemicznego sieciowania i kolokalizacja białek, choć szeroko stosowane, mają szereg wad. Niektóre z głównych wad obejmują słabą kwantyfikację interakcji i potencjalne wprowadzenie nienatywnych zdarzeń wiązania. Dla porównania, pojawiające się techniki oparte na bliskości stanowią alternatywne i skuteczne podejście do wychwytywania interakcji białek w komórkach. Test ligacji zbliżeniowej (PLA)1, te....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórek HeLa
- Przygotuj następujące materiały: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4), pH 7,4; DMEM, uzupełniony 10% FCS i 1% Pen-Strep; 4% paraformaldehydu w PBS; 0,5% Triton-X100 w PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0,0001% sterylny roztwór poli-L-lizyny; 10-dołkowe szkiełka diagnostyczne; wilgotna komora; bibułka; i słoiki do barwienia szkiełek Coplin.
nuta: Aby zapewnić optymalną skuteczność utrwalania, roztwory paraformaldehydu należy przygotowywać świeże przed każdym eksperymentem. - Przygotuj wilgotną komorę, przyk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Nasze wcześniejsze badania in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych białek wykazały, że podzbiór ludzkich białek JDP klasy A i klasy B tworzy przejściowe mieszane kompleksy JDP, aby skutecznie celować w szeroki zakres zagregowanych białek i prawdopodobnie ułatwiać montaż dysagregaz białkowych opartych na Hsp707. Zastosowaliśmy metodę PLA, aby ustalić, czy mieszane kompleksy JDP (klasa A+B) występują w ludzkich komórkach raka szyjki macicy (HeLa). Ludzkie białka JDP DNAJA2 (klasa A) i DNAJB1 (klasa .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podejścia oparte na koimmunoprecypitacji i kolokalizacji są od dawna stosowane jako metody charakteryzowania zespołów białkowych. Wykrywanie przejściowo utworzonych specyficznych kompleksów opiekuńczych jest dużym wyzwaniem przy użyciu tak konwencjonalnych metod, w wyniku czego wcześniejsze odkrycia są w dużej mierze ograniczone do interpretacji jakościowych. Techniki koimmunoprecypitacji oparte na lizie komórek często wymagają sieciowania w celu ustabilizowania interakcji białko-białko. Liza komórek zwiększa ryzyko zakł.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
NBN jest wspierany przez specjalny grant rekrutacyjny z Wydziału Medycyny, Pielęgniarstwa i Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Monash, finansowany przez Rząd Stanowy Wiktorii i Rząd Australijski. Dziękujemy Berndowi Bukau (ZMBH, Uniwersytet w Heidelbergu, Niemcy) i Harmowi H. Kampinga (Wydział Nauk Biomedycznych Komórek i Systemów, Uniwersytet w Groningen, Holandia) za ich nieocenione wsparcie i udostępnienie odczynników, Holgerowi Lorenzowi (ZMBH Imaging Facility, Uniwersytet w Heidelbergu, Niemcy) za wsparcie w zakresie mikroskopii konfokalnej i przetwarzania obrazu oraz Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australia) za krytyczną lekturę rękopisu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 37% Formaldehyd | Merck | 103999 | |
| aceton | Przeciwciało anty-DNAJA2 Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anty-DNAJA1 | Abcam | ab157216 | |
| Przeciwciało anty-DnaK | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| Domowe | |||
| przeciwciało anty-mCherry | Abcam | ab125096 | |
| przeciwciało anty-Sis1 | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| przeciwciało anty-Ydj1 | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| przeciwciało anty-YFP | W domu | ||
| Słoik do barwienia szkiełek z kopliny | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Szkiełka diagnostyczne | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink Odczynniki do wykrywania in situ Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Podłoże montażowe Situ + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Sonda Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ Sonda PLA Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescencyjna | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Płodowa surowica cielęca | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lizozym | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Termo-Fischer | 15070063 | |
| Poli-L-Lizyna | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolaza 100T / / Lyticase | Stany Zjednoczone Biological | Z1004 |
Bibliografia
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addit....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
