Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie heterogenicznych gradientów leków w różnych populacjach nowotworów w akceleratorze ewolucji mikroprzepływowej do obserwacji w czasie rzeczywistym

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60185

⸱

19 września 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Princeton University, 2Johns Hopkins Medical Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy mikroprzepływowy model raka na chipie, technologię "Akcelerator Ewolucji", która zapewnia kontrolowaną platformę do długoterminowych badań ilościowych dynamiki raka w czasie rzeczywistym w dobrze zdefiniowanych warunkach środowiskowych na poziomie pojedynczej komórki. Oczekuje się, że technologia ta sprawdzi się jako model in vitro do badań podstawowych lub przedklinicznego opracowywania leków.

Streszczenie

Konwencjonalna hodowla komórkowa pozostaje najczęściej używanym modelem przedklinicznym, pomimo udowodnionej ograniczonej zdolności do przewidywania wyników klinicznych w raku. Zaproponowano mikroprzepływowe modele raka na chipie, aby wypełnić lukę między nadmiernie uproszczonymi konwencjonalnymi hodowlami 2D a bardziej skomplikowanymi modelami zwierzęcymi, które mają ograniczoną zdolność do uzyskiwania wiarygodnych i powtarzalnych wyników ilościowych. W tym miejscu przedstawiamy mikroprzepływowy model raka na chipie, który w kompleksowy sposób odtwarza kluczowe składniki złożonego mikrośrodowiska guza, a jednocześnie jest wystarczająco prosty, aby zapewnić solidne ilościowe opisy dynamiki raka. Ten mikroprzepływowy model raka na chipie, "Akcelerator Ewolucji", rozkłada dużą populację komórek nowotworowych na połączony ze sobą układ mikrośrodowisk guza, generując jednocześnie niejednorodny krajobraz stresu chemoterapeutycznego. Postęp i dynamika ewolucyjna raka w odpowiedzi na gradient leku mogą być monitorowane przez tygodnie w czasie rzeczywistym, a liczne eksperymenty mogą być przeprowadzane jako uzupełnienie zdjęć poklatkowych wykonanych w trakcie eksperymentów.

Wprowadzenie

Rak jest coraz częściej rozpoznawany jako złożony ekosystem, który zależy nie tylko od ciągłej dysregulacji zmutowanych populacji komórek, ale także od istotnych interakcji między komórkami rakowymi a mikrośrodowiskiem gospodarza. W tym sensie rak ewoluuje w krajobrazie adaptacyjnym objawiającym się kombinacją czynników, w tym heterogenicznym mikrośrodowiskiem guza i wzajemnym oddziaływaniem z różnymi komórkami gospodarza, z których wszystkie przyczyniają się do selektywnego nacisku na dalsze zmiany genetyczne lub epigenetyczne1,2,3. W kontekście guzów litych nierównomierne rozmieszczenie chemioterapeutyków i innych gradientów zasobów przyczynia się do ich niejednorodności molekularnej i może odgrywać rolę w rozwoju oporności na leki, zwiększonej angiogenezie do określonych subpopulacji nowotworów, a nawet przerzutów4,5,6. Konwencjonalne badania 2D hodowli komórkowych in vitro, choć dysponują dużą skalą, wygodną zdolnością doświadczalną, zapewniają warunki pola średniego, jednolite i stałe, często pozbawione precyzyjnej kontroli przestrzennej i czasowej środowiska niezbędnej do prawdziwego naśladowania dynamiki guza in vivo. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania bardziej reprezentatywnych modeli ex vivo w celu odtworzenia mikrośrodowiska guza przed modelami zwierzęcymi w procesie opracowywania leków, aby lepiej przewidywać progresję raka, a także reakcje na leki w dynamicznych krajobrazach stresu. Zaproponowano mikrofluidykę, aby wypełnić lukę między badaniami 2D nad hodowlami komórkowymi a bardziej złożonymi badaniami na zwierzętach in vivo, które mogą nie być w stanie wesprzeć kontrolowanych badań ilościowych7,8,9.

