Artykuł metodologiczny

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Analiza immunoblot endogennej dimeryzacji IRF5

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60393

⸱

6 października 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, City University of Hong Kong

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano natywną metodę Western blot do analizy dimeryzacji endogennego czynnika regulacyjnego interferonu 5 w linii komórek dendrytycznych plazmocytoidu CAL-1. Protokół ten można również zastosować do innych linii komórkowych.

Streszczenie

Czynnik regulacyjny interferonu 5 (IRF5) jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym regulującym odpowiedź immunologiczną. Jest aktywowany poniżej szlaku sygnałowego genu odpowiedzi pierwotnej 88 receptora szpikowego Toll-like (TLR-MyD88). Aktywacja IRF5 obejmuje fosforylację, dimeryzację, a następnie translokację z cytoplazmy do jądra, co z kolei indukuje ekspresję genów różnych cytokin prozapalnych. Test detekcji aktywacji IRF5 jest niezbędny do badania funkcji IRF5 i jego odpowiednich szlaków. W tym artykule opisano solidny test do wykrywania endogennej aktywacji IRF5 w linii ludzkich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) CAL-1. Protokół składa się ze zmodyfikowanego testu elektroforezy niedenaturującej, który może odróżnić IRF5 w postaci monomerów i dimerów, zapewniając w ten sposób niedrogie i czułe podejście do analizy aktywacji IRF5.

Wprowadzenie

Czynnik regulacyjny interferonu 5 (IRF5) jest ważnym regulatorem transkrypcji, który odgrywa znaczącą rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej, szczególnie w uwalnianiu cytokin prozapalnych i interferonów typu I (IFN)1,2,3. Nieprawidłowa regulacja IRF5 jest czynnikiem przyczyniającym się do wielu chorób autoimmunologicznych, o czym świadczą różne polimorfizmy w locus IRF5, które są związane z toczniem rumieniowatym układowym, stwardnieniem rozsianym, reumatoidalnym zapaleniem stawów itp.4,5,6,7,8,9,10. W związku z tym solidny test wykrywania endogennego stanu aktywacji IRF5 ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia szlaków regulacyjnych i dalszych skutków IRF5 w fizjologicznie istotnym kontekście komórkowym.

IRF5 ulega konstytutywnej ekspresji w monocytach, komórkach dendrytycznych (DC), komórkach B i makrofagach1,11. Podobnie jak w przypadku innych czynników transkrypcyjnych z rodziny IRF, IRF5 znajduje się w cytoplazmie w stanie utajonym. Po aktywacji IRF5 ulega fosforylacji i tworzy homodimery, które następnie przemieszczają się do jądra i wiążą się ze specyficznymi elementami regulatorowymi genów kodujących IFN typu I i cytokiny prozapalne, ostatecznie indukując ekspresję tych genów1,2,11,12,13. IRF5 reguluje wrodzone odpowiedzi immunologiczne za różnymi receptorami Toll-podobnymi (TLR), takimi jak TLR7, TLR 8 i TLR 9, które są zlokalizowane w endosomach i wykorzystują MyD88 do sygnalizacji1,11,14. Te TLR rozpoznają przede wszystkim obce gatunki kwasów nukleinowych, takie jak jednoniciowy RNA (ssRNA) i niemetylowane DNA CpG, które są objawami infekcji15,16,17,18. Wykazano, że IRF5 reguluje odpowiedź immunologiczną przeciwko infekcjom bakteryjnym, wirusowym i grzybiczym19,20,21. Biorąc pod uwagę wpływową i zróżnicowaną rolę IRF5 w układzie odpornościowym, wzmacnianie lub tłumienie aktywności IRF5 może służyć jako nowa droga do rozwoju środków terapeutycznych22. W związku z tym tak ważne jest opracowanie protokołu monitorowania stanu aktywacji endogennego IRF5, aby umożliwić dokładne zbadanie szlaków i mechanizmów regulujących aktywność IRF5 w różnych typach komórek.

Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, przed opracowaniem tego protokołu nie opublikowano żadnego biochemicznego lub żelowego testu elektroforetycznego dla endogennej aktywacji IRF5. Wykazano, że fosforylacja jest ważnym pierwszym etapem aktywacji IRF5 i opracowano fosfospecyficzne przeciwciało IRF5, które doprowadziło do odkrycia i potwierdzenia reszty seryny ważnej dla aktywności IRF513. Jednakże, podczas gdy przeciwciało wyraźnie wykrywa fosforylowany IRF5, gdy jest immunoprecypitowany lub nadmiernie eksprymowany23, nie wykrywa fosforylacji IRF5 w lizacie całego komórkowego w naszych rękach (dane nie pokazane). Dimeryzacja jest kolejnym krokiem aktywacji IRF5, a wiele ważnych badań do tej pory badających ten etap opierało się na nadekspresji IRF5 znakowanego epitopem, często w nieistotnych typach komórek, które normalnie nie wyrażają IRF511,12,24,25. Wcześniejsze badania wykazały, że dimeryzowany IRF5 nie zawsze może translokować się do jądra, a zatem niekoniecznie jest w pełni aktywowany25,26. Opracowano test endogennej lokalizacji jądrowej IRF5 w celu oceny aktywacji IRF5 za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej27. Test ten został zastosowany w badaniach, które miały kluczowe znaczenie dla zrozumienia aktywności IRF5, zwłaszcza w pierwotnych lub rzadkich typach komórek28,29 i znacznie poszerzyły wiedzę w tej dziedzinie. Jednak test ten opiera się na specjalistycznym instrumencie, który nie jest powszechnie dostępny dla badaczy. Co więcej, często konieczne jest zbadanie początkowych etapów aktywacji podczas analizowania szlaków regulacyjnych IRF5 i identyfikowania regulatorów i komponentów szlaku. Badanie to zapewnia solidny i wiarygodny test biochemiczny dla wczesnych zdarzeń aktywacji IRF5, który można przeprowadzić w laboratoriach wyposażonych w narzędzia biologii molekularnej. Opisany tutaj protokół będzie bardzo przydatny w badaniu ścieżek i mechanizmów działania IRF5, zwłaszcza w połączeniu z testami ortogonalnymi, takimi jak obrazowa analiza cytometryczna przepływu lokalizacji jądrowej IRF523,27,28,30.

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (natywna STRONA) jest powszechnie stosowaną metodą analizy kompleksów białkowych31,32. W przeciwieństwie do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), natywna PAGE rozdziela białka na podstawie ich kształtu, wielkości i ładunku. Zachowuje również natywną strukturę białka bez denaturacji31,33,34,35. Prezentowany protokół wykorzystuje te cechy natywnego PAGE i wykrywa zarówno monomeryczne, jak i dimeryczne formy IRF5. Metoda ta jest szczególnie ważna w wykrywaniu wczesnych zdarzeń aktywacji, ponieważ nie ma odpowiedniego dostępnego na rynku przeciwciała, które mogłoby wykryć endogenny fosforylowany IRF5. Wcześniej w kilku opublikowanych badaniach wykorzystano natywną PAGE do oceny dimeryzacji IRF5. Jednak większość tych badań opierała się na nadekspresji egzogennego IRF5 znakowanego epitopem w celu analizy stanu aktywacji2,13,24,36,37. W niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku protokół analizy endogennej dimeryzacji IRF5 za pomocą zmodyfikowanej natywnej techniki PAGE w linii ludzkich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC), w której wykazano, że aktywność IRF5 jest kluczowa dla jej funkcji1,38,39,40. Ta sama technika została zastosowana do innych linii komórkowych23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Opisany tutaj protokół wykorzystuje linię komórkową pDC CAL-1 potraktowaną resikwimodem (R848), agonistą TLR7/8. Protokół ten został zastosowany do innych typów komórek ludzkich i mysich, w tym RAW 264.7 (mysia linia makrofagów), THP-1 (ludzka linia komórek monocytowych), BJAB (ludzka linia komórek B), Ramos (ludzka linia komórek B) i MUTZ-3 (ludzka linia komórek dendrytycznych)23.

