Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Analiza immunoblot endogennej dimeryzacji IRF5

Summary

Opisano natywną metodę Western blot do analizy dimeryzacji endogennego czynnika regulacyjnego interferonu 5 w linii komórek dendrytycznych plazmocytoidu CAL-1. Protokół ten można również zastosować do innych linii komórkowych.

Abstract

Czynnik regulacyjny interferonu 5 (IRF5) jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym regulującym odpowiedź immunologiczną. Jest aktywowany poniżej szlaku sygnałowego genu odpowiedzi pierwotnej 88 receptora szpikowego Toll-like (TLR-MyD88). Aktywacja IRF5 obejmuje fosforylację, dimeryzację, a następnie translokację z cytoplazmy do jądra, co z kolei indukuje ekspresję genów różnych cytokin prozapalnych. Test detekcji aktywacji IRF5 jest niezbędny do badania funkcji IRF5 i jego odpowiednich szlaków. W tym artykule opisano solidny test do wykrywania endogennej aktywacji IRF5 w linii ludzkich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) CAL-1. Protokół składa się ze zmodyfikowanego testu elektroforezy niedenaturującej, który może odróżnić IRF5 w postaci monomerów i dimerów, zapewniając w ten sposób niedrogie i czułe podejście do analizy aktywacji IRF5.

Introduction

Czynnik regulacyjny interferonu 5 (IRF5) jest ważnym regulatorem transkrypcji, który odgrywa znaczącą rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej, szczególnie w uwalnianiu cytokin prozapalnych i interferonów typu I (IFN)^1,2,3. Nieprawidłowa regulacja IRF5 jest czynnikiem przyczyniającym się do wielu chorób autoimmunologicznych, o czym świadczą różne polimorfizmy w locus IRF5, które są związane z toczniem rumieniowatym układowym, stwardnieniem rozsianym, reumatoidalnym zapaleniem stawów itp.^4,5,

Protocol

UWAGA: Opisany tutaj protokół wykorzystuje linię komórkową pDC CAL-1 potraktowaną resikwimodem (R848), agonistą TLR7/8. Protokół ten został zastosowany do innych typów komórek ludzkich i mysich, w tym RAW 264.7 (mysia linia makrofagów), THP-1 (ludzka linia komórek monocytowych), BJAB (ludzka linia komórek B), Ramos (ludzka linia komórek B) i MUTZ-3 (ludzka linia komórek dendrytycznych)²³.

1. Stymulacja komórek CAL-1

1. Utrzymuj hodowle komórek CAL-1 w kolbie T75 w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w sterylnych warunkach z 20−25 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 5% płodowej surowicy bydl....

Results

Immunoblot (IB) z przeciwciałem anty-IRF5 został przeprowadzony na komórkach CAL-1 niestymulowanych lub stymulowanych 1 μg/mL R848 przez 2 godziny (Rysunek 1). Przygotowano lizaty komórkowe i wykonano natywną PAGE. W niestymulowanych komórkach CAL-1 IRF5 wykryto jako pojedyncze prążko na natywnej PAGE, odpowiadające jego formie monomerycznej. Po potraktowaniu komórek CAL-1 R848 przez 2 godziny, poziom monomeru IRF5 zmniejszył się przy jednoczesnym wzroście akumulacji powoli migrującego pasma, które od.......

Discussion

Opisany tutaj protokół jest zmodyfikowaną natywną STRONĄ, która rozróżnia zarówno monomeryczne, jak i dimeryczne formy endogennego IRF5. Przeprowadzono niewiele badań donoszących o wykryciu endogennej aktywacji IRF5 przy użyciu specjalistycznej techniki obrazowania cytometrii przepływowej 23,27,28,30. Protokół ten wykorzystuje powszechną technikę oraz powszechne odczynniki i narzędzia do oceny .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Merkaptoetanol	Life Technologies, HK	21985023
Zasilacz 300 W/250 V 230 V AC	Life Technologies, HK	PS0301
Przeciwciało anty-IRF5	Bethyl Laboratories, USA	A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (bezpieczny w chłodniach)	EcoLife, HK	MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0,5 M 4x 100 mL	Life Technologies
Glicerol 500 ml	Life Technologies	15514011
Glycine	Life Technologies, HK	15527013
Kozie przeciwciało przeciw mysim IgG DyLight 800 Sprzężone przeciwciało	LAB-A-PORTER/Rockland, HK	610-145-002-0,5
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG DyLight 800	LAB-A-PORTER/Rockland, HK	611-145-002-0,5
Koktajl inhibitorów proteazy Halt (100x)	Thermo Fisher Scientific, HK	78430
HEPES	Life Technologies, HK	15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS)	Gene Company, HK	927-50000
Zestaw modułów Mini Tank blot; Moduł transferowy, akcesoria	Life Technologies, HK	NW2000
NativePAGE 3-12% żele, zestaw 10 dołków	Life Technologies, HK	BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x	Life Technologies, HK	BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x	Life Technologies, HK	BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethyle Glycol	Tin Hang/ Calbiochem, HK#	492016-100ML
PBS 7.4	Life Technologies, HK	10010023
Biogen z membraną z polifluorku winylidenu (PVDF)	/Merck Millipore, HK	IPFL00010
Zestaw do oznaczania białek II (BSA)	Bio-Rad, HK	5000002
R848	Invivogen, HK	tlrl-r848
RPMI 1640	Life Technologies, HK
Chlorek sodu	ThermoFisher	BP358-1
Deoksycholan sodu ≥ 97% (miareczkowanie)	Tin Hang/Sigma, HK	D6750-100G
Tris	Life Technologies, HK	15504020
TWEEN 20	Tin Hang/Sigma, HK	#P9416-100ML