Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60172

⸱

2 września 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences of Cells & Systems, University of Groningen, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Colombo, 3Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Streszczenie

Białka domeny J (JDP) tworzą największą i najbardziej zróżnicowaną rodzinę ko-opiekuńczą w komórkach eukariotycznych. Ostatnie odkrycia pokazują, że określeni członkowie rodziny JDP mogą tworzyć przejściowe heterokompleksy u eukariontów w celu precyzyjnego dostrojenia wyboru substratu dla białek opiekuńczych opartych na białku szoku cieplnego o mocy 70 kDa (Hsp70). Kompleksy JDP celują w zagregowane białka wywołane ostrym/przewlekłym stresem i przypuszczalnie pomagają w gromadzeniu disaggregazów poprzez rekrutację wielu Hsp70 na powierzchnię agregatów białkowych. Zakres sieci kontroli jakości białek (PQC) utworzonej przez te fizycznie oddziałujące JDP pozostaje w dużej mierze niescharakteryzowany in vivo. W tym miejscu opisujemy oparty na mikroskopii test interakcji białek in situ o nazwie test ligacji zbliżeniowej (PLA), który jest w stanie solidnie uchwycić te przejściowo utworzone kompleksy opiekuńcze w różnych przedziałach komórkowych komórek eukariotycznych. Nasza praca rozszerza zastosowanie PLA z komórek ludzkich na drożdże (Saccharomyces cerevisiae) i bakterie (Escherichia coli), tworząc w ten sposób ważne narzędzie do monitorowania dynamiki przejściowo formowanych zespołów białkowych zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych.

Wprowadzenie

Ogromna ilość informacji genomicznych pozostaje niemożliwa do zinterpretowania z powodu naszego niepełnego zrozumienia interaktomii komórkowych. Konwencjonalne metody wykrywania interakcji białko-białko, takie jak koimmunoprecypitacja białek z lub bez chemicznego sieciowania i kolokalizacja białek, choć szeroko stosowane, mają szereg wad. Niektóre z głównych wad obejmują słabą kwantyfikację interakcji i potencjalne wprowadzenie nienatywnych zdarzeń wiązania. Dla porównania, pojawiające się techniki oparte na bliskości stanowią alternatywne i skuteczne podejście do wychwytywania interakcji białek w komórkach. Test ligacji zbliżeniowej (PLA)1, teraz dostępny jako zastrzeżony zestaw, wykorzystuje przeciwciała do specyficznego celowania w kompleksy białkowe w oparciu o bliskość oddziałujących podjednostek.

PLA jest inicjowane przez tworzenie rusztowania składającego się z pierwotnych i drugorzędowych przeciwciał z małymi znacznikami DNA (sondy PLA) na powierzchni docelowego kompleksu białkowego (Rysunek 1, kroki 1-3). Następnie, określona na podstawie bliskości znaczników DNA, generowana jest kolista cząsteczka DNA poprzez hybrydyzację z oligonukleotydami łączników (Rysunek 1, krok 4). Tworzenie kolistego DNA jest zakończone etapem ligacji DNA. Nowo utworzony okrągły fragment DNA służy jako matryca dla późniejszej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) opartej na amplifikacji toczącego się koła (RCA), zapoczątkowanej przez jeden ze sprzężonych znaczników oligonukleotydowych. W ten sposób powstaje jednoniciowa, konkategomeryczna cząsteczka DNA przyłączona do kompleksu białkowego za pośrednictwem rusztowania przeciwciał (Rysunek 1, krok 6). Konkateneryczna cząsteczka DNA jest wizualizowana za pomocą fluorescencyjnie znakowanych oligonukleotydów, które hybrydyzują z wieloma unikalnymi sekwencjami rozproszonymi po amplifikowanym DNA ( Rysunek 1, krok 7)2. Wygenerowany sygnał PLA, który pojawia się jako fluorescencyjna kropka (Rysunek 1, krok 7), odpowiada lokalizacji docelowego kompleksu białkowego w komórce. W rezultacie, test może wykrywać kompleksy białkowe z dużą dokładnością przestrzenną. Technika ta nie ogranicza się jedynie do wychwytywania interakcji białkowych, ale może być również wykorzystana do wykrywania pojedynczych cząsteczek lub modyfikacji białek na białkach o wysokiej czułości1,2.

