Artykuł metodologiczny

Obrazowanie żywotności luminescencjiO2 za pomocą systemu kamer opartego na domenie częstotliwości

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60191

⸱

16 grudnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Marine Biological Section, Department of Biology, University of Copenhagen, 2Center for Electromicrobiology, Aarhus University, 3PCO AG, 4Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 5Aarhus University Centre for Water Technology, Section for Microbiology, Department of Bioscience, Aarhus University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy użycie nowatorskiej kamery o żywotności luminescencji w dziedzinie częstotliwości do mapowania rozkładów 2D O2 za pomocą folii czujników optycznych. Opisano system kamer i procedury analizy obrazu wraz z przygotowaniem, kalibracją i aplikacją folii sensorycznych do wizualizacji mikrośrodowiskaO2 w ryzosferze roślin wodnych.

Streszczenie

Opisujemy metodę obrazowania rozpuszczonego tlenu (O2) w 2D w wysokiej rozdzielczości przestrzennej (< 50-100 μm) i czasowej (< 10 s). Metoda wykorzystuje czułe folie czujników luminescencyjnych O2 (optody planarne) w połączeniu ze specjalistycznym systemem kamer do obrazowania czasu życia luminescencji w dziedzinie częstotliwości. Optody planarne przygotowuje się przez rozpuszczenie barwnika wskaźnikowego wrażliwego naO2 w polimerze i rozprowadzenie mieszaniny na stałym podłożu o określonej grubości za pomocą powłoki nożowej. Po odparowaniu rozpuszczalnika, planarna optoda jest umieszczana w bliskim kontakcie z próbką będącą przedmiotem zainteresowania - tutaj pokazano z korzeniami rośliny wodnej Littorella uniflora. Zależna od stężenia O2 zmiana czasu życia luminescencji barwnika wskaźnikowego w optodzie płaskiej jest obrazowana przez tylną stronę przezroczystej folii nośnej i ścianę akwarium za pomocą specjalnej kamery. Kamera ta mierzy czas życia luminescencji (μs) poprzez przesunięcie kąta fazowego między modulowanym sygnałem wzbudzenia a sygnałem emisyjnym. Metoda ta jest lepsza od metod obrazowania intensywności luminescencji, ponieważ sygnał jest niezależny od stężenia barwnika lub intensywności źródła wzbudzenia i opiera się wyłącznie na czasie zaniku luminescencji, który jest parametrem nieodłącznie odwołującym. W związku z tym nie jest potrzebny dodatkowy barwnik referencyjny ani inne środki odniesienia. Demonstrujemy zastosowanie systemu do makroskopowego obrazowania O2 ryzosfer roślinnych, ale system kamer można również łatwo połączyć z mikroskopem.

Wprowadzenie

Rozkład i dynamika gazów rozpuszczonych oraz jonów w osadach i glebach dostarczają kluczowych informacji o procesach biogeochemicznych, takich jak oddychanie mikrobiologiczne1,2, radialna utrata tlenu z korzeni roślin3,4,5 oraz chemiczne mikrośrodowisko drobnoustrojów6,7, ryzosfer roślin5,8,9 i nor zwierzęcych10,11,12. Aktywność biologiczna i chemiczna w takich środowiskach ograniczonych dyfuzyjnie może prowadzić do powstania stromych gradientów substratów chemicznych lub produktów procesów biogeochemicznych. W szczególności dostępność O2 ma ogromny wpływ na procesy biogeochemiczne, a tym samym na biologię i ekologię systemu13. Dlatego analiza stężeń O2 z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową ma kluczowe znaczenie w naukach wodnych i lądowych. W pierwszej kolejności opracowano elektrochemiczne i optyczne mikrosensory14,15 do pomiaru tego ważnego anality. Później wprowadzono dwuwymiarowe (2D) obrazowanie O2 za pomocą optod płaskich12,16,17,18,19, co umożliwiło wizualizację i kwantyfikację heterogenicznego rozkładu O2 w glebach i osadach.

Planarne optody O2 składają się z barwnika wskaźnikowego wrażliwego na O220, który jest rozpuszczony w odpowiednim polimerze21. Barwnik wskaźnikowy jest pobudzany przy określonych długościach fal optycznych i podczas relaksacji emituje światło przesunięte w stronę czerwieni w postaci luminescencji. W obecności O2 wzbudzony barwnik wskaźnikowy może przekazać swoją energię cząsteczce O2 podczas kolizji, co określa się mianem wygaszania luminescencji opartego na kolizjach22. W związku z tym intensywność oraz czas życia luminescencji ulegają zmniejszeniu wraz ze wzrostem stężenia O223. W przypadku idealnym zmiana intensywności i czasu życia odpowiada równaniu Sterna-Volmera (równanie 1), wykorzystując intensywność lub czas życia luminescencji w nieobecności (I0; τ0) lub obecności (I, τ) O2 przy danym stężeniu [Q]. Stała Sterna-Volmera (Ksv) jest miarą czułości optody na O2; KSV zależy od zmiennych środowiskowych, takich jak temperatura i ciśnienie.

(1) figure-introduction-1

Rejestrowanie takich zmian luminescencji nad płaską folią sensoryczną za pomocą systemu kamer może być wykorzystane do wizualizacji odpowiadających im zmian w rozkładzie O2. Początkowo stosowano proste obrazowanie O2 oparte na intensywności luminescencji18. Jednakże taka metodologia jest bardzo wrażliwa na zakłócenia zewnętrzne, które obniżają wiarygodność wyników ze względu na niejednorodne oświetlenie, wahania źródła wzbudzenia lub kamery, a także nierównomierny rozkład barwnika wskaźnikowego w płaskiej optodzie.

Niektóre z tych ograniczeń można zredukować, stosując płaskie optody do obrazowania ratiometrycznego17,24, w których barwnik wskaźnikowy czuły na O2 jest współimmobilizowany w warstwie polimerowej płaskiej optody wraz z nieczułym barwnikiem referencyjnym, emitującym w innym zakresie spektralnym niż wskaźnik O2. Na podstawie obrazów emisji pozyskanych w dwóch oknach spektralnych, sygnał emisji czuły na O2 jest dzielony przez sygnał referencyjny, co pozwala na wygenerowanie obrazu stosunku (ratio image), który jest mniej podatny na wspomniane wcześniej interferencje5,17. Metoda ta wymaga użycia drugiego barwnika, który w idealnym przypadku może być wzbudzany tym samym źródłem wzbudzenia, ale emituje na innej długości fali (bez znaczącego nakładania się widm), w innym oknie spektralnym kamery (np. w innym kanale kolorystycznym kamery RGB).

Alternatywnie obrazowanie O2 może opierać się na ilościowym określaniu zależnej od O2 zmiany czasu życia luminescencji barwnika wskaźnikowego, co nie jest zaburzone przez nierównomierne oświetlenie lub niejednorodności w stężeniu wskaźnika25. Pierwsze systemy obrazowania O2 oparte na czasie życia luminescencji wykorzystywały pomiary w dziedzinie czasu z systemem kamer CCD (charged coupled device) z funkcją bramkowania26, w którym stosowano impulsowe źródło wzbudzenia, a obrazy luminescencji rejestrowano w określonych odstępach czasu w trakcie wzbudzenia lub emisji wskaźnika8,23,27. Na podstawie takich obrazów można wyznaczyć czas życia luminescencji i powiązać go z odpowiadającym mu stężeniem O2 w kalibracji. Następnie obrazy czasu życia luminescencji dla danej próbki dociśniętej do planarnej optody można przekształcić w obrazy odpowiadającego im dwuwymiarowego rozkładu stężenia O2. System ten był wykorzystywany w wielu zastosowaniach, zarówno w laboratorium, jak i in situ16,28, jednak kluczowa kamera CCD z funkcją bramkowania nie jest już dostępna w sprzedaży.

