Tutaj przedstawiono protokół do produkcji i hodowli ryb elektrycznych z nokautem genomu CRISPR/Cas9. Szczegółowo przedstawiono wymagane wymagania z zakresu biologii molekularnej, hodowli i hodowli zarówno dla żywiciela, jak i mormyryda, a także techniki iniekcji w celu wytworzenia larw indelu F0 indukowanych przez Cas9.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Elektrorecepcja i elektrogeneza zmieniły się w ewolucyjnej historii kręgowców. Istnieje uderzający stopień konwergencji w tych niezależnie wyprowadzonych fenotypach, które mają wspólną architekturę genetyczną. Być może najlepszym tego przykładem są liczne zbieżne cechy gymnotiformes i mormyridów, dwóch bogatych gatunkowo kladów teleostowych, które wytwarzają i wykrywają słabe pola elektryczne i nazywane są rybami słabo elektrycznymi. W ciągu 50 lat od odkrycia, że słabo elektryczne ryby wykorzystują elektryczność do wyczuwania otoczenia i komunikowania się, rosnąca społeczność naukowców uzyskała ogromny wgląd w ewolucję rozwoju, systemy i obwody, neurobiologię, fizjologię komórkową, ekologię, biologię ewolucyjną i zachowanie. Ostatnio nastąpił wzrost zasobów genomowych ryb elektrycznych. Wykorzystanie tych zasobów umożliwiło już uzyskanie ważnych informacji na temat związku między genotypem a fenotypem u tych gatunków. Główną przeszkodą w integracji danych genomicznych z danymi fenotypowymi ryb o słabym natężeniu elektrycznym jest obecny brak funkcjonalnych narzędzi genomicznych. Przedstawiamy tutaj pełny protokół przeprowadzania mutagenezy CRISPR/Cas9, który wykorzystuje endogenne mechanizmy naprawy DNA u ryb o słabym natężeniu elektrycznym. Wykazaliśmy, że protokół ten jest równie skuteczny zarówno w przypadku gatunku mormyrydów Brienomyrus brachyistius, jak i gimnastyki Brachyhypopomus gauderio, wykorzystując CRISPR / Cas9 do celowania w indele i mutacje punktowe w pierwszym eksonie genu kanału sodowego scn4aa. Korzystając z tego protokołu, uzyskano zarodki obu gatunków i poddano je genotypowaniu, aby potwierdzić, że przewidywane mutacje w pierwszym eksonie kanału sodowego scn4aa były obecne. Fenotyp sukcesu nokautu został potwierdzony nagraniami wykazującymi zmniejszone amplitudy wyładowań elektrycznych narządów w porównaniu z niewstrzykniętymi kontrolami o dopasowanej wielkości.
Wprowadzenie
Elektrorecepcja i elektrogeneza zmieniły się w ewolucyjnej historii kręgowców. Dwie linie ryb teleostowych, osteoglossiformes i siluriformes, rozwijały elektrorecepcję równolegle, a pięć linii teleostów (gymnotiformes, mormyrids i rodzaje Astroscopus, Malapterurus i Synodontis) ewoluowało równolegle. Istnieje uderzający stopień zbieżności w tych niezależnie wywodzących się fenotypach, które mają wspólną architekturę genetyczną1,2,3.
To jest być może najlepszym przykładem liczne zbieżne cechy gymnotiform i mormyridów, dwóc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Michigan.
1. Wybór celów sgRNA
UWAGA: W kroku 1.1 przewidziano protokół do ręcznego projektowania sgRNA. Zostało to wykorzystane do wyboru celu scn4aa. W celu ułatwienia tego procesu (krok 1.2) udostępniono dodatkowy protokół z wykorzystaniem portalu internetowego EFISHGENOMICS. Zaleca się, aby użytkownicy wybrali protokół 1.2, który zawiera kilka automatycznych "kontroli", aby zapewnić sukces w projektowaniu sgRNA dla niestandardowych celów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Miejsca docelowe sgRNA zidentyfikowano w eksonie 1 genu scn4aa u obu gatunków, B. gauderio i B. brachyistius, zgodnie z opisem w sekcji 1. sgRNA wygenerowano zgodnie z opisem w sekcji 2. Po pomyślnym wyborze i syntezie sgRNA (Rycyna 1), przetestowano cięcie in vitro (Rycina 2). Następnie wybrano sgRNA wykazujące zdolność do cięcia in vitro do mikroiniekcji pojedynczych komórek.
Dorosłe ryby poddano kondycjon.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Bogactwo fenotypowe ryb o słabym natężeniu elektryczności, wraz z niedawnym rozpowszechnieniem zasobów genomicznych, motywuje silne zapotrzebowanie na funkcjonalne narzędzia genomiczne w modelu ryb o słabym natężeniu elektryczności. System ten jest szczególnie atrakcyjny ze względu na zbieżną ewolucję licznych cech fenotypowych w równoległych liniach ryb, które można łatwo przechowywać w laboratorium.
Opisany tutaj protokół demonstruje skuteczność techniki CRISPR/Cas9 w liniach słabo elektrycz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują bohaterskim wysiłkom Moniki Lucas, Katherine Shaw, Ryana Taylora, Jareda Thompsona, Nicole Robichaud i Hope Healey za pomoc w hodowli ryb, zbieraniu danych i wczesnym rozwoju protokołu. Chcielibyśmy również podziękować trzem recenzentom za sugestie dotyczące manuskryptu. Uważamy, że produkt końcowy jest lepszej jakości po ustosunkowaniu się do ich uwag. Praca ta została sfinansowana dzięki wsparciu Narodowej Fundacji Nauki #1644965 i #1455405 dla JRG oraz grantu DG Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (Natural Sciences and Engineering Research Council) dla VLS.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 20 mg / ml glikogen klasy RNA | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 pz drabinka DNA | NEB | N3236L | |
| Kapilara ze szkła borokrzemianowego z włóknem | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm, długość 10 cm) |
| Białko Cas9 z NLS; 1 mg / ml | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Zestaw chusteczek | higienicznych Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Mikrowtryskiwacz | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Końcówki do pipet | Fisher Scientific | ||
| Hamilton | Fisher Scientific | 14-824-654 | określana w protokole jako "precyzyjna szklana strzykawka" |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | określany jako "delikatne czyszczenie zadaniowe" w protokole |
| MEGAscript T7 Zestaw do transkrypcji | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 NEB | B7003S | używany do testu rozszczepienia in vitro | |
| Zestaw DNA OneTaq | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | określany jako "czynnik tarłowy" w protokole |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | określany jako "termoplastyczny" w protokole |
| Ściągacz do pipet | WPI | SU-P97 | marki |
| sutter Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR | Qiagen | 28106 | |
| Igła wielokrotnego użytku - wymaga dostosowania | Fisher Scientific | 7803-02 | Dostosuj do długości 0,7 cala; styl punktowy 4 i kąt 25 |
| Polimeraza DNA T4 | NEB | M0203L | Używaj z 10x buforem NEB, który jest dołączony |
| narzędzi pokrytych teflonem | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | określanych w protokole jako "politetrafluoroeten" |
Bibliografia
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
