Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Elektrorecepcja i elektrogeneza zmieniły się w ewolucyjnej historii kręgowców. Dwie linie ryb teleostowych, osteoglossiformes i siluriformes, rozwijały elektrorecepcję równolegle, a pięć linii teleostów (gymnotiformes, mormyrids i rodzaje Astroscopus, Malapterurus i Synodontis) ewoluowało równolegle. Istnieje uderzający stopień zbieżności w tych niezależnie wywodzących się fenotypach, które mają wspólną architekturę genetyczną^1,2,3.

To jest być może najlepszym przykładem liczne zbieżne cechy gymnotiform i mormyridów, dwóch bogatych gatunkowo kladów teleost, które wytwarzają i wykrywają słabe pola elektryczne i są nazywane rybami o słabym napędzie elektrycznym. W ciągu 50 lat od odkrycia, że ryby o niskiej elektryczności wykorzystują elektryczność do wyczuwania otoczenia i komunikowania się⁴, rosnąca społeczność naukowców zdobyła ogromny wgląd w ewolucję rozwoju^1,5^,6, systemy i obwody neuronauka^7,8,9,10, fizjologia komórkowa^11,12, ekologia i energetyka^{13,14,15,16,17}, behavior^18,19, oraz macroevolution^3,20,21.

Ostatnio nastąpił wzrost ilości zasobów genomicznych, transkryptomicznych i proteomicznych dla ryb elektrycznych1^{,22,23,24,25,26,27,28}. Korzystanie z tych zasobów przyniosło już ważne spostrzeżenia dotyczące związku między genotypem a fenotypem u tych gatunków^{1,2,3,28,29,30}. Główną przeszkodą w integracji danych genomicznych z danymi fenotypowymi ryb o słabym natężeniu elektrycznym jest obecny brak funkcjonalnych narzędzi genomicznych³¹.

Jednym z takich narzędzi jest niedawno opracowana technika Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats sparowana z endonukleazą Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 to narzędzie do edycji genomu, które weszło do powszechnego użycia zarówno w modelu^32,33,34 i organizmach niemodelowych^35,36,37. Technologia CRISPR/Cas9 rozwinęła się do punktu, w którym laboratorium zdolne do podstawowej biologii molekularnej może z łatwością generować specyficzne dla genów sondy zwane krótkimi przewodnikami RNA (sgRNA), przy niskich kosztach przy użyciu metody bez klonowania³⁸. CRISPR ma przewagę nad innymi strategiami nokautu/knockdown, takimi jak morpholinos^39,40, nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALENs) i nukleazy palca cynkowego (ZFN), których generowanie dla każdego docelowego genu jest kosztowne i czasochłonne.

System CRISPR/Cas9 działa w celu tworzenia nokautów genów, celując w określony region genomu, kierowany przez sekwencję sgRNA i powodując dwuniciowe pęknięcie. Pęknięcie dwuniciowe jest wykrywane przez komórkę i uruchamia endogenne mechanizmy naprawy DNA preferencyjnie przy użyciu szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ). Szlak ten jest bardzo podatny na błędy: podczas procesu naprawy cząsteczka DNA często zawiera insercje lub delecje (indele) w miejscu pęknięcia dwuniciowego. Indele te mogą powodować utratę funkcji z powodu (1) przesunięć w otwartej ramce odczytu, (2) wstawienia przedwczesnego kodonu stop lub (3) przesunięć w krytycznej strukturze pierwszorzędowej produktu genu. W tym protokole wykorzystujemy edycję CRISPR/Cas9 do celowania w mutacje punktowe w genach docelowych za pomocą NHEJ u słabo elektrycznych gatunków ryb. Chociaż ta metoda mutagenezy jest prostsza i bardziej skuteczna niż inne techniki, oczekuje się, że spowoduje to szereg nasileń fenotypowych w F₀, co przypisuje się mozaicyzmowi genetycznemu^41,42,43,44.

Wybór organizmów
W celu ułatwienia przyszłych badań nad genomiką porównawczą ryb o słabym natężeniu elektrycznym, konieczne było wybranie gatunku reprezentatywnego zarówno dla gymnotiformes, jak i mormyridów w celu opracowania protokołu. Po dyskusjach podczas spotkania Electric Fish w Montevideo w 2016 r. w Montevideo w Urugwaju, społeczność zgodziła się na wykorzystanie gatunków, które już mogły być hodowane w laboratorium i które miały dostępne zasoby genomowe. Gymnotiform Brachyhypopomus gauderio i mormyrid Brienomyrus brachyistius zostały wybrane jako gatunki spełniające te kryteria. U obu gatunków naturalne sygnały do wywoływania i utrzymywania warunków rozrodczych są łatwe do naśladowania w niewoli. B. gauderio, gatunek gymnotiform z Ameryki Południowej, ma tę zaletę, że ma niskie wymagania hodowlane: ryby mogą być trzymane w stosunkowo dużym zagęszczeniu w stosunkowo małych (4 l) zbiornikach. B. gauderio charakteryzuje się również szybką wymianą pokoleniową w warunkach niewoli. W warunkach laboratoryjnych B. gauderio może rozwinąć się z jaja do dorosłego osobnika w ciągu około 4 miesięcy.

B. brachyistius, gatunek ryb mormyrydów z Afryki Środkowo-Zachodniej, łatwo rozmnaża się w niewoli. B. brachyistius jest łatwo dostępny w handlu akwarystycznym i był szeroko stosowany w wielu badaniach, a obecnie dysponuje wieloma zasobami genomicznymi. Ich cykl życia wynosi 1-3 lata, w zależności od warunków laboratoryjnych. Wymagania hodowlane są nieco bardziej intensywne dla tego gatunku, wymagające średniej wielkości zbiorników (50−100 l) ze względu na ich agresję podczas lęgów.

Laboratoria badające inne gatunki ryb elektrycznych powinny być w stanie łatwo dostosować ten protokół, o ile gatunki mogą być hodowane, a zarodki jednokomórkowe mogą być zbierane i hodowane do dorosłości. Wskaźniki utrzymania, hodowli larw i zapłodnienia in vitro (IVF) prawdopodobnie zmienią się w przypadku innych gatunków; Jednak protokół ten może być wykorzystany jako punkt wyjścia do prób rozrodu u innych ryb o słabym natężeniu elektrycznym.

Idealny cel genetyczny do dowodu słuszności koncepcji: scn4aa<br /> Słabo elektryczne ryby mormyrydowe i gymnotiform wytwarzają pola elektryczne (elektrogenezę) poprzez rozładowanie wyspecjalizowanego narządu, zwanego narządem elektrycznym. Wyładowania elektryczne narządów (EOD) powstają w wyniku jednoczesnego wytwarzania potencjałów czynnościowych w komórkach narządów elektrycznych zwanych elektrocytami. EOD są wykrywane przez szereg elektroreceptorów w skórze w celu stworzenia wysokiej rozdzielczości obrazów elektrycznych otoczenia ryby⁴⁵. Słabo elektryczne ryby są również zdolne do wykrywania cech przebiegów EOD swoich współplemieńców¹⁸, a także ich szybkości rozładowania⁴⁶, co pozwala EOD funkcjonować dodatkowo jako sygnał komunikacji społecznej analogiczny do śpiewu ptaków lub wokalizacji żab⁴⁷.