Niedawno wprowadzono inny system kamery do pomiaru czasu życia luminescencji, który pozyskuje obrazy w dziedzinie częstotliwości8. System ten opiera się na ciągle modulowanym źródle światła do wzbudzenia. Może to być fala sinusoidalna lub prostokątna zamiast wzbudzenia impulsowego, które jest stosowane do pozyskiwania obrazów w dziedzinie czasu. Modulacja ta skutkuje modulowaną emisją luminescencji barwnika wskaźnikowego O2, która jest przesunięta w fazie o kąt φ, zależny od czasu życia luminescencji barwnika wskaźnikowego (τ) (patrz równanie 2).

(2) figure-introduction-2

Zmiana między amplitudą wzbudzenia a emisji (tj. tzw. indeks lub głębokość modulacji (amplituda podzielona przez stałą część luminescencji)) zależy również od czasu życia luminescencji. Zatem poprzez ustawienie znanej częstotliwości modulacji, specjalny czujnik obrazu CMOS w kamerze jest w stanie zmierzyć czas życia luminescencji w zakresie od ns do µs, co zostało szczegółowo opisane w innych publikacjach 8,29,30. Ogólny przewodnik po zasadzie działania można znaleźć (korzystając z następującego linku https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).

W poniższym protokole prezentujemy zastosowanie nowoczesnego systemu kamer do obrazowania rozkładu stężenia O2 wokół korzeni wodnej rośliny słodkowodnej Littorella uniflora w 2D9,31. Pragniemy podkreślić, że metoda ta w żadnym stopniu nie ogranicza się tylko do tego zastosowania. Optody wrażliwe na tlen lub cząstki sensorowe27 w połączeniu z różnymi metodami obrazowania były wykorzystywane w badaniach medycznych32, w biodruku33, przy zastosowaniu farb wrażliwych na ciśnienie34,35 lub do badania układów fotosyntetycznych2,36,37, wymieniając jedynie niektóre z innych dziedzin zastosowań.

Protokół

1. Wytwarzanie planarnego optodu do pomiaru stężenia O2

  1. Rozpuść 1,5 mg luminofora O2 barwnik wskaźnikowy platyna(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorofenylo)-porfina (PtTFPP) oraz 100 mg polistyrenu (PS) w 1 g chloroformu, aby uzyskać tzw. „koktajl sensorowy”.
    UWAGA: Koktajl można przechowywać w zamkniętym, szczelnym szklanym fiolku w lodówce i w ciemności przez kilka godzin do momentu ponownego użycia.
  2. Umocuj czystą, wolną od kurzu folię poli(tereftalanu etylenu) (PET) (o rozmiarze zależnym od zastosowania) na oczyszczonym szkle za pomocą cienkiej warstwy wody lub etanolu (70%)Rycina 1A).
  3. Umieść oczyszczoną urządzenie do powlekania noża (120 µm) na folię i za pomocą pipety szklanej nałóż linię koktajlu sensora przed urządzeniem (Rysunek 1B). Następnie powoli i jednostajnie przesuń urządzenie nożowe po folii PET, aby równomiernie rozprowadzić koktajl.
    UWAGA: Wszystkie materiały i narzędzia należy dokładnie oczyścić, a proces wytwarzania należy przeprowadzać w środowisku wolnym od kurzu, np. w okapie wentylacyjnym, na stole laminarnym lub pod urządzeniem z ssącym punktowym. Aby uniknąć niejednorodności w końcowej folii czujnika, kroki następujące po nałożeniu koktajlu czujnika na folię należy wykonać szybko, ponieważ chloroform szybko paruje.
  4. Wysusz gotowy płaski O2-wrażliwy optod w powietrzu otaczającym przez 1 h, a następnie całą noc w szafce grzewczej w temperaturze 50-60 °C, co po ewaporacji rozpuszczalnika daje końcową grubość warstwy wynoszącą ~12 µm. Przechowuj wytworzone optody w ciemności (np. w kopercie papierowej) do momentu ich dalszego użycia (Rycina 1C).
    UWAGA: Planarna O2 optody można przechowywać suche i w ciemności przez kilka miesięcy do lat przed użyciem. Grubość końcowej warstwy waha się od 1-20 µm okazało się skuteczne, zapewniając wystarczający sygnał luminescencji i odpowiednią szybkość reakcji.

2. Komora typu „piasek korzeniowy”

  1. Wyczyść dwie szklane płytki (24,5 x 14 cm2, grubość: 4 mm) za pomocą etanolu o stężeniu 96%.
  2. Użyj kleju akrylowego utwardzanego światłem (zobacz Tabelę materiałów) do przyklejenia szkiełek mikroskopowych (76 x 26 mm2, grubość: 1 mm) wzdłuż krawędzi pierwszej płytki szklanej (tj. tylniej strony komory), pozostawiając jeden długi brzeg otwarty. Skróć szkiełka mikroskopowe nożycą do szkła, jeśli to konieczne.
    OSTRZEŻENIE: Cięcie szkła może spowodować powstanie ostrych krawędzi; należy postępować ostrożnie.
    UWAGA: Szkiełka mikroskopowe działają jako dystansory między przednią a tylną częścią, a w zależności od grubości korzeni i rozmiaru rośliny, można na siebie nakładać wiele warstw szkiełek mikroskopowych.
  3. Wytnij planarny optyd do odpowiedniego kształtu i wielkości, aby pasował do przestrzeni między przyklejonymi szkiełkami mikroskopowymi. Umieść go na wewnętrznej stronie przedniej płytki szklanej, warstwą powłokową skierowaną do góry, aby umożliwić kontakt z badanym materiałem po jego przyciśnięciu.
  4. Za pomocą taśmy przyklej jeden brzeg folii optydowej do płytki szklanej i dodaj kilka kropli wody z kranu pomiędzy płytkę szklaną a folię optydową (Rycina 2A). Powoli opuść folię na krople wody, pozwalając jej wyprostować się na powierzchni szkła.
  5. Delikatnie usuń pęcherzyki powietrza uwięzione pomiędzy planarnym optydem a płytką szklaną za pomocą miękkiego ręcznika, unikając zadrapań powłoki czujnika. Osusz płytkę szklaną i przyklej taśmą pozostałe brzegi folii optydowej do płytki szklanej (Rycina 2B).
    UWAGA: Należy wybrać taśmę o odpowiedniej przyległości w warunkach wilgotnych.
  6. Przesiej osad przez sito o wielkości oczek 0,5 mm. Umieść łyżkę wilgotnego osadu na pierwszej płytce szklanej (Rycina 2C).
    UWAGA: Wielkość oczek sita nie powinna przekraczać połowy grubości dystansora.
  7. Rozłóż osad równomiernie i wyrównaj jego grubość do takiej samej jak grubość szkiełek mikroskopowych działających jako dystansory, używając płaskiej płytki szklanej. Delikatnie oczyść górną powierzchnię szkiełek mikroskopowych, aby zapewnić szczelne zamknięcie komory drugą płytką szklaną.
  8. Nanosząc smar silikonowy na powierzchnię szkiełek mikroskopowych, pokryj osad cienką warstwą wody, starannie unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
  9. Delikatnie opłucz pojedynczy pęd Littorella uniflora i umieść go na osadzie, tak aby liście rośliny wystawały przez górny otwarty brzeg (Rycina 2D).
  10. Umieść drugą płytkę szklaną, z przymocowanym optydem, na osadzie i delikatnie naciśnij, aby zbliżyć optyd do korzeni rośliny i otaczającego osadu.
    UWAGA: Pęcherzyki powietrza uwięzione w osadzie można usunąć, delikatnie przechylając płytki szklane podczas ich łączenia.
  11. Sklej płytki szklane za pomocą zacisków (Rycina 2E). Osusz zewnętrzne krawędzie papierowym ręcznikiem. Utrzymuj liście w wilgotnym stanie przez cały czas montażu „piersiówki korzeniowej” (np. poprzez częste dodawanie kilku kropli wody).
  12. Zaciśnij komorę „piersiówki korzeniowej” taśmą winylową do izolacji elektrycznej. Uszczelnij krawędzie plasteliną, a następnie dodatkowo oblep taśmą winylową do izolacji elektrycznej (Rycina 2F).
    UWAGA: Jeśli w osadzie znajduje się wiele pęcherzyków powietrza lub ziarna osadu między szkiełkami mikroskopowymi-dystansorami a drugą płytką szklaną, komorę należy ponownie złożyć, ponieważ woda porowa może wyciekać (powtórz kroki 2.4–2.8).
  13. Przykryj „piersiówkę korzeniową” nieprzezroczystą folią plastikową, pozostawiając w niej szczelinę, przez którą mogą wystawać liście rośliny. Wycięcie okienko w folii plastikowej, aby można je było otworzyć podczas eksperymentów poprzez rozłożenie. Zamykaj okienko podczas okresu adaptacji za pomocą gumek, aby chronić optyd przed wybieleniem fotochemicznym podczas inkubacji rośliny (Rycina 2G).
    UWAGA: Ponieważ wzrost glonów może potencjalnie zakłócać pomiar stężenia O2, zalecamy próbę ograniczenia tego zjawiska poprzez użycie wody filtrowanej, uprzednio oczyszczonego sprzętu doświadczalnego oraz usuwanie glonów zaraz po ich pojawieniu się.

