Artykuł metodologiczny

Obrazowanie żywotności luminescencjiO2 za pomocą systemu kamer opartego na domenie częstotliwości

DOI:

10.3791/60191

⸱

16 grudnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Marine Biological Section, Department of Biology, University of Copenhagen, 2Center for Electromicrobiology, Aarhus University, 3PCO AG, 4Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 5Aarhus University Centre for Water Technology, Section for Microbiology, Department of Bioscience, Aarhus University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy użycie nowatorskiej kamery o żywotności luminescencji w dziedzinie częstotliwości do mapowania rozkładów 2D O2 za pomocą folii czujników optycznych. Opisano system kamer i procedury analizy obrazu wraz z przygotowaniem, kalibracją i aplikacją folii sensorycznych do wizualizacji mikrośrodowiskaO2 w ryzosferze roślin wodnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę obrazowania rozpuszczonego tlenu (O2) w 2D w wysokiej rozdzielczości przestrzennej (< 50-100 μm) i czasowej (< 10 s). Metoda wykorzystuje czułe folie czujników luminescencyjnych O2 (optody planarne) w połączeniu ze specjalistycznym systemem kamer do obrazowania czasu życia luminescencji w dziedzinie częstotliwości. Optody planarne przygotowuje się przez rozpuszczenie barwnika wskaźnikowego wrażliwego naO2 w polimerze i rozprowadzenie mieszaniny na stałym podłożu o określonej grubości za pomocą powłoki nożowej. Po odparowaniu rozpuszczalnika, planarna optoda jest umieszczana w bliskim kontakcie z próbką będącą przedmiotem zainteresowania - tutaj pokazano z korzeniami rośliny wodnej Littorella uniflora. Zależna od stężenia O2 zmiana czasu życia luminescencji barwnika wskaźnikowego w optodzie płaskiej jest obrazowana przez tylną stronę przezroczystej folii nośnej i ścianę akwarium za pomocą specjalnej kamery. Kamera ta mierzy czas życia luminescencji (μs) poprzez przesunięcie kąta fazowego między modulowanym sygnałem wzbudzenia a sygnałem emisyjnym. Metoda ta jest lepsza od metod obrazowania intensywności luminescencji, ponieważ sygnał jest niezależny od stężenia barwnika lub intensywności źródła wzbudzenia i opiera się wyłącznie na czasie zaniku luminescencji, który jest parametrem nieodłącznie odwołującym. W związku z tym nie jest potrzebny dodatkowy barwnik referencyjny ani inne środki odniesienia. Demonstrujemy zastosowanie systemu do makroskopowego obrazowania O2 ryzosfer roślinnych, ale system kamer można również łatwo połączyć z mikroskopem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozkład i dynamika rozpuszczonych gazów i jonów w osadach i glebach dostarczają kluczowych informacji na temat procesów biogeochemicznych, takich jak oddychanie mikrobiologiczne1,2, czyli radialna utrata tlenu z korzeni roślin3,4,5, oraz chemiczne mikrośrodowisko mikrobów6,7, plant rhizospheres5,8,9 and animal norrows10,11,12. Aktywność biologiczna i chemiczna w takich środowiskach o ograniczonej dyfuzji może tworzyć strome gradienty substratów chemicznych lub produktów procesów biogeochemicznych. W szczególności dostępnośćO2 ma ogromny wpływ na procesy biogeochemiczne, a tym samym na biologię i ekologię systemu13. Dlatego analiza stężeńO2 w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej ma pierwszorzędne znaczenie w naukach wodnych i lądowych. Po pierwsze, do pomiaru tego ważnego analitu opracowano mikroczujniki elektrochemiczne i optyczne14,15. Później wprowadzono dwuwymiarowe (2D) obrazowanie O2 z płaskimi optodami12,16,17,18,19, co umożliwiło wizualizację i kwantyfikację niejednorodnego rozkładuO2 w glebach i osadach.

Planarne optody O2 składają się z barwnika wskaźnikowego wrażliwego na O220, który rozpuszcza się w odpowiednim polimerze21. Barwnik wskaźnikowy jest wzbudzany przy określonych długościach fal optycznych i emituje światło przesunięte ku czerwieni po relaksacji w postaci luminescencji. W obecnościO2 wzbudzony barwnik wskaźnikowy może przenieść swoją energię do cząsteczkiO2 po zderzeniu, co jest określane jako wygaszanie luminescencji oparte na zderzeniu22. W związku z tym intensywność luminescencji, jak również czas życia luminescencji są zmniejszane wraz ze wzrostem stężeniaO223. W idealnym przypadku zmiana intensywności i czasu życia jest zgodna z równaniem Sterna-Volmera (równanie 1) przy użyciu natężenia luminescencji lub czasu życia przy braku (I0; τ0) lub obecności (I, τ)O2 przy danym stężeniu [Q]. Stała Sterna-Volmera (Ksv) jest miarą czułości optody w stosunku do O2; KSV jest zależny od zmiennych środowiskowych, takich jak temperatura i ciśnienie.

(1) figure-introduction-1

Rejestrowanie takich zmian luminescencji na płaskiej folii sensora za pomocą systemu kamer może być wykorzystane do wizualizacji odpowiednich zmian w rozkładzie O2. Początkowo stosowano proste obrazowanie O2 oparte na intensywności luminescencji18. Taka metodologia jest jednak bardzo wrażliwa na zakłócenia zewnętrzne, które zagrażają wiarygodności wyników ze względu na niejednorodne oświetlenie, wahania źródła wzbudzenia lub kamery, a także nierównomierny rozkład barwnika wskaźnikowego w optodzie płaskiej.

Niektóre z tych ograniczeń mogą być złagodzone poprzez użycie płaskich optodów do obrazowania ratiometrycznego17,24, gdzie barwnik wskaźnikowy wrażliwy na O2 jest współunieruchomiony w warstwie polimerowej płaskiej optody za pomocą niewrażliwego barwnika referencyjnego emitującego w innym zakresie spektralnym niż wskaźnik O2. Na podstawie obrazów emisyjnych uzyskanych w dwóch oknach spektralnych, sygnał emisyjny czuły naO2 jest dzielony przez sygnał odniesienia, generując obraz proporcjonalny, który jest mniej podatny na wyżej wymienione zakłócenia5,17. Metoda wymaga użycia drugiego barwnika, który w idealnym przypadku może być wzbudzony przez to samo źródło wzbudzenia, ale emituje go na innej długości fali (bez znacznego nakładania się widma), w innym oknie widmowym kamery (np. w innym kanale barwnym kamery RGB).

Alternatywnie, obrazowanie O2 może opierać się na ilościowym określeniu zależnej od O2 zmiany czasu życia luminescencji barwnika wskaźnikowego, na którą nie ma wpływu nierównomierne oświetlenie lub niejednorodność stężenia wskaźnika25. Pierwsze systemy obrazowania O2 oparte na żywotności luminescencji opierały się na pomiarach w dziedzinie czasu za pomocą systemu kamer CCD z możliwością bramki26, gdzie wykorzystywane jest źródło wzbudzenia impulsowego, a obrazy luminescencji są wykonywane w określonych przedziałach czasowych w zakresie wzbudzenia lub emisji wskaźnika8,23,27. Na podstawie takich obrazów można określić czas życia luminescencji i skorelować go z odpowiednim stężeniemO2 w kalibracji. Następnie obrazy czasu życia luminescencji dla danej próbki przyciśniętej do płaskiej optody mogą być konwertowane na obrazy odpowiedniego rozkładu 2D stężeniaO2. System ten był używany w wielu aplikacjach, zarówno w laboratorium, jak i in situ16,28, ale podstawowa kamera CCD z możliwością bramki nie jest już dostępna na rynku.

