Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp

.

Streszczenie

Zależne od ubikwityny (ub) i ubikwityny (ubl) potranslacyjne modyfikacje białek odgrywają fundamentalne biologiczne role regulacyjne w komórce, kontrolując stabilność, aktywność, interakcje i lokalizację wewnątrzkomórkową. Umożliwiają one komórce reagowanie na sygnały i dostosowywanie się do zmian w jej otoczeniu. Zmiany w tych mechanizmach mogą prowadzić do poważnych sytuacji patologicznych, takich jak choroby neurodegeneracyjne i nowotwory. Celem opisanej tutaj techniki jest szybkie i dokładne ustalenie profili PTM zależnych od ub/ubls na podstawie hodowanych linii komórkowych. Porównanie różnych profili uzyskanych w różnych warunkach pozwala na identyfikację konkretnych zmian, takich jak te wywołane na przykład przez leczenie. Transdukcja komórkowa za pośrednictwem lentiwirusa jest wykonywana w celu wytworzenia stabilnych linii komórkowych wyrażających dwuznacznikową (6His i Flag) wersję modyfikatora (ubikwityny lub ubl, takiego jak SUMO1 lub Nedd8). Znaczniki te umożliwiają oczyszczanie komórek z ubikwityny, a tym samym z ubikwitynowanych białek. Odbywa się to poprzez dwuetapowy proces oczyszczania: pierwszy jest wykonywany w warunkach denaturacji przy użyciu tagu 6His, a drugi w warunkach natywnych przy użyciu znacznika Flag. Prowadzi to do wysoce specyficznej i czystej izolacji zmodyfikowanych białek, które są następnie identyfikowane i częściowo oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii cieczowej, a następnie technologii tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS). Łatwa analiza informatyczna danych MS za pomocą oprogramowania Excel umożliwia tworzenie profili PTM poprzez eliminację sygnałów tła. Profile te są porównywane między każdym schorzeniem w celu zidentyfikowania konkretnych zmian, które następnie zostaną zbadane bardziej szczegółowo, zaczynając od ich walidacji za pomocą standardowych technik biochemicznych.

Wprowadzenie

Proponowana tutaj metoda jest dedykowana do badania PTM, w których pośredniczą członkowie rodziny ubikwityny z hodowanych komórek ssaków, w celu zidentyfikowania potencjalnych zmian związanych z konkretnym stanem (leczenie, różnicowanie, itp.). PTM reprezentują ostatni etap regulacji funkcji białek¹. Rzeczywiście, po wytworzeniu przez maszynerię translacyjną, większość, jeśli nie wszystkie białka przechodzą różne rodzaje PTM, które modulują ich aktywność, interakcje molekularne i lokalizację wewnątrzkomórkową¹. Wśród mnóstwa PTM znajdują się te, w których pośredniczy rodzina białek ubikwityny, sama ubikwityna i wszystkie ubikwityny podobne, mają potencjał do regulowania wszystkich białek wewnątrzkomórkowych lub częściowo cytoplazmatycznych². Ponieważ same w sobie są białkami, mogą być sprzężone ze sobą, tworząc jednorodne i heterogeniczne łańcuchy o różnych topologiach, z których każda jest związana z określonymi funkcjami regulacyjnymi². Potrzebne są narzędzia, które pozwolą rozszyfrować i zrozumieć tę skomplikowaną maszynerię. Na całym świecie opracowano wiele podejść, które mają swoje zalety i wady, a tutaj proponujemy jedno o wysokiej wydajności, odpowiednie dla hodowanych komórek.

Główną zaletą tej metody jest jej dokładność. Rzeczywiście, czystość izolowanych zmodyfikowanych białek jest znacznie poprawiona przez kombinatoryczne użycie dwóch znaczników (6His i Flag) oraz procedury dwuetapowej, a zatem jest znacznie bardziej selektywna niż fuzja pojedynczego znacznika Ub/Ubl^3,4. Obecność znacznika 6His umożliwia pierwszy etap oczyszczania w stanie pełnej denaturacji, unikając w ten sposób jakiegokolwiek współoczyszczania białek zawierających domeny wiążące ubikwitynę lub innych białek wiążących się z ubikwitynowanymi. Jest to problem techniczny, na który napotyka kilka innych podejść opartych na oczyszczaniu powinowactwa ubikwitynowanych proteomów przy użyciu specyficznych przeciwciał⁵ lub tandemowych elementów wiążących ubikwitynę (TUBEs)⁶. Co ważne, technika ta nie jest stronnicza na korzyść oczyszczania określonego rodzaju ubikwitynacji, jak może to mieć miejsce w przypadku niektórych innych podejść, ponieważ zidentyfikowano zarówno mono, jak i różne rodzaje poliubikwitynacji⁷. W związku z tym, raz znaleziona zmiana ubikwitynacji będzie musiała zostać zbadana bardziej szczegółowo za pomocą standardowych metod biochemicznych w celu zidentyfikowania dokładnego rodzaju ubikwitynacji.