Głównym składnikiem generowania potencjału czynnościowego w elektrocytach zarówno ryb mormyrydowych, jak i gimnastykokształtnych o słabo elektrycznym wyglądzie jest bramkowany napięciem kanał sodowy NaV1.4². Nieelektryczne teleosty wyrażają dwie paralogiczne kopie genów, scn4aa i scn4ab, kodujące bramkowany napięciem kanał sodowy NaV1.4³⁰. Zarówno w liniach ryb gymnotiform, jak i mormyridów, scn4aa ewoluował szybko i przeszedł liczne substytucje aminokwasów, które wpływają na jego właściwości kinetyczne⁴⁸. Co najważniejsze, scn4aa został podzielony w obu liniach na organy elektryczne^2,3. Stosunkowo ograniczona ekspresja scn4aa w narządzie elektrycznym, a także jego kluczowa rola w generowaniu EOD, czyni go idealnym celem dla eksperymentów z nokautem CRISPR/Cas9, ponieważ ma minimalne szkodliwe efekty plejotropowe. Ponieważ słabo elektryczne ryby zaczynają rozładowywać swoje larwalne narządy elektryczne 6-8 dni po zapłodnieniu (DPF), celowanie w scn4aa idealnie nadaje się do szybkiego fenotypowania po mikroiniekcji zarodka.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Michigan.

1. Wybór celów sgRNA

UWAGA: W kroku 1.1 przewidziano protokół do ręcznego projektowania sgRNA. Zostało to wykorzystane do wyboru celu scn4aa. W celu ułatwienia tego procesu (krok 1.2) udostępniono dodatkowy protokół z wykorzystaniem portalu internetowego EFISHGENOMICS. Zaleca się, aby użytkownicy wybrali protokół 1.2, który zawiera kilka automatycznych "kontroli", aby zapewnić sukces w projektowaniu sgRNA dla niestandardowych celów.

1. Projektowanie celów sgRNA.
   1. Do generowania oligonukleotydów przewodnika sgRNA najlepiej jest celować w ekson 1 lub inne eksony 5'. 5' UTR może być namierzony; Najlepiej jednak celować w sekwencję kodowania 5'. Preferowane jest wykorzystanie informacji genomicznych, ale możliwe jest opracowanie udanych sgRNA przy użyciu danych transkryptomowych. Preferowane są adnotacje dotyczące granic intron/ekson (dane genomowe) lub granic eksonu/eksonu.
   2. Kandydujące sekwencje genomowe z 1.1 są poszukiwane pod kątem przypuszczalnych sekwencji docelowych, które pasują do wzorca 5'-N(18)-NGG-3'. Może to być wykonywane automatycznie za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji na komputery stacjonarne, niestandardowych skryptów lub poprzez ręczną inspekcję sekwencji.
   3. Sekwencje mogą być priorytetyzowane za pomocą metody Doench et al.⁴⁹ dla aktywności na celu. Dodatkowo, sekwencje docelowe mogą być oceniane przez wyszukiwanie BLAST w genomicznych/transkryptomicznych bazach danych pod kątem wiązania poza celem.
   4. Upewnij się, że można wygenerować standardowe startery PCR, które otaczają sekwencję docelową. Startery powinny znajdować się co najmniej 20 pz z każdej strony miejsca cięcia (trzy zasady przed sekwencją NGG). Idealnie, produkt PCR powinien mieć 150-200 par zasad (bp).
   5. Zaprojektuj oligomery spełniające powyższe kryteria, korzystając z poniższego szablonu, który obejmuje promotor T7 (5' z N₁₈) i region komplementarny (3' z N₁₈) do wyżarzania do stałego oligomeru (1.1.6): 5'-TAATACGACTCACTATAGG-N _{18-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3}'
      nuta: Sekwencja N₁₈ nie obejmuje sekwencji NGG protospacer adjacent motif (PAM). Nie należy tego włączać do oligomeru.
   6. Zamów stały oligomer (Tabela 1), który zostanie użyty do syntezy wszystkich sgRNA, oligomerów dla celów sgRNA (krok 1.1.5) i starterów PCR (krok 1.1.4) jako standardowe odsolone oligomery z usługi produkcji oligonukleotydów. Oligomery i startery PCR można zamawiać jako standardowe oligomery odsolone, bez konieczności dodatkowego oczyszczania.
2. Wykonaj zautomatyzowane projektowanie celów sgRNA.
   1. Korzystając z danych genomicznych, wybierz gen docelowy. Dane transkryptomu mogą być używane zamiast tego, gdy znane są granice eksonów/intronów. Cele można zidentyfikować za pomocą portalu EFISHGENOMICS (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu). Idealny cel będzie znajdował się w eksonie 1; jednak można wziąć pod uwagę inne eksony 5' i UTR 5'
   .
   2. Po zidentyfikowaniu sekwencji docelowej załaduj bezpłatnie dostępne narzędzie internetowe EFISHGENOMICS CRISPR (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/). To narzędzie internetowe wykorzystuje dostosowaną wersję algorytmu CRISPOR do generowania celów^50,51.
   3. W polu Kroku 1 wprowadź nazwę sekwencji i wprowadź sekwencję celu w odpowiednim polu.
3. Wybierz odpowiedni genom, z którego pochodzi sekwencja. Obecnie dostępne są dane genomiczne dotyczące B. brachyistius i B. gauderio. Sekwencje genomu nie są wymagane do korzystania z tego narzędzia, ale są przydatne w ocenie potencjalnych niepożądanych skutków niedocelowych.
4. Wybierz odpowiedni PAM. Zalecany jest PAM 20 bp-NGG, chociaż istnieje kilka dodatkowych motywów PAM do wyboru, w zależności od użytego białka Cas9.
5. Zostanie wygenerowany raport z lokalizacją sekwencji docelowej w genomie wraz z sugerowanymi sekwencjami prowadzącymi. Wybierz trzy obiekty docelowe o niskich przewidywanych efektach niedocelowych, wysokich wynikach swoistości i wysokich wynikach wydajności. Najwyżej punktowane sekwencje przewodników są podświetlone na zielono po lewej stronie. Jeśli to możliwe, należy unikać żółtych i czerwonych sekwencji pomocniczych.
6. Kliknięcie na wybrane sekwencje docelowe generuje kompleksowy raport CRISPOR. Kluczowe informacje z tych raportów dotyczą "ekspresji T7 in vitro z nakładających się oligonukleotydów". Z tego raportu wyodrębnij następujące informacje: zalecane oligonukleotydy sgRNA, startery PCR dla miejsca docelowego oraz stały oligomer, który zostanie użyty do syntezy wszystkich sgRNA.
7. Zamów wybrane oligomery (krok 1.6) w firmie zajmującej się produkcją oligonukleotydów. Oligomery i startery PCR można zamawiać jako standardowe oligomery odsolone, bez konieczności dodatkowego oczyszczania.

