Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Witryfikacja kropel masowych w celu pierwotnego zachowania hepatocytów

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60250

⸱

25 października 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, 2Shriners Hospitals for Children, Boston, 3Department of Surgery, University of Amsterdam

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje metodę kriokonserwacji bez lodu dla dużych ilości hepatocytów szczurów, dzięki której komórki pierwotne są wstępnie inkubowane środkami krioprotrotacyjnymi o niskim stężeniu i zeszklone w dużych kropelkach.

Streszczenie

Witryfikacja jest obiecującą alternatywą dla klasycznej kriokonserwacji próbek biologicznych metodą powolnego zamrażania (około 1 °C/min). Witryfikacja wymaga niezwykle szybkiego tempa chłodzenia, aby osiągnąć przejście wody w fazę szklistą, unikając jednocześnie szkodliwego tworzenia się lodu. Chociaż wstępna inkubacja ze środkami krioprotekcyjnymi (CPA) może zmniejszyć krytyczną szybkość chłodzenia próbek biologicznych, na ogół potrzebne są wysokie stężenia, aby umożliwić kriokonserwację bez lodu przez witryfikację. W rezultacie witryfikacja jest utrudniona przez toksyczność CPA i ograniczona do małych próbek, które można szybko schłodzić. Niedawno wykazano, że te nieodłączne ograniczenia można przezwyciężyć poprzez witryfikację kropel luzem. Korzystając z tej nowatorskiej metody, komórki są najpierw wstępnie inkubowane z niskim wewnątrzkomórkowym stężeniem CPA. Wykorzystując szybkie odwodnienie osmotyczne, wewnątrzkomórkowy CPA jest skoncentrowany bezpośrednio przed witryfikacją, bez konieczności pełnego równoważenia toksycznych stężeń CPA. Odwodnienie komórkowe odbywa się w urządzeniu fluidycznym i jest zintegrowane z ciągłym wytwarzaniem dużych kropelek o wysokiej przepustowości, które są zeszklone ciekłym azotem. Ta bezlodowa metoda kriokonserwacji z minimalną toksycznością CPA jest odpowiednia dla dużych ilości komórek i powoduje zwiększoną żywotność hepatocytów i funkcję metaboliczną w porównaniu z klasyczną kriokonserwacją wolno zamrażającą. Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje metody udanej witryfikacji kropel luzem.

Wprowadzenie

Utrata żywotności komórek i funkcji metabolicznych po kriokonserwacji hepatocytów jest nadal poważnym problemem, który ogranicza zastosowania kliniczne1,2,3. Wzorcową metodą kriokonserwacji hepatocytów jest powolne zamrażanie, które polega na wstępnej inkubacji hepatocytów z CPA (dimetylosulfotlenek [DMSO], glukoza i albumina), a następnie kontrolowanej szybkości zamrażania (w temperaturze około 1 °C/min) do temperatur kriogenicznych4,5. Pomimo wielu zgłoszonych optymalizacji, toksyczność CPA wraz z szkodliwymi zaburzeniami równowagi osmotycznej podczas zamrażania i mechanicznymi naprężeniami związanymi z tworzeniem się lodu pozostają podstawowymi wadami powolnego zamrażania6,7.

Witryfikacja oferuje przewagę nad powolnym zamrażaniem, ponieważ całkowicie unika się urazów spowodowanych tworzeniem się lodu dzięki bezpośredniemu przejściu fazowemu wody w stan szklany6. Jednak, aby osiągnąć temperaturę zeszklenia czystej wody (-137 °C), woda musi być schładzana z szybkością rzędu miliona stopni Celsjusza na sekundę (tj. krytyczną szybkością chłodzenia), aby uniknąć tworzenia się lodu powyżej temperatury zeszklenia8. Dodanie CPA może obniżyć krytyczną szybkość chłodzenia i zwiększyć temperaturę zeszklenia roztworów wodnych9. Jednak nawet przy wysokich stężeniach CPA (np. 40% v/v DMSO lub wyższych) szybkie szybkości chłodzenia są mimo wszystko wymagane do pomyślnej witryfikacji8,9.

