Wykorzystanie danych z obrazowania metodą rezonansu magnetycznego i biopsji do kierowania procedurami pobierania próbek do biobankowania raka prostaty

Podsumowanie

Ta metoda polega na wykorzystaniu klinicznych danych diagnostycznych dla pacjentów z rakiem prostaty w celu kierowania procedurami pobierania próbek podczas biobankowania tkanek po radykalnej prostatektomii. Pozwala to przezwyciężyć problemy z wcześniej opublikowanymi metodami dotyczącymi wydajności i dostępności świeżej tkanki dla szerszego zakresu dalszych zastosowań.

Streszczenie

Poprzednie metody biobankowania tkanki prostaty, po radykalnej prostatektomii, zazwyczaj polegały na losowym pobieraniu próbek. Aby zwiększyć wydajność i umożliwić szerszy zakres dalszych zastosowań, opracowano bardziej ukierunkowaną metodę pobierania próbek z tkanki gruczołu krokowego. W tym przypadku wykorzystujemy zarówno dane z rezonansu magnetycznego (MRI), jak i biopsji, aby ukierunkować określone obszary narządu do pobrania próbek. Metoda polega na użyciu wcześniej opublikowanego urządzenia do krojenia prostaty, które usuwa 5 mm poprzeczny plasterek z wcześniej określonego obszaru prostaty, a następnie usuwa biopsje stemplowane 6 mm z wcześniej określonych obszarów tego wycinka. Próbki te mogą być przechowywane w stanie zamrożonym lub utrwalonym do celów biobankowania lub natychmiast wykorzystane świeże z 70% pewnością zawartości guza, w porównaniu z 10% pewnością w przypadku losowego pobierania próbek. Umożliwia to wykorzystanie wszystkich standardowych technik niższego szczebla, takich jak genomika, proteomika lub prace histologiczne, ale także prac wymagających świeżej tkanki, takich jak obrazowanie żywych tkanek lub hodowla ex vivo.

Wprowadzenie

Dostęp do wysokiej jakości ludzkiej tkanki raka prostaty jest kluczowym wymogiem dla prowadzenia efektywnych badań w tej dziedzinie. Istnieje wiele metod pobierania próbek tkanki prostaty po radykalnej prostatektomii do badań. Zazwyczaj obejmują one użycie biopsji stempla w celu pobrania losowych próbek ze świeżego, zamrożonego lub utrwalonego wycinka tkanki prostaty i retrospektywnego potwierdzenia, czy guz jest obecny w każdej próbce za pomocą hematoksyliny i eozyny (H&E), zgodnie z oceną uropatologa^1,2,3,4,5. Niedawny przegląd zebrał przegląd tych istniejących metod⁶. Metody te są przydatne w niektórych dalszych zastosowaniach, w których tkanka może być przechowywana i oceniana pod kątem zawartości guza w późniejszym terminie, takich jak analizy genomowe na dużą skalę, takie jak Międzynarodowe Konsorcjum Genomu Raka (ICGC) i Atlas Genomu Raka (TCGA)^4,7. Jednak metody te można by ulepszyć, gdybyśmy wykorzystali obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i/lub dane z biopsji do celowania w określone obszary prostaty do pobierania próbek. Pozwoliłoby to na ulepszenie metodyki na dwa sposoby; Po pierwsze, zmniejszając liczbę pobieranych próbek tkanek, zwiększając wydajność i zmniejszając presję na oddziały patomorfologii oraz koszty przechowywania, a po drugie, umożliwiając natychmiastowe wykorzystanie świeżej tkanki bez konieczności natychmiastowego potwierdzania zawartości guza, do nowych, najnowocześniejszych technologii niższego szczebla, takich jak obrazowanie żywych tkanek, generowanie organoidów lub hodowla ex vivo. Ta potrzeba badawcza doprowadziła do opracowania metody PEOPLE (PatiEnt prOstate samPLes for rEsearch), a wyniki z pierwszych 84 przypadków biobankowanych za pomocą PEOPLE zostały niedawno opublikowane⁸. Opublikowano również odmianę tej metody z trójwymiarowym (3D) wydrukowanym aparatem do krojenia i formą specyficzną dla pacjenta, w celu ułatwienia rezonansu magnetycznego ex vivo na tkance przed i po utrwaleniu^9,10.

