Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcja in vitro przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi

DOI:

10.3791/60422

⸱

26 listopada 2019

 ,  , 
1Department of Zoology, The University of British Columbia, 2Life Sciences Institute, The University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożoność tkanek systemów wielokomórkowych utrudnia identyfikację związku przyczynowego między sygnałami zewnątrzkomórkowymi a indywidualnymi zachowaniami komórek. W tym miejscu przedstawiamy metodę badania bezpośredniego związku między wskazówkami zależnymi od kontaktu a osiami podziału przy użyciu blastomerów zarodkowych C. elegans i adhezyjnych kulek polistyrenowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W systemach wielokomórkowych, pojedyncze komórki są otoczone różnymi fizycznymi i chemicznymi sygnałami pochodzącymi z sąsiednich komórek i środowiska. Ta złożoność tkanki utrudnia identyfikację związku przyczynowego między sygnałami zewnętrznymi a dynamiką komórkową. Syntetycznie odtworzony system wielokomórkowy rozwiązuje ten problem, umożliwiając naukowcom testowanie pod kątem określonej wskazówki, jednocześnie eliminując inne. W tym miejscu przedstawiamy metodę odtwarzania wzorców kontaktowych komórek za pomocą izolowanych blastomerów Caenorhabditis elegans i adhezyjnych kulek polistyrenowych. Zabiegi obejmują usunięcie skorupki jaja, izolację blastomerów poprzez przerwanie adhezji komórka-komórka, przygotowanie adhezyjnych kulek polistyrenowych oraz odtworzenie kontaktu komórka-komórka lub komórka-kulka. Na koniec przedstawiono zastosowanie tej metody do badania orientacji osi podziału komórkowego, która przyczynia się do regulacji przestrzennego wzorca komórkowego i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach. Ta solidna, powtarzalna i wszechstronna metoda in vitro umożliwia badanie bezpośrednich relacji między przestrzennymi wzorcami kontaktu komórek a reakcjami komórkowymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas rozwoju wielokomórkowego, zachowania komórkowe (np. oś podziału) poszczególnych komórek są określane przez różne chemiczne i fizyczne wskazówki. Zrozumienie, w jaki sposób poszczególni komórki interpretują te informacje i jak regulują składanie się wielu komórek jako właściwość emergentną, jest jednym z ostatecznych celów badań morfogenezy. Organizm modelowy C. elegans znacząco przyczynił się do zrozumienia regulacji morfogenezy na poziomie komórkowym, takich jak polaryzacja komórek1, wzorzec podziału komórek1, cell fate decision2 oraz regulacje skali tkankowej, takie jak okablowanie neuronalne3 i organogeneza4,5. Chociaż dostępnych jest wiele narzędzi genetycznych, metody inżynierii tkankowej są ograniczone.

Najbardziej udaną metodą inżynierii tkankowej w badaniu C. elegans jest klasyczna izolacja blastomerów6; ponieważ zarodek C. elegans jest otoczony skorupką jaja i barierą przepuszczalności7, ich usunięcie jest jedną z głównych procedur tej metody. Chociaż ta metoda izolacji blastomerów umożliwia odtworzenie kontaktu komórka-komórka w uproszczony sposób, nie pozwala na eliminację niepożądanych sygnałów; Kontakt z komórką nadal stwarza zarówno mechaniczne (np. adhezja), jak i chemiczne wskazówki, ograniczając w ten sposób naszą zdolność do pełnej analizy związku przyczynowego między wskazówką a zachowaniem komórki.

Metoda przedstawiona w tym artykule wykorzystuje modyfikowane karboksylami kulki polistyrenowe, które mogą kowalencyjnie wiązać się z dowolnymi cząsteczkami amino-reaktywnymi, w tym białkami jako ligandami. W szczególności użyliśmy reagującej z aminą formy Rhodamine Red-X jako liganda, aby koraliki były zarówno wizualnie śledzone, jak i przyklejane do komórki. Grupy karboksylowe powierzchni kulki i pierwszorzędowych grup aminowych cząsteczki liganda są sprzężone rozpuszczalnym w wodzie karbodimidem 1-etylo-3-(dimetyloaminopropylo)karbodimidem (EDAC)8,9. Otrzymane kulki adhezyjne pozwalają na uwzględnienie wpływu mechanicznej wskazówki na dynamikę komórkową10. Użyliśmy tej techniki do zidentyfikowania wskazówek mechanicznych wymaganych do orientacji podziału komórki10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie kleju do polistyrenu

UWAGA: Ten protokół nie wymaga techniki aseptycznej.

