Artykuł metodologiczny

Obrazowanie nanoskopowe skrawków tkanek ludzkich poprzez ekspansję fizyczną i izotropową

DOI:

10.3791/60195

⸱

25 września 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2QPathology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie klinicznych próbek tkanek w nanoskali może pomóc lepiej zrozumieć patogenezę choroby. Patologia ekspansji (ExPath) to wersja mikroskopii ekspansyjnej (ExM), zmodyfikowana pod kątem kompatybilności ze standardowymi klinicznymi próbkami tkanek, w celu zbadania konfiguracji biomolekuł w nanoskali przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W nowoczesnej patologii mikroskopia optyczna odgrywa ważną rolę w diagnozowaniu chorób, ujawniając mikroskopijne struktury próbek klinicznych. Jednak podstawowa granica dyfrakcji fizycznej uniemożliwia badanie anatomii w nanoskali i subtelnych zmian patologicznych przy użyciu konwencjonalnych metod obrazowania optycznego. W tym miejscu opisujemy prosty i niedrogi protokół, zwany patologią ekspansji (ExPath), do obrazowania optycznego w nanoskali typowych typów klinicznych pierwotnych próbek tkanek, w tym zarówno skrawków tkanek zamrożonych, jak i utrwalonych w formalinie (FFPE). Metoda ta omija granicę dyfrakcji optycznej poprzez chemiczne przekształcanie próbek tkanek w hybrydę tkankowo-hydrożelową i fizyczne rozszerzanie ich izotropowo w wielu skalach w czystej wodzie. W wyniku ekspansji wcześniej nierozdzielcze cząsteczki są oddzielane, dzięki czemu można je obserwować za pomocą konwencjonalnego mikroskopu optycznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie molekularnej organizacji tkanek w kontekście trójwymiarowym (3D) może dostarczyć nowego zrozumienia funkcji biologicznych i rozwoju choroby. Jednak te nanoskalowe środowiska wykraczają poza możliwości rozdzielczości konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji (200−300 nm), gdzie minimalna rozdzielczość d, d jest zdefiniowana przez d α λ/NA. Tutaj λ to długość fali światła, a NA to apertura numeryczna (NA) systemu obrazowania. Ostatnio bezpośrednia wizualizacja cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie stała się możliwa dzięki nowo opracowanym technikom obrazowania o wysokiej rozdzielczości1,2,3, w tym wymuszone zubożenie emisji (STED), mikroskopia lokalizacyjna aktywowana światłem (PALM), stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna (STORM) i mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM). Chociaż te techniki obrazowania zrewolucjonizowały zrozumienie funkcji biologicznych w nanoskali, w praktyce często opierają się na drogim i/lub specjalistycznym sprzęcie i etapach przetwarzania obrazu, mogą mieć wolniejszy czas akwizycji w porównaniu z konwencjonalnym obrazowaniem optycznym, wymagają fluoroforów o określonych cechach (takich jak zdolność do przełączania zdjęć i/lub wysoka fotostabilność). Ponadto wyzwaniem pozostaje wykonywanie obrazowania 3D w superrozdzielczości na próbkach tkanek.

Mikroskopia ekspansywacyjna (ExM), po raz pierwszy wprowadzona w 2015 roku4, zapewnia alternatywny sposób obrazowania cech nanoskali (<70 nm) poprzez fizyczne rozszerzanie zachowanych próbek osadzonych w pęczniejącym hydrożelu polielektrolitowym. W tym przypadku kluczowe biomolekuły i/lub etykiety są zakotwiczone in situ w sieci polimerowej, która może być ekspandowana izotopowo po obróbce chemicznej. Ponieważ ekspansja fizyczna zwiększa całkowitą efektywną rozdzielczość, cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania mogą być następnie rozdzielone przy użyciu konwencjonalnych systemów obrazowania z ograniczeniem dyfrakcji. Od czasu opublikowania oryginalnego protokołu, w którym niestandardowe syntetyzowane etykiety fluorescencyjne zostały zakotwiczone w sieci polimerowej4, zastosowano nowe strategie bezpośredniego zakotwiczania białek (retencja białek ExM lub proExM)5,6,7,8,9 i RNA9,10,11,12 do hydrożelu i zwiększ powiększenie fizyczne poprzez iteracyjne rozszerzanie13 lub adaptację chemii żelu8,14,15.