Niedawno wydano inny system kamer o żywotności luminescencji, który rejestruje obrazy w dziedzinie częstotliwości8. System opiera się na stale modulowanym źródle światła do wzbudzenia. Może to być fala sinusoidalna lub prostokątna zamiast wzbudzenia impulsowego, które jest wykorzystywane do akwizycji obrazu w dziedzinie czasu. Modulacja ta powoduje modulowaną emisję luminescencji barwnika wskaźnikowegoO2, która jest przesunięta w fazie o kąt φ, który jest zależny od czasu trwania luminescencji barwnika wskaźnikowego (τ) (patrz równanie 2).

(2) figure-introduction-2

Zmiana między amplitudą wzbudzenia a emisji (tj. tak zwanym wskaźnikiem modulacji lub głębokością (amplituda podzielona przez część stałej luminescencji)) jest również zależna od czasu życia luminescencji. Tak więc, ustawiając znaną częstotliwość modulacji, specjalny przetwornik obrazu CMOS w kamerze jest w stanie zmierzyć czas trwania luminescencji w zakresie od ns do μs, jak opisano szczegółowo w innym miejscu 8,29,30. Ogólny przewodnik po zasadzie działania można znaleźć (korzystając z poniższego linku https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).

W poniższym protokole demonstrujemy użycie nowatorskiego systemu kamer do obrazowania rozkładu stężenia O2 wokół korzeni wodnej rośliny słodkowodnej Littorella uniflora w 2D9,31. Pragniemy podkreślić, że ta metoda nie jest w żadnym wypadku ograniczona do tej aplikacji. Optyczne czujniki tlenu lub cząstki czujnika27 w połączeniu z różnymi metodami obrazowania były używane w badaniach medycznych32, w bioprinting33, dla farb wrażliwych na nacisk34,35, lub do badania systemów fotosyntetycznych2,36,37, by wymienić tylko kilka innych pól aplikacja.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wykonanie płaskiej optody O2

  1. Rozpuścić 1,5 mg luminescencyjnego barwnika wskaźnikowegoO2 platyny(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorofenylo)-porfiryny (PtTFPP) i 100 mg polistyrenu (PS) w 1 g chloroformu, aby otrzymać tzw. "koktajl czujnikowy".
    UWAGA: Koktajl można przechowywać w zamkniętej, gazoszczelnej szklanej fiolce przez kilka godzin w lodówce i ciemności do dalszego użycia.
  2. Przymocuj czystą, bezpyłową folię z politereftalanu etylenu (PET) (rozmiar zależny od zastosowania) na oczyszczonej szklanej płycie za pomocą folii wodnej lub etanolowej (70%) (Rysunek 1A).
  3. Umieść oczyszczone urządzenie do powlekania noża (120 μm) na folii i nałóż linię koktajlu czujnika przed urządzeniem za pomocą szklanej pipety (Rysunek 1B). Następnie powoli i równomiernie przeciągnij nóż do powlekania po folii PET, aby równomiernie rozprowadzić koktajl.
    UWAGA: Wszystkie materiały i narzędzia muszą być dokładnie wyczyszczone, a produkcja powinna odbywać się w środowisku wolnym od kurzu, takim jak wyciąg, ławka przepływowa lub pod urządzeniem ssącym punktowym. Aby uniknąć niejednorodności w końcowej folii czujnika, kroki następujące po nałożeniu koktajlu czujnika na folię powinny być wykonane szybko, ponieważ chloroform szybko odparowuje.
  4. Suszyć gotową płaską optodę wrażliwą na O2 w powietrzu otoczenia przez 1 godzinę, a następnie przez noc w komorze grzewczej w temperaturze 50-60 °C, uzyskując końcową grubość warstwy po odparowaniu rozpuszczalnika ~12 μm. Wytworzone optody należy przechowywać w ciemności (np. w papierowej kopercie) do czasu dalszego użycia (Rysunek 1C).
    UWAGA: Optody Planar O2 mogą być przechowywane w suchym i ciemnym miejscu przez kilka miesięcy do lat przed użyciem. Udowodniono, że końcowa grubość warstwy w zakresie 1-20 μm zapewnia dobre wyniki, z wystarczającym sygnałem luminescencyjnym i odpowiednim czasem reakcji.

2. Komora Rhizo-sandwich

  1. Wyczyść dwie szklane płytki (24,5 x 14 cm2, grubość: 4 mm) 96% etanolem.
  2. Za pomocą światłoutwardzalnego kleju błyskawicznego na bazie akrylu (patrz Tabela materiałów) przykleić szkiełka mikroskopowe (76 x 26 mm2, grubość: 1 mm) wzdłuż krawędzi pierwszej płytki szklanej (tj. strony tylnej komory), pozostawiając jedną długą krawędź otwartą. W razie potrzeby użyj noża do szkła, aby skrócić szkiełka mikroskopowe.
    UWAGA: Cięcie szkła może powodować ostre krawędzie i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
    UWAGA: Szkiełka mikroskopowe pełnią funkcję przekładek między przodem a tyłem, a w zależności od grubości korzeni i wielkości rośliny, wiele warstw szkiełek mikroskopowych można przykleić jedna na drugiej.
  3. Przytnij płaską optodę do wymaganego kształtu i rozmiaru, aby zmieściła się w przestrzeni między sklejonymi szkiełkami mikroskopu. Umieść go po wewnętrznej stronie przedniej szklanej płytki powlekaną stroną do góry, aby umożliwić kontakt z badaną próbką po dociśnięciu do niej.
  4. Przyklej jedną krawędź folii optodowej do szklanej płytki i dodaj kilka kropel wody z kranu między szklaną płytkę a folię optodową (Rysunek 2A). Powoli opuść folię na te kropelki wody, pozwalając jej wyprostować się na powierzchni szkła.
  5. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza uwięzione między optodą planarną a szklaną płytką za pomocą miękkiej chusteczki, unikając zarysowania powłoki czujnika. Wytrzyj szklaną płytkę do sucha i przyklej pozostałe krawędzie folii optodowej do szklanej płytki (Rysunek 2B).
    UWAGA: Należy wybrać taśmę o odpowiedniej przyczepności pod wodą.
  6. Przesiać osad o rozmiarze oczek 0,5 mm. Umieść łyżkę mokrego osadu na pierwszym szklanym talerzu (Rysunek 2C).
    UWAGA: Rozmiar oczek nie powinien być większy niż połowa grubości przekładki.
  7. Rozprowadź osad równomiernie i dostosuj go do tej samej grubości, co przekładki szkiełek mikroskopowych za pomocą płaskiej płytki szklanej. Ostrożnie wyczyść górną powierzchnię szkiełek mikroskopowych, aby upewnić się, że druga szklana płytka prawidłowo uszczelnia komorę.
  8. Nałóż smar silikonowy na powierzchnię szkiełka mikroskopowego. Przykryj osad cienką warstwą wody, ostrożnie unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.
  9. Ostrożnie umyj pojedynczy pęd Littorella uniflora i umieść go na osadzie, tak aby liście rośliny wystawały z górnej otwartej strony (Rysunek 2D).
  10. Umieść drugą szklaną płytkę z przymocowaną do niej optodą na osadzie i delikatnie dociśnij, aby optoda znalazła się w bliskim kontakcie z korzeniami rośliny i otaczającym osadem.
    UWAGA: Pęcherzyki powietrza uwięzione w osadzie można usunąć, przechylając szklane płytki podczas zbliżania ich do siebie.
  11. Przymocuj szklane płytki do siebie za pomocą zacisków (Rysunek 2E). Osusz zewnętrzne krawędzie bibułą. Utrzymuj liście nawilżone przez cały czas składania ryzokanapki (np. poprzez częste dodawanie kilku kropli wody).
  12. Dokręć komorę ryzo-kanapkową za pomocą winylowej taśmy izolacyjnej. Uszczelnij krawędzie plasteliną i dodatkowo zaklej je winylową taśmą izolacyjną (Rysunek 2F).
    UWAGA: Jeśli w osadzie znajduje się wiele pęcherzyków powietrza lub ziarna osadu między szkiełkami mikroskopowymi a drugą szklaną płytką, komorę należy ponownie zmontować, ponieważ woda z porów może wyciekać (powtórz kroki 2.4 - 2.8).
  13. Użyj nieprzezroczystego plastiku, aby przykryć ryzokanapkę, ale pozostaw szczelinę w folii, aby liście rośliny wystawały. Wytnij okienko w plastikowej folii, aby można je było otworzyć do eksperymentów przez rozłożenie. Zamknij okno podczas aklimatyzacji za pomocą gumek recepturek (Rysunek 2G), aby chronić optodę przed blaknięciem fotograficznym podczas inkubacji rośliny.
    UWAGA: Ponieważ wzrost glonów może potencjalnie zakłócać mierzone stężeniaO2, zalecamy próbę jego zminimalizowania poprzez użycie przefiltrowanej wody, wstępnie oczyszczonego sprzętu eksperymentalnego i usunięcie glonów po utworzeniu.