Hsp70 tworzy wysoce wszechstronny system opiekuńczy, fundamentalnie ważny dla utrzymania homeostazy białek komórkowych, uczestnicząc w szeregu funkcji związanych z porządkiem i stresem. Czynności porządkowe systemu opiekuńczego Hsp70 obejmują fałdowanie białek de novo, translokację białek przez błony komórkowe, montaż i demontaż kompleksów białkowych, regulację aktywności białek i łączenie różnych maszyn do zwijania białek/kontroli jakości3. Ten sam system opiekuńczy również ponownie fałduje nieprawidłowo sfałdowane/niesfałdowane białka, zapobiega agregacji białek, wspomaga dezagregację białek i współpracuje z proteazami komórkowymi w celu degradacji ostatecznie nieprawidłowo sfałdowanych/uszkodzonych białek, aby ułatwić naprawę komórkową po stresach proteotoksycznych4,5. Aby osiągnąć tę funkcjonalną różnorodność, opiekun Hsp70 opiera się na współpracujących ko-opiekuńczych z rodziny JDP i czynnikach wymiany nukleotydów (NEF), które precyzyjnie dostrajają zależną od ATP allosteryczną kontrolę wiązania i uwalniania substratu Hsp703,6. Co więcej, współopiekuńcze JDP odgrywają istotną rolę w doborze substratów dla tego wszechstronnego systemu opiekuńczego. Członkowie tej rodziny są podzieleni na trzy klasy (A, B i C) w oparciu o ich homologię strukturalną do prototypu JDP, E. coli DnaJ. JDP klasy A zawierają N-końcową domenę J, która oddziałuje z Hsp70, regionem bogatym w glicynę-fenyloalaninę, regionem wiążącym substrat składającym się z regionu przypominającego palec cynkowy (ZFLR) i dwóch domen β-baryłkowatych oraz domeny dimeryzacji C-końcowej. JDP z N-końcową domeną J i regionem bogatym w glicynę i fenyloalaninę, ale bez ZFLR, należą do klasy B. Ogólnie rzecz biorąc, członkowie tych dwóch klas są zaangażowani w funkcje opiekuńcze. Członkowie należący do klasy catchall C, która zawiera JDP, które współdzielą tylko J-domain4, rekrutują Hsp70 do wykonywania różnych funkcji nieopiekuńczych. Istotna rola JDP jako wymiennych "adapterów" systemu Hsp70 do rozpoznawania substratów znajduje odzwierciedlenie w rozszerzaniu się członków rodziny w trakcie ewolucji. Na przykład ludzie mają ponad 42 różne elementy JDP4. Te JDP funkcjonują jako monomery, homodimery i/lub oligomery homo/hetero4,5. Ostatnio zaobserwowano funkcjonalną współpracę poprzez przejściowe tworzenie kompleksów między klasą A (np. H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae (S. cerevisiae) Ydj1) i klasy B (np. H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae (S. cerevisiae) Stwierdzono, że eukariotyczne JDP Sis1) promują skuteczne rozpoznawanie amorficznych agregatów białkowych in vitro7,8. Te mieszane kompleksy JDP przypuszczalnie gromadzą się na powierzchni zagregowanych białek, aby ułatwić tworzenie disaggregaz białkowych opartych na Hsp70 i Hsp70+Hsp1007,8,9,10. Krytyczne dowody na istnienie tych przejściowo uformowanych kompleksów JDP klasy mieszanej w komórkach eukariotycznych zostały dostarczone przez PLA8.