Tutaj prezentujemy zaadaptowaną wersję proExM, zwaną patologią ekspansji (ExPath)16, która została zoptymalizowana pod kątem formatów patologii klinicznej. Protokół przekształca próbki kliniczne, w tym utrwalone w formalinie próbki zatopione w parafinie (FFPE), barwione hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz świeżo zamrożone próbki tkanek ludzkich zamontowane na szkiełkach podstawowych, do stanu zgodnego z ExM. Białka są następnie zakotwiczane w hydrożelu i przeprowadzana jest mechaniczna homogenizacja (Rysunek 1)16. Dzięki 4-krotnej rozszerzalności liniowej próbek, wielokolorowe obrazy o super rozdzielczości (~70 nm) można uzyskać za pomocą konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego o rozdzielczości zaledwie ~300 nm i można je również łączyć z innymi technikami obrazowania o wysokiej rozdzielczości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie podstawowych odczynników i roztworów

  1. Przygotuj składniki roztworu żelującego.
    UWAGA:     Stężenia roztworów podane są w g/ml (w/v procentach).
    1. Przygotować następujące roztwory podstawowe: 38% (m/v) akrylan sodu (SA), 50% (w/v) akryloamid (AA), 2% (w/v) N,N′-metylenobisakryloamid (Bis) i 29,2% (w/v) chlorek sodu (NaCl). Rozpuść związki w wodzie podwójnie dejonizowanej (ddH2O). Należy wykorzystać kwoty w tabeli 1 jako odniesienie; Przygotowane rozwiązania można skalować w górę lub w dół w zależności od potrzeb. Na przykład, aby przygotować 10 ml 38% (w/v) roztworu SA, dodaj 1,9 g SA do butli z podziałką 10 ml i dodaj ddH2O do objętości 5 ml.
    2. Przygotować 9,4 ml roztworu monomeru o stężeniu 1,06x, jak pokazano w tabeli 1.
      nuta: Spowoduje to stężenie 1x po dodaniu inicjatora, akceleratora i inhibitora. Monomer może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy lub w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
    3. Przygotować następujące roztwory podstawowe oddzielnie w ddH2O: 0,5% (m/v) inhibitora 4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylopirydyno-1-oksylu (4HT), który hamuje żelowanie, aby umożliwić dyfuzję roztworu żelującego do tkanek, 10% (v/v) inicjatora tetrametyloetylenodiaminy (TEMED), który przyspiesza wytwarzanie rodników przez nadsiarczan amonu (APS) i 10% (w/v) APS, który inicjuje proces żelowania.
      nuta: Roztwory podstawowe 4HT i TEMED można przygotować w podwielokrotnościach o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy. Stwierdzono, że APS traci skuteczność po długotrwałym przechowywaniu i najlepiej przygotowywać go w małych ilościach (<0,1 ml) bezpośrednio przed żelowaniem.
  2. Przygotuj bufor wytrawiający (50 mM Tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5% [w/v] niejonowy środek powierzchniowo czynny, 0,8 M NaCl) przez połączenie 25 ml 1 M Tris pH 8 (3,03 g zasady Tris w 25 ml ddH2O), 25 ml EDTA (0,5 M pH 8), 2,25 g niejonowego środka powierzchniowo czynnego i 23,38 g NaCl. Dodać ddH2O do całkowitej objętości 500 ml.
    nuta: Roztwór można skalować w górę lub w dół w zależności od potrzeb i przechowywać w temperaturze 4 °C. Proteinaza K (ProK) zostanie dodana bezpośrednio przed etapem trawienia.
  3. Przygotować 20 mM roztworu cytrynianu sodu, łącząc 2,941 g cytrynianu sodu trójzasadowego dwuwodnego z 500 mlddH2O i dostosowując pH do 8,0 w temperaturze pokojowej (RT). W razie potrzeby skaluj ilość zapasów.
  4. Przygotować roztwór podstawowy kwasu 6-((akryloilo)amino)heksanowego, estru sukcynimidylowego (akryloilo-X, SE; AcX), związek kotwiący. Rozpuścić AcX w 500 μl bezwodnego dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia 10 mg/ml.
    nuta: Roztwór może być przechowywany w suchym środowisku w temperaturze -20 °C w 20 μl podwielokrotności.
  5. Jeśli nie używasz dostępnych w handlu do barwienia immunologicznego, przygotuj bufor blokujący. Użyj buforu blokującego składającego się z 5% (v/v) normalnej surowicy zwierzęcej i 0,1% (w/v) niejonowego środka powierzchniowo czynnego w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wybierz surowicę na podstawie zwierzęcia gospodarza przeciwciał drugorzędowych. Na przykład, aby przygotować 500 ml buforu blokującego dla przeciwciał wyhodowanych u kóz, połącz 25 ml koziej surowicy, 0,45 g niejonowego środka powierzchniowo czynnego i 1x PBS do objętości 500 ml.