3. Inkubacja w komorze Rhizo-sandwich

  1. Umieść komorę rhizo-sandwich w zbiorniku na wodę (32 x 7 x 28 cm3) w lekko pochylonej pozycji, aby pobudzić wzrost korzeni w kierunku przeciwnym do płaskiej optody.
  2. Napełnij zbiornik na wodę wystarczającą ilością wody, aby całkowicie zanurzyć liście rośliny.
  3. Ustal 14-godzinny cykl światła i 10 godzin ciemności w celu aklimatyzacji rośliny za pomocą lampy sterowanej czasowo. Umieść kamień napowietrzający lub pompę wodną w zbiorniku, aby zapewnić napowietrzenie i wymieszanie wody (Rysunek 2H).

4. Obrazowanie

  1. Konfiguracja obrazowania
    1. Usuń folię z tworzywa sztucznego zakrywającą optody planarnej w komorze ryzo-warstwowej. Ustaw komorę ze szklaną ścianą z optodą pionowo przy ścianie akwarium. Za pomocą przekładki dociśnij komorę ryzo-kanapkową do ściany akwarium.
      UWAGA: Całkowita grubość ścianki akwarium wraz ze ścianką komory ryzo-warstwowej nie powinna być zbyt gruba, jednak grubości szkła dla ścian akwariów do obrazowania luminescencyjnego są zalecane > 1 cm, w celu zmniejszenia przesłuchów przestrzennych poprzez zwiększenie tłumienia rozproszonego światła. Ważne jest, aby użyć tego samego materiału na obie szklane ścianki (ten sam wskaźnik ogniotrwałości), aby zminimalizować rozpraszanie światła na granicy materiałów; ponieważ doprowadziłoby to również do rozmycia obrazu12.
    2. Umieść opartą na dziedzinie częstotliwości kamerę żywotności luminescencji wyposażoną w obiektyw (patrz tabela materiałów) przed akwarium i obszarem zainteresowania (korzenie rośliny wodnej Littorella uniflora, które są w bezpośrednim kontakcie z płaską optodą) (Rysunek 3).
      UWAGA: Kamerę można umieścić na stojaku laboratoryjnym, aby umożliwić łatwą regulację wysokości kamery. Pozycja stanowiska laboratoryjnego powinna być oznaczona i utrzymywana w stałym miejscu. Dodatkowo kamerę można przykleić taśmą do stojaka laboratoryjnego, aby uniknąć przypadkowego ruchu kamery podczas eksperymentu.
    3. Przykręć odpowiedni filtr emisyjny do obrazowania PtTFPP jako barwnika wskaźnikowego (patrz Tabela materiałów) na obiektywie kamery, aby usunąć wnioski ze źródła wzbudzenia.
      UWAGA: Filtry nakręcane są idealne, ale filtry kwadratowe mogą być również używane z odpowiednim adapterem lub po starannym przyklejeniu ich taśmą do obiektywu.
    4. Podłącz źródło wzbudzenia LED (patrz tabela materiałów) do wyjścia modulacji i ciemnej bramki kamery.
      UWAGA: Pierwszy z nich dostarcza sygnał modulacyjny do źródła światła, podczas gdy drugi wyłącza światło podczas odczytu obrazu z przetwornika obrazu. Podłącz źródło wzbudzenia LED i kamerę do komputera. Światło tła powinno być zminimalizowane podczas odczytu obrazu, poprzez przyciemnienie całego pomieszczenia lub nałożenie gęstej, czarnej tkaniny na cały zestaw. W tym drugim przypadku ważne jest, aby zapewnić odpowiednią wentylację, aby uniknąć nagrzewania się kamery.
    5. Zamocuj światłowód w źródle wzbudzenia LED i ustaw go tak, aby równomiernie oświetlał planarną folię optodową pokrywającą obszar zainteresowania.
      UWAGA: W zastosowanym źródle wzbudzenia LED możliwe jest przełączanie między 3 różnymi diodami LED (460 nm, 528 nm, 625 nm), których intensywność można regulować za pomocą oprogramowania sterującego.
  2. Ustawienia i obsługa aparatu
    UWAGA: W opisanych eksperymentach użyliśmy dożywotniej kamery opartej na domenie częstotliwości w połączeniu z dedykowanym modułem do obrazowania dożywotniego w komercyjnie dostępnym pakiecie oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
    1. Przed użyciem wybierz kamerę w wybranym oprogramowaniu.
      UWAGA: Oprogramowanie i sterowniki aparatu należy zainstalować przed rozpoczęciem obrazowania zgodnie z wytycznymi producenta.
    2. Otwórz oprogramowanie sterujące diodami LED (ponownie zainstalowane przed rozpoczęciem eksperymentu) i wybierz odpowiednią diodę LED (tutaj: 528 nm), zaznaczając tryb czuwania. Ustaw intensywność diody LED zgodnie z potrzebami (tutaj na 30%). Upewnij się, że dioda LED jest wyzwalana przez zewnętrzny TTL; odbywa się to poprzez zaznaczenie analogu i synchronizacji dla diody LED.
      UWAGA: Intensywność diody LED należy regulować indywidualnie, ponieważ zbyt duża moc lasera może prowadzić do przyspieszonego wybielania fotograficznego wskaźnika lub barwnika referencyjnego.
    3. Ustaw ostrość aparatu i ręcznie wyreguluj przysłonę obiektywu (w niniejszym badaniu użyj f = 2.8).
      UWAGA: Ważne jest, aby ustawić ostrość kamery na płaskiej optody, a nie na szybie akwarium; Można to zapewnić, wykonując zdjęcie linijką w celu uzyskania skali i skupiając się na cieniu linijki na optode, a nie na rzeczywistej linijce.
    4. Ustaw następujące parametry w panelu sterowania kamery oprogramowania: wewnętrzne źródło modulacji; fala sinusoidalna dla przebiegu wyjściowego; dodatkowe próbkowanie fazowe (Tak); próbki 8-fazowe, odwrotna kolejność faz, odczyt Tap A + B; częstotliwość modulacji 5 kHz.
      UWAGA: Te parametry wpływają na jakość obrazu i w razie potrzeby można je zmienić. Producent kamery udostępnia wytyczne dotyczące poszczególnych parametrów (producent kamery wydaje wytyczne i aktualizacje za każdym razem, gdy oprogramowanie jest aktualizowane).
