Artykuł metodologiczny

Ustalenie i charakterystyka sferoid guza neuroendokrynnego jelita cienkiego

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60303

⸱

14 października 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Iowa Carver College of Medicine, 2High Throughput Screening Facility, University of Iowa Carver College of Medicine, 3Department of Pathology, University of Iowa Carver College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Guzy neuroendokrynne (NET) wywodzą się z komórek neuroendokrynnych grzebienia nerwowego. Rosną wolno i stanowią wyzwanie dla kultury. Przedstawiamy alternatywną strategię hodowli NET z jelita cienkiego poprzez hodowlę ich jako sferoid. Te sferoidy mają markery siatki jelita cienkiego i mogą być używane do testowania narkotyków.

Streszczenie

Guzy neuroendokrynne jelita cienkiego (SBNETs) są rzadkimi nowotworami wywodzącymi się z komórek enterochromafinowych jelita. Badania w tej dziedzinie były ograniczone, ponieważ wygenerowano bardzo niewiele linii komórkowych SBNET pochodzących od pacjentów. Dobrze zróżnicowane komórki SBNET rosną wolno i są trudne do rozmnażania. Kilka linii komórkowych, które zostały ustanowione, nie jest łatwo dostępnych, a po pewnym czasie w hodowli może nie wykazywać nadal cech komórek NET. Generowanie nowych linii komórkowych może zająć wiele lat, ponieważ komórki SBNET mają długi czas podwojenia i potrzeba wielu etapów wzbogacania w celu wyeliminowania szybko dzielących się fibroblastów związanych z rakiem. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy protokół hodowli komórek SBNET z chirurgicznie usuniętych guzów jako sferoid w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). ECM tworzy trójwymiarową matrycę, która otacza komórki SBNET i naśladuje mikrośrodowisko guza, umożliwiając wzrost komórek SBNET. Tutaj scharakteryzowaliśmy tempo wzrostu sferoid SBNET i opisaliśmy metody identyfikacji markerów SBNET za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i immunohistochemii w celu potwierdzenia, że sferoidy są neuroendokrynnymi komórkami nowotworowymi. Dodatkowo wykorzystaliśmy sferoidy SBNET do badania cytotoksyczności rapamycyny.

Wprowadzenie

Guzy neuroendokrynne jelita cienkiego (SBNET) wywodzą się z komórek enterochromafinowych jelita cienkiego. Chociaż SBNET-y są ogólnie znane z tego, że rosną powoli, często dają przerzuty do wątroby1. Chociaż w wielu przypadkach można rozważyć chirurgiczne usunięcie lub ablację guza, nawrót jest prawie powszechny, dlatego terapia medyczna odgrywa ważną rolę w leczeniu. Włożono ogromne wysiłki w wygenerowanie nowych linii komórkowych SBNET do testowania leków. Sukcesy były jednak bardzo niewielkie. Zgłoszono tylko 6 linii komórkowych SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS)2,3,4,5; i niestety jedna linia komórkowa nie wykazuje już ekspresji NET markers6, a trzy inne linie komórkowe SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) zostały określone jako pochodzące z transformowanych limfoblastów zamiast NETs7. Aby przyspieszyć identyfikację leków ukierunkowanych na SBNET, potrzebne są alternatywne metody testowania narkotyków in vitro.

Tutaj korzystamy z dostępności wyciętych SBNETów i stworzyliśmy sposób na hodowlę tych SBNET-ów pochodzących od pacjentów jako sferoid rosnących w ECM. Ogólnym celem tego manuskryptu jest opisanie metody hodowli SBNET jako hodowli trójwymiarowej (3D) oraz nakreślenie procedur charakteryzujących te sferoidy w celu zachowania markerów SBNET przez barwienie immunofluorescencyjne i immunohistochemię.

Ponadto pokazujemy, jak te sferoidy SBNET mogą być używane do testowania działania rapamycyny, leku przeciwnowotworowego dla NETs8. Uzasadnieniem tego protokołu jest opracowanie nowej metody hodowli komórek SBNET in vitro i wykorzystania ich do testowania leków. Przewagą tej techniki nad tradycyjną metodą tworzenia linii komórkowej SBNET jest to, że można szybko uzyskać hodowle 3D SBNET, a testy narkotykowe można wykonać w ciągu 3 tygodni. Sferoidy SBNET mogą być potencjalnie wykorzystane jako model do przeprowadzania badań przesiewowych leków in vitro w celu identyfikacji nowych leków dla pacjentów z SBNET. Ponieważ linie komórkowe SBNET nie są powszechnie dostępne, hodowle 3D sferoid SBNET mogą służyć jako nowy model in vitro do badania SBNET i mogą być udostępniane naukowcom w tej dziedzinie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z użyciem próbek ludzkich guzów neuroendokrynnych zostały zatwierdzone przez komitet IRB Szpitala i Klinik Uniwersytetu Iowa (numer protokołu 199911057). Wykaz wszystkich materiałów i wyposażenia znajduje się w Tabeli Materiałów. Wykaz pożywek wzrostowych i kluczowych rozwiązań znajduje się w tabeli 1.