1. Stymulacja komórek CAL-1

  1. Utrzymuj hodowle komórek CAL-1 w kolbie T75 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sterylnych warunkach z 20−25 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 25 mM HEPES i 1x merkaptoetanolu (tj. kompletnej pożywki RPMI 1640).
  2. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    nuta: Komórki CAL-1 nie przylegają. W przypadku przylegających typów komórek można przeprowadzić standardową trypsynizację w celu pobrania komórek.
  3. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 8 ml kompletnej pożywki RPMI 1640, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową.
  4. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Zasiać komórki o gęstości 1 x 106 komórek na studzienkę na płytce 6-dołkowej z 4 ml podgrzanej, kompletnej pożywki RPMI 1640 w każdym dołku. Inkubować przez 20-24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby konfluencja osiągnęła 90%-95% (co odpowiada około 1,5 x 106 komórek).
  5. Stymuluj komórki, dodając 4 μl 1 mg/ml R848 na dołek płytki 6-dołkowej (końcowe stężenie 1 μg/ml). Skonfiguruj również niestymulowaną studzienkę kontrolną z komórkami bez leczenia R848.
  6. Upewnij się, że R848 jest równomiernie rozprowadzony, delikatnie kołysząc płytką na boki. Następnie inkubować komórki przez 2-16 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

2. Ekstrakcja białek komórkowych

  1. Przenieść zawiesiny komórek z płytki 6-dołkowej do probówek wirówkowych o pojemności 5 ml.
  2. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny jednokomórkowej.
  3. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  4. Wirować krótko w temperaturze 12 000 x g przez 0,5−1 min w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant.
  5. Przygotować bufor do lizy zawierający 6,25 ml 1 M Tris-HCl pH 7,4 (końcowe stężenie 25 mM), 7,5 ml 5 M NaCl (końcowe stężenie 150 mM), 0,5 ml 0,5 M EDTA (końcowe stężenie 1 mM), 2,5 ml NP-40 (końcowe stężenie 1%) i 7,5 ml glicerolu (końcowe stężenie 5%) w 250 ml wody dejonizowanej (ddH2O). Dodaj jednorazowy koktajl 100x inhibitora proteazy do końcowego stężenia 1x do buforu do lizy tuż przed użyciem. Przygotowany bufor do lizy należy przechowywać na lodzie.
    nuta: Bufor do lizy bez proteazy może być przechowywany w temperaturze 4 °C.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 30 μl lodowatego buforu do lizy i mieszać, pipetując w górę i w dół.
  7. Inkubować na lodzie przez 15−20 min.
  8. Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g przez 15−20 min w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj ekstrakty na lodzie przez cały czas.
    nuta: Lizaty komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Nie gotować próbek.
  9. Zmierz stężenie białka za pomocą odczynnika Bradforda.