2. Przygotowanie zarchiwizowanych i świeżo przygotowanych preparatów tkanek klinicznych dla ExPath

  1. Przekształć tkankę do formatu zgodnego z ExPath. Wybierz jeden z czterech następujących kroków (2.1.1−2.1.4) w zależności od sposobu przygotowania próbki: szkiełka FFPE, barwione szkiełka FFPE lub niezamocowane lub utrwalone zamrożone szkiełka tkankowe w roztworze o optymalnej temperaturze cięcia (OCT).
    UWAGA:     Są one oparte na standardowych krokach odzyskiwania próbek patologicznych i nie są specyficzne dla protokołu ExPath.
    1. Próbki kliniczne FFPE
      1. Przygotuj 30 ml 95% etanolu, 70% etanolu i 50% etanolu. Odmierz 30 ml ksylenu, 100% etanolu i ddH2O.
      2. Umieścić szkiełko z próbką w stożkowym pojemniku o pojemności 50 ml za pomocą kleszczy i dodać 15 ml ksylenu. Zakryj probówkę i umieść ją poziomo na wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 60 obr./min i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty dla każdego roztworu. Powtórz z pozostałymi 15 ml ksylenu.
      3. Powtórzyć krok 2.1.1.2 ze 100% etanolem, 95% etanolem, 70% etanolem, 50% etanolem i ddH2O zamiast ksylenu.
    2. Szkiełka stałe barwione i montowane
      1. Umieść szkiełko w szalce Petriego o średnicy 100 mm i przykryj ksylenem. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki. Jeśli szkiełko nakrywkowe nie jest łatwe do usunięcia, umieść szkiełko z powrotem na ksylenie, aż szkiełko nakrywkowe się poluzuje .
      2. Przetwarzaj zgodnie z krokami dla próbek FFPE (kroki 2.1.1.1−2.1.1.3).
        nuta: W przypadku szkiełek barwionych H&E plamy są eliminowane podczas procesu rozszerzania.
    3. Nieutrwalone zamrożone szkiełka tkankowe w roztworze OCT
      1. Utrwalić tkankę w acetonie w temperaturze -20 °C na 10 minut.
      2. Przemyć próbki 1 x roztworem PBS 3 razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej temperatury.
    4. Wcześniej utrwalone, zamrożone kliniczne preparaty tkankowe
      1. Inkubować szkiełka przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby stopić roztwór OCT.
      2. Przemyć próbkę 1 x roztworem PBS 3 razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej temperatury.
  2. Przeprowadzić obróbkę cieplną w celu pobrania antygenu na wszystkich próbkach po konwersji formatu.
    1. Dodać 20 mM roztworu cytrynianu (pH 8 przy wilgotności względnej) do żaroodpornego pojemnika, takiego jak słoik do barwienia szkiełek.
      nuta: Roztworu powinno być wystarczająco dużo, aby przykryć chusteczkę zamontowaną na szkiełku podstawowym (50 ml dla standardowego słoika do barwienia szkiełek).
    2. Podgrzać roztwór cytrynianu do 100 °C w kuchence mikrofalowej i umieścić szkiełko w roztworze. Natychmiast przenieść pojemnik do komory inkubacyjnej i inkubować w temperaturze 60 °C przez 30 min.
      nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Szkiełka można umieszczać na szalkach Petriego, przykrywać 1x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Wybarwić próbkę przy użyciu standardowych protokołów barwienia immunofluorescencyjnego (IF)/immunohistochemicznego (IHC).