PLA jest coraz częściej wykorzystywane do oceny interakcji białek w metazoa, głównie w komórkach ssaków. W tym miejscu informujemy o udanym rozszerzeniu tej techniki w celu monitorowania przejściowo utworzonych kompleksów opiekuńczych w eukariotycznych i prokariotycznych organizmach jednokomórkowych, takich jak pączkujące drożdże S. cerevisiae i bakteria E. coli.Co ważne, ekspansja ta podkreśla potencjalne zastosowanie PLA w wykrywaniu i analizowaniu drobnoustrojów, które infekują komórki ludzkie i zwierzęce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komórek HeLa

  1. Przygotuj następujące materiały: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4), pH 7,4; DMEM, uzupełniony 10% FCS i 1% Pen-Strep; 4% paraformaldehydu w PBS; 0,5% Triton-X100 w PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0,0001% sterylny roztwór poli-L-lizyny; 10-dołkowe szkiełka diagnostyczne; wilgotna komora; bibułka; i słoiki do barwienia szkiełek Coplin.
    nuta: Aby zapewnić optymalną skuteczność utrwalania, roztwory paraformaldehydu należy przygotowywać świeże przed każdym eksperymentem.
  2. Przygotuj wilgotną komorę, przykrywając dno zamkniętego pudełka mokrymi chusteczkami. Przed rozpoczęciem doświadczenia umieścić wilgotną komorę w temperaturze 37 °C, aby upewnić się, że temperatura w komorze wynosi 37 °C podczas inkubacji reakcji enzymatycznych.
  3. Hodowla komórek HeLa w kolbach T25, w 5 ml DMEM (suplement o wysokiej zawartości glukozy, glutaminianu i pirogronianu sodu) uzupełnionego 10% FCS i 1% Pen-Strep, w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C zawierającym 5% CO2. Dysocjuj przylegające komórki za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA. Po dodaniu świeżego DMEM do zdysocjowanych komórek, policz komórki za pomocą komory do liczenia komórek i hoduj na szkiełkach diagnostycznych w wilgotnej komorze.
  4. Sterylizować szkiełka diagnostyczne za pomocą promieniowania UV w sterylnym kapturze do hodowli komórkowych przez 30 minut.
  5. Dodaj 100 μl sterylnej, przefiltrowanej 0,0001% poli-L-lizyny do każdego dołka wymaganego w eksperymencie. Inkubować przez 30 minut. Zmyj nadmiar poli-L-lizyny, myjąc każdą studzienkę 3x 50 μl ultraczystej wody.
  6. Trypsynizuj komórki HeLa i dodaj około 15 000 komórek do każdej studzienki. W razie potrzeby rozcieńczyć komórki do co najmniej 30-50 μl DMEM na studzienkę.
  7. Hoduj komórki w wilgotnej komorze w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 przez około 24 godziny. Komórki powinny być zlewane w 60%-80% przed rozpoczęciem PLA.
    nuta: Zbyt duża konfluencja zmniejsza absorpcję odczynników, zmniejszając uzyskany sygnał na końcu protokołu.
  8. Usuń pożywkę, umieszczając bibułkę na krawędzi studzienki. Umyj studzienki 3x z 50 μL PBS.
    nuta: Ogniwa ulegają odłączeniu, gdy płyny są dodawane ostro. Można temu zapobiec, nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia studzienek przed dodaniem nowej cieczy i delikatnie dodając nową ciecz do krawędzi studzienki.
  9. Napraw komórki, dodając 50 μl świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu w PBS do każdej studzienki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Umyj szkiełka 3x w PBS. Wykonuj pranie w słoiku do barwienia szkiełek Coplin zawierającym 100 ml PBS. Przy każdym praniu inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania.
  11. Przepuszczalność błony komórkowej poprzez zanurzenie szkiełek w 100 ml 0,5% Triton-X100 w PBS w słoiku do barwienia szkiełek Coplin. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania.
  12. Szkiełka myjące 3x w TBS-T. Wykonuj pranie w słoiku do barwienia szkiełka Coplin zawierającym 100 ml TBS-T. Przy każdym praniu inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania.
  13. Po ostatnim praniu usuń nadmiar buforu za pomocą bibuły. W tym momencie komórki są gotowe do protokołu testu ligacji zbliżeniowej, który zostanie omówiony w sekcji 4.