Idealny system in vitro do charakteryzowania dynamiki komórek nowotworowych powinien posiadać zdolność do generowania heterogenicznego mikrośrodowiska do naśladowania adaptacyjnych odpowiedzi komórkowych, które mogą mieć miejsce w guzie, a także umożliwiać obserwację tej dynamiki w rozdzielczości pojedynczej komórki. W tym artykule opisujemy mikroprzepływową platformę hodowli komórkowych, urządzenie oparte na PDMS o nazwie "Akcelerator Ewolucji" (EA), które pozwala na równoległe badania in vitro dynamiki komórek nowotworowych w rozdzielczości komórkowej z akwizycją danych w czasie rzeczywistym w ciągu kilku tygodni, przy jednoczesnym stabilnym utrzymaniu gradientów stresu w całym krajobrazie hodowli. Projekt tej platformy opiera się na naszych wcześniejszych pracach, w których dynamika ewolucyjna organizmów w metapopulacji może być przyspieszona10,11. W szczególności w grupie przestrzennie oddzielonych populacji, które oddziałują na siebie na pewnym poziomie, po wystawieniu na niejednorodny krajobraz stresu, najbardziej przystosowane gatunki mogą dominować w lokalnej populacji szybciej w porównaniu z dużą jednolitą populacją. Korzystne gatunki migrują następnie do sąsiednich mikrosiedlisk w poszukiwaniu zasobów i przestrzeni, aby ostatecznie zdominować całą populację. Jak pokazano na Rysunek 1, wzór mikroprzepływowego chipa EA składa się z (i) pary kanałów serpentynowych, które zapewniają cyrkulację świeżego podłoża i konstruują stałe warunki brzegowe dla dyfuzji chemicznej, oraz (ii) sześciokątnego obszaru hodowli komórek, który składa się ze 109 połączonych ze sobą sześciokątnych i 24 półsześciokątnych komór w środku, przypominających strukturę plastra miodu. Chip ma głębokość 100 μm. Kanały pożywkowe i obszar hodowli komórkowej są połączone małymi szczelinami (o szerokości około 15 μm), które zapobiegają bezpośredniemu przepływowi pożywki i wynikającemu z tego naprężeniu ścinającemu w obszarze hodowli komórkowej, a jednocześnie umożliwiają dyfuzję chemikaliów przez małe szczeliny i wymianę składników odżywczych, odpadów metabolicznych itp. Generowanie gradientów chemicznych jest pokazane w Rysunek 1B, gdzie jeden kanał medialny zawiera 0,1 mM fluoresceiny, podczas gdy drugi kanał jest wolny od fluoresceiny. Komórki są hodowane na membranie przepuszczającej gaz, otoczonej mikrostrukturami poprzez dodatnie ciśnienie zwrotne na membranie w stosunku do chipa. Elementy uchwytu urządzenia są zilustrowane na Rysunek 2, a konfiguracja eksperymentalna jest zilustrowana na Rysunek 3, gdzie hodowla jest utrzymywana na odwróconym mikroskopie w temperaturze 37 °C, przy wilgotności względnej powyżej 85% i kondycjonowana w składzie gazu normoxia.

Ten system zapewnia szczegółową obserwację zlokalizowanych interakcji komórkowych za pośrednictwem kanałów jasnego pola i fluorescencji oraz pozwala na przestrzennie rozdzielcze testy niższego szczebla, takie jak immunofluorescencja, Western blot lub spektrometria mas. Wcześniej wykazaliśmy jako dowód słuszności tego mikroprzepływowego modelu raka na chipie długoterminową kokulturę nabłonkowych i mezenchymalnych komórek raka prostaty PC3 w 12, a także pojawienie się opornych na leki poliploidalnych gigantycznych komórek rakowych przy użyciu nabłonkowej linii komórkowej PC313. Podczas gdy przedstawiamy zastosowanie tej platformy do zrozumienia czasoprzestrzennej dynamiki nabłonkowego PC3 i mezenchymalnych komórek raka prostaty pod gradientem stresu docetakselu, system mikroprzepływowy można łatwo zastosować do dowolnej kombinacji linii komórkowych i gradientów zasobów (tj. leków, składników odżywczych, tlenu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja urządzenia mikroprzepływowego