Na koniec, kolejną techniczną zaletą tego protokołu jest użycie lentiwirusów, które łatwo i szybko tworzą stabilne linie komórkowe o rozsądnym poziomie ekspresji oznaczonego modyfikatora, nie zakłócając normalnego zachowania komórki.

Podczas gdy jedną z ważnych ról ubikwitynacji jest ukierunkowanie białek na degradację proteasomalną, obecnie wiadomo, że ma ona wiele innych właściwości regulacyjnych dla potencjalnie większości białek wewnątrzkomórkowych lub częściowo wewnątrzkomórkowych¹. Liczba tych funkcji jest dodatkowo zwiększona przez istnienie wielu białek podobnych do ubikwityny, tworzących rodzinę białek regulujących prawie wszystkie mechanizmy komórkowe¹. Ich zmiany mogą mieć drastyczny wpływ na biologię komórki i mogą prowadzić do patologicznych sytuacji lub brać w nich udział⁸, takich jak rak⁹. W związku z tym potrzebne są narzędzia do zbadania tego rozległego krajobrazu i zidentyfikowania zmian związanych ze stanem patologicznym, które mogą służyć jako nowe cele terapeutyczne.

Ten protokół jest dedykowany komórkom w hodowli, ponieważ muszą one być transdukowane, aby wyrażały egzogenne oznaczone jako Ub/Ubl. Po utworzeniu, te stabilne linie komórkowe mogą być wykorzystane do generowania profili Ubl z hodowli w 2D lub 3D lub ksenoprzeszczepów, rozszerzając w ten sposób horyzont różnych modeli eksperymentalnych, które można zastosować do badania profili PTM.

Protokół

1. Generowanie stabilnych linii komórkowych wyrażających 6His-Flag-Ubl

UWAGA: Współtransfekcja komórek HEK-293T z pCCL-6HF-Ubl, pVSVG i delta-Helper.

1. Dzień 0: Wysiej komórki 293T na 6-dołkowej płytce, aby uzyskać 50-70% konfluencji następnego dnia.
2. Dzień 1: Kotransfekcja 50-70% zbiegających się komórek z mieszanką 1 μg pCCL-6HF-Ubl lub pCCL-GFP, 1 μg pVSVG i 1 μg wektorów delta-Helper, przy użyciu odczynnika do transfekcji i protokołu do produkcji lentiwirusa. Po 6 godzinach od transfekcji zmienić pożywkę na nową, odpowiadającą komórkom, które mają być transdukowane. Zasiej komórki, które mają być transdukowane, na płytce 6-dołkowej, aby uzyskać 10-20% konfluencji następnego dnia (w dniu rozpoczęcia transdukcji).
3. Dzień 2: 24 godziny po transfekcji odzyskać pożywkę zawierającą cząstki lentiwirusa i przefiltrować za pomocą filtrów 0,45 μm. W razie potrzeby w tym momencie dodaj świeżą pożywkę, aby wyprodukować drugą partię lentiwirusów. Zastąp pożywkę komórek, która ma być transdukowana (10-20% konfluencji) tym, które zawiera lentiwirusy.
   UWAGA: Pożywka lentiwirusowa może być przechowywana w temperaturze +4 °C przez kilka dni przed transdukcją lub przechowywana w temperaturze -80 °C przez miesiące.
4. Inkubować komórki z lentiwirusami przez 24 h do 72 h w standardowym inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ), a następnie zmienić pożywkę na świeżą standardową. Jeśli to możliwe, sprawdź ekspresję GFP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby ocenić skuteczność transdukcji: procent ekspresji komórek i względny poziom ekspresji na komórkę. Jeśli nie zostanie wykryta fluorescencja, odczekaj dodatkowe 2-3 dni, ponieważ ekspresja może potrwać dłużej w zależności od typu komórek, które mają być transdukowane.
5. Jeśli kontrola GFP jest dodatnia, hoduj wszystkie komórki, aż będą wystarczające do przeprowadzenia kontroli ekspresji 6HF-Ubl za pomocą immunofluorescencji i Western blot przy użyciu przeciwciała anty-Flag.

2. Podwójne oczyszczanie zmodyfikowanych białek

UWAGA: Bufor 1: 6 M guanidynium-HCl, 0,1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8,0, 0,5% Triton X-100,
Bufor 2: 50 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% glicerol, pH 8,0,
Bufor 3: 100 mM NH₄HCO₃, pH 8,0.