3. Inkubacja komory typu „pierszot korzeniowy”

  1. Umieść komorę typu „piaszczysty sандwicz” w zbiorniku wodnym (32 x 7 x 28 cm3) w lekko pochylonej pozycji, aby zachęcić wzrost korzeni w kierunku planarnego optyda.
  2. Wypełnij zbiornik wodą w ilości wystarczającej do całkowitego zanurzenia liści rośliny.
  3. Ustal cykl 14 godzin światła i 10 godzin ciemności w celu aklimatyzacji rośliny, wykorzystując lampę z czasowym sterowaniem. Umieść kamień powietrzny lub pompę wodną w zbiorniku, aby zapewnić napowietrzanie i mieszanie wody (Rysunek 2H).

4. Obrazowanie

  1. Ustawienie układu do wizualizacji
    1. Usuń folię plastikową pokrywającą planarny optyd w komorze typu „rhizo-sandwich”. Umieść komorę tak, aby ścianka szklana z optydem była ustawiona pionowo przy ścianie akwarium. Użyj dystansu, aby przycisnąć komorę typu „rhizo-sandwich” do ściany akwarium.
      UWAGA: Całkowita grubość ściany akwarium wraz ze ścianką komory „rhizo-sandwich” nie powinna być zbyt duża. Zaleca się jednak, aby grubość szkła ścian akwarium używanych do wizualizacji luminescencyjnej wynosiła > 1 cm, aby zmniejszyć przesłuch przestrzenny poprzez zwiększenie tłumienia światła rozproszonego. Ważne jest, aby użyć tego samego materiału do obu ścian szklanych (ten sam współczynnik załamania światła), aby zminimalizować rozpraszanie światła na granicy materiałów; rozpraszanie to również mogłoby prowadzić do rozmytego obrazu12.
    2. Umieść kamerę do pomiaru czasu życia luminescencji w trybie dziedziny częstotliwości, wyposażoną w obiektyw (zobacz Tabelę materiałów), przed akwarium i obszarem zainteresowania (korzenie rośliny wodnej Littorella uniflora, które są w bezpośrednim kontakcie z planarnym optydem) (Rysunek 3).
      UWAGA: Kamerę można ustawić na statywie laboratoryjnym, aby umożliwić łatwą regulację jej wysokości. Położenie statywu powinno być oznaczone i utrzymywane w stałym miejscu. Dodatkowo, kamerę można przykleić taśmą do statywu, aby zapobiec przypadkowemu przesunięciu podczas eksperymentu.
    3. Przykręć odpowiedni filtr emisyjny do wizualizacji barwnika wskaźnikowego PtTFPP (zobacz Tabelę materiałów) do obiektywu kamery, aby usunąć zakłócenia pochodzące ze źródła wzbudzenia.
      UWAGA: Filtry śrubowane są idealne, ale można również użyć filtrów kwadratowych, stosując odpowiedni adapter lub ostrożnie przyklejając je taśmą do obiektywu.
    4. Podłącz źródło wzbudzenia LED (zobacz Tabelę materiałów) do wyjścia modulacji i zatrzasku ciemnego kamery.
      UWAGA: Pierwsze z nich dostarcza sygnał modulacji dla źródła światła, podczas gdy drugie wyłącza światło podczas odczytu obrazu z czujnika. Podłącz źródło wzbudzenia LED i kamerę do komputera. Światło tła powinno być zminimalizowane podczas odczytu obrazu, poprzez całkowite przyciemnienie pomieszczenia lub przykrycie całego zestawu gęstą, czarną tkaniną. W tym drugim przypadku ważne jest zapewnienie odpowiedniej wentylacji, aby uniknąć nagrzewania się kamery.
    5. Umocuj przewód światłowodowy w źródle wzbudzenia LED i ustaw go tak, aby równomiernie oświetlał folię planarnego optydu pokrywającą obszar zainteresowania.
      UWAGA: W używanym źródle wzbudzenia LED możliwe jest przełączanie między trzema różnymi diodami LED (460 nm, 528 nm, 625 nm), których intensywność można regulować za pomocą oprogramowania sterującego.
  2. Ustawienia i obsługa kamery
    UWAGA: W opisanych eksperymentach użyto kamery do pomiaru czasu życia w trybie dziedziny częstotliwości w połączeniu z dedykowanym modułem do wizualizacji czasu życia w komercyjnym pakiecie oprogramowania (zobacz Tabelę materiałów).
    1. Wybierz kamerę w wybranym oprogramowaniu przed rozpoczęciem użytkowania.
      UWAGA: Oprogramowanie i sterowniki kamery muszą zostać zainstalowane przed wizualizacją zgodnie z wytycznymi producenta.
    2. Otwórz oprogramowanie sterujące LED (ponownie zainstalowane przed rozpoczęciem eksperymentu) i wybierz odpowiednią diodę LED (tutaj: 528 nm), wyłączając tryb czuwania. Ustaw intensywność diody LED zgodnie z potrzebami (tutaj na 30%). Upewnij się, że dioda LED jest uruchamiana zewnętrznym sygnałem TTL; odbywa się to poprzez zaznaczenie opcji analog i sync dla diody LED.
      UWAGA: Intensywność diody LED należy dostosować indywidualnie, ponieważ zbyt wysoka moc może prowadzić do przyspieszonego wybielania barwnika wskaźnikowego lub barwnika odniesienia.
    3. Skoncentruj kamerę i ręcznie dostosuj przysłonę obiektywu (w niniejszym badaniu użyto f = 2.8).
      UWAGA: Ważne jest, aby skoncentrować kamerę na planarnym optydzie, a nie na szkle akwarium; można to zapewnić, wykonując zdjęcie z linijką jako skalą i skupiając się na cieniu linijki na optydzie, a nie na samej linijce.
    4. Ustaw następujące parametry w panelu sterowania kamerą w oprogramowaniu: wewnętrzne źródło modulacji; falę sinusoidalną jako kształt fali wyjściowej; dodatkowe próbkowanie fazy (Tak); 8 próbek fazy, kolejność fazy przeciwna, odczyt Tap A + B; częstotliwość modulacji 5 kHz.
      UWAGA: Te parametry wpływają na jakość obrazu i mogą być zmieniane w razie potrzeby. Producent kamery udostępnia wytyczne dotyczące poszczególnych parametrów (producent kamery publikuje wytyczne i aktualizacje za każdym razem, gdy oprogramowanie jest aktualizowane).
    5. Wykonaj obraz odniesienia przed rozpoczęciem eksperymentów.