2. Generuj sgRNA

1. Oligomery wyżarzane w probówce PCR: dodać 1 μl stałego oligomeru 100 μM, 1 μl oligomeru specyficznego dla 100 μM sgRNA i 8 μl wolnego od nukleaz_H2O
2. Oligomery wyżarzane w termocyklerze z następującym programem: podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut, schłodzić do 85 °C w temperaturze -2 °C/s, schłodzić do 25 °C w temperaturze 0,1 °C/s i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
3. Aby wygenerować matrycę sgRNA, dodaj 2,5 μl mieszanki dNTP (10 mM), 2 μl 10-krotnego buforu, 0,5 μl polimerazy DNA T4 i 5 μl wolnego od nukleaz_H2Odo wyżarzonych oligomerów z kroku 2.2. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 12 °C.
4. Oczyść matrycę za pomocą kolumny czyszczącej PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Eluować w 20–30 μl. Użyj spektrofotometru, aby oszacować stężenie i czystość. Szablon powinien wynosić 100–200 ng/μL i 1,8–1,9 A_260/280.
6. Sprawdź za pomocą żelu agarozowego, uruchamiając 1–5 μl. Dominujące pasmo powinno wynosić 120 pz. Zobacz Rysunek 1A dla reprezentatywnych wyników.
7. Przechowuj zweryfikowaną w żelu matrycę sgRNA w temperaturze -20 °C (długotrwale) lub 4 °C (krótkoterminowo, 1–4 tygodnie).
8. Transkrybuj sgRNA za pomocą zestawu do transkrypcji RNA T7, dodając do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej 8 μl mieszanki dNTP (równe objętości dA, dT, dG, dC), 2 μl 10x buforu (temperatura pokojowa), 2 μl polimerazy T7 RNA, 100−200 ng matrycy sgRNA i wolnego od nukleaz H₂O do całkowitej objętości 20 μl. Zakręć, aby zebrać na dole. Inkubować przez 2–4 godziny w temperaturze 37 °C.
9. Dodać 1 μl DNazy i inkubować dodatkowe 15 minut w temperaturze 37 °C.
   1. Oczyść sgRNA, dodając 1 μl glikogenu, 30 μl H₂O bez nukleaz, 30 μl 5 M octanu amonu i 180 μl 100% EtOH do transkrybowanego sgRNA. Dobrze wymieszać i inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze -80 °C (do zamrożenia) lub w temperaturze -20 °C przez noc. Wirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut z maksymalną prędkością.
10. Wyjąć i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i przemyć 1 ml 70% EtOH bez RNaz, schłodzonego w temperaturze -20 °C. Wirować dodatkowe 5 minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C.
11. Usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i suszyć osad na powietrzu przez 5 minut.
12. Zawiesić ponownie w 30 μl H₂O bez nukleaz i oznaczyć czystość i wydajność za pomocą spektroskopii UV (minimalna wydajność 200 ng/μl).
13. Sprawdź obecność sgRNA w żelu bez RNaz. SgRNA pojawia się między 50 a 150 pz jako dwa prążki ze względu na strukturę drugorzędową (Rysunek 1B).
14. Porcjować do 3 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Sprawdź efektywność cięcia in vitro

1. Ekstrakcja genomowego DNA od gatunku docelowego przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA. Wycinki płetw brzusznych można stosować bez konieczności poświęcania ryby, ponieważ tkanki są regenerowane.
2. Amplifikuj docelowy region DNA za pomocą starterów zaprojektowanych zgodnie z opisem w krokach 1.6 i 1.7 przy użyciu standardowego PCR. Sprawdź produkt za pomocą elektroforezy żelowej. Sekwencjonowanie fragmentu w celu upewnienia się, że właściwy region jest amplifikowany, jest sugerowane, ale nie jest to konieczne. Reprezentatywne wyniki dla szablonu scn4aa są pokazane w Rysunek 2.
3. Oczyść fragment PCR za pomocą ustalonego protokołu laboratoryjnego lub firmowego.
4. Amplifikowane DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Należy rozważyć rozdzielenie go na porcje w celu skrócenia cykli zamrażania i rozmrażania.
5. Określ wymagane ilości i objętości każdego składnika. Rozważ przeprowadzenie kontroli ujemnych (z wyłączeniem sgRNA lub Cas9) i kontroli pozytywnej (wcześniej przetestowanego sgRNA, które rozszczepia docelowe DNA amplifikowane PCR), jeśli jest dostępne, a także serii stężeń sgRNA.
6. Ustawić poniższą mieszaninę reakcyjną w określonej kolejności w probówce PCR w temperaturze pokojowej, dodając sgRNA i białko Cas9 na końcu, aby uzyskać najlepsze wyniki: 50–100 ng docelowego produktu DNA PCR, 1 μL 10x buforu 3, 1 μL 10x BSA (0,1 g/ml), 50–200 ng białka Cas9 (1 mg/mL, sugerowane 150 ng) i 30–200 ng sgRNA (sugerowane 100 ng).
   1. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 65 °C przez 10 minut w celu inaktywacji białka Cas9.
   2. Przeprowadź całą próbkę na żelu agarozowym 2%-3% (oczekiwane rozmiary pasm między 30-200 pz) wraz z kontrolami dodatnimi i ujemnymi. Udane rozszczepienie może pokazać część produktu PCR, ale będzie również miało dwa mniejsze pasma. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 2.

4. Pozyskiwanie zarodków

UWAGA: Uzyskanie embrionów ryb o słabym natężeniu elektrycznym może być trudne. Staranne monitorowanie jakości wody, odpowiedni czas na pielęgnację ryb i regularne karmienie są kluczem do udanego programu hodowlanego. Ryby muszą być najpierw kondycjonowane przez kilka tygodni w celu rozmnażania⁵², jak opisano w kroku 4.1 protokołu. Następnie przedstawiono protokół wspomagający naturalną gametogenezę (4.2) do wykorzystania w naturalnych zachowaniach tarłowych (4.3), alternatywną niedawno opracowaną technikę in vitro do uzyskiwania zarodków w precyzyjnym czasie (4.4). Protokół 4.3 jest równie skuteczny w przypadku B. brachyistius i B. gauderio, a protokół 4.4 jest lepszy w przypadku B. gauderio.