Protokół

Protokół jest zgodny z lokalnymi wytycznymi i został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Biobanku UCL/UCLC (Nr ref. 15/YH/0311).

UWAGA: Ponieważ ta metoda polega na pobieraniu próbek z tkanek ludzkich, wszystkie lokalne procedury dotyczące etyki i zgody muszą być przestrzegane przed rozpoczęciem protokołu. Przypadki radykalnej prostatektomii mogą być uwzględnione, jeśli zarówno dane z rezonansu magnetycznego, jak i biopsji są dostępne przed operacją, przy średnicy guza ≥5 mm. Należy wykluczyć przypadki, w których zmiana wskaźnikowa nie jest dobrze zdefiniowana, tj. w MRI widoczne są tylko zmiany rozlane.

1. Aparat do krojenia prostaty

1. Kup aparat do krojenia prostaty (tabela materiałów). Alternatywnie, wydrukuj uchwyt ostrza za pomocą drukarki 3D, jak wcześniej opublikowano¹⁰.
   nuta: Użyte tutaj urządzenie i jednorazowe ostrza zostały zakupione w ramach umowy o przekazaniu materiałów od Instytutu Badań nad Rakiem w Londynie w Wielkiej Brytanii.

2. Celowanie w guz

1. Przejrzyj uwagi kliniczne, aby zidentyfikować zmianę wskaźnikową wskazaną przez biopsję diagnostyczną, np. lewy tylny.
2. Przejrzyj obrazy MRI, aby zmierzyć lokalizację powyższego guza.
   1. Znajdź sekwencję, w której guz jest najbardziej widoczny w płaszczyźnie osiowej, np. T2-ważony.
   2. Przewiń obrazy osiowe, aby znaleźć obraz, na którym guz jest największy i wydrukuj obraz w celach informacyjnych.
   3. Na odpowiednim obrazie koronalnym zmierz odległość od podstawy prostaty do wybranej pozycji osiowej oraz całą długość prostaty od wierzchołka do podstawy (mm) i wydrukuj w celach informacyjnych.

3. Kolekcja pProstate

1. Sprawdź notatki pacjenta, aby upewnić się, że uzyskano odpowiednią świadomą zgodę na tę procedurę i wszelkie dalsze wnioski badawcze.
2. Po radykalnej prostatektomii zbierz prostatę do suchego garnka. Upewnij się, że do prostaty nie została dodana formalina ani inny utrwalacz.
3. Przenieść do odpowiedniego sterylnego miejsca w celu pobrania próbek, np. okapu z przepływem laminarnym w laboratorium patomorfologicznym.
4. Należy jak najszybciej przystąpić do pobierania próbek, jeżeli wymagana jest świeża tkanka.
   nuta: W przypadku niektórych zastosowań (np. ocena DNA, które nie powinno ulegać degradacji tak szybko jak RNA), właściwe może być schłodzenie próbki do lodówki i pobranie próbek następnego dnia.

4. Przygotowanie próbki

1. Przygotuj okap z przepływem laminarnym i aparat do krojenia prostaty zgodnie z lokalnymi procedurami odkażania, stosując technikę sterylną. Tutaj spryskaj 70% etanolem i przetrzyj wszystkie powierzchnie. Używaj sterylnych igieł jednorazowego użytku i skalpeli. Użyj ostrzy krajalnicy do trzech razy; Po każdym użyciu umyć w gorącej wodzie z mydłem, a następnie spryskać i przetrzeć 70% etanolem.
2. Zważ prostatę (g) za pomocą standardowej wagi.
3. Tusz na prostacie. Pomaluj lewą stronę niebieskim tuszem, a prawą czarną farbą. Pokryj całą kapsułkę i pęcherzyki nasienne tuszem, aby później oznaczyć marginesy chirurgiczne.
   nuta: Procedury pisania odręcznego mogą się różnić lokalnie i mogą być odpowiednio modyfikowane.