2. Przygotowanie komórek S. cerevisiae

  1. Przygotuj następujące materiały: 100 mM KPO4, pH 6,5, określany jako bufor do płukania; 37% formaldehyd; 4% paraformaldehyd w 100 mM KPO4, pH 6,5; 1,2 M sorbitol w 100 mM KPO4, pH 6,5; roztwór litikazy (500 μg/ml litikazy, 20 mM β-merkaptoetanolu, 100 mM KPO4, pH 6,5); 0,0001% roztwór poli-L-lizyny; 1% Triton-X100 w 100 mM KPO4, pH 6,5; 10-dołkowe szkiełka diagnostyczne; wilgotna komora (przygotowana jak w kroku 1.2); bibułka; i słoiki do barwienia szkiełek Coplin.
    nuta: Aby zapewnić optymalną skuteczność utrwalania, roztwory paraformaldehydu należy przygotowywać świeże przed każdym eksperymentem.
  2. Hoduj kulturę przez noc w nieselektywnym podłożu z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD) w temperaturze 30 °C, wstrząsając.
    nuta: W zależności od wymagań doświadczalnych, komórki S. cerevisiae mogą być hodowane na pożywce Synthetic Complete (SC) lub selektywnej pożywce Synthetic Minimal (SM).
  3. Rozcieńczyć kulturę stacjonarną do OD600 0,1 w 20 ml pożywki. Hodować komórki w temperaturze 30 °C, potrząsając, aż OD600 osiągnie 0,5.
  4. Przenieść 20 ml kultury do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Granulować komórki przez odwirowanie przy 665 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml świeżej pożywki.
  5. Napraw komórki, dodając do kultury 550 μl 37% formaldehydu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  6. Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 665 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant. Zawiesić osad w 1 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu w buforze do mycia. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Podczas inkubacji należy przygotować szkiełka diagnostyczne, dodając 100 μl 0,01% roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka. Inkubować szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Po 30 minutach zmyj nadmiar poli-L-lizyny ultraczystą wodą i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu. Suche szkiełka są gotowe do użycia.
  9. Umyj komórki dwukrotnie 1 ml buforu do mycia. Przeprowadzać płukanie przez odwirowanie komórek przy 665 x g przez 3 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze do mycia.
  10. Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 665 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1,2 M sorbitolu w buforze do mycia.
  11. Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 665 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant. Zawiesić osad w 250 μl świeżo przygotowanego roztworu litikazy w celu strawienia ściany komórkowej. Inkubować komórki w roztworze litykazy przez 15 minut w temperaturze 30 °C, wstrząsając.
  12. Po roztrawieniu przemyć komórki 3x przez odwirowanie przy 665 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 250 μl 1,2 M sorbitolu w buforze do płukania.
    nuta: Ponieważ komórki są kruche po trawieniu ściany komórkowej, należy je ponownie zawiesić bardzo ostrożnie, aby nie uszkodzić komórek.
  13. Dodać 20 μl zawieszonych komórek do szkiełek pokrytych poli-L-lizyną. Pozwól im przymocować się do slajdów przez 30 minut. Zmyj nieprzylegające komórki, przemywając studzienki 3x 50 μl buforu do mycia.
  14. Przepuszczalność błony komórkowej poprzez przemycie 3x 50 μL 1% Triton-X w buforze do mycia.
    nuta: W tym momencie komórki są gotowe do protokołu testu ligacji zbliżeniowej, który zostanie omówiony w sekcji 4.