    5. Zrób zdjęcie referencyjne przed eksperymentami.
      UWAGA: Można to zrobić, obrazując wzorzec kalibracji (barwnik luminescencyjny o znanym czasie życia (ns lub μs)) lub wykorzystując światło odbite od diody LED. W tym drugim przypadku filtr długoprzepustowy emisji musi zostać usunięty z obiektywu, a znany czas życia można ustawić na 1 ns.
    6. Dostosuj czas naświetlania w sekcji kalibracji dedykowanego oprogramowania do obrazowania, aż odczyt statystyk ROI (w dolnej części tego panelu) dla znormalizowanego obrazu o intensywności luminescencji będzie mieścił się w zakresie 0,68 - 0,72,
      UWAGA: Teraz czas życia odniesienia (np. 1 ns) jest podawany jako dane wejściowe do oprogramowania.
    7. Naciśnij przycisk Przechwyć odniesienie, aby rozpocząć pobieranie referencyjnej serii pomiarowej.
      UWAGA: Po zakończeniu dane referencyjne są zapisywane i można wykonać pomiary pojedyncze lub poklatkowe na próbkach.
  3. Kalibracja optodu O2
    1. Umieść kawałek płaskiej optody wrażliwej na O2 w (małym) szklanym akwarium. Zamocować optody planarnej na szklanej ścianie komory kalibracyjnej, jak opisano wcześniej (patrz sekcja 2.3). Umieść akwarium kalibracyjne przed aparatem. Upewnij się, że dioda LED jest równomiernie oświetlona, a także aby optoda wypełniała całe pole widzenia.
      UWAGA: Optoda planarna powinna być wykonana z tego samego kawałka folii lub wykonana z tego samego koktajlu czujnika, co folia użyta w rzeczywistym eksperymencie.
    2. Napełnij akwarium tym samym płynnym podłożem, które zostało użyte w eksperymentach.
      UWAGA: Używanie różnych mediów do kalibracji i eksperymentów może mieć wpływ na pomiar (np. poprzez zmianę odpowiedzi czujnika i/lub rozpuszczalnościO2). W związku z tym kalibracja powinna być wykonywana w tym samym medium i w tej samej temperaturze, co rzeczywisty eksperyment. Wahania temperatury wpływają na sygnał luminescencji i należy ich unikać. Jeśli jednak temperatura nie może być utrzymana na stałym poziomie, należy dokonać kompensacji temperatury poprzez kalibrację optody czułej naO2 (wiele punktów) w różnych (istotnych) temperaturach, a następnie ponowne obliczenie wartości.
    3. Wyregulować stężenieO2 w akwarium kalibracyjnym, przepłukując wodę mieszaniną powietrze/N2 o znanym stężeniuO2, za pomocą urządzenia do mieszania gazów. Upewnij się, że woda jest dobrze zrównoważona ze zużytą mieszanką gazów, napowietrzając przez wystarczająco długi czas (w zależności od natężenia przepływu i wielkości akwarium).
      UWAGA: Zalecamy monitorowanie poziomuO2 w akwarium kalibracyjnym za pomocą zewnętrznego, skalibrowanego czujnikaO2 z kompensacją temperatury (np. za pomocą czujnika światłowodowego lub elektrochemicznegoO2).
    4. Wykonaj serię zdjęć przy różnych stężeniachO2 w komorze kalibracyjnej.
      UWAGA: Należy zmierzyć co najmniej pięć różnych stężeńO2, aby umożliwić prawidłowe dopasowanie krzywej do uzyskanych danych kalibracyjnych. Ważne jest, aby mierzyć przy 0 hPa (warunki beztlenowe), a następnie rozłożyć inne wartości w zakresie dynamiki określonego barwnika wskaźnikowego. Tutaj użyliśmy PtTFPP jako wrażliwego na O2 barwnika wskaźnikowego unieruchomionego w osnowie polistyrenowej. Zdjęcia wykonano przy 0, 48, 102, 156 i 207 hPa; 207 hPa odpowiada 100% nasyceniu powietrza przy danym zasoleniu i ciśnieniu.
  4. Obrazowanie próbki
    1. Umieść próbkę przed kamerą i zapewnij równomierne oświetlenie.
    2. Wyłącz światło naświetlające roślinę (i wszystkie inne źródła światła) tuż przed uzyskaniem obrazu żywotności luminescencji rośliny. Dostosuj czas akwizycji w oparciu o natężenie obrazu, upewniając się, że sygnał nie jest ani przesycony, ani zbyt słaby, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu (S/N) w okresie eksploatacji.
    3. Wystaw roślinę na działanie różnych warunków oświetleniowych (np. jasne/ciemne) i uzyskaj zestaw obrazów.
    4. Włącz światło w pomieszczeniu, aby uzyskać obraz strukturalny.
      UWAGA: Gdy światło tła jest włączone, aparat nie będzie mierzył realistycznego obrazu w całym okresie użytkowania. Jednak obraz intensywności pokazuje teraz całe pole widzenia widziane przez półprzezroczystą optodę.
    5. Zrób zdjęcie za pomocą linijki lub podobnego elementu w polu view, aby umożliwić późniejsze skalowanie uzyskanych obrazów.

5. Analiza danych

  1. Obrazy o okresie życia i intensywności faz można eksportować bezpośrednio z dedykowanego oprogramowania do obrazowania, korzystając z makra dostarczonego przez producenta aparatu.
  2. Wykonaj dalszą analizę obrazu za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów).
  3. Otwórz obrazy czasu życia fazy kalibracji w oprogramowaniu do analizy obrazu i określ średnią całego obrazu za pomocą funkcji pomiaru. Wykreśl zmierzone czasy życia w stosunku do znanych stężeńO2, aby określić funkcję kalibracji (Rysunek 4A).
  4. Oblicz τ0/τ ze wszystkich danych (τ0 to zmierzony czas życia fazy przy brakuO2). Wykreśl te wartości w stosunku do znanych stężeńO2 (Rysunek 4B).
  5. Wyznacz parametry K,sv i f z wykresu kalibracyjnego, używając uproszczonego modelu dwumiejscowego do dynamicznego tłumienia kolizyjnego (równanie 3)38,39 gdzie [Q] jest stężeniemO2. Zdefiniuj funkcję dopasowania w oprogramowaniu do analizy danych, które następnie określa K,sv i f.