  1. Wygeneruj żądany wzór mikroprzepływowy za pomocą oprogramowania do projektowania układu (patrz Materiały dodatkowe).
  2. Stwórz fotomaskę. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać więcej informacji.
    1. Za pomocą pisarki laserowej napisz wzór na płytce ze szkła sodowo-wapniowego pokrytej 100 nm Cr i 500 nm fotorezystu AZ1518.
    2. Wywołaj fotorezystor za pomocą AZ300MIF wywoływacza przez 60 s.
    3. Wytrawić chrom bez ochrony przed fotorezystem za pomocą wytrawiacza chromowego Cr-7.
    4. Usunąć resztki fotorezystu za pomocą środka do usuwania fotorezystu w temperaturze 70 °C przez 45 minut.
  3. Wzór fotorezystu. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać więcej informacji.
    1. Wiruj HMDS na płytce krzemowej z prędkością 4000 obr./min przez 40 s.
    2. Fotorezystor wirowy AZ4330 na płytce krzemowej z prędkością 4000 obr./min przez 40 s.
    3. Wafel silikonowy pieczemy na miękko w temperaturze 95 °C przez 60 sekund.
    4. Użyj nakładki maski, aby wystawić promieniowanie UV na płytkę silikonową.
    5. Wywołaj fotorezystor za pomocą AZ300MIF wywoływacza przez 4 minuty.
  4. Wykonaj wytrawianie DRIE. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać więcej informacji.
    1. Wytrawić na sucho płytkę z wzorem fotorezystu za pomocą systemu Silicon Deep Reactive Ion Etching (DRIE) na głębokość 100 μm.
    2. Zdejmij fotorezyst acetonem i wytrawiaj plazmowo za pomocą wytrawiacza plazmowego.
  5. Utlenianie i silanizacja wafli. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać więcej informacji.
    1. Przeprowadzić utlenianie termiczne na wytrawionej płytce krzemowej w piecu w temperaturze 1100 °C przez 1 godzinę.
    2. Poczekaj, aż płytka krzemowa ostygnie, a następnie umieść wafel w eksykatorze z kilkoma kroplami trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooktylosilanu (PFOTS) wlanymi do małego pojemnika w pobliżu płytki.
    3. Pompować ciśnienie eksykatora do 0,5 atm w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Forma wafla krzemowego powinna stać się hydrofobowa po odpowiedniej silanizacji, co można przetestować, dodając kilka kropel wody do płytki.
  6. Miękka litografia. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać więcej informacji.
    1. Wymieszać prepolimer i środek sieciujący (z zestawu do polifetylosiloksanu metylosiloksanu) w stosunku wagowym 10:1.
    2. Wlej zmieszany PDMS, aby utworzyć film o wysokości 10 mm na silanizowaną formę waflową z krzemu.
    3. Odgazowanie powstałego układu PDMS-krzemowa płytka krzemowa w eksykatorze przez 30 minut do 1 godziny.
    4. Inkubować wafel krzemowy PDMS w inkubatorze o temperaturze 70 °C przez noc w celu utwardzenia PDMS.
    5. Po utwardzeniu PDMS ostrożnie zdejmij folię PDMS z płytki krzemowej.
    6. Za pomocą igieł do biopsji wybij otwory przelotowe w portach wlotowych w oparciu o położenie wzoru na PDMS i użyj okrągłego stempla do cięcia wiórów o średnicy 27 mm.
  7. Klejenie warstw PDMS.
    1. Utwardzaj na gorąco dwa stosy butli PDMS o średnicy 27 mm (bez wzoru), które staną się warstwą zbiornika i warstwą zamykającą urządzenie.
    2. Wytnij dwa 7-milimetrowe okręgi wokół wlotów na warstwie zbiornika i użyj igły do biopsji, aby przebić otwory w otworach wlotowych w warstwie zakrywającej.
    3. Połącz trzy stosy PDMS (wzorzysty stos, warstwa zbiornika, warstwa zakrywająca) za pomocą plazmy tlenowej.
    4. Za pomocą igły do biopsji przebij otwory przelotowe w wylotach i środkowym porcie urządzenia.