Wymagane szybkości chłodzenia i wysokie stężenia CPA powodują dwie główne wady witryfikacji. Po pierwsze, aby umożliwić szybkie chłodzenie, próbki muszą mieć niską masę termiczną. Po drugie, aby osiągnąć wysokie stężenia CPA przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzenia osmotycznego, CPA muszą być powoli wprowadzane i w pełni zrównoważone między przedziałami wewnątrz- i zewnątrzkomórkowymi6. Wydłuża to czas ekspozycji komórek na toksyczne CPA. Razem sprawia to, że witryfikacja jest uciążliwym procesem, który jest ograniczony do kilku małych próbek (mikrolitrów) na raz. Witryfikacja kropelkowa została zaproponowana jako potencjalne rozwiązanie tych ograniczeń. Wystawienie maleńkich kropelek (nanolitrów) zawierających komórki na działanie ciekłego azotu znacznie zwiększa szybkość chłodzenia, co w konsekwencji pozwala na znaczne zmniejszenie stężenia CPA10,11,12,13,14. Chociaż wiele dysz generujących kropelki o wysokiej częstotliwości może być potencjalnie używanych jednocześnie, ekstremalnie mały rozmiar kropli ogranicza przepustowość do mikrolitrów na minutę10, co wyklucza wydajną witryfikację dużych objętości komórek o znacznie większych szybkościach przetwarzania rzędu mililitrów na minutę.

Ostatnio wykazano, że te nieodłączne ograniczenia witryfikacji mogą być pokonane przez witryfikację masowymi kropelkami15. Ta nowatorska metoda wykorzystuje szybkie odwodnienie osmotyczne w celu skoncentrowania wewnątrzkomórkowego stężenia CPA wynoszącego 7,5% v/v glikolu etylenowego i DMSO bezpośrednio poprzedzającego witryfikację, eliminując potrzebę pełnej równowagi toksycznych stężeń CPA. Odwodnienie komórkowe odbywa się w urządzeniu fluidycznym poprzez krótką ekspozycję hepatocytów na wysokie zewnątrzkomórkowe stężenie CPA. Chociaż ta ekspozycja powoduje szybkie odwodnienie osmotyczne, jest zbyt krótka, aby wysokie stężenie CPA mogło dyfundować do komórek. Natychmiast po odwodnieniu komórki są ładowane kropelkami, które są bezpośrednio zeszklone w ciekłym azocie. Metoda ta eliminuje potrzebę pełnego wewnątrzkomórkowego wychwytu wysokich stężeń CPA, podczas gdy wysokie zewnątrzkomórkowe stężenie CPA umożliwia witryfikację kropelek o dużych rozmiarach, co skutkuje dużą przepustowością przy minimalnej toksyczności CPA.

Witryfikacja kropel poprawia bezpośrednią i długoterminową żywotność po konserwacji, a także morfologię i funkcję metaboliczną pierwotnych hepatocytów szczurów w porównaniu z klasyczną kriokonserwacją przez powolne zamrażanie15. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegóły metodologiczne dotyczące witryfikacji pierwotnych hepatocytów szczurów za pomocą kropelek masowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Podstawowe izolacje hepatocytów dla tego protokołu zostały przeprowadzone przez Cell Resource Core (CRC) w Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Protokół dla zwierząt (#2011N000111) został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Szpitala Ogólnego w Massachusetts.

