Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp

.

Streszczenie

Zależne od ubikwityny (ub) i ubikwityny (ubl) potranslacyjne modyfikacje białek odgrywają fundamentalne biologiczne role regulacyjne w komórce, kontrolując stabilność, aktywność, interakcje i lokalizację wewnątrzkomórkową. Umożliwiają one komórce reagowanie na sygnały i dostosowywanie się do zmian w jej otoczeniu. Zmiany w tych mechanizmach mogą prowadzić do poważnych sytuacji patologicznych, takich jak choroby neurodegeneracyjne i nowotwory. Celem opisanej tutaj techniki jest szybkie i dokładne ustalenie profili PTM zależnych od ub/ubls na podstawie hodowanych linii komórkowych. Porównanie różnych profili uzyskanych w różnych warunkach pozwala na identyfikację konkretnych zmian, takich jak te wywołane na przykład przez leczenie. Transdukcja komórkowa za pośrednictwem lentiwirusa jest wykonywana w celu wytworzenia stabilnych linii komórkowych wyrażających dwuznacznikową (6His i Flag) wersję modyfikatora (ubikwityny lub ubl, takiego jak SUMO1 lub Nedd8). Znaczniki te umożliwiają oczyszczanie komórek z ubikwityny, a tym samym z ubikwitynowanych białek. Odbywa się to poprzez dwuetapowy proces oczyszczania: pierwszy jest wykonywany w warunkach denaturacji przy użyciu tagu 6His, a drugi w warunkach natywnych przy użyciu znacznika Flag. Prowadzi to do wysoce specyficznej i czystej izolacji zmodyfikowanych białek, które są następnie identyfikowane i częściowo oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii cieczowej, a następnie technologii tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS). Łatwa analiza informatyczna danych MS za pomocą oprogramowania Excel umożliwia tworzenie profili PTM poprzez eliminację sygnałów tła. Profile te są porównywane między każdym schorzeniem w celu zidentyfikowania konkretnych zmian, które następnie zostaną zbadane bardziej szczegółowo, zaczynając od ich walidacji za pomocą standardowych technik biochemicznych.

Wprowadzenie

Proponowana tutaj metoda jest dedykowana do badania PTM, w których pośredniczą członkowie rodziny ubikwityny z hodowanych komórek ssaków, w celu zidentyfikowania potencjalnych zmian związanych z konkretnym stanem (leczenie, różnicowanie, itp.). PTM reprezentują ostatni etap regulacji funkcji białek¹. Rzeczywiście, po wytworzeniu przez maszynerię translacyjną, większość, jeśli nie wszystkie białka przechodzą różne rodzaje PTM, które modulują ich aktywność, interakcje molekularne i lokalizację wewnątrzkomórkową¹. Wśród mnóstwa PTM znajdują się te, w których pośredniczy rodzina białek ubikwityny, sama ubikwityna i wszystkie ubikwityny podobne, mają potencjał do regulowania wszystkich białek wewnątrzkomórkowych lub częściowo cytoplazmatycznych². Ponieważ same w sobie są białkami, mogą być sprzężone ze sobą, tworząc jednorodne i heterogeniczne łańcuchy o różnych topologiach, z których każda jest związana z określonymi funkcjami regulacyjnymi². Potrzebne są narzędzia, które pozwolą rozszyfrować i zrozumieć tę skomplikowaną maszynerię. Na całym świecie opracowano wiele podejść, które mają swoje zalety i wady, a tutaj proponujemy jedno o wysokiej wydajności, odpowiednie dla hodowanych komórek.

Główną zaletą tej metody jest jej dokładność. Rzeczywiście, czystość izolowanych zmodyfikowanych białek jest znacznie poprawiona przez kombinatoryczne użycie dwóch znaczników (6His i Flag) oraz procedury dwuetapowej, a zatem jest znacznie bardziej selektywna niż fuzja pojedynczego znacznika Ub/Ubl^3,4. Obecność znacznika 6His umożliwia pierwszy etap oczyszczania w stanie pełnej denaturacji, unikając w ten sposób jakiegokolwiek współoczyszczania białek zawierających domeny wiążące ubikwitynę lub innych białek wiążących się z ubikwitynowanymi. Jest to problem techniczny, na który napotyka kilka innych podejść opartych na oczyszczaniu powinowactwa ubikwitynowanych proteomów przy użyciu specyficznych przeciwciał⁵ lub tandemowych elementów wiążących ubikwitynę (TUBEs)⁶. Co ważne, technika ta nie jest stronnicza na korzyść oczyszczania określonego rodzaju ubikwitynacji, jak może to mieć miejsce w przypadku niektórych innych podejść, ponieważ zidentyfikowano zarówno mono, jak i różne rodzaje poliubikwitynacji⁷. W związku z tym, raz znaleziona zmiana ubikwitynacji będzie musiała zostać zbadana bardziej szczegółowo za pomocą standardowych metod biochemicznych w celu zidentyfikowania dokładnego rodzaju ubikwitynacji.