1. Zbieranie guzów neuroendokrynnych jelita cienkiego (SBNET) i dysocjacja komórek

  1. Uzyskaj wycięte próbki SBNET pacjenta po potwierdzeniu tkanek nowotworowych z rdzenia patologii chirurgicznej.
  2. Pokrój SBNETy w kostkę o średnicy 5 mm i przechowuj w 25 ml pożywki DMEM/F12 w stożkowej probówce do transportu do laboratorium.
  3. Przenieś guzy do DMEM zawierającego 1% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep), 1% glutaminy (Wash Medium) i inkubuj w tym pożywce do mycia przez 15 minut.
  4. Przenieś guzy do nowego naczynia i zmiel guzy na mniej niż 1 mm kawałki za pomocą sterylnych zakrzywionych nożyczek.
  5. Przenieść zmielone tkanki do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu do mycia.
  6. Odwirować próbkę o masie 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 10 ml pożywki płuczącej zawierającej kolagenazę (100 U/ml) i DNazę (0,1 mg/ml).
  8. Pozostawić trawienie zmielonych guzów w inkubatorze o temperaturze 37 °C z powolnym wstrząsaniem (50 obr./min) przez 1,5 godziny.

2. Hodowla SBNETów jako sferoid nowotworowych w ECM

  1. Po zakończeniu trawienia (etap 1.8) odwirować przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 ml pożywki płuczącej.
  2. Umieść sitko o pojemności 70 μm na nowej probówce o pojemności 50 ml i przenieś 10 ml pożywki myjącej na sitko do komórek. Zakręć medium myjącym, aby przykryć bok plastikowej rurki, aby zapobiec przywieraniu komórek NET do boku plastikowej rurki.
  3. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko do komórek.
  4. Wirować przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 200 μl pożywki płuczącej (całkowita objętość wynosi ~ 250 μl) i umieścić na lodzie.
  5. Przenieść 5 μl komórek do 500 μl pożywki płuczącej (współczynnik rozcieńczenia 1/100). Użyj rozcieńczonych komórek do zliczania komórek za pomocą hemocytometru, aby uzyskać liczbę komórek na mililitr. Pomnóż przez 100, aby skorygować współczynnik rozcieńczenia.
  6. Pomnóż liczbę komórek na ml otrzymaną w kroku 2.5 przez całkowitą objętość komórek w zawiesinie otrzymaną w kroku 2.4 (~ 250 μL).
  7. Wirować przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w ciekłym ECM (1 x 106 komórek/ml) i przechowywać na lodzie.
  8. Przenieść 5-20 μl sferoid SBNET w ECM na płytkę 96-dołkową i pozwolić ciekłemu ECM zestalić się, umieszczając płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.
  9. Dodać 200 μl pożywki hodowlanej SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% glutaminy + 10 mM nikotynamidu + 10 μg/ml insuliny) do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej sferoidy SBNET w ECM.
  10. Alternatywnie, hoduj organoidy SBNET w pożywkach z komórek macierzystych podobne do tego, co zostało wcześniej opisane do hodowli organoidów ludzkiej wątroby lub trzustki9 i wymienione w Tabeli Materiałów.
  11. Zmieniaj nośniki co 5-7 dni.

3. Kwantyfikacja wielkości sferoidy SBNET za pomocą ImageJ

  1. Zrób 5-10 zdjęć sferoid SBNET w dniu 1, 4, 7, 14, 23 i 97 kultury, używając obiektywu 10x.
  2. Otwórz zapisane obrazy w ImageJ. Przejdź do zakładki Analizuj, wybierz opcję Ustaw pomiary i zaznacz opcję Obszar.
  3. Użyj narzędzia do zaznaczania owalu z paska narzędzi, aby wygenerować elipsoidę lub okrąg wokół dobrze wyostrzonej sferoidy.
  4. Przejdź do zakładki Analiza i wybierz opcję Zmierz. Powtórz kroki 3.4 i 3.5, aby uzyskać pomiar obszaru z 25-50 sferoid SBNET. Wartości są podane w pikselach kwadracie.
  5. Przekonwertuj obszar piksela na μm2, dzieląc rozmiar każdego piksela przez długość każdego piksela Współczynnik konwersji na μm obrazów mikroskopowych.
    UWAGA: Komórki SBNET rosną głównie jako sferoidy, a czasami jako elipsoidy.