      UWAGA: Można to zrobić, wizualizując standard kalibracyjny (barwnik luminescencyjny o znanym czasie życia (ns lub µs)), lub używając światła odbitego od diody LED. W tym drugim przypadku filtr długofalowy emisji musi zostać usunięty z obiektywu, a znany czas życia można ustawić na 1 ns.
    6. Dostosuj czas ekspozycji w sekcji kalibracji dedykowanego oprogramowania do wizualizacji, aż odczyt Statystyki ROI (na dole tego panelu) dla znormalizowanego obrazu intensywności luminescencji znajdzie się w zakresie 0,68–0,72.
      UWAGA: Teraz czas życia odniesienia (np. 1 ns) jest wprowadzany do oprogramowania jako wartość wejściowa.
    7. Kliknij Wykonaj obraz odniesienia, aby rozpocząć akwizycję serii pomiarowej odniesienia.
      UWAGA: Po zakończeniu dane odniesienia są zapisywane, a następnie można wykonywać pojedyncze pomiary lub pomiary z przebiegiem czasowym na próbkach.
  3. Kalibracja optydu O2
    1. Umieść kawałek planarnego optydu wrażliwego na O2 w (małym) szklanym akwarium. Zamocuj planarny optyd na ścianie szklanej komory kalibracyjnej, jak opisano wcześniej (zobacz sekcję 2.3). Umieść akwarium kalibracyjne przed kamerą. Zapewnij równomierne oświetlenie diodą LED oraz to, że optyd wypełnia cały obszar widzenia.
      UWAGA: Planarny optyd powinien pochodzić z tego samego kawałka folii lub być wykonany z tej samej mieszaniny sensora, co folia używana w rzeczywistym eksperymencie.
    2. Wypełnij akwarium tym samym medium ciekłym, co w eksperymentach.
      UWAGA: Użycie różnych mediów do kalibracji i eksperymentów może wpływać na pomiar (np. poprzez zmianę odpowiedzi sensora i/lub rozpuszczalności O2). Dlatego kalibrację należy przeprowadzać w tym samym medium i w tej samej temperaturze, co rzeczywisty eksperyment. Fluktuacje temperatury wpływają na sygnał luminescencji i powinny być unikane. Jeśli jednak nie można utrzymać stałej temperatury, konieczna jest kompensacja temperatury poprzez kalibrację optydu wrażliwego na O2 (wielopunktową) w różnych (istotnych) temperaturach, a następnie ponowne przeliczenie wartości.
    3. Dostosuj stężenie O2 w akwarium kalibracyjnym, przepuszczając wodę przez mieszaninę gazów powietrze/N2 o znanym stężeniu O2, używając urządzenia do mieszania gazów. Upewnij się, że woda jest dobrze zrównoważona z używaną mieszaniną gazów, napowietrzając ją przez wystarczająco długi czas (czas zależy od przepływu i wielkości akwarium).
      UWAGA: Zalecamy monitorowanie poziomu O2 w akwarium kalibracyjnym za pomocą zewnętrznego, skalibrowanego czujnika O2 z kompensacją temperatury (np. za pomocą światłowodowego lub elektrochemicznego czujnika O2).
    4. Wykonaj serię obrazów przy różnych stężeniach O2 w komorze kalibracyjnej.
      UWAGA: Należy zmierzyć co najmniej pięć różnych stężeń O2, aby umożliwić odpowiednie dopasowanie krzywej do uzyskanych danych kalibracyjnych. Ważne jest, aby wykonać pomiar przy 0 hPa (warunki beztlenowe), a następnie rozłożyć pozostałe wartości na całym zakresie dynamicznym danego barwnika wskaźnikowego. W tym przypadku użyto PtTFPP jako barwnika wskaźnikowego wrażliwego na O2, immobilizowanego w matrycy polistyrenowej. Obrazy wykonano przy 0, 48, 102, 156 i 207 hPa; 207 hPa odpowiada 100% nasyceniu powietrzem przy danej zasoleniu i ciśnieniu.
  4. Wizualizacja próbki
    1. Umieść próbkę przed kamerą i zapewnij równomierne oświetlenie.
    2. Wyłącz światło oświetlające roślinę (i wszystkie inne źródła światła) tuż przed wykonaniem obrazu czasu życia luminescencji rośliny. Dostosuj czas akwizycji na podstawie obrazu intensywności, zapewniając, że sygnał nie jest ani przesycany, ani zbyt słaby, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu (S/N) przy określaniu czasu życia.
    3. Wystaw roślinę do różnych warunków oświetleniowych (np. światło/ciemność) i wykonaj zestaw obrazów.
    4. Włącz światło w pomieszczeniu, aby wykonać Obraz strukturalny.
      UWAGA: Gdy światło tła jest włączone, kamera nie będzie mierzyć realistycznego obrazu czasu życia. Obraz intensywności pokazuje teraz cały obszar widzenia, widziany przez półprzezroczysty optyd.
    5. Wykonaj obraz z linijką lub podobnym obiektem w polu widzenia, aby umożliwić późniejsze skalowanie uzyskanych obrazów.

5. Analiza danych

  1. Wyeksportuj obrazy czasu życia fazowego i intensywności bezpośrednio z dedykowanego oprogramowania do obrazowania, używając makra dostarczonego przez producenta kamery.
  2. Wykonaj dalszą analizę obrazów za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazów (zobacz Tabelę materiałów).
  3. Otwórz obrazy czasu życia fazowego kalibracji w oprogramowaniu do analizy obrazów i wyznacz średnią wartość dla całego obrazu, korzystając z funkcji pomiarowej. Sporządź wykres zmierzonych czasów życia w funkcji znanych stężeń O2, aby wyznaczyć funkcję kalibracyjną (Rysunek 4A).
  4. Oblicz τ0/τ dla wszystkich danych (τ0 to zmierzony czas życia fazowego w warunkach braku O2). Sporządź wykres tych wartości w funkcji znanych stężeń O2 (Rysunek 4B).
  5. Wyznacz parametry Ksv i f z wykresu kalibracyjnego, stosując uproszczony model dwuśrodkowy dla dynamicznego gaszenia kolizyjnego (równanie 3)38,39, gdzie [Q] to stężenie O2. Zdefiniuj funkcję dopasowania w oprogramowaniu analitycznym, które następnie wyznaczy wartości Ksv i f.