(3) figure-protocol-1

  1. Otwórz uzyskane obrazy próbek w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby przeliczyć zobrazowane czasy życia na stężeniaO2, używając określonych parametrów Ksv, f i τ0,
    UWAGA: Jako alternatywne podejście można również bezpośrednio wykorzystać uzyskane wartości żywotności fazy kalibracji (Rysunek 4A). W takim przypadku do kalibracji używane jest dopasowanie wykładnicze przy użyciu funkcji dopasowania krzywej.
  2. Otwórz obraz za pomocą linijki w oprogramowaniu do analizy obrazu i zmierz znaną odległość za pomocą narzędzia pomiarowego. Ustaw tę miarę jako skalę globalną w obszarze Ustaw skalę.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako przykład zastosowania nowego systemu obrazowania, pokazujemy obrazowanie 2D O2 złożonej próbki biologicznej (tj. ryzosfery rośliny wodnej Littorella uniflora).

Po pierwsze, metoda opisuje wytwarzanie płaskiej folii sensorowej, tak zwanej optody planarnej. Jak widać na Rysunek 1, taka optoda składa się z cienkiej warstwy wskaźnika optycznego w matrycy polimerowej, która jest rozłożona na przezroczystym nośniku. Postępując zgodnie z opisanym protokołem, uzyskuje się jednorodną folię czujnika o jednolitej grubości, zgodnie z definicją szczeliny urządzenia do powlekania noża. Jeśli wyprodukowana optoda ma niejednolity rozkład materiału czujnika (np. w powłoce, widoczne paski lub agregaty barwnika (można to ocenić wizualnie i wizualnie za pomocą lampy UV)), protokół należy powtórzyć, a wszystkie materiały należy dokładnie oczyścić za pomocą acetonu.

Po przygotowaniu opody płaskiej, próbka może być doprowadzona do bliskiego kontaktu z warstwą detekcyjną optody płaskiej, jak pokazano tutaj z optodą planarną zintegrowaną w komorze warstwowej, gdzie korzenie rośliny w otaczającej matrycy osadowej mogą być umieszczone w bliskim kontakcie z optodzie płaskiej (Rysunek 2). Przy prawidłowym przygotowaniu komora rhizo-sandwich powinna być łatwa do przenoszenia z jednego akwarium (inkubacja) do drugiego (pomiar). Jeśli komora ryzo-kanapkowa nie zostanie prawidłowo wykonana, może być niestabilna, tracić osad lub zawierać pęcherzyki powietrza. W związku z tym zaleca się oględziny komory ryzo-warstwowej bezpośrednio po montażu.

Podany protokół umożliwia obrazowanie czasu życia luminescencji próbki stykającej się z optodą planarną w oparciu o domenę częstotliwości za pomocą kamery o żywotności luminescencji opartej na domenie częstotliwości. Więcej szczegółów na temat tego systemu kamer, takich jak tryb pozyskiwania obrazu i charakterystyka naukowej kamery SCMOS (Complementary metal-oxide-semiconductor), można znaleźć w najnowszych publikacjach8,29.

Sama konfiguracja jest dość prosta i obejmuje tylko kamerę, która steruje źródłem światła (w tym przypadku źródło wzbudzenia LED) oraz próbkę z optodą (Rysunek 3). Upewnij się, że wszystkie części są prawidłowo połączone i że próbka jest oświetlona jednorodnie. Podczas wykonywania pomiarów należy unikać światła tła.

Przed obrazowaniem próbki, optoda musi zostać skalibrowana. Jak widać na rysunku Rysunek 4A, zmierzony czas życia luminescencji zmniejsza się wraz ze wzrostem stężeniaO2 po quasi-wykładniczym zaniku. Zależność tę można również opisać za pomocą uproszczonego modelu dwumiejscowego (Rysunek 4B i równanie 3). W podanym przykładzie parametry potrzebne do późniejszego obliczenia stężeniaO2 były następujące; τ0 = 56,26 μs, Ksv = 0,032 hPa-1 i f = 0,86.

Przeprowadzenie kalibracji jest również idealnym sposobem na sprawdzenie, czy system działa poprawnie. Jeśli wszystkie komponenty są zainstalowane zgodnie z opisem tutaj (lub zgodnie z wytycznymi producenta), zmierzona żywotność powinna wykazywać taką samą zależność od O2, jak pokazano na Rysunek 4. Ponadto dla tej samej kombinacji materiałów czujnikowychO2 (polimer i barwnik) zmierzona τ0 powinna mieścić się w tym samym zakresie (± kilka μs), co zmierzona tutaj (głównie pod wpływem temperatury doświadczalnej). Jeśli nie można uzyskać podobnej krzywej kalibracyjnej, upewnij się, że wszystkie kroki zostały wykonane prawidłowo. Czasami optoda jest przypadkowo zamocowana wrażliwą stroną skierowaną w stronę szklanej ściany, a nie próbki, lub uzyskane obrazy są prześwietlone lub niedoświetlone.

Dzięki parametrom kalibracji możliwe jest określenie stężeniaO2 poprzez obrazowanie czasu życia luminescencji (τ). Jest to pokazane w Rysunek 5A,B, gdzie rozkład stężeniaO2 w ryzosferze Littorella uniflora został zobrazowany w ciemności i po ekspozycji na światło 500 μmol fotonów m-2 s-1 odpowiednio przez 12 godzin. Ze względu na aktywność fotosyntetyczną rośliny stężenie O2 w ryzosferze wzrosło po ekspozycji na światło. Oprócz obrazów w całym okresie życia, również obrazy "strukturalne" mogą być uzyskiwane przy zewnętrznym oświetleniu, przy zachowaniu stałej geometrii obrazowania. W ten sposób obrazy O2 mogą być precyzyjnie skorelowane z obrazem strukturalnym (Rysunek 5C), przekrojami poprzecznymi lub obszarami zainteresowania. Na przykład profile stężenia O2 w pojedynczym korzeniu zostały wyodrębnione z obrazu uzyskanego odpowiednio w ciemności i świetle (Rysunek 5D).