1. Witryfikacja kropelek

  1. Przygotować roztwory do witryfikacji.
    1. Dodać 40 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 17,0 ml roztworu Uniwersytetu Wisconsin (UW), aby uzyskać roztwór witryfikacyjny 1 (V1). Sterylnie przefiltrować roztwór V1 za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: UW jest powszechnie stosowanym rozwiązaniem do konserwacji narządów. Zawiera 50 g/l skrobi hydroksyetylu, 35,83 g/l kwasu laktobionowego, 3,4 g/l jednozasadowego fosforanu potasu, 1,23 g/l siedmiowodnego siarczanu magnezu, 17,83 g/l pentahydratu rafinozy, 1,34 g/l adenozyny, 0,136 g/l allopurynolu, 0,992 g/l całkowitego glutationu, 5,61 g/l wodorotlenku potasu i wodorotlenek sodu w celu dostosowania pH do 7,4.
    2. Połącz 7,0 ml UW, 6,5 ml DMSO, 6,5 ml glikolu etylenowego (EG), 40 mg BSA i 5,48 g sacharozy, aby uzyskać roztwór witryfikacyjny 2 (V2). Sterylny przefiltrować roztwór V2 za pomocą filtra 0,22 μm. Załadować 3,5 ml sterylnego, przefiltrowanego roztworu V2 do strzykawki o pojemności 3 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Aby ułatwić rozpuszczanie CPA, roztwory przygotowuje się w większych ilościach niż jest to wymagane.
  2. Przygotować aparat do witryfikacji kropel luzem.
    1. Aby przygotować igłę do mieszania, najpierw przeciąć wzdłuż jednej strony zewnętrznej szarej tulei igły mieszającej, a następnie zegnij rękaw, aby wyjąć go z igły mieszającej.
    2. Nasuń dwie 25-milimetrowe odcinki silikonowej rurki na wloty igły mieszającej i zabezpiecz ich położenie klejem (Rysunek 1A).
    3. Przyciąć igłę na długość 20 mm (tj. długość wewnętrznej spirali mieszającej), jak pokazano w Rysunek 1A.
      UWAGA: Długość igły mieszającej jest proporcjonalna do objętości wewnątrz igły i dlatego można ją zmienić, aby kontrolować czas ekspozycji hepatocytów na roztwór o wysokim stężeniu CPA.
    4. Włożyć wylot odcinający igły mieszającej do igły iniekcyjnej 20 G (Rysunek 1B).
      UWAGA: Rozmiar igły do wstrzykiwań ma wpływ na wielkość kropli.
    5. Wysterylizuj zespół igły mieszającej przez autoklawowanie.
    6. Napełnij sterylny Dewara ciekłym azotem. Wysterylizuj zewnętrzną część Dewara izopropanolem przed umieszczeniem Dewara w sterylnym kapturze do hodowli komórek z przepływem laminarnym.
      UWAGA: Zanieczyszczenie jest ważnym czynnikiem podczas bezpośredniego wystawienia kropelek na działanie ciekłego azotu. Chociaż w obecnym protokole nie stwierdzono zanieczyszczenia przy użyciu niesterylizowanego ciekłego azotu, ciekły azot może być filtrowany lub napromieniowywany w celu zapewnienia sterylności w razie potrzeby16.
    7. Włóż lejek o tej samej średnicy zewnętrznej co wewnętrzna średnica ciekłego azotu Dewara do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby stworzyć urządzenie do zbierania kropel (Rysunek 1C−E).
    8. Zanurz urządzenie do zbierania kropelek w ciekłym azocie, powoli dociskając je w końcowej pozycji pionowej za pomocą dużych kleszczyków. Upewnij się, że stożkowa rura spoczywa w pozycji pionowej na dole Dewara (Rysunek 1D−E).
      UWAGA: Lejek powinien pozostać włożony i spoczywać na stożkowej rurce. Poziom ciekłego azotu powinien znajdować się 1 cm poniżej wysokości wlotu lejka, jak pokazano na Rysunek 1D.
    9. Zamontuj pompę strzykawkową w pozycji pionowej na ścianie okapu do hodowli komórkowych, przywiązując sznurek od nóżek pompy strzykawkowej do wystających ze ścianki okapu do hodowli komórkowych.
    10. Umieść ciekły azot Dewara z urządzeniem do zbierania kropel pod pionowo zamontowaną pompą strzykawkową (Rysunek 1E).
  3. Wstępna inkubacja z CPA.
    1. Po uzyskaniu świeżo wyizolowanych hepatocytów szczura, policz stężenie zapasu przez wykluczenie błękitu trypanowego i weź 40 milionów żywotnych hepatocytów.
      UWAGA: Delikatne obchodzenie się z hepatocytami w zawiesinie ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania śmierci komórek.
    2. Wirować przy 50 x g przez 5 minut bez hamulca.
    3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić hepatocyty w 3,4 ml roztworu V1.
    4. Inkubować na lodzie przez 3 minuty.
    5. Dodać 150 μl DMSO i 150 μl EG do hepatocytów i delikatnie wymieszać.
    6. Inkubować na lodzie przez 3 minuty.
    7. Ponownie dodaj 150 μl DMSO i 150 μl EG do hepatocytów i delikatnie wymieszaj.
    8. Załadować 3,5 ml do strzykawki o pojemności 3 ml.
  4. Wykonaj witryfikację.
    1. Wprowadzić strzykawkę ze wstępnie inkubowanymi hepatocytami i strzykawkami z roztworem V2 do adaptera pompy strzykawkowej.
    2. Przymocuj dwa żeńskie adaptery zadziorów węża Luer lock do strzykawek i nasuń silikonową rurkę zespołu igły mieszającej na złączki z zadziorami (Rysunek 1F).
    3. Umieść cały zespół w pompie strzykawkowej (Rysunek 1E).
    4. Trzy minuty po ostatnim dodaniu DMSO i EG do hepatocytów uruchomić pompę przy 2 ml/min.
    5. Zatrzymaj pompę po dodaniu wszystkich hepatocytów do ciekłego azotu.