(3) figure-protocol-1

  1. Otwórz uzyskane obrazy próbek w oprogramowaniu do analizy obrazów, aby przeliczyć zarejestrowane czasy życia na stężenia O2, wykorzystując określone parametry Ksv, f oraz τ0.
    NOTKA: Jako alternatywną metodę można również bezpośrednio wykorzystać uzyskane wartości czasu życia w fazie kalibracji (Rysunek 4A). W takim przypadku do kalibracji stosuje się dopasowanie wykładnicze przy użyciu funkcji dopasowania krzywej.
  2. Otwórz obraz z linijką w oprogramowaniu do analizy obrazów i zmierz znaną odległość za pomocą narzędzia pomiarowego. Ustaw ten pomiar jako skalę globalną w opcji Ustaw skalę.

Wyniki

Jako przykład zastosowania nowego systemu obrazowania prezentujemy obrazowanie 2D O2 złożonej próbki biologicznej (tj. ryzosfery rośliny wodnej Littorella uniflora).

W pierwszej kolejności metoda opisuje wytwarzanie płaskiej błony sensorycznej, tzw. optody planarnej. Jak pokazano na Rysunku 1, taka optoda składa się z cienkiej warstwy wskaźnika optycznego w matrycy polimerowej, naniesionej na przezroczyste podłoże. Postępując zgodnie z opisanym protokołem, otrzymuje się jednorodną błonę sensoryczną o równomiernej grubości, zdefiniowanej przez szczelinę urządzenia do powlekania nożowego. Jeśli otrzymana optoda wykazuje niejednorodny rozkład materiału sensorycznego (np. dziury w powłoce, pasy lub agregaty barwnika (można to ocenić wizualnie oraz z pomocą lampy UV)), należy powtórzyć protokół, a wszystkie materiały dokładnie oczyścić za pomocą acetonu.

Po przygotowaniu planarnego optodu można doprowadzić próbkę do bezpośredniego kontaktu z warstwą sensorową optodu, co pokazano tutaj na przykładzie planarnego optodu zintegrowanego w komorze typu rhizo-sandwich, w której korzenie rośliny w otaczającej matrycy osadów mogą być umieszczone w bliskim kontakcie z optodem (Rysunek 2). Jeśli komora rhizo-sandwich została przygotowana prawidłowo, powinna być łatwo przenaszalna z jednego akwarium (inkubacja) do drugiego (pomiar). W przypadku nieprawidłowego wykonania komora rhizo-sandwich może być niestabilna, może dochodzić do utraty osadu lub pojawić się pęcherzyki powietrza. Dlatego zaleca się przeprowadzenie kontroli wizualnej komory rhizo-sandwich bezpośrednio po montażu.

Przedstawiony protokół umożliwia obrazowanie czasu życia luminescencji próbki w kontakcie z płaską optodą w dziedzinie częstotliwości, z wykorzystaniem kamery do obrazowania czasu życia luminescencji w dziedzinie częstotliwości. Więcej szczegółów na temat tego systemu kamer, takich jak tryb akwizycji obrazu i charakterystyka naukowej kamery CMOS (SCMOS), podano w niedawnych publikacjach8,29.

Sama konfiguracja jest dość prosta i obejmuje jedynie kamerę sterującą źródłem światła (w tym przypadku źródłem wzbudzenia LED) oraz próbkę z optodą (Rycina 3). Należy upewnić się, że wszystkie elementy są prawidłowo podłączone, a próbka jest oświetlona jednorodnie. Podczas wykonywania pomiarów należy unikać światła tła.

Przed obrazowaniem próbki optoda musi zostać skalibrowana. Jak pokazano na Rycina 4A, zmierzony czas życia luminescencji maleje wraz ze wzrostem stężenia O2 zgodnie z quasi-wykładniczym zanikiem. Zależność tę można również opisać za pomocą uproszczonego modelu dwumiejscowego (Rycina 4B i równanie 3). W podanym przykładzie parametry niezbędne do późniejszego obliczenia stężenia O2 wynosiły: τ0 = 56.26 µs, Ksv = 0.032 hPa-1 oraz f = 0.86.

Przeprowadzenie kalibracji jest również idealnym sposobem na sprawdzenie, czy system działa poprawnie. Jeśli wszystkie komponenty zostały zainstalowane zgodnie z opisem (lub zgodnie z wytycznymi producenta), zmierzony czas życia powinien wykazywać taką samą zależność od O2, jaką przedstawiono na Rysunku 4. Ponadto, dla tej samej kombinacji materiałów sensorowych O2 (polimeru i barwnika), zmierzona wartość τ0 powinna mieścić się w tym samym zakresie (± kilka µs), co w pomiarach przedstawionych tutaj (zależność ta jest głównie wpływana przez temperaturę eksperymentalną). W przypadku braku możliwości uzyskania podobnej krzywej kalibracyjnej należy upewnić się, że wszystkie kroki zostały wykonane prawidłowo. Czasami optoda zostaje przypadkowo zamocowana stroną czułą skierowaną w stronę szklanej ścianki, a nie próbki, lub pozyskane obrazy są prześwietlone bądź niedoświetlone.

Wykorzystując parametry kalibracyjne, możliwe jest określenie stężenia O2 poprzez obrazowanie czasu życia luminescencji (τ). Zostało to zaprezentowane na Rysunku 5A,B, gdzie obrazowano rozkład stężenia O2 w ryzosferze Littorella uniflora odpowiednio w ciemności oraz po ekspozycji na światło o natężeniu 500 µmol fotonów m-2 s-1 przez 12 h. Ze względu na aktywność fotosyntetyczną rośliny, stężenie O2 w ryzosferze wzrosło po naświetleniu. Oprócz obrazów czasu życia, przy zachowaniu stałej geometrii obrazowania, można uzyskać obrazy „strukturalne” pod wpływem zewnętrznego oświetlenia. W ten sposób obrazy O2 można precyzyjnie skorelować z obrazem strukturalnym (Rysunek 5C), przekrojami poprzecznymi lub obszarami zainteresowania. Jako przykład, z obrazów uzyskanych odpowiednio w ciemności i w świetle wyodrębniono profile stężenia O2 w poprzek pojedynczego korzenia (Rysunek 5D).