3. Przygotowanie komórek E. coli

  1. Przygotuj następujące materiały: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 0,05% Tween-20), pH 7,4; roztwór lizozymu (2 mg/ml lizozymu, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM glukozy, 10 mM EDTA); 0,0001% roztwór poli-L-lizyny; 99% metanol o lodowate metanolu; 99% metanol o temperaturze pokojowej; 99% acetonu; 10-dołkowe szkiełka diagnostyczne; wilgotna komora (przygotowana jak w kroku 1.1.1); bibułka; oraz słoiki do barwienia szkiełka Coplina.
  2. Wyhodować kulturę przez noc na podłożu Luria-Bertani (LB) w temperaturze 30 °C, wstrząsając.
  3. Rozcieńczyć kulturę stacjonarną do OD600 0,02 w świeżej pożywce LB. Hodować komórki w temperaturze 30 °C, wytrząsając, aż OD600 osiągnie 0,4 dla komórek w fazie logarytmicznej.
  4. Około 15 minut przed tym, jak komórki osiągną OD600 0,4, przygotuj szkiełka pokryte poli-L-lizyną, dodając 100 μl 0,0001% poli-L-lizyny do każdej studzienki. Inkubować szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Po 30 minutach zmyj nadmiar poli-L-lizyny ultraczystą wodą i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu. Suche szkiełka są gotowe do użycia.
  6. Gdy komórki osiągną OD600 0,4, przenieść 1 ml kultury do sterylnej probówki do mikrowirówki i granulować komórki w temperaturze 2,650 x g przez 2 minuty.
  7. Zawiesić komórki w 50 μl pożywki LB.
  8. Napraw komórki, dodając 1 ml lodowatego 99% metanolu. Wymieszaj bardzo delikatnie ręcznie. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze -20 °C.
  9. Po utrwaleniu dodać 20 μl komórek do szkiełek pokrytych poli-L-lizyną. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut.
  10. Dodaj 50 μl świeżo przygotowanego roztworu lizozymu do każdej studzienki, aby strawić ścianę komórkową. Inkubować w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze 25 °C.
  11. Usuń roztwór lizozymu z dołków, dodając bibułkę do krawędzi studzienki. Umyj szkiełka 3x w 100 ml PBS-T. Wykonuj każde pranie w słoiku do barwienia szkiełek Coplin przez 30 sekund, bez wstrząsania.
  12. Usuń bufor myjący ze szkiełek, stukając w szkiełka w bibułkę.
  13. Przepuszczalność błon komórkowych poprzez dodanie 50 μl 99% metanolu do każdej studzienki. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  14. Usuń metanol, umieszczając bibułkę na krawędzi studzienki.
  15. Dodaj 50 μl 99% acetonu do każdej studzienki. Inkubować przez 1 minutę.
  16. Usuń nadmiar acetonu, umieszczając bibułkę na krawędzi studzienki. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu. W tym momencie komórki są gotowe do protokołu testu ligacji zbliżeniowej, który zostanie omówiony w sekcji 4.