Na koniec, kolejną techniczną zaletą tego protokołu jest użycie lentiwirusów, które łatwo i szybko tworzą stabilne linie komórkowe o rozsądnym poziomie ekspresji oznaczonego modyfikatora, nie zakłócając normalnego zachowania komórki.

Podczas gdy jedną z ważnych ról ubikwitynacji jest ukierunkowanie białek na degradację proteasomalną, obecnie wiadomo, że ma ona wiele innych właściwości regulacyjnych dla potencjalnie większości białek wewnątrzkomórkowych lub częściowo wewnątrzkomórkowych¹. Liczba tych funkcji jest dodatkowo zwiększona przez istnienie wielu białek podobnych do ubikwityny, tworzących rodzinę białek regulujących prawie wszystkie mechanizmy komórkowe¹. Ich zmiany mogą mieć drastyczny wpływ na biologię komórki i mogą prowadzić do patologicznych sytuacji lub brać w nich udział⁸, takich jak rak⁹. W związku z tym potrzebne są narzędzia do zbadania tego rozległego krajobrazu i zidentyfikowania zmian związanych ze stanem patologicznym, które mogą służyć jako nowe cele terapeutyczne.

Ten protokół jest dedykowany komórkom w hodowli, ponieważ muszą one być transdukowane, aby wyrażały egzogenne oznaczone jako Ub/Ubl. Po utworzeniu, te stabilne linie komórkowe mogą być wykorzystane do generowania profili Ubl z hodowli w 2D lub 3D lub ksenoprzeszczepów, rozszerzając w ten sposób horyzont różnych modeli eksperymentalnych, które można zastosować do badania profili PTM.

Protokół

1. Generowanie stabilnych linii komórkowych wykazujących ekspresję 6His-Flag-Ubl

UWAGA: Ko-transfekcja komórek HEK-293T z pCCL-6HF-Ubl, pVSVG i delta-Helper.

1. Dzień 0: Wysiać komórki 293T na płytkę 6-dołkową, aby uzyskać 50-70% konfluencji następnego dnia.
2. Dzień 1: Przeprowadzić kotransfekcję komórek o 50-70% konfluencji mieszanką 1 µg pCCL-6HF-Ubl lub pCCL-GFP, 1 µg pVSVG oraz 1 µg wektorów delta-Helper, stosując odczynnik i protokół transfekcyjny przeznaczony do produkcji lentiwirusów. Po 6 h od transfekcji wymienić pożywkę na świeżą, odpowiadającą typowi komórek przeznaczonych do transdukcji. Wysiać komórki do transdukcji na płytkę 6-dołkową, aby uzyskać 10-20% konfluencji następnego dnia (w dniu rozpoczęcia transdukcji).
3. Dzień 2: 24 h po transfekcji zebrać pożywkę zawierającą cząstki lentiwirusowe i przefiltrować ją przez filtry 0,45 µm. W razie potrzeby w tym momencie dodać świeżą pożywkę, aby uzyskać drugą partię lentiwirusów. Wymienić pożywkę komórek przeznaczonych do transdukcji (10-20% konfluencji) na pożywkę zawierającą lentiwirusy.
   UWAGA: Pożywka lentiwirusowa może być przechowywana w temperaturze +4 °C przez kilka dni przed transdukcją lub w -80 °C przez wiele miesięcy.
4. Inkubować komórki z lentiwirusami od 24 h do 72 h w standardowym inkubatorze (37 °C, 5% CO₂), a następnie wymienić pożywkę na świeżą pożywkę standardową. Jeśli to możliwe, sprawdzić ekspresję GFP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby ocenić wydajność transdukcji: odsetek komórek wykazujących ekspresję oraz względny poziom ekspresji na komórkę. Jeśli nie wykryto fluorescencji, odczekać dodatkowe 2-3 dni, ponieważ ekspresja może trwać dłużej w zależności od typu transdukowanych komórek.
5. W przypadku pozytywnej kontroli GFP hodować wszystkie komórki do czasu uzyskania ilości wystarczającej do przeprowadzenia kontroli ekspresji 6HF-Ubl za pomocą immunofluorescencji i Western blotu z zastosowaniem przeciwciała anty-Flag.

2. Podwójne oczyszczanie zmodyfikowanych białek

UWAGA: Bufor 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0,1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8,0, 0,5% Triton X-10.
Bufor 2: 50 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% glicerolu, pH 8,0.
Bufor 3: 10 mM NH₄HCO₃, pH 8,0.