figure-results-1
Rycina 1: Wykonanie płaskiego optodu O2. (A) Folia PET zostaje przymocowana do szklanej płytki, a urządzenie do powlekania nożowego zostaje umieszczone na folii. (B) Przygotowana mieszanina sensorowa jest rozprowadzana na folii PET w formie cienkiej linii przed urządzeniem do powlekania nożowego. (C) Urządzenie do powlekania nożowego jest przesuwane w dół, aby rozprowadzić mieszaninę sensorową w postaci cienkiej warstwy na folii PET, co po odparowaniu rozpuszczalnika daje gotowy do użycia płaski optod. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Montaż komory rhizo-sandwich z zintegrowanym płaskim optodem O2. (A) Optod zostaje przymocowany do jednej z szklanych płytek za pomocą filmu wodnego. (B) Optod zostaje przyklejony do płytki taśmą izolacyjną. (C) Osad zostaje wsypany do przeciwległej płytki z dołączonymi dystansami (tj. szkiełkami przedmiotowymi). (D) Korzenie roślin zostają umieszczone na równomiernie rozprowadzonym osadzie. (E) Komora rhizo-sandwich zostaje zamknięta i tymczasowo przymocowana zaciskami. (F) Całkowicie zamknięta i zmontowana komora rhizo-sandwich. (G) Aby chronić optod przed ekspozycją na światło lampy inkubacyjnej i uniknąć wzrostu glonów, nad zmontowaną komorą rhizo-sandwich umieszcza się plastikową osłonę. (H) Komora rhizo-sandwich inkubowana w akwarium. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Układ obrazowania zawierający kamerę do pomiaru czasu życia luminescencji w dziedzinie częstotliwości, z obiektywem ustawionym na próbkę z optodą od tyłu przez przezroczyste ścianki akwarium i komory rhizo-sandwich. Przewód światłowodowy źródła wzbudzenia LED jest ustawiony tak, aby równomiernie oświetlać próbkę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Krzywe kalibracyjne dla planarnej optody O2. (A) Różne czasy życia fosforescencji zmierzone przy odpowiednich stężeniach O2 w wypełnionej wodą komorze kalibracyjnej. (B) Wykres Sterna-Volmera z danych kalibracyjnych dopasowanych przy użyciu uproszczonego modelu dwumiejscowego dla dynamicznego wygaszania kolizyjnego (równanie 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Obrazowanie czasu życia rozkładu O2 w ryzosferze rośliny wodnej Littorella uniflora. (A) Rozkład O2 po utrzymywaniu rośliny w świetle przez 12 h przy natężeniu około 500 µmol photons m-2 s-1. (B) Rozkład O2 po utrzymywaniu rośliny w ciemności przez 1 h. (C) Obraz strukturalny korzeni rośliny widziany przez optodę płaską. (D) Poprzeczny profil stężenia O2 (lokalizacja zaznaczona żółtą linią na panelach A i B) po 12 h w świetle (kolor czerwony) i 1 h w ciemności (kolor czarny). Adaptowano za zgodą (Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Analytical Chemistry. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Copyright (2019) American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym protokole uwzględniony jest cały przepływ pracy od przygotowania optody do analizy obrazuO2. Postępując zgodnie z tym protokołem, obrazy chemiczne można uzyskać za pomocą nowatorskiej kamery o żywotności luminescencji opartej na domenie częstotliwości. W zależności od zastosowania, płaskie optody mogą być wytwarzane w różnych rozmiarach i grubościach warstwy czujnika, od wytrzymałych płaskich optodów o grubości 50-100 μm i kilku dziesiątych centymetra kwadratowego do szkiełek nakrywkowych mikroskopu z warstwami czujnika o grubości <1 μm 6,40. Potencjał tej metody został zademonstrowany przy szczególnym zastosowaniu, ale nie ogranicza się tylko do obrazowaniaO2 w ryzosferach roślinnych12,28.

Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z metodami obrazowania chemicznego opartymi na intensywności czystej luminescencji. Na obrazowanie czasu życia luminescencji nie ma wpływu, a przynajmniej w znacznie mniejszym stopniu, nierównomierne oświetlenie, nierówna grubość optody i wybielanie zdjęć25. Ponadto w tej metodzie unika się stosowania dodatkowego barwnika referencyjnego powszechnego w obrazowaniu ratiometrycznym17,37. W porównaniu z innymi systemami kamer opartymi na żywotności, takimi jak powszechnie stosowane kamery bramkowanew dziedzinie czasu 8,26, zaprezentowany tutaj nowatorski system kamer i protokół mogą zapewnić porównywalne wyniki. W niedawnej publikacji porównano charakterystyki analityczne tych dwóch systemów i stwierdzono, że system kamer o żywotności luminescencji oparty na domenie częstotliwości jest co najmniej porównywalny z wycofanym z produkcji poprzednikiem opartym na dziedzinie czasu8.

Przedstawiliśmy najprostszą optodęO2 składającą się tylko ze wskaźnika w matrycy polimerowej. Oprócz wielu innych możliwych wskaźnikówO2 20 , które mogą być stosowane, można dołączyć dodatki, tj. środki rozpraszające, takie jak TiO2 lub proszek diamentowy2 w celu zwiększenia sygnału czujnika przy jednoczesnym zmniejszeniu przezroczystości optody. Można również użyć dodatkowych barwników w celu zwiększenia intensywności sygnału poprzez transfer energii41.

W przypadku wytwarzania płaskiej optody zalecamy użycie szczeliny w urządzeniu do powlekania nożem wynoszącej 75 - 120 μm, aby uzyskać końcową grubość warstwy czujnika około 7,5 do 12 μm po odparowaniu rozpuszczalnika (około 10% zastosowanej szczeliny), w przypadku stosowania opisanego składu koktajlu czujnika. Jest to dobry kompromis pomiędzy intensywnością sygnału, która może być modyfikowana przez większe obciążenie barwnikiem, lub poprzez wybór barwników wskaźnikowych i referencyjnych o wyższej jasności, a czasem reakcji. Wzrost grubości warstwy powoduje wydłużenie czasu reakcji, ponieważ wydłuża się czas potrzebny do osiągnięcia przez analit równowagi termodynamicznej w warstwie czujnikowej z otaczającymi mediami12.

Optody, jak opisano tutaj, reagują na zmiany stężeniaO2 w ciągu kilku sekund17 , nadal mając wystarczająco silny sygnał luminescencyjny. Ultracienkie powłoki czujników z czasem reakcji poniżej sekundy mogą być realizowane za pomocą powłokispin-coating 6. Jeśli podpora lub urządzenie do powlekania noża nie są dobrze oczyszczone, może to spowodować powstanie niejednorodnych warstw czujnika. Ponadto, gdy koktajl nie jest całkowicie jednorodny lub nakładany zbyt szybko po rozprowadzeniu przed urządzeniem powlekającym, można zaobserwować taki niepożądany efekt. Dlatego może być potrzebna pewna praktyka, aby przygotować optymalne optody.

Metoda ta może być stosowana do obrazowania próbek, które mogą być w bliskim kontakcie z optodą, takich jak niektóre zwierzęta morskie42, biofilmy6 i gleby31 , by wymienić tylko kilka. Prezentujemy samodzielną konfigurację z obiektywem, jednak kamerę można łatwo połączyć z mikroskopem w celu obrazowania chemicznego o wyższej rozdzielczości43.