figure-results-1
Rysunek 1: Wykonanie płaskiej optodyO2. (A) Folię PET mocuje się na szklanej płycie, a urządzenie do powlekania nożem umieszcza się na folii. (B) Przygotowany koktajl z czujnika rozprowadza się na folii PET jako cienką linię przed urządzeniem do powlekania nożem. (C) Urządzenie do powlekania nożem jest przesuwane w dół, aby rozprowadzić koktajl czujnika w postaci cienkiej warstwy na folii PET, która po odparowaniu rozpuszczalnika daje gotową do użycia optopedę planarną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zespół komory ryzo-warstwowej z integracją płaskiej optody O2 . (A) Optoda jest mocowana na jednej ze szklanych płytek za pomocą folii wodnej. (B) Optoda jest przyklejona do płytki za pomocą taśmy elektrycznej. (C) Osad jest wypełniany na przeciwległej płytce za pomocą dołączonych przekładek (tj. szkiełek mikroskopowych). (D) Korzenie roślin umieszcza się na równomiernie rozłożonym osadzie. (E) Komora ryzo-sandwich jest zamknięta i tymczasowo przymocowana zaciskami. (F) Całkowicie zamknięta i zmontowana komora ryzo-warstwowa. (G) W celu ochrony optody przed światłem wystawionym przez lampę inkubacyjną i w celu uniknięcia wzrostu glonów, na zmontowaną komorę ryzo-kanapkową nakłada się plastikową osłonę. (H) Komora ryzo-sandwich inkubowana w akwarium. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Konfiguracja obrazowania zawierająca kamerę o żywotności luminescencji w domenie częstotliwości, z obiektywem skierowanym na próbkę z optodą od tyłu przez przezroczyste ścianki akwarium i komory ryzowarstwowej. Światłowód źródła wzbudzenia LED jest ustawiony tak, aby równomiernie oświetlić próbkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Krzywe kalibracyjne dla płaskiej optody O2. (A) Różne czasy trwałości fosforescencji mierzone przy odpowiednich stężeniachO2 w komorze kalibracyjnej wypełnionej wodą. (B) Wykres Sterna-Volmera danych kalibracyjnych dopasowanych przy użyciu uproszczonego modelu dwumiejscowego do dynamicznego wygaszania kolizyjnego (równanie 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Obrazowanie rozkładuO2 w czasie życia w ryzosferze rośliny wodnej Littorella uniflora. (A) DystrybucjaO2 po utrzymywaniu rośliny w świetle przez 12 godzin przy około 500 μmol fotonach m-2 s-1. (B) DystrybucjaO2 po trzymaniu rośliny w ciemności przez 1 godzinę. (C) Obraz strukturalny korzeni roślin widziany przez optodzie płaskiej. (D) Przekrój poprzeczny profilu stężeniaO2 (lokalizacja jest oznaczona żółtą linią w panelach A i B) po 12 godzinach w kolorze jasnym (czerwonym) i 1 h w ciemności (). Zaadaptowano za zgodą (Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Chemia analityczna. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Prawa autorskie (2019) Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole uwzględniony jest cały przepływ pracy od przygotowania optody do analizy obrazuO2. Postępując zgodnie z tym protokołem, obrazy chemiczne można uzyskać za pomocą nowatorskiej kamery o żywotności luminescencji opartej na domenie częstotliwości. W zależności od zastosowania, płaskie optody mogą być wytwarzane w różnych rozmiarach i grubościach warstwy czujnika, od wytrzymałych płaskich optodów o grubości 50-100 μm i kilku dziesiątych centymetra kwadratowego do szkiełek nakrywkowych mikroskopu z warstwami czujnika o grubości <1 μm 6,40. Potencjał tej metody został zademonstrowany przy szczególnym zastosowaniu, ale nie ogranicza się tylko do obrazowaniaO2 w ryzosferach roślinnych12,28.

Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z metodami obrazowania chemicznego opartymi na intensywności czystej luminescencji. Na obrazowanie czasu życia luminescencji nie ma wpływu, a przynajmniej w znacznie mniejszym stopniu, nierównomierne oświetlenie, nierówna grubość optody i wybielanie zdjęć25. Ponadto w tej metodzie unika się stosowania dodatkowego barwnika referencyjnego powszechnego w obrazowaniu ratiometrycznym17,37. W porównaniu z innymi systemami kamer opartymi na żywotności, takimi jak powszechnie stosowane kamery bramkowanew dziedzinie czasu 8,26, zaprezentowany tutaj nowatorski system kamer i protokół mogą zapewnić porównywalne wyniki. W niedawnej publikacji porównano charakterystyki analityczne tych dwóch systemów i stwierdzono, że system kamer o żywotności luminescencji oparty na domenie częstotliwości jest co najmniej porównywalny z wycofanym z produkcji poprzednikiem opartym na dziedzinie czasu8.

Przedstawiliśmy najprostszą optodęO2 składającą się tylko ze wskaźnika w matrycy polimerowej. Oprócz wielu innych możliwych wskaźnikówO2 20 , które mogą być stosowane, można dołączyć dodatki, tj. środki rozpraszające, takie jak TiO2 lub proszek diamentowy2 w celu zwiększenia sygnału czujnika przy jednoczesnym zmniejszeniu przezroczystości optody. Można również użyć dodatkowych barwników w celu zwiększenia intensywności sygnału poprzez transfer energii41.

W przypadku wytwarzania płaskiej optody zalecamy użycie szczeliny w urządzeniu do powlekania nożem wynoszącej 75 - 120 μm, aby uzyskać końcową grubość warstwy czujnika około 7,5 do 12 μm po odparowaniu rozpuszczalnika (około 10% zastosowanej szczeliny), w przypadku stosowania opisanego składu koktajlu czujnika. Jest to dobry kompromis pomiędzy intensywnością sygnału, która może być modyfikowana przez większe obciążenie barwnikiem, lub poprzez wybór barwników wskaźnikowych i referencyjnych o wyższej jasności, a czasem reakcji. Wzrost grubości warstwy powoduje wydłużenie czasu reakcji, ponieważ wydłuża się czas potrzebny do osiągnięcia przez analit równowagi termodynamicznej w warstwie czujnikowej z otaczającymi mediami12.

Optody, jak opisano tutaj, reagują na zmiany stężeniaO2 w ciągu kilku sekund17 , nadal mając wystarczająco silny sygnał luminescencyjny. Ultracienkie powłoki czujników z czasem reakcji poniżej sekundy mogą być realizowane za pomocą powłokispin-coating 6. Jeśli podpora lub urządzenie do powlekania noża nie są dobrze oczyszczone, może to spowodować powstanie niejednorodnych warstw czujnika. Ponadto, gdy koktajl nie jest całkowicie jednorodny lub nakładany zbyt szybko po rozprowadzeniu przed urządzeniem powlekającym, można zaobserwować taki niepożądany efekt. Dlatego może być potrzebna pewna praktyka, aby przygotować optymalne optody.

Metoda ta może być stosowana do obrazowania próbek, które mogą być w bliskim kontakcie z optodą, takich jak niektóre zwierzęta morskie42, biofilmy6 i gleby31 , by wymienić tylko kilka. Prezentujemy samodzielną konfigurację z obiektywem, jednak kamerę można łatwo połączyć z mikroskopem w celu obrazowania chemicznego o wyższej rozdzielczości43.

Podczas gdy obrazowanie czasu życia luminescencji w dziedzinie czasu umożliwiło tłumienie fluorescencji tła26, jest to problem w przypadku korzystania z nowego systemu kamer opartego na dziedzinie częstotliwości8. Ze względu na ciągłą akwizycję obrazu, kamera ta zarejestruje dowolną fluorescencję tła próbki, która może być wzbudzona przez wybraną diodę LED i emitowana w wybranym oknie widmowym, zgodnie z definicją filtra emisyjnego na obiektywie kamery. Spowoduje to pozornie krótszy czas życia, a co za tym idzie, fałszywe odczyty. W przypadku pracy z próbkami o znacznej fluorescencji wewnętrznej pokrywającej się ze wzbudzeniem i emisją czujnikaO2, konieczne jest zastosowanie dodatkowej izolacji optycznej na wierzchu optody, poprzez pokrycie dodatkowej warstwy zawierającej sadzę 2,17. W ten sposób do kamery dotrze tylko luminescencja emitowana z optody planarnej. W celu sprawdzenia luminescencji tła można wykonać zdjęcie bez optody, które następnie pokaże wyłącznie luminescencję wewnętrzną próbki. Możliwe jest również dodanie środków rozpraszających, takich jak TiO2 lub proszek diamentowy 2,44, do koktajlu czujnika, w celu zwiększenia intensywności luminescencji barwnika wskaźnikowego. Jednak może to również prowadzić do szybszego wybielania zdjęć, a TiO2 jest znanym fotokatalizatorem, który może pogorszyć fotostabilność barwnika41. Kolejnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę, jest światło tła. Podczas obrazowania czasów życia luminescencji należy jak najskuteczniej unikać światła tła. Dlatego ta metoda obrazowania wymaga, aby zestaw był umieszczony w ciemnym otoczeniu, a wszelkie zewnętrzne źródła światła muszą być tymczasowo wyłączone podczas akwizycji obrazu.