2. Przygotowanie pożywek i linii komórkowych

  1. Przygotuj pożywkę do hodowli linii komórkowych PC3, w tym PC3-EMT i PC3-EPI: zmieszaj pożywkę RPMI 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1x antybiotyko-antybiotykiem. Wygeneruj linie komórkowe zgodnie z wcześniejszym opisem14.
    UWAGA: Linie komórkowe PC3 są utrzymywane w powyższych pożywkach w nawilżanych inkubatorach w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Dziel komórki i subkulturę co 3 dni, zanim osiągną 100% zbieżności.
  2. Transfekcyjne linie komórkowe z cytoplazmatycznymi markerami fluorescencyjnymi dla lepszej wizualizacji, jak opisano wcześniej12, tak, że PC3-EMT wyraża cytoplazmatyczne GFP, a PC3-EPI wyraża cytoplazmatyczne mCherry. Należy pamiętać, że technologia jest również kompatybilna z dowolnymi komórkami znakowanymi fluorescencyjnie, a także z obrazowaniem w jasnym polu nieznakowanych komórek.

3. Konfiguracja eksperymentalna

  1. Produkcja uchwytu na metalową płytę
    1. Wyprodukuj uchwyt na płytkę, który jest wystarczający do jednoczesnego przechowywania przepuszczających gaz naczyń hodowlanych do równoległych eksperymentów poprzez obróbkę skrawaniem lub drukowanie 3D. Plik CAD 3D ("płytka 3-dołkowa. FCStd") można znaleźć w serwisie GitHub jako odniesienie (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
    2. Odkręć elementy uchwytu (Rysunek 2) za pomocą śrubokręta. Zdezynfekować elementy poprzez naświetlanie promieniami UV przez co najmniej 1 godzinę i pozostawić w sterylnym środowisku.
      UWAGA: Uchwyt został zaprojektowany tak, aby zapewnić odpowiednie warunki do równowagi termicznej i idealnego składu gazu, z wlotami kanałów gazowych, które umożliwiają przepływ powietrza. Więcej szczegółów można znaleźć w naszej poprzedniej pracy 12.
    3. Przygotuj do trzech przepuszczalnych dla gazów naczyń hodowlanych, z których błona hodowli komórkowej jest stosunkowo elastyczna.
  2. Wysiewanie linii komórkowych
    1. Na 24 godziny przed rozpoczęciem doświadczenia należy pobrać komórki PC3-EPI i PC3-EMT przez trypsynizację przez 5 minut. Dodać podgrzaną pożywkę hodowlaną, następnie odwirować przy 150 x g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.
    2. Policz komórki każdego PC3-EPI i PC3-EMT za pomocą hemocytometru i wyizoluj łącznie 2,5 x 104 każdego typu komórek dla każdej przepuszczalnej dla gazów płytki hodowlanej.
    3. Wymieszać i ponownie zawiesić oba typy komórek w 2 ml pożywki hodowlanej i umieścić komórki w każdym z naczyń hodowlanych przepuszczających gaz.
    4. Pozostaw cały uchwyt płytki w inkubatorze na noc, aby komórki mogły się przyczepić.
    5. Zdezynfekuj urządzenia PDMS poprzez ekspozycję na promieniowanie UV przez co najmniej 1 godzinę i pozostaw w sterylnym środowisku.
  3. Konfiguracja termicznej jednostki sterującej i systemu zasilania gazem
    1. Jak pokazano na Rysunek 3, skonfiguruj system zasilania gazem, który składa się zarówno z jednostek sterującychCO2, jak i O2, pompy gazowej, komory mieszania gazów, nawilżacza lub bełkotki oraz trzech oddzielnych zestawów zaworów gazowych i manometrów. Więcej szczegółów można znaleźć w naszej poprzedniej pracy 12.
    2. Ustawić jednostki sterujące CO2 i O2 w taki sposób, aby regulowały szybkość mieszania gazu ze zbiorników CO2 i N2 oraz źródłaO2 . Alternatywnie działałby każdy system zaopatrzenia w gaz, który dostarcza gaz w warunkach normoksji.
    3. Upewnij się, że gaz, który jest połączony w komorze mieszania i nawilżony przez bełkotkę, jest tak wysoki, że wilgotność względna wzrasta do 85% (zgodnie z odczytem z monitora wilgotności względnej) i że gaz prowadzi do trzech niezależnych zaworów gazowych z manometrami w celu kontrolowania i monitorowania natężenia przepływu gazu w uchwycie płyty.
    4. Umieścić cały uchwyt płytki w umieszczonej na etapie inkubacji jednostce termicznej kontroli z oddzielnymi podzespołami grzewczymi dla pokrywy i dolnej płyty, przy wszystkich jednostkach ustawionych na 37 °C. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać więcej informacji.