4. Charakterystyka sferoid SBNETS za pomocą immunofluorescencji

  1. Przenieś organoidy wyhodowane w ECM do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety P1000.
  2. Odwirować przy 1 500 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.
  3. Umyć kulturę organoidów, dodając 1 ml PBS, wymieszać, odwirować przy 1 500 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.
  4. Utrwalić organoidy, dodając 500 μl 4% paraformaldehydu i inkubować przez 15 minut.
  5. Umyj kulturę dwukrotnie 1 ml PBS.
  6. Przepuszczalność kultury należy dodać 500 μl PBS + 3% BSA + 0,1% Triton X 100 przez 5 minut.
  7. Następnie umyj trzykrotnie 1 ml PBS + 3% BSA.
  8. Inkubować przez 1 godzinę z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko synaptofizynie (SYP)10 w rozcieńczeniu 1/600 lub chromograniny A (CgA)11 i receptorowi somatostatyny 2 (SSTR2)12 przy rozcieńczeniu 1/400 w buforze przeciwciał (2,5% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% azydku sodu, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM chlorku sodu).
    UWAGA: Użyj 300 μl lub więcej roztworu przeciwciał na probówkę.
  9. Umyj trzy razy 1 ml PBS + 3% BSA.
  10. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z FITC w rozcieńczeniu 1:500 w buforze przeciwciał przez 1 godzinę. Użyć 300 μl lub więcej roztworu przeciwciała na probówkę.
  11. Umyj 3 razy 1 ml PBS + 3% BSA. Upewnij się, że odessałeś i odrzuciłeś cały supernatant.
  12. Dodać 5 μl podłoża montażowego zawierającego barwnik jądrowy DAPI.
  13. Za pomocą pipety P20 przenieś 5 μl sferoidów SBNET z kroku 4.12 na szkiełko podstawowe i uszczelnij szkiełkiem przykrywkowym.
  14. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu obiektywów 10x, 20x lub 40x.

5. Charakterystyka sferoid SBNET metodą immunohistochemiczną (IHC)

  1. Przenieść sferoidy SBNET z płytki hodowlanej do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety P1000.
  2. Odwirować przy 1 500 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.
  3. Utrwalić sferoidy SBNET, dodając 500 μl 10% formaliny do probówki z kroku 5.2 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-5 dni przed zatopieniem parafiny i wyciąć skrawki sferoidalne o grubości 4 μm.
  4. Deparafinowanie, ponowne uwodnienie i wykorzystanie indukowanego ciepłem pobierania epitopów w roztworze do pobierania antygenu o pH 9 poprzez ogrzewanie do 97 °C przez 20 minut przy użyciu automatycznej stacji przetwarzania szkiełek 3 w 1 w celu przygotowania szkiełek do inkubacji przeciwciał.
  5. Blokuj szkiełka i inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko SYP10 w rozcieńczeniu 1/100 przez 15 min, CgA11 w rozcieńczeniu 1/800 przez 15 min i SSTR212 w rozcieńczeniu 1/5 000 przez 30 min.
  6. Inkubować z wtórnym systemem wykrywania przeciwciał przez 15 minut w przypadku barwienia anty-SYP i CgA oraz 30 minut w przypadku barwienia anty-SSTR2. Rób zdjęcia za pomocą obiektywu 400x.

6. Leczenie organoidów SBNET rapamycyną

  1. Rozpuścić rapamycynę w DMSO, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM.
  2. Przygotować pożywkę SBNET z DMSO (np. 1 ml pożywki SBNET + 1 μl DMSO) i pożywkę SBNET z 10 μM rapamycyny (np. 1 ml pożywki SBNET + 1 μl 10 mM roztworu podstawowego rapamycyny).
  3. Przenieść 200 μl pożywki z pożywką SBNET z DMSO lub 10 μM rapamycyną do kultur sferoidalnych SBNET.
  4. Inkubować sferoidy SBNET przez 5 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  5. Dodać 1 μM homodimeru etydyny i inkubować przez 30 minut. Usunąć pożywkę zawierającą homodimer etydyny, przemyć 200 μl PBS i przenieść 200 μl PBS do każdej studzienki.
  6. Wykonuj obrazy mikroskopowe sferoid SBNET z leczeniem farmakologicznym i bez niego za pomocą czerwonej kostki filtra z obiektywami 10x, 20x lub 40x mikroskopu fluorescencyjnego.
    UWAGA: Martwe komórki wybarwione homodimerem etydyny pojawiają się na czerwono przy użyciu czerwonej kostki filtracyjnej G dostępnego na rynku mikroskopu (tabela materiałów). Alternatywnie sygnał można przechwycić za pomocą spektrofotometru przy wzbudzeniu 535 nm i emisji 624 nm.