1. Lizaza komórek: Po przygotowaniu opłukać naczynia hodowlane co najmniej raz solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) w temperaturze pokojowej (RT) i przystąpić do lizy komórek lub alternatywnie zamrozić gwałtownie w ciekłym N₂ i przechowywać w temperaturze -80 °C. W celu lizy dodać 2 mL Buforu 1 na naczynie o średnicy 15 cm w RT. Użyć skrobaka do komórek, aby zebrać wszystkie lizaty do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 mL (objętość końcowa około 20 mL).
2. Poddać lizaty sonikacji trzy razy po 30 s, z 1 min przerwy pomiędzy cyklami.
3. Odwirować sonikowane lizaty przy 15 0 x g przez 15 min.
4. Przenieść nadsącz do nowej probówki, używając sita komórkowego (40 µm).
5. Wyznaczyć stężenie próbek i w razie potrzeby dostosować je, aby uzyskać taką samą ilość białek i taką samą objętość. Użyć całkowitej ilości białka od 50 do 10 mg (10 naczyń o średnicy 15 cm dla komórek MiaPaCa-2).
6. Dodać kuleczki Ni²⁺-NTA, stosując 2 µL kuleczek na 1 mg białka.
7. Inkubować na rotatorze przy 30 rpm przez 2,5 h w RT.
8. Odwirować kuleczki przy 500 x g przez 5 min.
9. Przepłukać kuleczki 1 mL Buforu 1, przenosząc próbki do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, a następnie umieścić probówki na lodzie. Wszystkie kolejne kroki wykonywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
10. Przepłukać dwukrotnie 1 mL schłodzonego do 4 °C Buforu 2 zawierającego 10 mM imidazolu.
11. Aby eluować związane białka, dodać 60 µL Buforu 2 zawierającego 250 mM imidazolu i inkubować na rotatorze przez 2 h w temperaturze 4 °C.
12. Odwirować kuleczki przy 50 x g przez 1 min. Przenieść nadsącze do nowych, schłodzonych wcześniej probówek o pojemności 1,5 mL i dodać 50 µL kuleczek sprzężonych z przeciwciałem anty-Flag M2.
13. Inkubować na rotatorze przy 30 rpm przez 2,5 h w temperaturze 4 °C, następnie przepłukać 2 razy 50 µL Buforu 2, a potem 2 razy 50 µL Buforu 3.
14. W celu końcowej elucji dodać 10 µL Buforu 3 zawierającego peptyd Flag w stężeniu 0,1 µg/µL i inkubować na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 1,5 h.
15. Odwirować przy 50 x g przez 1 min i przenieść nadsącze do nowych, schłodzonych wcześniej probówek.
16. Pobrać 10% (10 µL) do nałożenia na żel SDS-PAGE i przeprowadzić barwienie srebrem w celu kontroli jakości oczyszczania. Jeśli oczyszczanie przebiegło pomyślnie, pozostałe 90% przeanalizować metodą LC-MS/MS.

3. Przetwarzanie danych spektrometrii masowej w celu wygenerowania profili PTM Ub/Ubl oraz identyfikacji istotnych różnic między nimi

UWAGA: Wyniki analizy MS zawierają wiele informacji, w tym całkowitą liczbę peptydów, a także wartości powierzchni piku (średnia powierzchni 3 najważniejszych peptydów)¹⁰) dla każdego białka zidentyfikowanego w każdej próbce. Dane te można przetwarzać, wykorzystując liczbę peptydów, wartości pól powierzchni pików lub obie te metody. W przypadku obliczeń z wykorzystaniem pól powierzchni pików, ponieważ wartości te zazwyczaj mieszczą się w zakresie 10⁶należy podzielić je według tego porządku przed zastosowaniem tych samych wzorów, które podano poniżej. Wyniki uzyskane obiema metodologiami liczenia powinny wykazywać silną korelację, co zazwyczaj ma miejsce. Dla każdego zidentyfikowanego białka należy zastosować następujące wzory, gdzie:
v1 wartości peptydów w niepoddanej działaniu leku próbce ubikwityny (np. Ub – lek)
v2 wartości peptydów w próbce ubikwityny traktowanej gemcytabiną (np. Ub + lek)
k1 wartości peptydów w nieleczonej próbce kontrolnej GFP (np. GFP – lek)
k2 wartości peptydów w próbce kontrolnej GFP traktowanej gemcytabiną (np. GFP + lek).