    UWAGA:     Specyficzne stężenia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych oraz czas barwienia zależą od stężeń sugerowanych przez producenta lub od optymalizacji dla konkretnego eksperymentu.
    1. Użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować granicę wokół odcinka (odcinków) tkanki na szkiełku, aby zminimalizować objętość roztworu potrzebną do pokrycia tkanki. Umieść szkiełko w naczyniu wystarczająco dużym, aby zmieściło się w szkiełku. W przypadku standardowej prowadnicy 3-calowej użyj szalki Petriego o średnicy 100 mm.
      nuta: Pióro hydrofobowe nie zakłóca polimeryzacji próbki ani procesu trawienia.
    2. Inkubować tkankę z buforem blokującym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania.
    3. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe do pożądanego stężenia w odpowiedniej ilości przygotowanego buforu blokującego (lub innego preferowanego buforu barwiącego). Inkubować tkanki z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej lub 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.
      nuta: Próbki należy umieścić w nawilżonym pojemniku (takim jak szalka Petriego z wilgotną chusteczką), aby zapobiec wysychaniu tkanki. Zazwyczaj przeciwciała rozcieńcza się do 1:100−1:500 w 200−500 μl buforu, w zależności od wielkości tkanki i zastosowanego przeciwciała.
    4. Przemyć tkankę przygotowanym buforem blokującym (lub innym preferowanym buforem do mycia) 3 razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej
    5. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (i 300 nM 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu [DAPI] w razie potrzeby) w przygotowanym buforze blokującym (lub innym preferowanym buforze barwiącym) do stężenia około 10 μg/ml. Inkubować tkankę w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 37 °C.
      nuta: Czas podawania przeciwciał można dostosować w zależności od zastosowanych przeciwciał i grubości tkanki. Przeciwciała drugorzędowe zawierające barwniki cyjaninowe (Cy3, Cy5, Alexa 647) nie są zgodne z protokołem ExM po zastosowaniu polimeryzacji wstępnej. Sugerowane barwniki to Alexa 488 (zielony), Alexa 546 (pomarańczowy/czerwony) i Atto 647N lub CF633 (daleki czerwony). DAPI należy ponownie nałożyć po rozprężeniu, ponieważ jest zmywany podczas procesu rozprężania.
    6. Przemyć chusteczkę przygotowanym buforem blokującym (lub innym preferowanym buforem do mycia) 3 razy po 10 minut w temperaturze RT.
      nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Szkiełka można umieszczać na szalkach Petriego, przykrywać 1x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    7. Obrazowanie fluorescencyjne należy wykonywać za pomocą konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego, mikroskopu konfokalnego lub innego wybranego systemu obrazowania.
      nuta: Ten krok jest wymagany do określenia długości biologicznej za pomocą współczynnika ekspansji poprzez porównanie obrazów przed i po ekspansji. Aby ułatwić obrazowanie po ekspansji, należy wybrać łatwe do zidentyfikowania obszary zainteresowania i zebrać obrazy zarówno w małym, jak i dużym powiększeniu.