5. Krojenie prostaty

1. Zmontuj urządzenie do krojenia, wkładając ścianki prostopadle do podstawy stojaka (Rysunek 1A).
2. Umieść prostatę tak, aby podstawa i wierzchołek były skierowane w stronę przeciwległych ścian, tylną stroną do dołu i przednią do góry. Umieść złote szpilki wokół prostaty. W razie potrzeby lekko wepchnij prostatę do środka, aby uzyskać dokładne dopasowanie, które będzie wspierać prostatę podczas krojenia.
3. Zmierz długość prostaty od podstawy do wierzchołka za pomocą linijki i porównaj z długością prostaty mierzoną za pomocą rezonansu magnetycznego. Jeśli prostata się skurczyła, zastosuj doraźną korektę do przewidywanej odległości od podstawy do docelowego przekroju poprzecznego. Na przykład, jeśli pełna długość prostaty na obrazie MRI wynosi 50 mm, ale po zmierzeniu linijką w tym momencie skurczyła się do 45 mm, zmniejsz przewidywaną pozycję krojenia o 10%.
4. Zmierz od podstawy do żądanego przekroju poprzecznego. Wybierz szpilkę, która znajduje się najbliżej tego pomiaru, aby ją przeciąć.
5. Zakładając rękawice z kolczugi, aby zapobiec obrażeniom, przytrzymaj urządzenie do krojenia (Rysunek 1B), umieść ostrza po obu stronach zidentyfikowanej szpilki i użyj przekładki, aby utrzymać ostrza w odległości 5 mm od siebie. Weź plasterek, powoli i stanowczo przesuwając ostrza w dół, do przodu i do tyłu długimi pociągnięciami (Rysunek 1C). Upewnij się, że cały plasterek został oddzielony przed demontażem aparatu.
6. Usuń ścianki i szpilki i ostrożnie wyjmij plasterek na sterylny arkusz tablicy korkowej za pomocą rękawiczek.

6. Pobieranie próbek tkanek

1. Sprawdź wzrokowo wycinek poprzeczny i porównaj go z osiowym obrazem MRI. W niektórych przypadkach obszar guza może wydawać się jaśniejszy niż otaczająca tkanka.
2. Delikatnie obmacuj poprzeczny plasterek. W niektórych przypadkach guz może wydawać się twardszy niż otaczająca go tkanka.
3. Korzystając z osiowego obrazu MRI jako przewodnika, wybierz jeden lub więcej obszarów do próbkowania.
4. Weź stemple biopsyjne pożądanego obszaru tkanki.
   1. Za pomocą dziurkacza o średnicy 6 mm dociśnij żądany obszar tkanki.
   2. Przekręć stempel do tkanek w miejscu i w dół do korka, aby zapewnić pełną separację i w razie potrzeby użyj ostrego skalpela, aby oddzielić.
   3. Wyjmij stempel i w razie potrzeby umieść go w probówkach/foremkach, wysuwając go za pomocą tłoka.
   4. Powtórz dla dalszych próbek guza i łagodnych w razie potrzeby, z oddzielnymi sterylnymi stemplami biopsyjnymi. Otwory, w których zostały wykonane stemple, namaluj na czerwono.
   5. Zwróć uwagę na lokalizację każdego stempla wraz z wagą prostaty i wszelkimi obserwacjami dotyczącymi koloru/jędrności tkanki.

7. Zgłoszenie prostaty do diagnostyki miejscowej

1. Przed utrwaleniem przypnij prostatę do korka sterylnymi igłami jednorazowego użytku, aby zapobiec kurczeniu się i wypaczaniu tkanek, co mogłoby zmienić wygląd marginesów chirurgicznych.
2. Po przypinaniu do korka należy przesłać prostatę do oddziału histopatologii w celu standardowej diagnostyki klinicznej.

8. Dekontaminacja aparatury

1. Wyrzuć cały sprzęt jednorazowego użytku do strumieni odpadów biomedycznych i/lub pojemników na ostre przedmioty zgodnie z lokalnymi wyznaczeniami.
2. Odkazić okap z przepływem laminarnym i aparat do krojenia prostaty zgodnie z lokalnymi ocenami ryzyka właściwymi dla tkanek ludzkich (np. poprzez spryskanie 70% EtOH i wytarcie).