1. Klimatyzacja
   1. Trzymaj B. brachyistius w parach/małych grupach (zbiorniki 100–150 litrów) lub w bardzo dużych zbiornikach (2 samce i 5–6 samic w zbiorniku o pojemności około 475 litrów), ponieważ w warunkach hodowlanych stają się bardzo agresywne. Na każdą rybę powinny przypadać co najmniej 1–2 rurki z PVC, które mają służyć jako schronienie (Rysunek 3A,B).
   2. B. gauderio może być hodowany w znacznie większym zagęszczeniu. W zbiorniku o pojemności 100 litrów można przechowywać do ośmiu osobników (2 samce i 6 samic). Na każdą rybę powinna przypadać co najmniej 1 rurka z PVC, która ma służyć jako schronienie. Dodanie splątanej przędzy zwiększa wzbogacenie i kryjówki. Dodaj 50 ml probówek wirówkowych z wywierconymi w nich otworami o średnicy 1 cm do górnej części zbiornika, aby umożliwić dorosłym osobnikom naturalne odradzanie się w probówkach (Rysunek 3C).
   3. W sezonie lęgowym codziennie karmić ryby świeżymi czarnymi robakami uzupełnionymi mrożonymi dżdżownicami. W razie potrzeby karmę można wzbogacić witaminami i suplementami.
   4. Ryby domowe zwykle w roztworze o stosunkowo wysokiej przewodności (300–600 μS), zrównoważonym pH. W okresie lęgowym stopniowo zmniejszaj przewodność o co najmniej połowę w ciągu 1–3 tygodni, aby wywołać rekupację gonad i tarło. Niższa przewodność dzięki codziennemu dodawaniu wody z odwróconej osmozy (RO), zwracając szczególną uwagę na pH, gdy przewodność jest niska (pH <6).
   5. Warunki rozrodcze można utrzymać przez około 3-5 miesięcy, przy czym produkcja jaj z czasem maleje. Po tym czasie powoli przywracaj ryby do wysokiej przewodności przez 1–3 tygodnie. Utrzymuj kolejne 3 miesiące w wysokiej przewodności, zanim ponownie wystawisz się na warunki hodowlane.
2. Stosować środki tarliwe (SGnRHa + Domperidon) do wstrzykiwań.
   1. Zidentyfikuj samice ryb w warunkach hodowlanych, które wydają się ciężkie (Rysunek 4). U B. gauderio samica będzie miała spuchnięte gonady tuż ogonowe do ujścia wentylacyjnego. Samice B. brachyistius będą miały spuchnięte brzuchy i będą wyglądały na głębokie (Ryc. 4A). Samce na ogół nie mają problemu z produkcją plemników. Jednak preferowane są większe samce ze względu na większą objętość zebranych plemników.
      nuta: Czynnik tarłowy to komercyjna mieszanka hormonów, która ułatwia dojrzewanie gamet i koordynuje tarło. Jeśli rybie wstrzyknięto w przeszłości czynnik tarłowy, należy przeczekać >4 tygodnie odpoczynku i obfite karmienie między wstrzyknięciami. Sugerujemy wstrzyknięcie co najmniej 2 samców i 4-5 samic, aby zapewnić kilka lęgów jaj i dużo plemników.
   2. Znieczulaj ryby w MS-222 (0,4 g/3 l) przez kilka minut, aż ryba nie będzie w stanie utrzymać swojej pozycji, nie będzie ruchoma, ale nadal będzie miała ruch operkularny (Etap II53).
   3. Zważyć ryby (g), aby obliczyć ilość czynnika tarłowego, (0,5 μl/g) + 0,5 μl. Dodatkowe 0,5 μl odpowiada za błędy pipetowania.
   4. Dodaj czynnik tarlakowy do 4 razy większej objętości buforu (1x PBS lub DPBS) w probówce PCR i dobrze wymieszaj. Roztwór stanie się mętny. Pomaga to w dozowaniu czynnika tarłowego na tworzywo termoplastyczne, a następnie użyciu pipety do odmierzenia obliczonej dawki. Czynnik tarłowy jest lepki, dlatego należy dozować całą dawkę i zachować ostrożność podczas pipetowania.
   5. Odpipetować roztwór do wstrzykiwań na tworzywo termoplastyczne i pobrać do precyzyjnej szklanej strzykawki, unikając pęcherzyków powietrza. Zalecamy igłę ze ściętym skosem o gramaturze 28 g i długości 19–25 mm.
   6. Roztwór należy wstrzykiwać w mięsień grzbietowy tułowia w płynnym tempie. Pozostaw igłę na 2-4 sekundy, a następnie usuń. Natychmiast umieść ryby w słodkiej wodzie systemowej w celu odzyskania sprawności.
   7. Po około 24 godzinach przygotować się do pobrania zarodków (patrz 4.3 lub 4.4). Należy zebrać wszystkie niezbędne materiały, w tym materiały potrzebne do mikroiniekcji jednokomórkowej (patrz punkt 5).
3. Pozyskuj zarodki poprzez naturalne tarło.
   1. Dorosłe osobniki z wstrzykniętym czynnikiem tarłowym (4.2) są trzymane w dużych zbiornikach o pojemności 450 litrów. Najbardziej efektywne proporcje płci to zazwyczaj 1-2 samce i 3-4 samice z odpowiednimi kryjówkami wykonanymi z rurek PVC i ciemnego marmurowego podłoża na dnie zbiornika, aby zapobiec spożyciu jaj. Kulki są zazwyczaj ważniejsze dla B. brachyistius niż B. gauderio, które wolą składać swoje lepkie jaja w szczelinach lub probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml, jak opisano powyżej.
   2. Umieść ryby w odwróconym cyklu świetlnym, aby dopasować nocne tarło do regularnych godzin pracy laboratorium. Korzystając z gotowego systemu bezpieczeństwa klasy konsumenckiej, monitoruj ryby za pomocą oświetlenia w podczerwieni, aby zminimalizować zakłócenia ze zdalnie podłączonego komputera (Rysunek 3).
   3. Ryba spontanicznie składa ikrę podczas ciemnego fotoperiodu około 24 godziny po wstrzyknięciu czynnika tarłowego.