Podsumowując, obrazowanie czasu życia luminescencji jest solidną metodą obrazowania chemicznego, którą można dostosować do wielu różnych zastosowań. Protokół ten (patrz sekcja 1 - 5) obejmuje wszystkie niezbędne kroki do wygenerowania obrazuO2 i wykorzystuje obecnie najbardziej elastyczny system obrazowania czasu życia luminescencji w dziedzinie częstotliwości, który może zastąpić wycofaną kamerę bramkowaną w dziedzinie czasu do obrazowania 2D O2 z płaskimi optodami.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor Gerhard Holst jest pracownikiem firmy PCO AG, która jest producentem systemu kamer użytego w tym artykule. PCO AG partycypowało finansowo w pokryciu kosztów publikacji i otwartego dostępu do artykułu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Sofie Lindegaard Jakobsen (Uniwersytet w Kopenhadze) i Larsowi Borregaardowi Pedersenowi (Uniwersytet w Aarhus) za pomoc techniczną. Finansowanie tego badania uzyskano z grantu Sapere-Aude Advanced z Niezależnego Funduszu Badawczego w Danii (DFF-1323-00065B; MK), granty projektowe z Niezależnego Funduszu Badawczego Dania | Nauki przyrodnicze (DFF-8021-00308B; MK) oraz Nauk Technicznych i Produkcyjnych (DFF-8022-00301B i DFF-4184-00515B; MK), Duńską Narodową Fundację Badawczą (DNRF136) oraz Fundację Poul Due Jensen (KK).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa powietrza z kamieniem napowietrzającym i pompą wodnąLokalny sklep
ChloroformSigma Aldrich67-66-3
DC4 związeksilikonowy Dow Corning GmbH2793695
Mieszalnik gazówVö gtlin Instruments GmbHred-y kompaktowy miernik GCMTo tylko jeden z możliwych instrumentów. Kilka firm oferuje urządzenia do mieszania gazów
Szklane płyty i akwaria Lokalneakwarium lub sklep
Oprogramowanie ImageJImageJBezpłatnie dostępne oprogramowanie do obrazowania (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Urządzenie do powlekania nożem