Wyniki

Świeża tkanka prostaty pobrana metodą PEOPLE może być wykorzystana do różnych technik, w tym sekwencjonowania genomu i hodowli ex vivo. Pierwsze 59 przypadków pobranych przy użyciu tej metody zostało wcześniej opublikowanych w porównaniu z wcześniejszą wersją metody, wraz z początkowymi danymi podrzędnymi⁸. Czas od pierwszego pokrojenia prostaty do zamrożenia/utrwalenia biopsji stempla wynosił tutaj około 1 minuty, który został ograniczony do minimum, aby uniknąć degradacji RNA. Czas od usunięcia prostaty do pokrojenia prostaty powinien być również ograniczony do minimum, chociaż w tym przypadku zajęło to około 20 minut, ponieważ nasze laboratoria teatralne i patomorfologiczne znajdują się w różnych miejscach.

W zależności od dalszego zastosowania, zazwyczaj pobierane są co najmniej dwie próbki: jedna z obszaru przewidywanej tkanki nowotworowej i jedna z obszaru przewidywanej tkanki łagodnej. Kluczową miarą sukcesu samej metody pobierania próbek jest ocena zawartości guza w danej próbce.

Aby wziąć udział w projekcie 100 000 genomów, wycinek tkanki wybarwionej H&E musi zostać oceniony przez uropatologa, a próbka musi zawierać co najmniej 40% komórek nowotworowych. Próbki, które zawierają mniej niż 40% guza, mogą nadal zostać włączone do projektu, jeśli zostaną pomyślnie poddane makrodyssekcji. Z pierwszych 92 przypadków pobranych w ten sposób, 64% zawierało co najmniej 40% guza i zostało zgłoszonych do Projektu 100 000 Genomów bez makrodyssekcji. DNA zostało wyekstrahowane i we wszystkich przypadkach miało wystarczającą wydajność i jakość (Tabela 1). Początkowy podzbiór 59 tych próbek został wcześniej opublikowany w porównaniu z wcześniejszą metodą⁸.

Dla hodowli ex vivo, dopasowany guz i łagodna tkanka muszą być wystarczająco dobrej jakości, aby wytrzymać 72 godziny hodowli bez znaczącej degradacji. Udało się wyhodować wiele próbek tkanek od łącznie trzech pacjentów⁸.

Rycina 1: Aparat do krojenia prostaty. Aparatura ta została pozyskana na podstawie umowy o transferze materiałów z Instytutu Badań nad Rakiem. (A) Ściany są wkładane prostopadle do podstawy, a złote kołki są wkładane w podstawę otaczającą prostatę (prostata nie jest pokazana na zdjęciu). (B) Wymienne równoległe ostrza są włożone do uchwytu ostrza. (C) Ostrza przechodzą między złotymi szpilkami w celu przecięcia 5-milimetrowego odcinka prostaty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

	n (%)
Trafienie (>40% guza)	59 (64 proc.)
Częściowe trafienie (5-30% guza)	6 (7%)
Panna (0% guza)	27 (29 proc.)
łączny	92 (100%)

Tabela 1: Wskaźnik trafień w nowotwory. Wskaźnik trafień guza został określony przez konsultanta patologa specjalizującego się w raku prostaty, po przeglądzie tkanki barwionej H&E. Zawartość komórek nowotworowych na poziomie >40% została uznana za odpowiednią do włączenia do Projektu 100 000 Genomów, zgodnie z wytycznymi Genomics England.

Dyskusja

Kluczowe kroki w ramach tego protokołu obejmują identyfikację regionu guza do pobrania próbki, pomiar prostaty i pobranie próbek tkanek. Po pierwsze, kluczowe znaczenie ma pomiar rezonansu magnetycznego w celu zidentyfikowania właściwego obszaru pobierania próbek. Demonstrujemy tę metodę w załączonym filmie; Zalecamy jednak również potwierdzenie pomiarów u radiologa w pierwszej kolejności. Idealne są wyraźne notatki kliniczne, które kierują badacza w stronę obszaru obrazów MRI, który zawiera zmianę wskaźnikową. Po drugie, pomiar prostaty należy przeprowadzać ostrożnie, upewniając się, że linijka jest trzymana pod kątem, aby zmierzyć całą długość od podstawy do wierzchołka, równolegle do przedniej części prostaty. Po trzecie, obszary guza powinny zostać potwierdzone przed pobraniem próbki poprzez wizualne sprawdzenie wycinka tkanki w stosunku do oryginalnego obrazu MRI, badanie palpacyjne tkanki (w niektórych przypadkach obszar guza może wydawać się bardziej gęsty) i wizualną ocenę koloru tkanki (w niektórych przypadkach guz będzie wyglądał na bardziej blady niż otaczająca go łagodna tkanka).