4. Test ligacji zbliżeniowej

  1. Przygotuj następujące materiały: Bufor blokujący; Bufor do rozcieńczania przeciwciał; Bufor płuczący "A" – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) pH 7,4; Bufor płuczący "B" – (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7,4; Przeciwciało wtórne przeciwko królikowi PLUS; Przeciwciało wtórne przeciwko myszom MINUS; 5x bufor ligacyjny; ligaza; 5x bufor wzmacniający (pomarańczowy: λex 554 nm; λem 576 nm); Polimerazy; ultraczysta woda; oraz nośnik montażowy zawierający DAPI.
    UWAGA: Odczynniki do wykrywania PLA są również dostępne w wariantach Zielony (λex 495 nm; λem 527 nm), Czerwony (λex 594 nm; λem 624 nm), FarRed (λex 644 nm; λem 669 nm) lub Brightfield (sprzężona z peroksydazą chrzanową (HRP)).
  2. Zablokuj komórki, dodając kroplę bufora blokującego do każdej studzienki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.
  3. Przygotować roztwory przeciwciał, rozcieńczając przeciwciała podstawowe w buforze do rozcieńczania przeciwciał. Na każdą studzienkę wymagane jest 40 μl roztworu przeciwciał.
  4. Usuń bufor blokujący, umieszczając bibułę na krawędzi studzienki. Dodać 40 μl przeciwciała rozcieńczonego w buforze do rozcieńczania przeciwciał do każdego dołka. Inkubować przez 60 minut w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Usuń roztwór przeciwciał z dołków, umieszczając bibułkę na krawędzi studzienki. Myj szkiełka podstawowe 2x w 100 ml buforu do mycia "A" w słoiku do barwienia szkiełek z Coplin przez 5 minut, bez wstrząsania.
  6. Podczas etapów płukania rozcieńczyć 5 razy drugorzędowe sondy przeciwciał, anty-królicze PLUS i anty-mysie MINUS (specyficzność gatunkowa sond zależy od użytych przeciwciał pierwotnych), w buforze do rozcieńczania przeciwciał. Przygotować 40 μl roztworu przeciwciał na dołek.
  7. Dodać 40 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.
  8. Usuń wtórny roztwór przeciwciał z dołków, umieszczając bibułkę na krawędzi studzienki. Myj szkiełka podstawowe 2x w 100 ml buforu do mycia "A" w słoiku do barwienia szkiełek z Coplin przez 5 minut, bez wstrząsania.
  9. Podczas płukania należy przygotować 40 μl mieszaniny do ligacji na studzienkę, mieszając 8 μl 5x buforu ligacyjnego, 31 μl wody ultraczystej i 1 μl ligazy.
  10. Do każdego dołka dodać 40 μl mieszaniny do podwiązania. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.
  11. Usuń mieszaninę ligacyjną ze studzienek, umieszczając bibułę na krawędzi dołka. Myj szkiełka 2x w 100 ml buforu do mycia "A" w słoiku do barwienia szkiełek Coplin przez 2 minuty, bez wstrząsania.
  12. Podczas mycia przygotuj 40 μl mieszaniny amplifikacyjnej na studzienkę, mieszając 8 μl 5x roztworu amplifikacyjnego, 31,5 μl ultraczystej wody i 0,5 μl polimerazy.
    nuta: Wzmacniacz 5x zawiera sondy fluorescencyjne. Chroń tę mieszaninę przed światłem. Chroń również prowadnice przed światłem podczas każdego z poniższych kroków. Jeśli używasz półprzezroczystych słoików do barwienia szkiełka Coplin i wilgotnych komór, zawiń je w folię aluminiową.
  13. Dodać 40 μl mieszaniny amplifikacyjnej do studzienki. Inkubować przez 100 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.
  14. Usuń mieszaninę amplifikacyjną ze studzienek. Myj szkiełka 2x w 100 ml buforu do mycia "B" w słoiku do barwienia szkiełek Coplin przez 10 minut bez wstrząsania.
  15. Myj szkiełka w 100 ml buforu myjącego "B" rozcieńczonego w stosunku 1:100 w ultraczystej wodzie w słoiku do barwienia szkiełek Coplin przez 30 s.
  16. Dodać 20 μl DAPI zawierającego pożywkę montażową na studzienkę do szkiełek. Zamknij szkiełka nakrywką i uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci.
  17. W przypadku obrazowania należy natychmiast inkubować DAPI zawierającą pożywkę montażową przez 10–15 minut, chroniąc ją przed światłem. Jeśli nie, przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C przez okres do 1 tygodnia, chroniąc je przed światłem.