   4. Kiedy rozpoczyna się tarło, zbieraj jaja co godzinę, podczas gdy następuje tarło. U B. brachyistius zbieraj jaja za pomocą syfonu o małej średnicy nad siatką o drobnych bawełnianych oczkach, aby zminimalizować uszkodzenia świeżo złożonych jaj. Zebrać jaja B. gauderio z probówek wirówkowych o pojemności 50 ml lub podłoża w zbiorniku. Pracuj wydajnie przy minimalnych zakłóceniach tarła ryb, używając czołówki z czerwonym światłem o niskiej intensywności. Ponieważ pierwsze rozszczepienie następuje około 1 godziny po zapłodnieniu (HPF), duża część komórek jajowych będzie nadawała się do mikroiniekcji jednokomórkowej.
   5. Natychmiast należy przystąpić do mikroiniekcji (patrz punkt 5).
4. Wyciśnij samce do zapłodnienia in vitro B. gauderio.
   1. Przygotuj roztwór przedłużacza nasienia (SES) zgodnie z opisem w The Zebrafish Book⁵⁴: 10 mM HEPES, 80 mM KCl, 45 mM NaCl, 45 mM octan sodu, 0,4 mM CaCl₂ i 0,2 mM MgCl₂.
      1. Użyj ddH₂O, aby zwiększyć objętość i dostosować pH do 7,7 za pomocą 1 M NaOH.
      2. Przechowywać w lodówce.
      3. Przed użyciem przefiltrować przez filtr 0,22 μm.
   2. Znieczulać ryby w MS-222 (0,4 g/3 l) przez kilka minut, aż ryba nie będzie w stanie utrzymać swojej pozycji, będzie nieruchoma, ale nadal będzie miała ruch operkularny (Etap II53). Umieścić 500 μl podwielokrotności SES w lodzie.
   3. Dokładnie osusz ręce i ryby, szczególnie w okolicach głowy i otworu wentylacyjnego. Umieść brzuszną stroną do góry, do przodu po lewej stronie (dla osób praworęcznych) w uchwycie z pianki polistyrenowej/gąbki pokrytym nasączonym, wilgotnym ręcznikiem papierowym MS-222. Głowica powinna być jak najbardziej równoległa do stołu.
      nuta: Kroki 4.4.4–4.4.6 należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, a ryby powinny być poza wodą tylko przez 30–60 sekund.
   4. Wywieraj nacisk w kierunku ogonowym do rostralnego, a światło ściska przyśrodkowo nad gonadami w kierunku otworu wentylacyjnego. Ryby mogą wydalać odpady. Uważaj, aby wyczyścić otwór wentylacyjny delikatną ściereczką zadaniową, jeśli zostaną wydalone jakiekolwiek odpady. Nie zbieraj odpadów wraz z nasieniem. W zależności od wielkości samca zwykle stosuje się 10-60 μl.
   5. Za pomocą mikropipetera z końcówką ostrożnie zbieraj plemniki, które są wyciskane z samca w odstępach co 50 μl. Umieść plemniki bezpośrednio w 500 μl porcji SES na lodzie. Pomocne może być poproszenie innego badacza o pomoc w zbieraniu nasienia, podczas gdy drugi ściska. Nasienie powinno być wykorzystane tak szybko, jak to możliwe, ale pozostaje żywotne przez co najmniej 1 godzinę.
   6. Natychmiast po zebraniu umieść ryby w słodkiej wodzie systemowej w celu odzyskania sprawności. Ryba powinna być poza wodą tylko przez 30–60 sekund.
5. Ściskaj samice do zapłodnienia in vitro B. gauderio.
   1. Znieczulać ryby w MS-222 (0,4 g/3 l) przez kilka minut, aż ryba nie będzie w stanie utrzymać swojej pozycji, będzie nieruchoma, ale nadal będzie miała ruch operkularny (Etap II53). Umieść arkusz politetrafluoroetenu na stacji roboczej.
      nuta: Sekcje 4.5.1–4.5.5 należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, a ryby powinny być poza wodą tylko przez 30–60 sekund.
   2. Dokładnie osusz ręce, narzędzia, arkusz politetrafluoroetenu i ryby, szczególnie wokół głowy i otworu wentylacyjnego. Ułóż na boku z głową skierowaną do przodu (dla osób praworęcznych).
   3. Wywieraj nacisk w kierunku ogonowym do rostralnego, a światło ściska przyśrodkowo nad gonadami w kierunku otworu wentylacyjnego. Ryby mogą wydalać odpady. Uważaj, aby wyczyścić otwór wentylacyjny delikatną ściereczką zadaniową, jeśli zostaną wydalone jakiekolwiek odpady. W zależności od wielkości ryby zwykle składa się 20–150 jaj. Za pomocą szpatułki/narzędzia pokrytego politetrafluoroetenem ostrożnie zbieraj jajka podczas wyciskania ich z kloaki. Szybko przenieś jajka na małą szalkę Petriego i przykryj. Upewnij się, że jajka pozostają suche podczas tego procesu. Alternatywnie, po wyciśnięciu, przyłóż masę jajową do podstawy małej szalki Petriego lub do arkusza politetrafluoroetenu, gdy są one wydalane z samicy.
   4. Natychmiast po zebraniu umieść rybę w słodkiej wodzie systemowej w celu odzyskania sprawności.
6. Wykonaj zapłodnienie jaj w celu zapłodnienia in vitro B. gauderio.
   1. Dodać 100 μl dobrze wymieszanych plemników w SES (patrz krok 4.4) bezpośrednio nad masą jajową.
   2. Dodaj 1 ml wody systemowej (przefiltrowanej przez filtr 0,22 μm) i dobrze mieszaj przez 30–60 sekund.
   3. Dodać dodatkowe 1–2 ml wody systemowej (pozostawić trochę miejsca na szalce Petriego) i umieścić w inkubatorze. Zapisz czas zapłodnienia in vitro na szalce Petriego i przenieś do inkubatora o temperaturze 29 °C. Ustaw 50-minutowy timer, aby sprawdzić postęp rozwoju (np. formowanie pojedynczej komórki na biegunie zwierzęcym, patrz Rysunek 6). W tym czasie należy przygotować materiały do mikroiniekcji.