1. Liza komórek: Po przygotowaniu umyć naczynia hodowlane co najmniej raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w temperaturze pokojowej (RT) i przystąpić do lizy komórek lub, alternatywnie, błyskawicznego zamrożenia w cieczy_N2 i przechowywać w temperaturze -80 °C. Do lizy dodać 2 ml buforu 1 na 15-centymetrowe naczynie w temperaturze pokojowej. Użyj skrobaka do komórek, aby odzyskać wszystkie lizaty w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml (końcowa objętość około 20 ml).
2. Sonikuj lizaty trzy razy przez 30 sekund w odstępie 1 minuty.
3. Odwirować sonikowane lizaty przy 15 000 x g przez 15 min.
4. Przenieść supernatant do nowej probówki za pomocą sitka do komórek (40 μm).
5. Oznaczyć stężenie próbek i dostosować, jeśli to konieczne, w celu uzyskania tej samej ilości białek i tej samej objętości. Użyj całkowitej ilości białka od 50 do 100 mg (10 szalek o średnicy 15 cm dla komórek MiaPaCa-2).
6. Dodaj kulki Ni²⁺-NTA, używając 2 μl kulek na 1 mg białka.
7. Obracaj z prędkością 30 obr./min przez 2.5 h przy natężeniu obrotowym.
8. Granuluj kulki w rozmiarze 500 x g przez 5 minut.
9. Umyj kulki 1 ml buforu 1, przenosząc próbki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie przenieś probówki na lód. Wszystkie następne kroki należy wykonać na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
10. Przemyć dwa razy 1 ml lodowatego buforu 2 zawierającego 10 mM imidazolu.
11. W celu wymycia związanych białek dodać 600 μl buforu 2 zawierającego 250 mM imidazolu i obracać przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
Granulki osadzać
12. przez odwirowanie przy 500 x g przez 1 minutę. Przenieść supernatanty do nowych, wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 1,5 ml i dodać 50 μl kulek sprzężonych z przeciwciałem anty-Flag M2.
13. Obracać z prędkością 30 obr./min przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C, następnie przemyć 2 razy 500 μl buforu 2, a następnie 2 razy 500 μl buforu 3.
14. W celu końcowej elucji dodać 100 μl buforu 3 zawierającego peptyd Flag w stężeniu 0,1 μg/μl i obracać w temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny.
15. Wirować przy 500 x g przez 1 minutę i przenieść supernatanty do nowych, wstępnie schłodzonych probówek.
16. Weź 10% (10 μL) do załadowania na SDS-PAGE i wykonaj barwienie żelu srebrem, aby kontrolować jakość oczyszczania. Jeśli oczyszczanie wygląda dobrze, przeanalizuj 90% pozostawione przez LC-MS/MS.

3. Przetwarzanie danych ze spektrometrii mas w celu wygenerowania profili Ub/Ubls PTM i zidentyfikowania istotnych różnic między nimi

UWAGA: Wyniki analizy MS zawierają wiele informacji, w tym całkowitą liczbę peptydów, jak również wartości powierzchni pików (średnia z TOP 3 obszaru peptydów¹⁰) dla każdego białka zidentyfikowanego w każdej próbce. Dane te mogą być przetwarzane przy użyciu liczb peptydów lub wartości obszaru piku, lub obu tych wartości. W przypadku obliczeń z powierzchniami pików, ponieważ wartości te mieszczą się zwykle w zakresie 10⁶, konieczne jest podzielenie ich według tej kolejności przed zastosowaniem tych samych wzorów, co poniżej. Wyniki uzyskane przy zastosowaniu obu metodologii liczenia powinny wykazywać silną korelację, jak to zwykle ma miejsce. Dla każdego zidentyfikowanego białka należy zastosować następujące wzory, gdzie:
v1 wartości peptydów w próbce ubikwityny niepoddanej działaniu substancji (np. Ub - lek)
v2 wartości peptydów w próbce ubikwityny traktowanej gemcytabiną (np. Ub + lek)
k1 wartości peptydów w próbce kontrolnej GFP niepoddanej działaniu substancji (np. GFP - lek)
k2 wartości peptydów w próbce kontrolnej GFP traktowanej gemcytabiną (np. GFP + lek).