2. Przechowywanie kriogeniczne

  1. Nakłuć 10 małych otworów w wieczku stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą igły 20 G i owinąć zewnętrzną część pokrywki elastyczną folią, jak pokazano na Rysunek 1B. W ten sposób powstaje zawór, który umożliwia ucieczkę odparowujących resztek ciekłego azotu.
  2. Aby zebrać zeszklone kropelki hepatocytów, najpierw usuń lejek z ciekłego azotu Dewara. Następnie za pomocą długich kleszczy wyjmij stożkową rurkę zawierającą kropelki z ciekłego azotu i powoli wylej nadmiar ciekłego azotu ze stożkowej rurki.
  3. Zamknij stożkową rurkę z przebitą pokrywką i bezpośrednio umieść zamkniętą stożkową rurkę ze zeszklonymi kropelkami hepatocytów z powrotem w ciekłym azocie Dewara.
  4. Przenieś stożkową rurkę z ciekłego azotu do kriozbiornika parowego ciekłego azotu.

3. Podgrzewanie zeszklonych kropelek hepatocytów

  1. Przygotuj roztwór do podgrzewania.
    1. Rozpuścić 17,13 g sacharozy w 100 ml pożywki do hodowli hepatocytów DMEM, aby uzyskać roztwór do podgrzewania. Sterylnie przefiltrować roztwór do podgrzewania za pomocą filtra 0,22 μm i ogrzać do 37 °C.
  2. Rozgrzej hepatocyty.
    1. Weź stożkową probówkę z zeszklonymi hepatocytami z kriozbiornika i przetransportuj ją w ciekłym azocie Dewara do kaptura do hodowli komórkowych.
    2. Lekko poluzuj nakrętkę i włóż stożkową rurkę z powrotem do ciekłego azotu.
    3. Dodać zeszklone kropelki hepatocytów do pustej zlewki, natychmiast dodać ciepły (37 °C) roztwór do podgrzewania i natychmiast mieszać przez 10 s.
      UWAGA: Bardzo ważna jest szybka praca, aby uniknąć zamarznięcia podczas podgrzewania. W zależności od wymagań badania, od kilku do wszystkich zeszklonych kropelek można podgrzać jednocześnie.
  3. Rozładuj roztwór do podgrzewania.
    1. Podzielić roztwór rozgrzewający z hepatocytami na dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml.
    2. Odwirować dwie stożkowe probówki przez 2 minuty przy 100 x g w temperaturze 4 °C bez hamulca.
    3. Odessać supernatant, aby pozostawić całkowitą objętość 12,5 ml, używając znacznika podziałki stożka jako odniesienia i dodać 12,5 ml lodowatego DMEM na probówkę stożkową, aby rozcieńczyć roztwór do podgrzewania do 50%.
    4. Ponownie zawiesić hepatocyty i inkubować na lodzie przez 3 minuty.
    5. Dodaj 25 ml lodowatego DMEM na stożkową probówkę, aby rozcieńczyć roztwór do podgrzewania do 25%.
    6. Wirować przez 5 minut przy 50 x g w temperaturze 4 °C bez hamulca.
    7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić hepatocyty w 2 ml żądanej pożywki hodowlanej do użycia.
      UWAGA: W razie potrzeby można zastosować wirowanie w gradiencie gęstości do usunięcia martwych hepatocytów z zawiesiny komórkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do bezpośredniego porównania witryfikacji dużych kropli z klasyczną krio konserwacją, z wykorzystaniem czołowych protokołów powolnego zamrażania opisanych w literaturze4,5, użyto świeżo wyizolowanych pierwotnych hepatocytów z pięciu różnych wątrób szczurzych. W skrócie, hepatocyty zawieszono w roztworze UW uzupełnionym o BSA (2,2 mg/mL), glukozę (333 mM) i DMSO (10% v/v), a następnie zamrożono w zamrażarce o kontrolowanej szybkości schładzania. Po przechowywaniu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kriokonserwacja hepatocytów poprzez powolne zamrażanie powoduje zmniejszenie żywotności i funkcji metabolicznych. Witryfikacja stanowi obiecującą alternatywę dla klasycznej kriokonserwacji, ponieważ całkowicie unika się uszkodzeń spowodowanych zamarznięciem9. Jednak wstępna inkubacja z CPA jest wymagana w celu obniżenia krytycznej szybkości chłodzenia8. W związku z tym witryfikacja jest utrudniona ze względu na toksyczność CPA17 i ograniczona do mały...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują konkurencyjne interesy finansowe. Doktorzy de Vries, Weng, Toner, Tessier i Uygun mają tymczasowe wnioski patentowe związane z tym badaniem. Dr Uygun ma udziały finansowe w Organ Solutions, firmie zajmującej się rozwojem technologii konserwacji narządów. Wszystkie interesy badaczy są zarządzane przez MGH and Partners HealthCare zgodnie z ich polityką przeciwdziałania konfliktowi interesów.