3. Analiza dimeryzacji IRF5 według natywnej STRONY

  1. Przygotować do elektroforezy w górnej (-) i dolnej (+) komorze. Bufor górnej komory składa się z 0,3% deoksycholanu sodu (NaDOC) w 1x natywnym buforze do pracy PAGE, a dolna komora składa się tylko z 1x natywnego bufora uruchomionego PAGE.
    nuta: Przygotuj świeży bufor górnej komory dla każdego nowego przebiegu.
  2. Dokładnie spłucz 3%-12% natywny żel PAGE wodą, nie zniekształcając studzienek. Umieść żel w mini zbiorniku na żel i wyjmij grzebień. Żel należy rozprowadzić w chłodni o temperaturze 4 °C lub na lodzie pod napięciem 150 V przez 30 minut
    nuta: Wstępne uruchamianie usuwa nadmiar jonów amoniaku i nadsiarczanowych, które mogą zakłócać działanie żelu.
  3. Podczas przebiegu wstępnego przygotuj próbki do obciążenia, mieszając białka komórkowe trzymane na lodzie z 4x natywnym buforem próbki.
  4. Po przebiegu wstępnym załadować 10−15 μg białka o końcowej objętości 10−15 μl na próbkę.
    nuta: Przeciążenie białkiem może powodować rozmazywanie.
  5. Uruchom żel pod napięciem 85 V przez 30 minut, a następnie 150 V przez 2 godziny.
    nuta: Biorąc pod uwagę różnice w sprzęcie i liniach komórkowych używanych przez różne laboratoria, niewielkie modyfikacje stężenia próbek białek, napięcia i czasu pracy mogą być odpowiednie do optymalizacji tego protokołu. Obniżenie napięcia przed uruchomieniem i podczas pracy przy jednoczesnym wydłużeniu czasu pracy może pomóc w poprawie rozdzielczości dimerów i spójności wyników.
  6. Namocz żel w buforze do biegania SDS (25 mM Tris pH 8,3, 250 mM glicyny, 0,1% SDS) przez 30 minut w temperaturze RT.
    nuta: Nie jest wymagane mieszanie. Czasami intensywność pasma może nie być proporcjonalna do ilości załadowanego białka z powodu nieefektywnego transferu w obecności deoksycholanu (DOC), który wpływa głównie na monomeryczną formę IRF5. Moczenie żelu w buforze SDS przed transferem rozwiązuje ten problem. Żel jest delikatny. Z pelencją należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością od dolnego (tj. o wyższym procencie) końca żelu.

4. Analiza immunoblot IRF5

  1. Aktywuj membranę z polifluorku winylidenu (PDVF), mocząc ją w metanolu na około 5 minut.
  2. Wykonaj nacięcie w jednym rogu membrany, aby wskazać jej orientację. Zmontuj kanapkę transferową zgodnie z sekwencyjną kolejnością wyszczególnioną w protokole producenta ze szczególną ostrożnością, aby upewnić się, że nie zostały w niej uwięzione pęcherzyki powietrza.
  3. Umieść kasetę transferową w zbiorniku i przelewaj pod napięciem 20 V przez 1 godzinę na lodzie.
    nuta: Wszystkie inkubacje i mycia wykonuj w kolejnych krokach za pomocą wytrząsarki na biegunach.
  4. Usuń membranę z kasety za pomocą plastikowych kleszczyków po zakończeniu przenoszenia. Zablokuj membranę w buforze blokującym (TBS) na 45 minut przy RT.
    nuta: Bufor TBS z 5% BSA może być również używany jako bufor blokujący.
  5. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem wymienionym w Tabeli 1. Umyj membranę 1x buforem myjącym TBST (20 mM Tris, pH 7,0, 150 mM NaCl i 0,1% Tween 20) przez 3 minuty podczas kołysania. Powtórz pranie 2x.
szt.
RozcieńczenieBufor rozcieńczającyInkubacjaKomentarze
Przeciwciało pierwszorzędowe (anty-IRF5)1/1 000Bufor blokujący TBSNoc w temperaturze 4 °C lub 2 h w temperaturze pokojowejRozcieńczone przeciwciała mogą być ponownie użyte kilka razy, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C w obecności 0,02% azydku sodu.
Przeciwciało drugorzędowe (anty-królik)1/10 000Bufor blokujący TBS45 min w RTRozcieńczone przeciwciała mogą być ponownie użyte kilka razy, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C w obecności 0,02% azydku sodu.
UWAGA: Rozcieńczanie musi być zoptymalizowane, ponieważ różni się w zależności od producenta.

Tabela 1: Specyfikacja przeciwciał stosowanych w procedurze immunoblottingu.