5. Mikroiniekcja jednokomórkowa

1. Wyciągnąć igły do mikroiniekcji przed wstrzyknięciem środka tarłowego (krok 4.2) lub naturalnym tarłem (krok 4.3). Do wyciągania igieł do mikroiniekcji należy użyć kapilary ze szkła borokrzemianowego z włóknem (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm, długość 10 cm) i ściągaczem igieł. Przygotować 2-4 igły na planowaną operację wstrzyknięcia.
   nuta: Preferowane są igły z ładowaniem wstecznym z filamentem, ponieważ filament odprowadza roztwór w kierunku końcówki i eliminuje pęcherzyki. Można jednak używać igieł bez filamentu, a ładowanie z góry nie powinno mieć wpływu na wynik. Igła powinna mieć długi, ale mocny stożek. Jako punkt wyjścia należy użyć programu ciągnięcia igły z następującymi specyfikacjami: ciepło = 500; Uciąg = 70; Prędkość = 70; i Czas = 100. Reprezentatywne morfologie igieł są pokazane na Rysunek 5A.
2. Przygotować roztwór do wstrzykiwań i przygotować igłę.
   1. Dodaj 0,9 μl sgRNA i 0,9 μl enzymu Cas9 (1 mg / ml) do 0,2 μl 10% lub 100% czerwieni fenolowej (dla odpowiednio 1% i 10% końcowego stężenia czerwieni fenolowej) w probówce PCR. Dobrze wymieszaj i pozostaw na lodzie 2-5 minut, aby sgRNA i Cas9 mogły się połączyć. Obliczyć końcowe stężenie sgRNA, Cas9 i czerwieni fenolowej w roztworze do wstrzykiwań.
      nuta: Jeśli występują problemy z zatykaniem się igieł lub wydajnością cięcia przy użyciu powyższego przepisu, przydatne może być użycie mieszanki soli / buforu o stężeniu 1x w celu ustabilizowania Cas9 i zapobieżenia zatykaniu się igły.
   2. Za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki wlać 2 μl roztworu do igły do mikroiniekcji. Wyrzuć płyn jak najbliżej końcówki.
   3. Załaduj igłę do mikromanipulatora i ustaw ustawienia ciśnienia (zacznij od 775 p_i, 0,1−0,2 s i 8-12 p_c).
   4. Pod lunetą użyj pary cienkich kleszczyków, aby złamać końcówkę igły pod skosem. Przerwij się w kierunku miejsca, w którym stożek igły zaczyna mieć sztywność. Najlepiej jest złamać się bliżej końcówki, sprawdzić wielkość roztworu do wstrzykiwań, a następnie w razie potrzeby rozbić dalej. Otwór igły powinien pozostać jak najmniejszy, zachowując sztywny stożek (Rysunek 5A).
   5. Użyj oleju mineralnego i mikrometru, aby zmierzyć wielkość roztworu do wstrzykiwań. Zwykle stosuje się 1-2 nL; średnica 0,1 mm to 0,5 nL.
   6. Dostosuj końcówkę igły lub ustawienia ciśnienia, aby uzyskać objętość wstrzyknięcia zgodną ze specyfikacją.
3. Zidentyfikuj rozwijające się zygoty i przygotuj etap wstrzyknięcia. Ustawić etap wstrzykiwania. Weź szalkę Petriego o średnicy 100 mm. Odwróć spód i umieść pod odwróconą górą. Umieść szklane szkiełko mikroskopowe w odwróconym blacie. W zależności od tego, w jaki sposób mikromanipulator jest zamontowany do lunety, dodatkowa wysokość od odwróconej podstawy może być zbędna.
   1. Przyjrzyj się rozwijającym się jajom i zidentyfikuj przypuszczalnie zapłodnione zygoty 50-60 minut po zapłodnieniu in vitro. Słup zwierzęcy zacznie się formować, a wokół granicy faz żółtka/komórki zwierzęcej pojawi się nadmiar małych kropelek tłuszczu (Rysunek 6).
   2. Zbierz 10–20 jajek z jak najmniejszą ilością wody za pomocą plastikowej pipety transferowej (lekko odetnij końcówkę, aby jajka przeszły) i umieść na krawędzi szkiełka. Woda będzie przesiąknięta pod zjeżdżalnią i będzie przyciągać jajka do krawędzi.
   3. Użyj delikatnej chusteczki roboczej i delikatnie dociśnij szkiełko, aby usunąć nadmiar wody i pozwól, aby jajka mocno przylegały do krawędzi szkiełka. Powinno być tylko tyle wody, aby jaja były wilgotne, a jednocześnie utrzymywały niewielką wilgotność stojącą, aby uniknąć ruchu jaj podczas wstrzykiwania.
4. Wstrzykiwać bezpośrednio do pojedynczej komórki.
   1. Ustaw jaja względem szkiełka pionowo, prostopadle do zbliżającej się igły (Rysunek 5B).
   2. Za pomocą mikromanipulatora przyłóż igłę do kosmówki. Pod kątem około 45° włóż igłę do kosmówki, a następnie do pojedynczej komórki. Pomocne może być wejście do pojedynczej komórki przez żółtko. Poruszanie zarówno etapem iniekcji wolną ręką, jak i mikromanipulatorem może zapewnić większą kontrolę nad procesem wstrzykiwania (Rysunek 5B).
   3. Wstrzyknąć roztwór sgRNA/Cas9/czerwieni fenolowej do pojedynczej komórki. Ostrożnie wyjąć igłę. Przejdź do następnego jaja i powtarzaj kroki 5.4.1–5.4.3, aż wszystkie jaja zostaną wstrzyknięte.
   4. Usunąć wszelkie jaja rozbite podczas wstrzykiwania za pomocą cienkich kleszczyków. Użyć 0,22 μm przefiltrowanej wody systemowej w butelce ze spryskiwaczem, aby delikatnie usunąć jaja ze etapu wstrzykiwania do nowej szalki Petriego o średnicy 100 mm.
   5. Powtarzaj kroki 5.3.3–5.4.6, aż wszystkie jaja zostaną wstrzyknięte lub rozwiną się do stadium dwukomórkowego. Upewnij się, że odłożyłeś około 20 przypuszczalnie zapłodnionych jaj jako kontrolę bez wstrzykiwania, aby określić wskaźniki zapłodnienia i powodzenie wstrzyknięcia. W przypadku większych lęgów należy użyć niewstrzykniętych zarodków, które rozwinęły się do stadium dwukomórkowego, a w przypadku mniejszych lęgów należy odłożyć przypuszczalnie zapłodnione jaja.
   6. Dodatkowo rozważ kontrolę sgRNA/iniekcji poprzez wstrzyknięcie 15-25 zarodków z Cas9 skompleksowanym sgRNA przeciwko genowi, który nie jest obecny w genomie. Gen GFP zalecany dla zarodków typu dzikiego. Zapisz liczbę jaj, rodziców, czas zapłodnienia in vitro i datę na każdej szalce Petriego. Dołącz cel lub etykietę sgRNA jako niewstrzykniętą. Przenieść do inkubatora o temperaturze 29 °C.

6. Hodowla zwierząt

1. Dbaj o jajka.
   1. Sprawdź żywotność jaj 4–6 godzin po wstrzyknięciu.
   2. Zapisz liczbę martwych jaj, a także tych, które nie są zapłodnione. Niezapłodnione jaja zatrzymują się około stadium ośmiokomórkowego i mają rozetowy wzór komórek na biegunie zwierzęcym (Ryc. 6). W zależności od liczby martwych jaj i ilości resztek jaj w wodzie, usuń co najmniej 50%–80% wody i zastąp ją przefiltrowaną wodą systemową. Pomocne może być wyszorowanie dna szalki Petriego, jeśli tworzy się film lub biofilm z resztek komórkowych.
   3. Przez następne 2-3 dni sprawdzaj jaja 1-2 razy dziennie. Powtórz kroki 6.1.2–6.1.3 za każdym razem, gdy jaja są sprawdzane.
   4. Po 2-3 dniach wykluwają się larwy. Usuń wszystkie osłonki jaj po wykluciu. Delikatne pipetowanie może pomóc w uwolnieniu na wpół wyklutych larw.
2. Dbaj o larwy.
   1. Sprawdzaj jajka 1−2 razy dziennie. Powtórz kroki 6.1.2–6.1.3 za każdym razem, gdy larwy są sprawdzane.
   2. Od 6–14 DPF karmić larwy węgorzami octowymi. Lekki nadmiar jedzenia jest dobry, ponieważ węgorze octowe pozostaną żywe w naczyniu. Dodawaj węgorze octowe za każdym razem, gdy naczynie jest sprawdzane i czyszczone.
   3. Z 11–14 DPF dodać 5–10 świeżo wyklutych artemii na larwy oprócz węgorzy octowych. W tym czasie larwy nauczą się jeść swobodnie pływającą artemię.
   4. Przy 15 DPF przenieść larwy do kubków na jaja (patrz sekcja 6.2.5) w zbiorniku z płynącą wodą, filtracją i napowietrzaniem. W jednej filiżance nie powinno być więcej niż około 25 zarodków. Kubki na jajka to plastikowe kubki z siatkową siatką na spodzie. Na dno kubka na jajka można dodać górną/dolną szalkę Petriego o średnicy 100 mm, aby zapobiec wypadaniu jedzenia przez siatkę. Kubki na jajka pozwalają na trzymanie ryb w większej objętości wody ze względu na jakość wody, przy zachowaniu dyskretnych grup. Kontynuuj dodawanie zarówno węgorzy octowych, jak i 15-30 świeżo wyklutych artemii na larwy od 15 do 18 dni. Codziennie czyść kawałek szalki Petriego i za pomocą pipety usuwaj masy martwej artemii.
   5. Od 18 do 30 dni karm tylko świeżo wyklutą artemię. Zwiększaj ilość pokarmu w miarę wzrostu ryb i jeśli widoczne jest gryzienie ogona.
   6. Po około 30 dniach przenieś ryby do zbiorników o pojemności 10 litrów (2,5 galona), około 25 osobników na zbiornik. Upewnij się, że jest filtracja, napowietrzanie i miejsca do ukrycia. Weź pod uwagę cylindryczne media biofiltracyjne i rurki PVC o małej średnicy.
   7. Karm świeżo wyklutą artemię i czarne robaki od około 30–45 dni. Utrzymuj standardowe czyszczenie i wymianę wody w zbiorniku (tj. co najmniej ~10%-20% wymiany wody na 1 tydzień).
   8. Po ~45 DPF karm tylko czarne robaki do ~60 DPF.
   9. Po ~60 DPF przenieś kohorty około 15 ryb do zbiorników o pojemności 40 l (10 galonów) i rozpocznij procedury hodowlane dla dorosłych. Dodaj rurki PCV i przędzę "mop" (masa brązowej przędzy związanej wokół korka) jako kryjówki (Rysunek 3C). Ryby powinny zbliżać się do wielkości lęgowej (10−12 cm) po około 3−4 miesiącach od zapłodnienia.