7. Dzielenie sferoid SBNET

UWAGA: To jest zrobione w celu rozszerzenia i udostępnienia innym badaczom.

  1. Za pomocą pipety P1000 mechanicznie rozbić moduł ECM i zassać moduł ECM ze sferoidami SBNET do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Odwirować przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C, usunąć cały supernatant i umieścić probówkę na lodzie.
  3. Dodaj 2-4 razy objętość nowego ECM do granulki. Wymieszaj nowy moduł ECM ze starymi sferoidami ECM i SBNET, pipetując 10 razy w górę i w dół. Unikanie wprowadzania pęcherzyków powietrza.
  4. Przenieść 5-20 μl mieszaniny sferoid ECM i SBNET na nową płytkę i pozwolić ECM na zestalenie się.
  5. Przykryj nową pożywką SBNET i przenieś do inkubatora. Wskaźnik odzysku wynosi około 95 do 100%.
  6. W przypadku wysyłki sferoid SBNET do innego laboratorium, należy przenieść sferoidy SBNET z nowym ECM do kolby T25 i pozwolić ECM na zestalenie się.
  7. Napełnij kolbę T25 podłożem sferoidalnym SBNET, mocno dokręć nakrętkę i przygotuj paczkę wysyłkową.
  8. Po otrzymaniu hodowli sferoidalnej SBNET usuń pożywkę hodowlaną i wykonaj kroki od 7.1 do 7.5, aby umieścić sferoidy SBNET z powrotem w hodowli.