1. Normalizacja: Znormalizuj wartości ubikwityny i GFP między komórkami leczonymi lekiem a komórkami nieleczonymi, korzystając z następujących wzorów. Znormalizowane v = V i znormalizowane k = K.
   V1=v1. (∑v1+ ∑v2) / (2. ∑v1) ; V2=v2. (∑v1+ ∑v2) / (2. ∑v2)
   K1=k1. (∑k1+ ∑k2) / (2. ∑k1) ; K2=k2. (∑k1+ ∑k2) / (2. ∑k2)
2. Usuwanie tła: Korzystając z poniższych wzorów, odejmij wartości w próbce kontrolnej (GFP) od wartości w próbce ubikwityny, aby uzyskać określone wartości (V'1 i V'2) dla każdego zidentyfikowanego białka w obu warunkach.
   V'1=V1-K1, jeśli V1-K1≥0 ; V'1=0, jeśli V1-K1<0
   V'2=V2-K2, jeśli V2-K2≥0 ; V'2 = 0, jeśli V2-K2<0
3. Zmienność (Var) ubikwitynacji. Aby uzyskać wynik (od -100 do +100) dla pozytywnych i ujemnych zmian PTM indukowanych przez lek, należy użyć następującego wzoru, w którym różnica między określonymi wartościami próbek poddanych działaniu substancji i niepoddanych działaniu środka dzieli się przez sumę wszystkich wartości, w tym wartości kontrolnych (w celu ukarania białek zidentyfikowanych również w kontrolnej GFP) i pomnóż przez 100,
   var = (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*100 ; -100 Odchylenia poniżej -50 (tłumienie PTM) lub powyżej 50 (indukcja PTM) są zwykle uważane za znaczące.
4. Zaufanie (Conf). Użyj następującej formuły, aby uzyskać wartość ufności z zakresu od 0 do 100%,:
   Conf = ((V1+V2)²/(1+V1+V2+K1+K2)²)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ; =0 jeśli <0
   Wartości powyżej 50 są zwykle uważane za pewne.
5. Aby uzyskać ładniejszy rozkład wartości indukcji/represji i uwzględnić zarówno parametry zmienności, jak i ufności, pomnóż wartości Var i Conf, korzystając z następującego wzoru, gdzie V Var and C Conf
   =SI(V2>0;( (V2*C2)^2)/(10^6);-((V2*C2)^2)/(10^6))
   UWAGA: Ponieważ wartości powierzchni pików są zwykle dokładniejsze niż zliczanie peptydów, możliwe jest użycie specjalnego oprogramowania, które jest dedykowane do interpretacji tego rodzaju danych, takiego jak Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), zgodnie z zaleceniami użytkowania.

Wyniki

Transdukcja komórek ssaków hodowlanych w celu wytworzenia komórek eksprymujących GFP i 6HF-Ub
Aby wytworzyć lentiwirusy, które zostaną później wykorzystane do transdukcji komórek MiaPaCa-2, 70% konfluentnych komórek HEK-293T jest współtransfekowanych z równą ilością trzech wektorów, pCCL-6HF-ubikwityny lub GFP / Delta-Helper / pvSvG. Po 24 godzinach produkcji pożywka zawierająca cząstki lentiwirusa jest odzyskiwana i filtrowana. W tym momencie możliwe jest kontrolowan...

Dyskusja

Opracowaliśmy solidną i wiarygodną metodologię generowania profili białek modyfikowanych przez głównych członków rodziny ubikwityny. Rzeczywiście, z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół do generowania profili PTM za pomocą ubikwityny, a także przez SUMO i Nedd8, oraz do wykrywania zmian związanych z leczeniem⁷, w odpowiedzi na nadekspresję lub knockdown określonego genu (dane nie pokazane) oraz w komórkach, które uzyskały fenotyp oporny na różne leki chemioterapeutyczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	wiąże wszystkie białka znakowane flagą
przeciwciało anty-Flag M2	Sigma-Aldrich	F3165	w celu wykrycia ekspresji znakowanej 6His-Flag filtra siatkowego komórek ub / ubl
40 i mikro; m	Falcon	352350	do usuwania pływającego osadu z komórek lizowanych guanidyną
Peptyd flagowy	Sigma-Aldrich	F3290	elucja flagi oznaczane białka z koralików antyflagowych
Chlorowodorek guanidyny Środek	Sigma-Aldrich	50933	stosowany do denaturacji wszystkich białek w lizacie komórkowym
Imidazol	Sigma-Aldrich	I5513	eliminuje białka wiązania 6His z kulek Ni-NTA
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	do transfekcji komórek HEK-293T w celu produkcji lentiwirusów
Probówki Lobind	Sigma-Aldrich	Z666491	zapobiega wchłanianiu cennego materiału
Filtr membranowy, 0,45 i mikro; m	Millipore	HAWP04700F1	do filtrowania lentiwirusowego supernantantu
Ni-NTA	Qiagen	30210	oczyszczanie znacznika 6His