7. Hodowla dorosłych

1. Codziennie karm ryby wystarczającą ilością czarnych robaków, aby niewielka ilość czarnych robaków była obecna przy następnym karmieniu. To karmienie ad libitum pozwala na maksymalny wzrost.
2. Kilka razy w tygodniu pomocne może być uzupełnienie żerowania czarnych robaków robakami krwionośnymi.
3. Czyść zbiorniki co 2–4 tygodnie z wymianą wody o 20%–30%. Jeśli mop z przędzy wypełni się biofilmem/glonami, przetrzyj go do czysta pod wodą RO.

Miejsca docelowe sgRNA zostały zidentyfikowane w eksonie 1 scn4aa zarówno u B. gauderio, jak i B. brachyistius, jak opisano w sekcji 1. SgRNA zostały wygenerowane zgodnie z opisem w sekcji 2. Po udanej selekcji i syntezie sgRNA (Rysunek 1) przetestowano rozszczepienie in vitro (Figura 2). SgRNA wykazujące cięcie in vitro zostały następnie wybrane do mikroiniekcji jednokomórkowych.

Dorosłe ryby zostały uwarunkowane do rozmnażania (sekcja 4.1), następnie wstrzyknięte czynnikiem tarłowym (sekcja 4.2), a następnie wyciśnięte (B. gauderio) do zapłodnienia in vitro, jak opisano w sekcji 4.4 lub dopuszczone do naturalnego tarła (B. brachyistius), jak opisano w sekcji 4.3. Wysiłki te zaowocowały pojedynczymi zarodkami komórkowymi do mikroiniekcji u obu gatunków. Jak opisano w sekcji 5, 1,5−2,0 nL kompleksu scn4aa sgRNA/Cas9/czerwień fenolowa (65-190 ng/uL sgRNA, 450 ng/uL Cas9, 1%−10% czerwieni fenolowej, stężenia końcowe) wstrzyknięto na etapie jednokomórkowym. Jaja z tego samego lęgu były używane jako niewstrzykiwane kontrole. Wszystkie zarodki były pielęgnowane w sposób opisany w punkcie 6. Po zapłodnieniu in vitro 40%-90% jaj zostało zapłodnionych, a 70%-90% zarodków przeżyło do wyklucia się po wstrzyknięciu.

Około 75% ryb przeżyło do 6−11 DPF, a następnie zostało poddanych fenotypowaniu. Larwy ryb umieszczono na 35-milimetrowej szalce Petriego osadzonej w większej szalce z unieruchomionymi elektrodami rejestrującymi Ag/Cl Sylgarda (Ryc. 7A). Ruch zarodka ograniczono za pomocą 3% form agarozowych wykonanych z wody systemowej i przyciętych tak, aby pasowały do zarodka (Ryc. 7B). Dla obu gatunków użyto tej samej komory zapisu, a wśród porównań gatunków użyto tej samej pleśni agarozowej. Zarodki były rejestrowane przez 60 sekund, co wystarcza do przechwycenia setek EOD. Do porównania wybrano niewstrzyknięte grupy kontrolne dopasowane pod względem wieku i wielkości. W tym momencie 10%-30% zarodków, które przeżyły, wykazuje EOD o zmniejszonej amplitudzie. Zarodki wykazujące zmniejszenie amplitudy EOD bez widocznych wad morfologicznych i kontrolne niewstrzyknięte całe zarodki zostały strawione w celu ekstrakcji DNA, a następnie PCR miejsca docelowego scn4aa. Często występował zakres penetracji fenotypu, przy czym niektóre osoby miały silniejsze zmniejszenie amplitudy EOD niż inne.

Po oczyszczeniu i sklonowaniu metodą PCR, 30+ klonów z każdego zarodka zostało wybranych do sekwencjonowania Sangera. Mutacje indukowane przez CRISPR/Cas9 zidentyfikowano u osób B. gauderio (Ryc. 8A,B) i B. brachyistius (Figura 9A,B) z silną redukcją amplitudy EOD (Rycina 8C i Figura 9C, w których niewstrzyknięte grupy kontrolne miały jedynie genotypy referencyjne. Wizualizacja amplitudy EOD między potwierdzonymi mutantami ("CRISPR") a grupą kontrolną dopasowaną pod względem wieku/wielkości wykazała, że zarówno zarodki z mutacją scn4aa B. brachyistius (Figura 10A), jak i B. gauderio (Figura 10B) miały znacznie niższą amplitudę EOD niż kontrole (p < 2,2 x 10-16, test t Welcha dla dwóch prób). Celowanie CRISPR/Cas9 w scn4aa zakończyło się sukcesem zarówno w przypadku B. brachyistius, jak i B. gauderio i wiąże się z scn4aa w larwalnym/wczesnym wyładowaniu elektrocytów u obu gatunków.