3. Polimeryzacja próbek in situ

  1. Inkubować próbkę w roztworze kotwiącym.
    1. Przygotować roztwór zakotwiczający (zwykle 250 μl wystarcza do pokrycia przekroju tkanki), rozcieńczając roztwór podstawowy AcX w 1x PBS do stężenia 0,03 mg / ml dla próbek utrwalonych utrwalaczami niealdehydowymi lub 0,1 mg / ml dla próbek utrwalonych utrwalaczami aldehydowymi, które mają mniej wolnych amin dostępnych do reakcji z AcX.
    2. Umieścić szkiełko podstawowe na szalce Petriego o średnicy 100 mm i odpipetować roztwór zakotwiczający na tkance. Inkubować przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Próbki należy inkubować w roztworze żelującym.
    1. Przygotować co najmniej 100-krotny nadmiar roztworu żelującego. Na 200 μl należy połączyć kolejno: 188 μl roztworu monomeru, 4 μl 0,5% roztworu podstawowego 4HT (rozcieńczenie 1:50, stężenie końcowe: 0,01%), 4 μl 10% roztworu podstawowego TEMED (rozcieńczenie 1:50, stężenie końcowe 0,2%) i 4 μl 10% roztworu podstawowego APS (rozcieńczenie 1:50, stężenie końcowe 0,2%).
      nuta: Roztwór żelujący należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C, a roztwór APS należy dodawać na końcu, aby zapobiec przedwczesnemu zżelowaniu.
    2. Usunąć nadmiar roztworu z sekcji tkankowej i umieścić szkiełko na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Dodać świeży, zimny roztwór żelujący do próbki i inkubować mieszaninę na tkance przez 30 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić dyfuzję roztworu do tkanki.
  3. Skonstruuj komorę na szkiełku wokół próbki (Rysunek 2A) bez naruszania roztworu żelującego.
    1. Wykonać przekładki do komory żelowania, cienko wycinając kawałki szkła nakrywkowego za pomocą noża diamentowego.
      nuta: Aby ułatwić obrazowanie po rozprężeniu, przekładki powinny mieć grubość zbliżoną do próbki tkanki, aby zmniejszyć ilość czystego żelu nad tkanką. Szkło o numerze 1,5 może być używane do standardowych próbek klinicznych (5−10 μm). Kawałki szkła nakrywkowego można układać w stosy w celu uzyskania grubszych próbek.
    2. Zabezpiecz przekładki po obu stronach chusteczki za pomocą kropelek wody (~10 μL).
    3. Ostrożnie umieść szklaną pokrywę na szkiełku, upewniając się, że pęcherzyki powietrza nie zatrzymują się na tkance (Rysunek 2B).
  4. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku (takim jak zamknięta szalka Petriego z wilgotną chusteczką) przez 2 godziny
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Komora szkiełkowa może być przechowywana w szczelnie zamkniętej szalce Petriego w temperaturze 4 °C.

4. Trawienie próbki

  1. Zdejmij pokrywę komory żelowania, delikatnie wsuwając żyletkę pod szkiełko nakrywkowe i powoli podnosząc szkiełko nakrywkowe z powierzchni żelu. Przytnij czysty żel wokół tkanki, aby zminimalizować objętość. Wytnij żel asymetrycznie, aby śledzić orientację żelu po homogenizacji, ponieważ próbka stanie się przezroczysta.
    1. Przed użyciem rozcieńczyć ProK w stosunku 1:200 w buforze wytrawiającym (końcowe stężenie 4 U/ml). Przygotuj wystarczającą ilość roztworu, aby całkowicie zanurzyć żel; pojedynczy dołek z czterodołkowej płytki do hodowli komórkowej z tworzywa sztucznego wymaga co najmniej 3 ml na studzienkę.
    2. Inkubować próbkę w zamkniętym pojemniku zawierającym bufor do wytrawiania przez 3 godziny w temperaturze 60 °C. Jeśli próbka nie odczepia się od szkiełka podczas trawienia, użyj żyletki, aby delikatnie usunąć próbkę.
      nuta: Próbkę należy całkowicie zanurzyć w buforze do wytrawiania, aby zapobiec wysychaniu próbki i umieścić w zakrytym pojemniku (małe pudełko na szkiełka, plastikowa studzienka, szalka Petriego itp.), który można uszczelnić folią.