8. Krioprzechowywanie i odzyskiwanie sferoid SBNET

  1. Przenieś sferoidy SBNET z 5-10 małych studzienek do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant, ponownie zawiesić w pożywce zamrażającej (90% FBS + 10% DMSO), przechowywać w pojemniku do zamrażania komórek i umieścić w temperaturze -80 °C.
  2. Przenieś do ciekłego azotu w celu dłuższego przechowywania.
  3. Aby odzyskać sferoidy SBNET, umieść zamrożoną fiolkę na lodzie i poczekaj, aż zawartość całkowicie się rozmrozi. Odwróć rurkę i umieść ją ponownie na lodzie, aby przyspieszyć proces rozmrażania.
  4. Po rozmrożeniu próbki umieścić ją w wstępnie schłodzonej wirówce i wirować z prędkością 1 000 x g przez 10 minut.
  5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić sferoidy w ECM. Trzymaj probówkę na lodzie, przenieś 20 μl na nową płytkę i poczekaj, aż ECM stwardnieje.
  6. Przenieść 200 μl pożywki SBNET z 10 μM inhibitora ROCK (Y-27632)13 i przenieść do inkubatora.
  7. Pozwól sferoidom SBNET zregenerować się i rosnąć przez 1 tydzień. Usunąć starą pożywkę hodowlaną, uzupełnić 200 μl pożywki SBNET i wrócić do inkubatora.
  8. Pozwól sferoidom SBNET na dalszy wzrost.
    UWAGA: Potrzeba co najmniej 1 tygodnia, aby szybko rosnące sferoidy zaczęły się regenerować po krioprezerwacji13. Sferoidy SBNET potrzebują co najmniej 2-4 tygodni, aby zacząć rosnąć. Wiele komórek SBNET umrze w ciągu pierwszych 2 tygodni, a wskaźnik przeżycia wynosi mniej niż 10%. Ponieważ jest to bardzo czasochłonny i mało wydajny proces, lepiej jest podzielić się z innymi badaczami sferoidami SBNET w kolbach hodowlanych (jak opisano w kroku 7). Kriomagazynowanie i odzyskiwanie powinno być używane tylko jako plan awaryjny w przypadku wystąpienia skażenia bakteryjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obecnie ustanowiono i opublikowano jedynie 2 linie komórkowe SBNET2,3,4,5, które nie są łatwo dostępne dla wielu badaczy. Proponujemy tutaj hodowlę SBNET w formie sferoidów w ECM i wykorzystanie tego jako alternatywnego modelu do badania wrażliwości SBNET na leki. Pobrano guz pochodzący od pacjenta z SBNET z przerzutami do wątroby, poddano go trawieniu w celu uwolnienia komórek SBNET, a następn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hodowle 3D nowotworów stały się cennym zasobem do przedklinicznych testów leków15. Niedawno utworzono różne biobanki organoidów nowotworowych z nowotworów raka piersi i raka prostaty16,17. W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli SBNET jako sferoidów oraz prostą i szybką metodę walidacji kultur sferoidalnych dla markerów NET za pomocą immunofluorescencji i badania wrażliwości leku. Z naszego doświadczenia wynika, że sferoid...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH przyznaje P50 CA174521 (dla J.R. Howe i A.M. Bellizzi). P.H. Ear jest laureatem nagrody P50 CA174521 Career Enhancement Program.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-królik FITCJackson ImmunoResearch11-095-152Wtórna para przeciwciał do zielonego fluoroforu
Roztwór do odzyskiwania antygenuAgilent DakoS2367Roztwór o pH 9 do przygotowania szkiełek do
IHC Autostainer Link 48Agilent DakoNiedostępnyZautomatyzowany system do barwienia przeciwciał
Pojemnik do zamrażania komórekThermo Scientific5100-0001Pojemnik do zamrażania komórek
CellSenceOlympusVersion 1.18Oprogramowanie komputerowe do korzystania z mikroskopu fluorescencyjnego
Przeciwciało chromograniny AAbcam-45179RB-9003-POPrzeciwciała dla IF
Przeciwciało chromograniny A (klon LK2H10)Thermo ScientificMA5-13096Przeciwciała dla
IHC CollagenazaSigmaC0130Enzym do trawienia tkanki nowotworowej
DMEMGibco11965-092Pożywka do przygotowania tkanek
DMEM/F12Gibco11320-033Pożywka do kultur organoidów
DMSOSigmaD8418Rozpuszczalnik do rozpuszczania DNA leku
SigmaDN25Enzym do trawienia tkanki nowotworowej
Ethidium HomodimerChemodexCDX-E0012-T1EBarwnik wiążący DNA i RNA
FBSGibco16000044Odczynnik do pożywek hodowlanych
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusCKX35Mikroskop do robienia zdjęć sferoid SBENT
GlutaminaGibcoA2916801Odczynnik do pożywek hodowlanych
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.51Oprogramowanie komputerowe do obrazowania analiza
InsulinaSigmaI0516Odczynnik do pożywek hodowlanych
MatrigelCorning356235Matryca do osadzania i zakotwiczania organoidów
Podłoże montażowe (VECTASHIELD)Vector LaboratoriesH-1200Utrwalacz do znakowanych komórek z barwnikiem jądrowym
NikotynamidSigma72340Odczynnik do pożywek
hodowlanychParaformaldehydowamikroskopia elektronowa Sciences15710Odczynnik do utrwalania komórek
PEN/STREPGibco15140-122Odczynnik do pożywek
hodowlanych PT LinkAgilent DakoNiedostępnyZautomatyzowany system do przygotowania szkiełek do barwienia IHC
RapamycinAlfa AesarJ62473Lek, który może hamować wzrost NET
Przeciwciała drugorzędowe dla IHCAgilent DakoK8000Przeciwciała drugorzędowe dla IHC przy użyciu systemu EnVision FLEX na bazie polimerów
Przeciwciało SSTR2GeneScritpA01591Przeciwciała przeciwko przeciwciału IF
SSTR2 (klon UMB1)Abcamab134152Przeciwciała przeciwko
synaptofizynieAbcam32127Przeciwciała przeciwko
IF Synaptophysin (klon DAK-SYNAP)Agilent DakoPrzeciwciała M7315dla IHC
TritonXMallinckrodt3555 KBGEOdczynnik do przenikania komórek
Inhibitor Y-2763 ROCKAdipogenAG-CR1-3564-M005W celu poprawy żywotności sferoidów SBNET po rozmrożeniu
IHC

Bibliografia

  1. Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
  2. Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
  3. Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
  4. Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
  5. Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
  6. Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
  7. Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
  8. Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
  9. Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
  10. Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
  11. Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
  12. Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
  13. Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66(2019).
  14. Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
  15. Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
  16. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
  17. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404(2018).
  18. Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sferoidy SBNETprotok hodowli 3Dmacierz zewn trzkom rkowamikroskopia immunofluorescencyjnaizolacja kom rektrawienie tkanekcytotoksyczno rapamycynymarker synaptofizynychromogranina A

Powiązane artykuły