Rysunek 1: synteza i transkrypcja matrycy sgRNA. (A) Żelowy obraz syntezy matrycy sgRNA. Znaczniki odpowiadają różnym sgRNA dla myod (MYO2, MYO1) i trzem sgRNA dla scn4aa (S1−S3). Po wyżarzaniu oligomerów wytwarza się matrycę o masie ~120 pz. (B) Żelowy obraz transkrypcji sgRNA dla trzech sgRNA dla B. gauderio (bg2017) i dwóch dla B. brachyistius (bb2016, 2017). sgRNA pojawi się jako dwa prążki ze względu na strukturę drugorzędową i będzie wynosić od 50 do 150 pz przy użyciu drabiny dsDNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywny obraz żelu udanych (sg1) i nieudanych (sg2) testów CRISPR in vitro. Równoważna ilość szablonu bez komponentów CRISPR jest pokazana na torze scn4aa. Zwróć uwagę na zduplikowane pasma w sg1, które pokazują, że nastąpiło przecięcie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Konfiguracje zbiorników hodowlanych dla ryb o słabym natężeniu elektrycznym. (A) Schemat typowej konfiguracji do bezprzewodowego monitorowania wideo tarła. Trzy dostępne na rynku kamery CCTV (Swann, Inc.) zdolne do wytwarzania światła podczerwonego są skierowane na powierzchnię wody i podłączone do cyfrowego rejestratora wideo (DVR). Wideo jest monitorowane w czasie rzeczywistym pod kątem tarła w sąsiednim pomieszczeniu z komputera podłączonego do sieci (PC). (B) Zachowanie podczas tarła uchwycone przy takim ustawieniu u B. brachyistius. (C) Typowy układ hodowlany dla B. gauderio z rurkami ukrywającymi z PVC i mopami z przędzy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Hodowla samców i samic. (A) B. brachyistius i (B) B. gauderio. Oba gatunki są dymorficzne płciowo i łatwo je odróżnić wizualnie, gdy osiągną dojrzałość płciową. Obie samice są na tych zdjęciach ciężkie, mają charakterystycznie spuchnięte brzuchy, które są pełne dojrzałych jaj. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Mikroiniekcja. (A) Końcówki szklanych igieł kapilarnych muszą zostać złamane, aby zapewnić odpowiednią objętość mikroiniekcji. Końcówka po lewej stronie jest nieprzerwana. Środkowa i prawa końcówka są złamane lekko skośnym skosem, aby przebić kosmówkę jaja. (B) Jaja są wyściełane na szkiełku podstawowym (1%-10% czerwieni fenolowej jest dołączone jako znacznik do wizualizacji wykonania zastrzyku) i wstrzykiwane za pomocą szklanych igieł kapilarnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Etapy rozwojowe. (A) B. gauderio i (B) B. brachyistius. Zakłada się, że wszystkie jaja są zapłodnione, a rozwój jest monitorowany do 24 HPF. W zdolnych do życia jajach widoczne są zarodki HPF od 12 do 24, w przeciwnym razie jaja wykazują degradację. Wydaje się, że podczas aktywacji komórki jajowej zachodzi kilka podziałów, niezależnie od zapłodnienia. Niezapłodnione jaja wykazują niezwykłe wzory łupliwości, które są znacznie bardziej symetryczne w zapłodnionych jajach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 7: Fotografia komory rejestracyjnej larw wykorzystanej w tym badaniu. (A) Elektrody są osadzone w Sylguard, ale rozciągają się do 35-milimetrowej szalki zawierającej zarodek ograniczony przez 3% formę agarozową. (B) Obraz w większym powiększeniu, podkreślający ograniczony ruch zarodka z powodu agarozy. Zwróć uwagę na kawałki agarozy, które można usunąć, gdy zarodek zmienia rozmiar. Zarodek B. gauderio jest skierowany w stronę elektrody dodatniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Mutacje wywołane przez CRISPR/Cas9 u B. gauderio. (A) Trzydzieści dwie sekwencje klonów z genomowego DNA mutacji indukowanych przez Cas9 w pojedynczym zarodku scn4aa ukierunkowanym na F0 B. gauderio (11 DPF). Sekwencja referencyjna jest podkreślona przez miejsce docelowe sgRNA podświetlone na szaro, sekwencję motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) zaznaczoną na czerwono, a miejsce cięcia Cas9 zaznaczone znakiem "|". W nawiasach podano zmianę w stosunku do oczekiwanej sekwencji typu dzikiego, a liczbę klonów dla każdej sekwencji. (Skróty: + = wstawienie, - = usunięcie, ± = indel) Wszelkie różnice w sekwencjach niezwiązane z CRISPR są pogrubione. Rysunek wzorowany na Jao et al.60. (B) Sekwencja aminokwasów przewidziana na podstawie zsekwencjonowanych klonów knockdown scn4aa B. gauderio z (A). Zmiany wywołane przez Cas9 z sekwencji typu dzikiego są podświetlone na czerwono i podany jest numer zmiany wywołanej nukleotydem. (C) Dwudziestosekundowe nagrania elektryczne z pięciu larw o dopasowanej wielkości, wszystkie zarejestrowały 6 DPF w tej samej komorze zapisu. Ustawienia wzmocnienia są identyczne dla wszystkich ścieżek. Ślady w kolorze czerwonym pochodzą od larw B. gauderio z potwierdzonymi mutacjami (jeden osobnik pokazany w Ryc. 8A, B powyżej), ślady w kolorze czarnym pochodzą od niewstrzykniętych larw B. gauderio. Ogólnie rzecz biorąc, edycja scn4aa za pomocą CRISPR/Cas9 wykazała zmniejszenie amplitudy EOD, chociaż efekt był niejednorodny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 9: Mutacje wywołane przez CRISPR/Cas9 u B. brachyistius. (A) Czterdzieści dwie sekwencje klonów z genomowego DNA mutacji indukowanych przez Cas9 w pojedynczym zarodku F0 B. brachyistius ukierunkowanym na scn4aa (11 DPF). Sekwencja referencyjna jest podkreślona przez miejsce docelowe sgRNA podświetlone na szaro, sekwencję motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) zaznaczoną na czerwono, a miejsce cięcia Cas9 zaznaczone znakiem "|". W nawiasach podano zmianę w stosunku do oczekiwanej sekwencji typu dzikiego, a liczbę klonów dla każdej sekwencji. (Skróty: + = wstawienie, - = usunięcie, ± = indel) Wszelkie różnice w sekwencjach niezwiązane z CRISPR są pogrubione. Rysunek wzorowany na Jao et al.60. (B) Sekwencja aminokwasów przewidziana na podstawie zsekwencjonowanych klonów z knockdown scn4aa B. brachyistius w (A). Zmiany wywołane przez Cas9 w stosunku do sekwencji typu dzikiego są podświetlone na czerwono i podany jest numer zmiany indukowanej nukleotydami. (C) Dziesięć sekundowych nagrań elektrycznych od czterech larw o dopasowanej wielkości, wszystkie zarejestrowały 10 DPF w tej samej komorze zapisu. Ustawienia wzmocnienia są identyczne dla wszystkich ścieżek. Ślady w kolorze czerwonym pochodzą od larw B. brachyistius z potwierdzonymi mutacjami (jeden osobnik pokazany w A, B powyżej), ślady w kolorze czarnym pochodzą od niewstrzykniętych larw B. brachyistius. Ogólnie rzecz biorąc, edycja scn4aa za pomocą CRISPR/Cas9 wykazała zmniejszenie amplitudy EOD, chociaż efekt był niejednorodny. Odwrócone EOD pochodzą ze zmiany orientacji ryby podczas nagrywania. Mimo to nie jest dostrzegalna różnica między rybami doświadczalnymi a kontrolnymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Wykresy pudełkowe średniej amplitudy EOD CRISPR i niewstrzykniętego rodzeństwa dopasowanego pod względem wielkości/wieku. (A) Amplituda EOD larw B. brachyistius przy 10 DPF. Zarejestrowane z zyskiem 100, CRISPR n = 56 EOD od dwóch osób, niewstrzyknięte n = 114 EOD od trzech osób. (B) Amplituda EOD larw B. gauderio przy 6 DPF. Zarejestrowane z przyrostem 500, CRISPR n = 34 EOD od dwóch osób, niewstrzyknięte n = 148 EOD od trzech osób. Amplituda ryb CRISPR była znacznie mniejsza niż w przypadku niewstrzykiwanych kontroli (p < 2,2 x 10-16, test t Welcha dla dwóch prób). Wszystkie osoby zostały nagrane w komorze rejestracyjnej opisanej w Rysunek 7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Oligonukleotydy niezbędne dla protokołu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.