Protokół ten został w pełni przeprowadzony na UCL/UCLH przez nieklinicznych badaczy z tytułem doktora, stypendystę patomorfologii, konsultantów patologii i techników badawczych. Z naszego doświadczenia wynika, że wszystkich kroków protokołu można nauczyć się w mniej niż dziesięciu przypadkach, niezależnie od zaplecza technicznego. Zalecamy jednak przeszkolenie przez radiologa w zakresie pomiaru MRI i szkolenie od patologa w zakresie krojenia w pierwszej kolejności. Protokół można modyfikować za pomocą wydrukowanego w 3D uchwytu do krojenia, jak wcześniej opublikowano¹⁰.

Do potencjalnych ograniczeń tej techniki należy ryzyko utrudnienia diagnozy. Cięcie prostaty jest kluczowym krokiem, który może utrudnić ocenę lub dodatnie stawki marży, jeśli zostanie wykonany nieprawidłowo. Istnieją tutaj dwa potencjalne problemy. Po pierwsze, jeśli cała zmiana wskaźnikowa zostanie natychmiast usunięta i wykorzystana do eksperymentów z nowymi tkankami, rutynowa diagnostyka kliniczna nie zostanie przeprowadzona dla tej zmiany, a pacjent może zostać błędnie zdiagnozowany jako rak o niższym stopniu złośliwości. Aby tego uniknąć, badacz powinien omówić plan pobierania próbek z konsultantem patologiem, który rutynowo dokona przeglądu przypadku przed pobraniem próbek i uzgodni liczbę i lokalizację próbek, które należy pobrać. Z tego powodu małe guzy można wykluczyć miejscowo. Po drugie, jeśli torebka prostaty nie zostanie prawidłowo przypięta do płyty korkowej przed mocowaniem, może to pozwolić na wybrzuszenie tkanki wewnętrznej na zewnątrz podczas mocowania, zmieniając marginesy chirurgiczne. Może to prowadzić do fałszywie dodatniego marginesu, w którym pozostały guz wydaje się znajdować w torebce wyłącznie z powodu wypaczenia tkanki.

Znaczenie tej techniki w stosunku do istniejących metod polega głównie na celowaniu w nowotwór. Do tej pory opublikowano szereg metod pobierania próbek z radykalnej prostatektomii; Jednak wszystkie one opierają się na całkowicie lub częściowo losowym podejściu do doboru próby 1,2,3,4,5,6,7. Zastosowanie biopsji, a w szczególności danych MRI, poprawiło wydajność, pozwalając na zmniejszenie liczby próbek przy zwiększonej pewności uzyskania tkanki nowotworowej⁸.

Przyszłe zastosowania tej metody pozwalają na przyjęcie szerszego zakresu dalszych technik niż w przypadku poprzednich metod pobierania próbek. Na przykład dostępność świeżej tkanki, która z dużym prawdopodobieństwem jest nowotworem, oznacza, że można zastosować droższe i/lub bardziej pracochłonne techniki świeżych tkanek, ponieważ wiele próbek nie jest wymaganych do zapewnienia obecności guza. Może to obejmować między innymi hodowlę ex vivo, rezonans magnetyczny ex vivo, zaawansowane obrazowanie i transkryptomikę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dziurkacz do biopsji 6 mm	Fisher Scientific	13404607	Jednorazowe stemple do biopsji do usuwania próbek tkanek 6 mm
atrament	Leica Biosystems	3801753	Znakowanie tkanek i barwnik marginesowy
Niebieski atrament	Leica Biosystems	3801751	Znakowanie tkanek i barwnik marginesowy
Rękawica kolczasta	Arco	1456803	Rękawice kolczaste chroniące dłoń podczas krojenia
Tablica korkowa	Fisher Scientific	12396447	Tablica korkowa do przypinania prostaty do następującej procedury pobierania próbek
Igły	SLS (materiały do laboratoriów naukowych)	SYR6112	Sterylne igły do przypinania tkanek do tablicy korkowej po pobraniu próbek
Aparat do krojenia prostaty	Instytut Badań nad Rakiem, Londyn	NA - musi być uzyskany w ramach MTA	Zestaw zawierający uchwyt krajalnicy, ostrza, przekładkę, podstawę, ścianki i kołki