  4. Instalacja urządzenia mikroprzepływowego. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać więcej informacji.
    1. Sprawdź, czy szczegółowe elementy uchwytu płytki 3-dołkowej są w porządku, jak na rysunku Rysunek 2. Każda z trzech studni jest identyczna i niezależna, z parą kanałów gazowych dla każdej studni. Każda studzienka posiada przepuszczający gaz uchwyt na miskę hodowlaną, uchwyt na chip PDMS, szklany uchwyt na okienko i parę szklanych okien o średnicy 35 mm. Elementy te można montować za pomocą zamontowanych.
      UWAGA: Szklane okna zapewniają izolowaną termicznie przestrzeń między przepuszczalną dla gazu membraną hodowlaną a studnią, tak aby nie dochodziło do kondensacji wody z powodu różnic temperatur na granicy faz. Należy pamiętać, że 3 studnie są niezależne, a 3 eksperymenty można wykonać osobno.
    2. Wstępnie ogrzać pożywkę hodowlaną w temperaturze 37 °C i odgazować w komorze próżniowej przez 20 minut.
    3. Traktuj chipy PDMS za pomocą systemu plazmy tlenowej przez 30 s w celu utrzymania hydrofilowości.
    4. Skonfigurować system strzykawkowy. Powoli załadować dwie strzykawki pożywką wzrostową, a pozostałe dwie strzykawki z pożądanym odczynnikiem (pożywka, pożywka z lekiem itp.). Podłącz każdą pojedynczą strzykawkę do rurki o długości 50 cm (0,020" x 0,060"OD) za pomocą igły dozującej 23 G do jednego wydrążonego stalowego kołka. Włóż wydrążony stalowy kołek do drugiego końca rurki.
    5. Zagruntować rurkę i włożyć stalowy kołek do każdego chipa PDMS przez warstwę zakrywającą. Napełnij warstwę zbiornika i zwilż wzór warstwy wzoru PDMS nośnikiem. Warstwa zbiornika działa jak pułapka bąbelkowa na chipie, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do wzorca mikroprzepływowego.
    6. Załadować strzykawkę o pojemności 1 ml pożywką hodowlaną. Podłączyć strzykawkę do rurki o średnicy 5 cm (0,020" x 0,060"OD) za pomocą igły dozującej 23 G do jednego wydrążonego stalowego kołka. Włóż wydrążony stalowy kołek do drugiego końca rurki i zalej rurkę.
    7. Włóż wydrążony stalowy kołek do środkowego otworu wióra, skąd nadmiar mediów może zostać usunięty z wióra później podczas procesu uszczelniania wiórów.
    8. Ponieważ każde urządzenie PDMS wymaga czterech strzykawek o pojemności 10 ml załadowanych do pompy strzykawkowej, należy załadować dwie strzykawki o pojemności 10 ml na chip do pokładu dziobowego. Umieścić dwie pozostałe strzykawki w zestawie wyjmującym systemu strzykawkowego.
    9. Umieść chip bezpośrednio na przepuszczalnych dla gazów membranach hodowlanych (z komórkami już przyklejonymi do membran). Aby uniknąć uwięzienia mikropęcherzyków we wzorze mikroprzepływowym, przed montażem należy wlać 1 ml wstępnie podgrzanego i odgazowanego podłoża do przepuszczalnej dla gazu płytki hodowlanej o średnicy 35 mm, a następnie upewnić się, że chip zbliża się do powierzchni cieczy pod kątem 15 stopni.
    10. Clamp przepuszczalną dla gazu naczynię hodowlaną i studzienkę w uchwycie naczyń do hodowli gazów dla każdego chipa, przy czym uchwyt chipa PDMS popycha urządzenie PDMS w dół.
    11. Przyklej arkusz zgrzewarki do urządzenia PDMS i zaciśnij go za uchwyt na wióry PDMS, aby zapobiec wysychaniu wióra.
    12. Ustaw natężenie przepływu mediów wokół matrycy na 20 μl/h.
    13. Umieść całą płytkę w inkubatorze na stoliku na zmotoryzowanym stoliku odwróconego mikroskopu. Podłącz system zasilania gazem do kanałów gazowych i dotrzymuj pod ciśnieniem membranę hodowlaną przepuszczającą gaz do zainstalowanego chipa PDMS, aby zapewnić uszczelnienie urządzenia. Utrzymuj ciśnienie manometryczne na poziomie 0.2 psi (1.4 x 104 Pa).
    14. Powoli usuń nadmiar pożywki z chipa za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml ze środkowego otworu. Obserwuj wiór pod mikroskopem podczas ekstrakcji mediów, a następnie przerwij ekstrakcję, gdy wiór jest zgrzewany. Uszczelnianie wiórów powinno być oczywiste, ponieważ część komórek zostałaby zmiażdżona przez mikrostruktury.
    15. Podłączyć czujnik temperatury inkubatora na poziomie do płytki 3-dołkowej i ustawić na 37 °C.