5. Wykrywanie

  1. Użyj mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać obrazy komórek HeLa, S. cerevisiae i E. coli z obiektywami planapochromatycznymi 20x/0,8 NA, 63x/1,4 NA i 100x/1,4 NA. Wzbudz DAPI barwione DNA za pomocą impulsowego lasera diodowego o długości fali 405 nm. Dla sygnału PLA (do tego badania) wzbudzić laserem na ciele stałym o długości fali 561 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nasze wcześniejsze badania in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych białek wykazały, że podzbiór ludzkich białek JDP klasy A i klasy B tworzy przejściowe mieszane kompleksy JDP, aby skutecznie celować w szeroki zakres zagregowanych białek i prawdopodobnie ułatwiać montaż dysagregaz białkowych opartych na Hsp707. Zastosowaliśmy metodę PLA, aby ustalić, czy mieszane kompleksy JDP (klasa A+B) występują w ludzkich komórkach raka szyjki macicy (HeLa). Ludzkie białka JDP DNAJA2 (klasa A) i DNAJB1 (klasa ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podejścia oparte na koimmunoprecypitacji i kolokalizacji są od dawna stosowane jako metody charakteryzowania zespołów białkowych. Wykrywanie przejściowo utworzonych specyficznych kompleksów opiekuńczych jest dużym wyzwaniem przy użyciu tak konwencjonalnych metod, w wyniku czego wcześniejsze odkrycia są w dużej mierze ograniczone do interpretacji jakościowych. Techniki koimmunoprecypitacji oparte na lizie komórek często wymagają sieciowania w celu ustabilizowania interakcji białko-białko. Liza komórek zwiększa ryzyko zakł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

NBN jest wspierany przez specjalny grant rekrutacyjny z Wydziału Medycyny, Pielęgniarstwa i Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Monash, finansowany przez Rząd Stanowy Wiktorii i Rząd Australijski. Dziękujemy Berndowi Bukau (ZMBH, Uniwersytet w Heidelbergu, Niemcy) i Harmowi H. Kampinga (Wydział Nauk Biomedycznych Komórek i Systemów, Uniwersytet w Groningen, Holandia) za ich nieocenione wsparcie i udostępnienie odczynników, Holgerowi Lorenzowi (ZMBH Imaging Facility, Uniwersytet w Heidelbergu, Niemcy) za wsparcie w zakresie mikroskopii konfokalnej i przetwarzania obrazu oraz Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australia) za krytyczną lekturę rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
37% FormaldehydMerck103999
acetonPrzeciwciało anty-DNAJA2 Sigma-Aldrich32201
anty-DNAJA1Abcamab157216
Przeciwciało anty-DnaKEnzo Life SciencesADI-SPA-450
Domowe
przeciwciało anty-mCherryAbcamab125096
przeciwciało anty-Sis1Cosmo Bio CorpCOP-080051
przeciwciało anty-Ydj1StressMarq Biosciences  SMC-150,
przeciwciało anty-YFPW domu
Słoik do barwienia szkiełek z koplinySigma-AldrichS5516
Szkiełka diagnostyczneMarienfeld1216530
DMEMThermo-Fischer31966021
DuoLink Odczynniki do wykrywania in situ OrangeSigma-AldrichDUO92007
DuoLink In Podłoże montażowe Situ + DAPISigma-AldrichDUO82040
DuoLink In Situ PLA Sonda Anti-Mouse MINUSSigma-AldrichDUO92004
DuoLink In Situ Sonda PLA Anti-Rabbit PLUSSigma-AldrichDUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, FluorescencyjnaSigma-AldrichDUO82049
Płodowa surowica cielęcaThermo-Fischer10082147
LizozymSigma-Aldrich62971
MetanolSigma-Aldrich32213
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Penicylina/StreptomycynaTermo-Fischer15070063
Poli-L-LizynaSigma-AldrichP47-07
SorbitolSigma-AldrichS7547
Triton-X100Merck108643
TrypsinThermo-Fischer25300096
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Zymolaza 100T / / LyticaseStany Zjednoczone BiologicalZ1004
Przeciwciało

Bibliografia

  1. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  2. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  3. Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
  4. Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
  5. Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  6. Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  7. Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
  8. Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
  9. Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
  10. Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
  11. Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
  12. Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
  13. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  14. Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
  15. Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
  16. Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
  17. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  18. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
  19. Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
  20. Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
  21. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  22. Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
  23. Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
  24. Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
  25. Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
  26. Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
  27. Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679(2015).
  28. Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
  29. Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
  30. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Analiza ligacji w pobliżuprzejściowe oddziaływania białkowebiałka z domeną Jchaperon Hsp70kontrola jakości białekkomórkowa proteostazalokalizacja subkomórkowaswoistość przeciwciałpowlekanie poli-L-lizynątrawienie ściany komórkowej drożdży
Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.