1. Normalizacja: Znormalizuj wartości pomiędzy komórkami traktowanymi lekiem a komórkami nietraktowanymi dla ubikwityny i GFP, stosując następujące wzory. Wartość znormalizowana v = V oraz wartość znormalizowana k = K.
   V1=v1.(∑v1+ ∑v2) / (2. ∑v1) ; V2=v2.(∑v1+ ∑v2) / (2. ∑v2)
   K1=k1.(∑k1+ ∑k2) / (2. ∑k1) ; K2=k2.(∑k1+ ∑k2) / (2. ∑k2)
2. Usuwanie tła: Korzystając z następujących wzorów, należy odjąć wartości z próbki kontrolnej (GFP) od wartości w próbce ubikwityny, aby uzyskać wartości specyficzne (V'1 i V'2) dla każdego zidentyfikowanego białka w obu warunkach.
   V'1=V1-K1, jeśli V1-K1≥0; V'1=0, jeśli V1-K1 < 0<0
   V'2=V2-K2, jeśli V2-K2≥0; V'2 =0, jeśli V2-K2 < 0<0
3. Wariancja (Var) ubikwitynacji. Aby uzyskać wynik (w zakresie od -10 do +10) dla wariancji pozytywnych i negatywnych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) indukowanych przez lek, należy zastosować następujący wzór, w którym różnicę między konkretnymi wartościami próbek traktowanych i nietraktowanych dzieli się przez sumę wszystkich wartości, wliczając te z grupy kontrolnej (aby ukarać białka zidentyfikowane również w kontroli GFP), a następnie mnoży przez 10.
   Var = (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*10 ; -10 Odchylenia poniżej -50 (represja PTM) lub powyżej 50 (indukcja PTM) są zazwyczaj uznawane za istotne.
4. Poziom ufności (Conf). Aby uzyskać wartość ufności w zakresie od 0 do 10%, należy zastosować następujący wzór:
   Conf = ((V1+V2)²/(1+V1+V2+K1+K2)²)*10 - 10/(1+V'1+V'2) ; =0 jeśli <0
   Wartości powyżej 50 są zazwyczaj uznawane za wiarygodne.
5. Aby uzyskać korzystniejszy rozkład wartości indukcji/represji oraz uwzględnić parametry wariancji i ufności, należy pomnożyć wartości Var i Conf, stosując następujący wzór, w którym V Var i C Konfiguracja
   =JEŻELI(V2>0;((V2*C2)^2)/(10^6);-((V2*C2)^2)/(10^6))
   UWAGA: Ponieważ wartości powierzchni piku są zazwyczaj dokładniejsze niż zliczanie peptydów, możliwe jest zastosowanie specjalistycznego oprogramowania przeznaczonego do interpretacji tego rodzaju danych, takiego jak Perseus (https://www.biochem.mpg.de/51810/perseus), zgodnie z zaleceniami dotyczącymi użytkowania.

Wyniki

Transdukcja hodowli komórek ssaków w celu stworzenia komórek wykazujących ekspresję GFP oraz 6HF-Ub
Aby wytworzyć lentiwirusy, które zostaną później użyte do transdukcji komórek MiaPaCa-2, komórki HEK-293T o 70% konfluencji poddaje się kotransfekcji równą ilością trzech wektorów: pCCL-6HF-Ubiquitin lub GFP/Delta-Helper/pvSvG. Po 24 h produkcji odzyskuje się i filtruje pożywkę zawierającą cząsteczki lentiwirusowe. Na tym etapie możliwe jest sprawdzenie wydajności trans...

Dyskusja

Opracowaliśmy solidną i wiarygodną metodologię generowania profili białek modyfikowanych przez głównych członków rodziny ubikwityny. Rzeczywiście, z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół do generowania profili PTM za pomocą ubikwityny, a także przez SUMO i Nedd8, oraz do wykrywania zmian związanych z leczeniem⁷, w odpowiedzi na nadekspresję lub knockdown określonego genu (dane nie pokazane) oraz w komórkach, które uzyskały fenotyp oporny na różne leki chemioterapeutyczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	wiąże wszystkie białka znakowane flagą
przeciwciało anty-Flag M2	Sigma-Aldrich	F3165	w celu wykrycia ekspresji znakowanej 6His-Flag filtra siatkowego komórek ub / ubl
40 i mikro; m	Falcon	352350	do usuwania pływającego osadu z komórek lizowanych guanidyną
Peptyd flagowy	Sigma-Aldrich	F3290	elucja flagi oznaczane białka z koralików antyflagowych
Chlorowodorek guanidyny Środek	Sigma-Aldrich	50933	stosowany do denaturacji wszystkich białek w lizacie komórkowym
Imidazol	Sigma-Aldrich	I5513	eliminuje białka wiązania 6His z kulek Ni-NTA
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	do transfekcji komórek HEK-293T w celu produkcji lentiwirusów
Probówki Lobind	Sigma-Aldrich	Z666491	zapobiega wchłanianiu cennego materiału
Filtr membranowy, 0,45 i mikro; m	Millipore	HAWP04700F1	do filtrowania lentiwirusowego supernantantu
Ni-NTA	Qiagen	30210	oczyszczanie znacznika 6His

chaotropowy