Podczas gdy obrazowanie czasu życia luminescencji w dziedzinie czasu umożliwiło tłumienie fluorescencji tła26, jest to problem w przypadku korzystania z nowego systemu kamer opartego na dziedzinie częstotliwości8. Ze względu na ciągłą akwizycję obrazu, kamera ta zarejestruje dowolną fluorescencję tła próbki, która może być wzbudzona przez wybraną diodę LED i emitowana w wybranym oknie widmowym, zgodnie z definicją filtra emisyjnego na obiektywie kamery. Spowoduje to pozornie krótszy czas życia, a co za tym idzie, fałszywe odczyty. W przypadku pracy z próbkami o znacznej fluorescencji wewnętrznej pokrywającej się ze wzbudzeniem i emisją czujnikaO2, konieczne jest zastosowanie dodatkowej izolacji optycznej na wierzchu optody, poprzez pokrycie dodatkowej warstwy zawierającej sadzę 2,17. W ten sposób do kamery dotrze tylko luminescencja emitowana z optody planarnej. W celu sprawdzenia luminescencji tła można wykonać zdjęcie bez optody, które następnie pokaże wyłącznie luminescencję wewnętrzną próbki. Możliwe jest również dodanie środków rozpraszających, takich jak TiO2 lub proszek diamentowy 2,44, do koktajlu czujnika, w celu zwiększenia intensywności luminescencji barwnika wskaźnikowego. Jednak może to również prowadzić do szybszego wybielania zdjęć, a TiO2 jest znanym fotokatalizatorem, który może pogorszyć fotostabilność barwnika41. Kolejnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę, jest światło tła. Podczas obrazowania czasów życia luminescencji należy jak najskuteczniej unikać światła tła. Dlatego ta metoda obrazowania wymaga, aby zestaw był umieszczony w ciemnym otoczeniu, a wszelkie zewnętrzne źródła światła muszą być tymczasowo wyłączone podczas akwizycji obrazu.

Podsumowując, obrazowanie czasu życia luminescencji jest solidną metodą obrazowania chemicznego, którą można dostosować do wielu różnych zastosowań. Protokół ten (patrz sekcja 1 - 5) obejmuje wszystkie niezbędne kroki do wygenerowania obrazuO2 i wykorzystuje obecnie najbardziej elastyczny system obrazowania czasu życia luminescencji w dziedzinie częstotliwości, który może zastąpić wycofaną kamerę bramkowaną w dziedzinie czasu do obrazowania 2D O2 z płaskimi optodami.

Oświadczenia

Autor Gerhard Holst jest pracownikiem firmy PCO AG, która jest producentem systemu kamer użytego w tym artykule. PCO AG partycypowało finansowo w pokryciu kosztów publikacji i otwartego dostępu do artykułu.

Podziękowania

Dziękujemy Sofie Lindegaard Jakobsen (Uniwersytet w Kopenhadze) i Larsowi Borregaardowi Pedersenowi (Uniwersytet w Aarhus) za pomoc techniczną. Finansowanie tego badania uzyskano z grantu Sapere-Aude Advanced z Niezależnego Funduszu Badawczego w Danii (DFF-1323-00065B; MK), granty projektowe z Niezależnego Funduszu Badawczego Dania | Nauki przyrodnicze (DFF-8021-00308B; MK) oraz Nauk Technicznych i Produkcyjnych (DFF-8022-00301B i DFF-4184-00515B; MK), Duńską Narodową Fundację Badawczą (DNRF136) oraz Fundację Poul Due Jensen (KK).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa powietrza z kamieniem napowietrzającym i pompą wodnąLokalny sklep
ChloroformSigma Aldrich67-66-3
DC4 związeksilikonowy Dow Corning GmbH2793695
Mieszalnik gazówVö gtlin Instruments GmbHred-y kompaktowy miernik GCMTo tylko jeden z możliwych instrumentów. Kilka firm oferuje urządzenia do mieszania gazów
Szklane płyty i akwaria Lokalneakwarium lub sklep
Oprogramowanie ImageJImageJBezpłatnie dostępne oprogramowanie do obrazowania (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Urządzenie do powlekania nożem

BYK-GARDNER GMBH		2021Jest to czterostronny aplikator folii, który umożliwia łatwą zmianę grubości folii. Dostępne są również inne wersje. Zalecamy grubość nakładanej folii w zakresie 75-120 i mikro; m, co daje końcową grubość warstwy czujnika wynoszącą ~10% grubości nałożonej przed odparowaniem rozpuszczalnika.
Lampa LED, Reflektor PAR38MegamanMM17572
LED LEDHUBOmicon Laserage, NiemcyMoże być skonfigurowany z różnymi diodami LED. W prezentowanym przykładzie niezbędna jest zielona dioda LED (528 nm)
LOCTITE AA 3494Henkel AG & Co. KGaANAKlej błyskawiczny na bazie akrylu
NIS Elements AR SoftwareNikon IncPakiet oprogramowania używany do akwizycji obrazu
pco.flimPCO AG, NiemcyDożywotnia żywotność luminescencji w
oparciu o domenę częstotliwościplatyna(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorfenylo)-porfiryna (PtTFPP)Frontier ScientificPtT975O2
Goodfellow320-992-72Takie folie można również znaleźć u innych dostawców i służą jako solidne podparcie
Polistyren (PS)Sigma Aldrich9003-53-6Matryca polimerowa
Schott Filtr RG610www.uviroptics.comTutaj można uzyskać przykręcanie 52 mm Filtry. Inne źródła oferują kwadratowe filtry szklane ze szkła Schott, które można zamocować przed obiektywem
Taśma izolacyjna winylowaScotch, Super 33+NA
Zeiss Makro Planar 2/100 z adapterem Hama C do Nikondostarczany z aparatemTutaj każdy inny obiektyw może być również używany w połączeniu z adapterem, jeśli obiektyw nie ma mocowania C
akwarystyczny: z narzędziami byk.com Folia wskaźnikowa z politereftalanu etylenu (PET)