4. Obrazowanie poklatkowe pojedynczej komórki

  1. Skonfiguruj oprogramowanie do obrazowania wykorzystujące odwrócony mikroskop do akwizycji obrazu poklatkowego. Należy pamiętać, że do eksperymentu EA wymagany jest odwrócony mikroskop fluorescencyjny z w pełni zmotoryzowanym stolikiem x-y, pokrętłem ostrości, migawką i kostkami filtrującymi.
  2. Skonfiguruj oprogramowanie do pozyskiwania obrazów w dwóch kanałach przy 10-krotnym powiększeniu dla każdego układu z automatycznym łączeniem obrazu po jednej rundzie autofokusa. Należy pamiętać, że systemy automatycznej korekcji, takie jak Perfect Focus, nie gwarantują zadowalającej jakości obrazu. Bardziej zalecane jest wygenerowanie niestandardowej powierzchni ostrości do długotrwałej akwizycji obrazu w oparciu o autofokus lub ręczne ustawianie ostrości na chipie.
  3. Rób zdjęcia co godzinę i pozostaw eksperyment uruchomiony w skali tygodni. Codziennie monitoruj jakość obrazu i w razie potrzeby aktualizuj powierzchnię ostrości.
  4. Przygotuj chip PDMS i przepuszczalne dla gazu naczynie hodowlane do późniejszej analizy immunofluorescencyjnej, jak opisano wcześniej13.