  1. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym wymienionym w tabeli 1. Myć membrany przez 3 minuty w 1x buforze myjącym TBST. Powtórz pranie 2x.
  2. Zeskanuj blot za pomocą odpowiedniego systemu dokumentacji żelu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Immunoblot (IB) z przeciwciałem anty-IRF5 został przeprowadzony na komórkach CAL-1 niestymulowanych lub stymulowanych 1 μg/mL R848 przez 2 godziny (Rysunek 1). Przygotowano lizaty komórkowe i wykonano natywną PAGE. W niestymulowanych komórkach CAL-1 IRF5 wykryto jako pojedyncze prążko na natywnej PAGE, odpowiadające jego formie monomerycznej. Po potraktowaniu komórek CAL-1 R848 przez 2 godziny, poziom monomeru IRF5 zmniejszył się przy jednoczesnym wzroście akumulacji powoli migrującego pasma, które od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół jest zmodyfikowaną natywną STRONĄ, która rozróżnia zarówno monomeryczne, jak i dimeryczne formy endogennego IRF5. Przeprowadzono niewiele badań donoszących o wykryciu endogennej aktywacji IRF5 przy użyciu specjalistycznej techniki obrazowania cytometrii przepływowej 23,27,28,30. Protokół ten wykorzystuje powszechną technikę oraz powszechne odczynniki i narzędzia do oceny ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca była wspierana przez fundusze Fundacji Crouchera i funduszy start-upowych Uniwersytetu Miejskiego. Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Chow za pomoc w eksperymencie i krytyczną lekturę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-MerkaptoetanolLife Technologies, HK21985023
Zasilacz 300 W/250 V 230 V ACLife Technologies, HKPS0301
Przeciwciało anty-IRF5Bethyl Laboratories, USAA303-385
BIOSAN Rocker Shaker (bezpieczny w chłodniach)EcoLife, HKMR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0,5 M 4x 100 mLLife Technologies
Glicerol 500 mlLife Technologies15514011
GlycineLife Technologies, HK15527013
Kozie przeciwciało przeciw mysim IgG DyLight 800 Sprzężone przeciwciałoLAB-A-PORTER/Rockland, HK610-145-002-0,5
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG DyLight 800LAB-A-PORTER/Rockland, HK611-145-002-0,5
Koktajl inhibitorów proteazy Halt (100x)Thermo Fisher Scientific, HK78430
HEPESLife Technologies, HK15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS)Gene Company, HK927-50000
Zestaw modułów Mini Tank blot; Moduł transferowy, akcesoriaLife Technologies, HKNW2000
NativePAGE 3-12% żele, zestaw 10 dołkówLife Technologies, HKBN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20xLife Technologies, HKBN2001
NativePAGE Sample Buffer 4xLife Technologies, HKBN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethyle GlycolTin Hang/ Calbiochem, HK#492016-100ML
PBS 7.4Life Technologies, HK10010023
Biogen z membraną z polifluorku winylidenu (PVDF)/Merck Millipore, HKIPFL00010
Zestaw do oznaczania białek II (BSA)Bio-Rad, HK5000002
R848Invivogen, HKtlrl-r848
RPMI 1640Life Technologies, HK
Chlorek soduThermoFisherBP358-1
Deoksycholan sodu ≥ 97% (miareczkowanie)Tin Hang/Sigma, HKD6750-100G
TrisLife Technologies, HK15504020
TWEEN 20Tin Hang/Sigma, HK#P9416-100ML
1557502061870127

Bibliografia

  1. Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
  2. Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).
  3. Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).
  4. Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360(2013).
  5. Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8 (1), 1789(2018).
  6. Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).
  7. Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).
  8. Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).
  9. Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).
  10. Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).
  11. Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).
  12. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).
  13. Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).
  14. McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).
  15. Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).
  16. Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).
  17. Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).
  18. Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).
  19. del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).
  20. Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
  21. Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10 (1), 1349(2019).
  22. Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).
  23. Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).
  24. Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).
  25. Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7 (3), 33098(2012).
  26. Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).
  27. Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).
  28. De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938(2017).
  29. Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).
  30. Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).
  31. Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
  32. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
  33. Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).
  34. Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002(1970).
  35. Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochemistry. 43 (35), 11248-11254 (2004).
  36. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).
  37. Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).
  38. Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).
  39. Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).
  40. Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Natywna elektroforeza w elu Native PAGEkom rki CAL 1elektroforeza bia ekWestern blotlizowanie kom rekdetekcja przeciwcia ami

Powiązane artykuły