5. Rozszerzanie próbki i obrazowanie

  1. Użyj miękkiego pędzla, aby przenieść próbkę do 1x PBS w pojemniku zgodnym z żądanym systemem obrazowania i wystarczająco dużym, aby pomieścić w pełni rozprężony żel. Upewnij się, że tkanka jest umieszczona próbką do dołu w przypadku obrazowania w systemie odwróconym lub do góry w przypadku obrazowania w systemie pionowym, aby zminimalizować odległość od obiektywu obrazowania do próbki. W razie potrzeby odwróć żel za pomocą miękkiego pędzla.
    nuta: Można zastosować boczne oświetlenie z diody LED, aby były one widoczne w cieczy. Standardowa płytka 6-dołkowa może pomieścić próbki, które mają wstępnie rozszerzoną średnicę mniejszą niż 0,6 cm. Do obrazowania w systemie odwróconym należy użyć płytki studzienkowej ze szklanym dnem.
  2. Umyć próbki w 1 PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. W razie potrzeby ponownie zabarwić próbkę 300 nM DAPI, ponieważ proces trawienia zmywa plamę DAPI. Usunąć PBS i zaplamić 300 nM DAPI rozcieńczonym w 1x PBS przez 20 minut w temperaturze RT, a następnie 10 minuty prać 1x PBS w temperaturze RT.
    nuta: Próbki można przykryć 1x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C przed przejściem do następnego etapu.
  3. Aby rozszerzyć próbki, należy wymienić PBS i przemyć nadmiarem objętości ddH2O (co najmniej 10x końcowa objętość żelu) 3−5 razy przez 10 minut każde, w temperaturze RT.
    nuta: Po 3lub 4 myciu ekspansja próbki powinna zacząć się stabilizować. W celu przechowywania, aby zapobiec rozwojowi bakterii, ddH2O można uzupełnić 0,002%-0,01% azydkiem sodu (NaN3). W takim przypadku końcowy współczynnik rozszerzalności jest odwracalnie zmniejszany o 10%.
  4. Obrazowanie fluorescencyjne należy wykonywać za pomocą konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego, mikroskopu konfokalnego lub innego wybranego systemu obrazowania.
    nuta: Aby zapobiec dryfowaniu żeli, nadmiar płynu można usunąć ze studni. Żele można również unieruchamiać 1,5−2% niskotopliwą agarozą. Przygotuj 1,5-2% (w/v) niskotopliwą agarozę w wodzie w pojemniku 2-4 razy większą od objętości roztworu. Podgrzej roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C lub w kuchence mikrofalowej przez 10-20 s, aby rozpuścić roztwór. Odpipetować rozpuszczoną agarozę wokół brzegów żelu. Po pozostawieniu agarozy do stwardnienia w temperaturze pokojowej lub 4 °C, dodać wodę do próbki, aby zapobiec odwodnieniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jeśli protokół został pomyślnie przeprowadzony (Rysunek 1), próbki pojawią się jako płaski i przezroczysty żel po mechanicznej homogenizacji (Rysunek 3A) i mogą rozszerzyć się o współczynnik 3−4,5x w wodzie (Rysunek 3B), zapewniając efektywną rozdzielczość ~70 nm w zależności od końcowego współczynnika rozszerzalności i zastosowanego systemu obrazowania5,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokółExPath 16, wariant proExM5 , który można zastosować do najczęstszych typów próbek biopsji klinicznych stosowanych w patologii, w tym próbek barwionych FFPE, H&E i świeżo mrożonych na szkiełkach podstawowych. Konwersja formatu, pobieranie antygenu i barwienie immunologiczne próbek są zgodne z powszechnie stosowanymi protokołami, które nie są specyficzne dla ExPath. W przeciwieństwie do oryginalnego protokołu proExM9...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