5. Przetwarzanie i analiza obrazu

  1. Przetwarzanie poeksperymentalne
    1. Konwertuj obrazy do formatu TIFF w celu przetwarzania obrazu i pomiarów z wykorzystaniem Fiji/ImageJ.
    2. Kompresuj pliki TIFF w celu ułatwienia dalszego przetwarzania obrazu.
  2. Analiza Fidżi/ImageJ
    1. Aby zidentyfikować komórki, wykonaj odejmowanie tła i analizę cząstek, aby zidentyfikować fluorescencyjne jasne punkty w celu wykrywania lokalizacji komórek i automatycznego zliczania komórek.
    2. Wykorzystaj wtyczki (Manual Tracking, Chemotaxis, Migration Tool, Trackmate) do analizy ruchliwości i migracji komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Walidacja optymalnego wzrostu komórek na chipie
Głównym celem platformy eksperymentalnej jest kompleksowe odtworzenie kluczowych komponentów i oddziaływań w złożonym mikrośrodowisku nowotworowym, przy jednoczesnym zachowaniu wystarczającej prostoty, aby zapewnić ilościowe, wiarygodne i powtarzalne dane. Cel ten można osiągnąć jedynie przy pełnej kontroli nad fizycznymi i biochemicznymi czynnikami środowiskowymi. Musimy albo wyeliminować niepożądane czynniki, albo znal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Konwencjonalna hodowla komórkowa została opracowana prawie sto lat temu i pozostaje najczęściej stosowanym modelem przedklinicznym w badaniach biomedycznych, pomimo udowodnionej ograniczonej zdolności do przewidywania wyników klinicznych w przypadku raka17. Modele zwierzęce oferują najwyższe znaczenie fizjologiczne i rozsądne podobieństwo genetyczne do ludzi, ale od dawna uznaje się, że mają znaczące ograniczenia w przewidywaniu wyników u ludzi18. Spośród wszystkich istniej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NSF PHY-1659940.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 ml strzykawki BD Luer-Lok z końcówkąBD14-823-16E
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczoSigma-AldrichA59551x anty-anty
AZ 300 MIFMerck KGaA18441123163Wywoływacz fotorezystu
AZ1518Merck KGaAAZ1518Fotorezystor
AZ4330Merck KGaAAZ4330Fotorezystor
Cr Wytrawiacz chromowySigma-Aldrich651826
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Life Technologies Corporation10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriterHeidelberg InstrumentsDWL66+Pisanie fotomaski
Hexamethyldisilazan (HMDS)Sigma-Aldrich379212Do zwiększenia przyczepności fotorezystu
Puste stalowe kołkiNowość Anglia Mała ruraNE-1300-01 . 025 OD .017 ID x .500 długi / typ 304 WD fullhard
ibidi System grzewczy, płytki wielodołkowe, K-Frameibidi10929Inkubator nasadowy 
Igła dozująca Luer-Lok 23 GMcMaster-Carr75165A684Do łączenia strzykawek i rurek
Naczynie Lumox 35Sarstedt94.6077.331Przepuszczalne dla gazów naczynie do hodowli komórkowych
Microposit Remover 1165Dow Electronic MaterialsMicroposit Remover 1165Ściągacz do usuwania fotorezystu
Microseal B Klej uszczelniającyBio-Rad LaboratoriesMSB1001Klej uszczelniacz
O-ring (do uszczelniania płyt Lumox)McMaster-Carr9452K114Kreska nr 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-ring (do uszczelniania dolnej szyby)McMaster-Carr9452K74Deska rozdzielcza nr 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen System do czyszczenia/trawienia plazmowegoPlasmatic Systems, IncplazmowyPlasma-Preen
RPMI 1640Life Technologies Corporation11875-093
Samco RIE800iPB DRIESamcoRIE800iPBSystem głębokiego reaktywnego wytrawiania jonowego
Suss MA6 Nakładka do maski SUSSMicroTecMA6Nakładka do maski 
Sylgard 184 Elastomer silikonowyFisher ScientificNC9285739PDMS elastomer
TePla M4L wytrawiacz plazmowyPVA TePlaM4LWytrawiacz plazmowy
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooktylosilan (PFOTS)Sigma-Aldrich448931Do silanizacji wafli krzemowych
Rurka mikrootworowa Tygon (0,020" x 0,060"OD)Cole-ParmerEW-06419-01Rurki do dostarczania nośników
System Oxygen

Bibliografia

  1. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  2. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  3. Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
  4. Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
  5. Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214(2012).
  6. Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142(2015).
  7. Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
  8. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  9. Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
  10. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
  11. Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
  12. Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001(2017).
  13. Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
  14. Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773(2013).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  17. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  18. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  19. Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
  20. Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
  21. Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).
  22. Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Mikrofluidyczny układ nowotworu na chipiegenerowanie gradientu lekuobrazowanie w czasie rzeczywistymanaliza migracji komórekśledzenie dynamiki populacjihodowla przepuszczalna dla gazówuszczelnianie chipa PDMSmetoda uszczelniania ciśnieniowegoeksperyment długoterminowy
Generowanie heterogenicznych gradientów leków w różnych populacjach nowotworów w akceleratorze ewolucji mikroprzepływowej do obserwacji w czasie rzeczywistym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.