BYK-GARDNER GMBH		2021Jest to czterostronny aplikator folii, który umożliwia łatwą zmianę grubości folii. Dostępne są również inne wersje. Zalecamy grubość nakładanej folii w zakresie 75-120 i mikro; m, co daje końcową grubość warstwy czujnika wynoszącą ~10% grubości nałożonej przed odparowaniem rozpuszczalnika.
Lampa LED, Reflektor PAR38MegamanMM17572
LED LEDHUBOmicon Laserage, NiemcyMoże być skonfigurowany z różnymi diodami LED. W prezentowanym przykładzie niezbędna jest zielona dioda LED (528 nm)
LOCTITE AA 3494Henkel AG & Co. KGaANAKlej błyskawiczny na bazie akrylu
NIS Elements AR SoftwareNikon IncPakiet oprogramowania używany do akwizycji obrazu
pco.flimPCO AG, NiemcyDożywotnia żywotność luminescencji w
oparciu o domenę częstotliwościplatyna(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorfenylo)-porfiryna (PtTFPP)Frontier ScientificPtT975O2
Goodfellow320-992-72Takie folie można również znaleźć u innych dostawców i służą jako solidne podparcie
Polistyren (PS)Sigma Aldrich9003-53-6Matryca polimerowa
Schott Filtr RG610www.uviroptics.comTutaj można uzyskać przykręcanie 52 mm Filtry. Inne źródła oferują kwadratowe filtry szklane ze szkła Schott, które można zamocować przed obiektywem
Taśma izolacyjna winylowaScotch, Super 33+NA
Zeiss Makro Planar 2/100 z adapterem Hama C do Nikondostarczany z aparatemTutaj każdy inny obiektyw może być również używany w połączeniu z adapterem, jeśli obiektyw nie ma mocowania C
akwarystyczny: z narzędziami byk.com Folia wskaźnikowa z politereftalanu etylenu (PET)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Glud, R. N., Kühl, M., Kohls, O., Ramsing, N. B. Heterogeneity of oxygen production and consumption in a photosynthetic microbial mat as studied by planar optodes. Journal of Phycology. 35 (2), 270-279 (1999).
  2. Moßhammer, M., Strobl, M., Kühl, M., Klimant, I., Borisov, S. M., Koren, K. Design and Application of an Optical Sensor for Simultaneous Imaging of pH and Dissolved O2 with Low Cross-Talk. ACS Sensors. 1 (6), 681-687 (2016).
  3. Jensen, S. I., Kühl, M., Glud, R. N., Jørgensen, L. B., Priemé, A. Oxic microzones and radial oxygen loss from roots of Zostera marina. Marine Ecology Progress Series. , 49-58 (2005).
  4. Larsen, M., Santner, J., Oburger, E., Wenzel, W. W., Glud, R. N. O2 dynamics in the rhizosphere of young rice plants (Oryza sativa L.) as studied by planar optodes. Plant and Soil. 390 (1-2), 279-292 (2015).
  5. Brodersen, K. E., Koren, K., Moßhammer, M., Ralph, P. J., Kühl, M., Santner, J. Seagrass-Mediated Phosphorus and Iron Solubilization in Tropical Sediments. Environmental Science and Technology. 51, 14155-14163 (2017).
  6. Kühl, M., Rickelt, L. F., Thar, R. Combined imaging of bacteria and oxygen in biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 73 (19), 6289-6295 (2007).
  7. Sønderholm, M., et al. Tools for studying growth patterns and chemical dynamics of aggregated Pseudomonas aeruginosa exposed to different electron acceptors in an alginate bead model. npj Biofilms and Microbiomes. 3, 1-11 (2018).
  8. Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S. M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Analytical Chemistry. 91 (5), 3233-3238 (2019).
  9. Brodersen, K. E., Koren, K., Lichtenberg, M., Kühl, M. Nanoparticle-based measurements of pH and O2 dynamics in the rhizosphere of Zostera marina L.: effects of temperature elevation and light-dark transitions. Plant, Cell & Environment. 39 (7), 1619-1630 (2016).
  10. Zhu, Q., Aller, R. C., Fan, Y. High-Performance Planar pH Fluorosensor for Two-Dimensional pH Measurements. in Marine Sediment and Water. Environmental Science & Technology. 39, 8906-8911 (2005).
  11. Murniati, E., Gross, D., Herlina, H., Hancke, K., Glud, R. N., Lorke, A. Oxygen imaging at the sediment-water interface using lifetime-based laser induced fluorescence (τLIF) of nano-sized particles. Limnology and Oceanography: Methods. 14 (8), 506-517 (2016).
  12. Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils - a review. Analytica Chimica Acta. , 9-42 (2015).
  13. Glud, R. N. Oxygen dynamics of marine sediments. Marine Biology Research. 4 (4), 243-289 (2008).
  14. Revsbech, N. P., Jorgensen, B. B., Blackburn, T. H. Oxygen in the Sea Bottom Measured with a Microelectrode. Science. 207 (4437), 1355-1356 (1980).
  15. Klimant, I., Meyer, V., Kuhl, M. Fiberoptic oxygen microsensors, a new tool in aquatic biology. Limnology and Oceanography. 40 (6), 1159-1165 (1995).
  16. Glud, R. N., Tengberg, A., Kühl, M., Hall, P. O. J., Klimant, I., Holst, G. An in situ instrument for planar O2 optode measurements at benthic interfaces. Limnology and Oceanography. 46 (8), 2073-2080 (2001).
  17. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9, 348-360 (2011).
  18. Glud, R., Ramsing, N., Gundersen, J., Klimant, I. Planar optrodes:a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
  19. Frederiksen, M. S., Glud, R. N. Oxygen dynamics in the rhizosphere of Zostera marina: A two-dimensional planar optode study. Limnology and Oceanography. 51 (2), 1072-1083 (2006).
  20. Quaranta, M., Borisov, S. M., Klimant, I. Indicators for optical oxygen sensors. Bioanalytical Reviews. 4, 115-157 (2012).
  21. Koren, K., Hutter, L., Enko, B., Pein, A., Borisov, S. M., Klimant, I. Tuning the dynamic range and sensitivity of optical oxygen-sensors by employing differently substituted polystyrene-derivatives. Sensors and Actuators B: Chemical. 176 (100), 344-350 (2013).
  22. Borisov, S. M. Fundamentals of Quenched Phosphorescence O2 Sensing and Rational Design of Sensor Materials. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , 1, Chapter 1 1-18 (2018).
  23. Wang, X., Wolfbeis, O. S. Optical methods for sensing and imaging oxygen: materials, spectroscopies and applications. Chemical Society Reviews. 43, 3666-3761 (2014).
  24. Ehgartner, J., Wiltsche, H., Borisov, S. M., Mayr, T. Low cost referenced luminescent imaging of oxygen and pH with a 2-CCD colour near infrared camera. The Analyst. 139 (19), 4924(2014).
  25. Meier, R. J., Fischer, L. H., Wolfbeis, O. S., Schäferling, M. Referenced luminescent sensing and imaging with digital color cameras: A comparative study. Sensors and Actuators B: Chemical. 177, 500-506 (2013).
  26. Holst, G., Kohls, O., Klimant, I., König, B., Kühl, M., Richter, T. A modular luminescence lifetime imaging system for mapping oxygen distribution in biological samples. Sensors and Actuators B. 51, 163-170 (1998).
  27. Moßhammer, M., Brodersen, K. E., Kühl, M., Koren, K. Nanoparticle- and microparticle-based luminescence imaging of chemical species and temperature in aquatic systems: a review. Microchimical Acta. , 1-28 (2019).
  28. Koren, K., Kühl, M. CHAPTER 7. Optical O2 Sensing in Aquatic Systems and Organisms. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. 1, 145-174 (2018).
  29. Chen, H., Holst, G., Gratton, E. Modulated CMOS camera for fluorescence lifetime microscopy. Microscopy Research and Technique. 78, 1075-1081 (2015).
  30. Franke, R., Holst, G. A. Frequency-domain fluorescence lifetime imaging system (pco.flim) based on a in-pixel dual tap control CMOS image sensor. Proceedings of SPIE 93281, Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues XIII. , 1-19 (2015).
  31. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  32. Schreml, S., et al. 2D luminescence imaging of physiological wound oxygenation. Experimental dermatology. 20 (7), 550-554 (2011).
  33. Trampe, E., et al. Functionalized Bioink with Optical Sensor Nanoparticles for O2 Imaging in 3D-Bioprinted Constructs. Advanced Functional Materials. 1804411, 1804411(2018).
  34. Gouterman, M. Oxygen Quenching of Luminescence of Pressure Sensitive Paint for Wind Tunnel Research. Journal of Chemical Education. 74 (6), 697(1997).
  35. Fischer, L. H., et al. Referenced dual pressure- and temperature-sensitive paint for digital color camera read out. Chemistry. 18 (49), 15706-15713 (2012).
  36. Fabricius-Dyg, J., Mistlberger, G., Staal, M., Borisov, S. M., Klimant, I., Kühl, M. Imaging of surface O2 dynamics in corals with magnetic micro optode particles. Marine Biology. 159 (7), 1621-1631 (2012).
  37. Koren, K., Jakobsen, S. L., Kühl, M. In-vivo imaging of O2 dynamics on coral surfaces spray-painted with sensor nanoparticles. Sensors and Actuators B: Chemical. 237, 1095-1101 (2016).
  38. Carraway, E. R., Demas, J. N., DeGraff, B. A., Bacon, J. R. Photophysics and Photochemistry of Oxygen Sensors Based on Luminescent Transition-Metal Complexes. Analytical Chemistry. 63 (4), 337-342 (1991).
  39. Klimant, I., Ruckruh, F., Liebsch, G., Stangelmayer, A., Wolfbeis, O. S. Fast response oxygen micro-optodes based on novel soluble ormosil glasses. Mikrochimica Acta. 131, 35-46 (1999).
  40. Askaer, L., Elberling, B., Glud, R. N., Kühl, M., Lauritsen, F. R., Joensen, H. P. Soil heterogeneity effects on O2 distribution and CH4 emissions from wetlands: In situ and mesocosm studies with planar O2 optodes and membrane inlet mass spectrometry. Soil Biology and Biochemistry. 42 (12), 2254-2265 (2010).
  41. Mayr, T., Borisov, S. M., Abel, T., Enko, B., Waich, K. Light Harvesting as a Simple and Versatile Way to Enhance Brightness of Luminescent Sensors. Analytical Chemistry. 81, 6541-6545 (2009).
  42. Kühl, M., et al. Microenvironmental Ecology of the Chlorophyll b-Containing Symbiotic Cyanobacterium Prochloron in the Didemnid Ascidian Lissoclinum patella. Frontiers in microbiology. 3, 1-18 (2012).
  43. Dalfen, I., Dmitriev, R. I., Holst, G., Klimant, I., Borisov, S. M. Background-Free Fluorescence-Decay-Time Sensing and Imaging of pH with Highly Photostable Diazaoxotriangulenium Dyes. Analytical Chemistry. 91 (1), 808-816 (2019).
  44. Chatni, M. R., Maier, D. E., Porterfield, D. M. Evaluation of microparticle materials for enhancing the performance of fluorescence lifetime based optrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 141, 471-477 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

optoda tlenowakamera w dziedzinie cz stotliwo cioptoda planarnast enie tlenuobrazowanie ryzosferykoktajl sensorowypowlekanie no emprocedura kalibracjiobrazowanie strukturalne

Powiązane artykuły