YZ i OB to dwaj wynalazcy, którzy złożyli wniosek o ochronę patentową i uzyskali ją w odniesieniu do podzbioru opisanych tutaj technologii (patenty amerykańskie US20190064037A1, WO2018157074A1 i WO2018157048A1).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusz Faculty Start-up z Carnegie Mellon University (YZ) oraz NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD025926-01 dla YZ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-hydroxy-TEMPO (4HT)Sigma Aldrich176141Inhibitor
6-dołkowa szklana płytka denna (#1.5 szkło nakrywkowe)CellvisP06-1.5H-N
AcetonFischer ScientifcA18-500
AkrylamidSigma AldrichA8887
Acryloyl-X, SE (AcX)InvitrogenA20770
AgarozaFischer ScientifcBP160-100
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma AldrichA3678Inicjator
anty-ACTN4 wytwarzane u królikaSigma AldrichHPA001873
Przeciwciało antykolagenowe IV wytwarzane u myszySanta Cruz Biotechsc-59814
Przeciwciało anty-wimentynowe wytwarzane w kurczakuAbcamab24525
Długopis hydrofobowy Aqua Hold IIUrządzenie naukowe980402
Matryca tkanek powszechnej choroby piersiAbcamab178113
DAPI (1 mg / ml)Thermo Scientific62248Plama jądrowa
Nóż diamentowy nr 88 CMNarzędzia ogólne31116
EtanolPharmco111000200
Kwas etylenodiaminotetraoctowy
(EDTA) 0,5 M		VWRBDH7830-1
FFPE Próbka nerkiUSBiomaxHuFPT072
Kleszcze
kozie anty-kurze IgY (H + L), wysoce adsorbowane krzyżowo CF488ABiotium20020
Kozie przeciwciała anty-kurze IgY (H+L), wysoce zaadsorbowane krzyżowo CF633Biotium20121
Kozia anty-królicza IgG (H+L) Wysoce zaadsorbowana krzyżowo Alexa Fluor 546InvitrogenA11010
MAXbind Staining MediumActive Motif15253Można zastąpić niekomercyjnym buforem do wybrania przez staling.
MAXblock Blocking MediumActive Motif15252Może być zastąpiony niekomercyjnym buforem blokującym do wyboru.
MAXwash Washing MediumActive Motif15254Można zastąpić niekomercyjnym buforem myjącym do wyboru.
Szkło z mikro osłoną #1 (24 mm x 60 mm)VWR48393 106
Szkło z mikro pokrywą #1.5 (24 mm x 60 mm)VWR48393 251
N,N,N′,N′-
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)		Sigma AldrichT9281Akcelerator
N,N′-MetylenobisakryloamidSigma AldrichM7279
Normalna surowicakoziaJackson Immunoresearch005-000-121Do przygotowania buforu blokującego. Zależny od gospodarza zwierzęcego przeciwciał drugorzędowych.
Nunclon 4-dołkowe x 5 mL MultiDish Cell Culture DishThermo Fisher167063Wielodołkowe plastikowe naczynie do hodowli
Nunclon 6-dołkowe naczynie do hodowli komórkowychThermo Fisher140675
Nunc 15 mL  StożkowyThermo Fisher339651
Nunc 50 ml  StożkowyThermo Fisher339653
Wytrząsarka
Pędzel
pH-metr
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10x roztwórFischer ScientifcBP399-1
Plastikowa szalka Petriego (100 mm)Fischer ScientifcFB0875713
Proteinaza K ( Klasa biologii molekularnej)Thermo ScientificEO0491
ŻyletkaFischer Scientifc12640
Probówki do mikrowirówek Safelock 1,5 mlThermo Fisher3457
Probówki do mikrowirówek Safelock 2,0 mlThermo Fisher3459
Akrylan soduSigma Aldrich408220
Chlorek soduSigma AldrichS6191
Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodnySigma AldrichC8532-1KG
Tris BaseFischer ScientifcBP152-1
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Aglutynina z kiełków pszenicy znakowana CF640RBiotium29026
KsylenySigma Aldrich214736
przeciwciała orbitalnamalarski

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
  3. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).
  9. Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
  10. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  11. Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165(2016).
  12. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  13. Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  14. Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
  15. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  16. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Patologia ekspansyjnaekspansja tkankowaobrazowanie w skali nanoinfuzja hydro elutrawienie proteinaz Kobrazowanie fluorescencyjnekonfokalny mikroskop z dyskiem wiruj cymprzekroje tkanek FFPEods anianie antygen wkomora eluj ca

Powiązane artykuły