Podziękowania

Finansowanie z amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia (R01DK096075, R01DK107875 i R01DK114506) oraz Departamentu Obrony USA (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) jest bardzo doceniane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD Jednorazowe strzykawki 3 ml z końcówkami Luer-LokFisher Scientific14-823-435
ZlewkaSigma-AldrichCLS1000-250
Belzer UW Roztwór do chłodniBridge to LifeBUW-001
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906
Cole-Parmer żeński Luer do 1/16" niskoprofilowej półsztywnej króćca rurki, PPCole-ParmerEW-45508-12
Kriogeniczny zbiornik do przechowywania / Wykres CryotankIndustriesMVE 800
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD8418
DMEM, proszek, wysoka zawartość glukozy, pirogronianLife Technologies12800-082
Glikol etylenowySigma-Aldrich107-21-1
Bardzo długie kleszczeFisher Scientific10-316C
Fisherbrand Szybkobieżne, łatwe do odczytania plastikowe probówki wirówkowe - płaskie zamknięcieFisher Scientific06-443-18
Żyłka wędkarskaStrenSOFS4-15
Ciekły azotAirgas7727-37-9
Rurki silikonowe utwardzane platyną Masterflex L/S, L/S 14Cole-ParmerEW-96410-14
Mieszaj końcówki, do użytku z 3HPW1Grainger3WRL7
Nalgene Lejek do proszku polipropylenowegoThermoFisher4252-0100
Igła 20 gaBecton Dickinson (BD)305175
Parafilm M - Elastyczna foliaSigma-AldrichP7793-1EA
ŻyletkaFisher Scientific12-640
SzpatułkaCole-ParmerEW-06369-18  Sterylny filtr
SteriflipFisher ScientificSE1M179M6
Sacharoza (krystaliczna/certyfikowana ACS)Fisher ScientificS5-500
Pompa strzykawkowaNew Era Pump Systems Inc.NE-1000
Termos Stołowy pojemnik na ciekły azotThermoFisher2122

Bibliografia

  1. Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
  2. Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
  3. Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
  4. Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
  5. Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
  6. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39(2007).
  7. Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
  8. Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
  9. Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
  10. Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428(2007).
  11. El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
  12. Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
  13. Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530(2011).
  14. Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
  15. de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
  16. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  17. Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

rodki krioprotekcyjneodwodnienie osmotyczneurz dzenie fluidyczneciek y azotywotno hepatocyt wfunkcja metabolicznaroztw r do ogrzewaniakriokonserwacja kom rek
Witryfikacja kropel masowych w celu pierwotnego zachowania hepatocytów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.