Bibliografia

  1. Glud, R. N., Kühl, M., Kohls, O., Ramsing, N. B. Heterogeneity of oxygen production and consumption in a photosynthetic microbial mat as studied by planar optodes. Journal of Phycology. 35 (2), 270-279 (1999).
  2. Moßhammer, M., Strobl, M., Kühl, M., Klimant, I., Borisov, S. M., Koren, K. Design and Application of an Optical Sensor for Simultaneous Imaging of pH and Dissolved O2 with Low Cross-Talk. ACS Sensors. 1 (6), 681-687 (2016).
  3. Jensen, S. I., Kühl, M., Glud, R. N., Jørgensen, L. B., Priemé, A. Oxic microzones and radial oxygen loss from roots of Zostera marina. Marine Ecology Progress Series. , 49-58 (2005).
  4. Larsen, M., Santner, J., Oburger, E., Wenzel, W. W., Glud, R. N. O2 dynamics in the rhizosphere of young rice plants (Oryza sativa L.) as studied by planar optodes. Plant and Soil. 390 (1-2), 279-292 (2015).
  5. Brodersen, K. E., Koren, K., Moßhammer, M., Ralph, P. J., Kühl, M., Santner, J. Seagrass-Mediated Phosphorus and Iron Solubilization in Tropical Sediments. Environmental Science and Technology. 51, 14155-14163 (2017).
  6. Kühl, M., Rickelt, L. F., Thar, R. Combined imaging of bacteria and oxygen in biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 73 (19), 6289-6295 (2007).
  7. Sønderholm, M., et al. Tools for studying growth patterns and chemical dynamics of aggregated Pseudomonas aeruginosa exposed to different electron acceptors in an alginate bead model. npj Biofilms and Microbiomes. 3, 1-11 (2018).
  8. Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S. M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Analytical Chemistry. 91 (5), 3233-3238 (2019).
  9. Brodersen, K. E., Koren, K., Lichtenberg, M., Kühl, M. Nanoparticle-based measurements of pH and O2 dynamics in the rhizosphere of Zostera marina L.: effects of temperature elevation and light-dark transitions. Plant, Cell & Environment. 39 (7), 1619-1630 (2016).
  10. Zhu, Q., Aller, R. C., Fan, Y. High-Performance Planar pH Fluorosensor for Two-Dimensional pH Measurements. in Marine Sediment and Water. Environmental Science & Technology. 39, 8906-8911 (2005).
  11. Murniati, E., Gross, D., Herlina, H., Hancke, K., Glud, R. N., Lorke, A. Oxygen imaging at the sediment-water interface using lifetime-based laser induced fluorescence (τLIF) of nano-sized particles. Limnology and Oceanography: Methods. 14 (8), 506-517 (2016).
  12. Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils - a review. Analytica Chimica Acta. , 9-42 (2015).
  13. Glud, R. N. Oxygen dynamics of marine sediments. Marine Biology Research. 4 (4), 243-289 (2008).
  14. Revsbech, N. P., Jorgensen, B. B., Blackburn, T. H. Oxygen in the Sea Bottom Measured with a Microelectrode. Science. 207 (4437), 1355-1356 (1980).
  15. Klimant, I., Meyer, V., Kuhl, M. Fiberoptic oxygen microsensors, a new tool in aquatic biology. Limnology and Oceanography. 40 (6), 1159-1165 (1995).
  16. Glud, R. N., Tengberg, A., Kühl, M., Hall, P. O. J., Klimant, I., Holst, G. An in situ instrument for planar O2 optode measurements at benthic interfaces. Limnology and Oceanography. 46 (8), 2073-2080 (2001).
  17. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9, 348-360 (2011).
  18. Glud, R., Ramsing, N., Gundersen, J., Klimant, I. Planar optrodes:a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
  19. Frederiksen, M. S., Glud, R. N. Oxygen dynamics in the rhizosphere of Zostera marina: A two-dimensional planar optode study. Limnology and Oceanography. 51 (2), 1072-1083 (2006).
  20. Quaranta, M., Borisov, S. M., Klimant, I. Indicators for optical oxygen sensors. Bioanalytical Reviews. 4, 115-157 (2012).
  21. Koren, K., Hutter, L., Enko, B., Pein, A., Borisov, S. M., Klimant, I. Tuning the dynamic range and sensitivity of optical oxygen-sensors by employing differently substituted polystyrene-derivatives. Sensors and Actuators B: Chemical. 176 (100), 344-350 (2013).
  22. Borisov, S. M. Fundamentals of Quenched Phosphorescence O2 Sensing and Rational Design of Sensor Materials. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , 1, Chapter 1 1-18 (2018).
  23. Wang, X., Wolfbeis, O. S. Optical methods for sensing and imaging oxygen: materials, spectroscopies and applications. Chemical Society Reviews. 43, 3666-3761 (2014).
  24. Ehgartner, J., Wiltsche, H., Borisov, S. M., Mayr, T. Low cost referenced luminescent imaging of oxygen and pH with a 2-CCD colour near infrared camera. The Analyst. 139 (19), 4924(2014).
  25. Meier, R. J., Fischer, L. H., Wolfbeis, O. S., Schäferling, M. Referenced luminescent sensing and imaging with digital color cameras: A comparative study. Sensors and Actuators B: Chemical. 177, 500-506 (2013).
  26. Holst, G., Kohls, O., Klimant, I., König, B., Kühl, M., Richter, T. A modular luminescence lifetime imaging system for mapping oxygen distribution in biological samples. Sensors and Actuators B. 51, 163-170 (1998).
  27. Moßhammer, M., Brodersen, K. E., Kühl, M., Koren, K. Nanoparticle- and microparticle-based luminescence imaging of chemical species and temperature in aquatic systems: a review. Microchimical Acta. , 1-28 (2019).
  28. Koren, K., Kühl, M. CHAPTER 7. Optical O2 Sensing in Aquatic Systems and Organisms. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. 1, 145-174 (2018).
  29. Chen, H., Holst, G., Gratton, E. Modulated CMOS camera for fluorescence lifetime microscopy. Microscopy Research and Technique. 78, 1075-1081 (2015).
  30. Franke, R., Holst, G. A. Frequency-domain fluorescence lifetime imaging system (pco.flim) based on a in-pixel dual tap control CMOS image sensor. Proceedings of SPIE 93281, Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues XIII. , 1-19 (2015).
  31. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  32. Schreml, S., et al. 2D luminescence imaging of physiological wound oxygenation. Experimental dermatology. 20 (7), 550-554 (2011).
  33. Trampe, E., et al. Functionalized Bioink with Optical Sensor Nanoparticles for O2 Imaging in 3D-Bioprinted Constructs. Advanced Functional Materials. 1804411, 1804411(2018).
  34. Gouterman, M. Oxygen Quenching of Luminescence of Pressure Sensitive Paint for Wind Tunnel Research. Journal of Chemical Education. 74 (6), 697(1997).
  35. Fischer, L. H., et al. Referenced dual pressure- and temperature-sensitive paint for digital color camera read out. Chemistry. 18 (49), 15706-15713 (2012).
  36. Fabricius-Dyg, J., Mistlberger, G., Staal, M., Borisov, S. M., Klimant, I., Kühl, M. Imaging of surface O2 dynamics in corals with magnetic micro optode particles. Marine Biology. 159 (7), 1621-1631 (2012).
  37. Koren, K., Jakobsen, S. L., Kühl, M. In-vivo imaging of O2 dynamics on coral surfaces spray-painted with sensor nanoparticles. Sensors and Actuators B: Chemical. 237, 1095-1101 (2016).
  38. Carraway, E. R., Demas, J. N., DeGraff, B. A., Bacon, J. R. Photophysics and Photochemistry of Oxygen Sensors Based on Luminescent Transition-Metal Complexes. Analytical Chemistry. 63 (4), 337-342 (1991).
  39. Klimant, I., Ruckruh, F., Liebsch, G., Stangelmayer, A., Wolfbeis, O. S. Fast response oxygen micro-optodes based on novel soluble ormosil glasses. Mikrochimica Acta. 131, 35-46 (1999).
  40. Askaer, L., Elberling, B., Glud, R. N., Kühl, M., Lauritsen, F. R., Joensen, H. P. Soil heterogeneity effects on O2 distribution and CH4 emissions from wetlands: In situ and mesocosm studies with planar O2 optodes and membrane inlet mass spectrometry. Soil Biology and Biochemistry. 42 (12), 2254-2265 (2010).
  41. Mayr, T., Borisov, S. M., Abel, T., Enko, B., Waich, K. Light Harvesting as a Simple and Versatile Way to Enhance Brightness of Luminescent Sensors. Analytical Chemistry. 81, 6541-6545 (2009).
  42. Kühl, M., et al. Microenvironmental Ecology of the Chlorophyll b-Containing Symbiotic Cyanobacterium Prochloron in the Didemnid Ascidian Lissoclinum patella. Frontiers in microbiology. 3, 1-18 (2012).
  43. Dalfen, I., Dmitriev, R. I., Holst, G., Klimant, I., Borisov, S. M. Background-Free Fluorescence-Decay-Time Sensing and Imaging of pH with Highly Photostable Diazaoxotriangulenium Dyes. Analytical Chemistry. 91 (1), 808-816 (2019).
  44. Chatni, M. R., Maier, D. E., Porterfield, D. M. Evaluation of microparticle materials for enhancing the performance of fluorescence lifetime based optrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 141, 471-477 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

optoda tlenowakamera w dziedzinie częstotliwościoptoda planarnastężenie tlenuobrazowanie ryzosferykoktajl sensorowypowlekanie nożemprocedura kalibracjiobrazowanie strukturalne
Obrazowanie żywotności luminescencjiO2 za pomocą systemu kamer opartego na domenie częstotliwości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.