  1. Odważyć 10 mg kulek polistyrenowych modyfikowanych karboksylanem w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Aby umyć kulki, dodaj 1 ml buforu kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) do probówki. Ponieważ bufor MES nie zawiera fosforanów i octanów, które mogą zmniejszać reaktywność karbokodiymidu, nadaje się do stosowania w reakcji sprzęgania białek. Obracaj rurkę, aby wymieszać koraliki.
  3. Wirować probówkę przez 60 s przy 2 000 x g za pomocą wirówki stołowej.
  4. Odrzucić sklarowany nad osadem, ostrożnie odmierzając bufor.
  5. Ponownie umyj kulki 1 ml buforu MES, wykonując czynności 1.2-1.4.
  6. Dodać 1 ml buforu MES zawierającego 10 mg EDAC do probówki, aby aktywować powierzchniowe grupy karboksylowe. Obracaj rurkę, aby wymieszać koraliki.
  7. Obracać i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Wiruj koraliki przez 60 s przy 2,000 x g.
  9. Odrzucić sklarowany nad osadem, ostrożnie odmierzając bufor.
  10. Aby umyć kulki, dodaj 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do probówki. Obracaj rurkę, aby wymieszać koraliki.
  11. Wiruj rurkę przez 60 s przy 2,000 x g.
  12. Odrzucić sklarowany nad osadem, ostrożnie odmierzając bufor.
  13. Ponownie umyj koraliki 1 ml PBS, wykonując czynności 1.10-1.12.
  14. Ostateczne stężenie użytej rodaminy będzie zależało od obrazowanego szczepu. Przygotować 1 ml serii 1-, 100- i 1000-krotnych rozcieńczeń Rhodamine Red-X z 0,65 mM roztworu podstawowego Rhodamine Red-X.
  15. Odpipetować 20 μl kulek do każdej probówki do rozcieńczania szeregowego.
  16. Obracać i inkubować probówkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  17. Umyj koraliki dwukrotnie 1 ml PBS, powtarzając kroki 1.10-1.12.
  18. Dodać 1 ml PBS do probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 tygodni. Sprawdź intensywność fluorescencji koralików pod mikroskopem używanym do obrazowania na żywo. Odpowiednie stężenie estru sukcynimidylowego Rhodamine Red-X zależy od warunków obrazowania (Rysunek 1).
    UWAGA: Koraliki bez obróbki Rhodamine Red-X nie przylegają do komórek. Rodamina Red-X służy zarówno jako marker fluorescencji, jak i cząsteczka adhezyjna. Oddziaływanie elektrostatyczne między dodatnio naładowaną rodaminą Red-X a ujemnie naładowaną błoną plazmatyczną jest przypuszczalną przyczyną adhezji.

2. Montaż pipety do ust

  1. Wytnij szerokie (średnica wewnętrzna 6,35 mm) i wąskie (średnica wewnętrzna 3,175 mm) rurki Tygon odpowiednio na około 25 cm i 40 cm długości (Rysunek 2).
  2. Połącz rurki Tygon z filtrem z politetrafluoroetylenu (PTFE) (wielkość porów 0,2 μm) (Rysunek 2).
  3. Zdemontuj dostępną w handlu rurkę aspiratora i przymocuj jej uchwyt kapilarny i ustnik odpowiednio do końca wąskich i szerokich probówek Tygon (Rysunek 2).
    UWAGA: Filtr PTFE został zastosowany w celu zapobieżenia wdychaniu oparów roztworu podchlorynu przez pipetę doustną.

3. Izolacja blastomeru zarodkowego

UWAGA: Nosić rękawice i fartuch laboratoryjny, aby uniknąć skaleczenia i kontaktu z roztworem wybielającym.

  1. Trzymaj każdy koniec mikrokapilary (pojemność; 10 μl) prawą i lewą ręką.
  2. Pociągnij mikrokapilę w kierunku obu końców, aby wywrzeć napięcie i przesuń środek kapilary nad palnikiem, aby utworzyć dwie ręcznie ciągnięte kapilary (Rysunek 3A).
  3. Przytnij końcówki ręcznie naciągniętych naczyń włosowatych kleszczami pod mikroskopem preparacyjnym i przymocuj wyciągniętą kapilę do aparatu do pipetowania doustnego (Rysunek 2). Przygotuj dwa rodzaje pipet. Rozmiary otworów końcówek dla pipet powinny być w przybliżeniu 2x i 1x krótsze długości zarodków C. elegans (30 μm) odpowiednio do transferu zarodków i usuwania skorupek jaj Rysunek 3B-D).
  4. Odpipetować 45 μl roztworu soli jaja do dołka szkiełka wielodołkowego (Rysunek 4A; na dole).
  5. Umieść 5-10 dorosłych C. elegans w studzience zawierającej roztwór soli jajecznej.
  6. Aby uzyskać wczesne zarodki C. elegans, pokrój dorosłe osobniki na kawałki, umieszczając dwie igły po prawej i lewej stronie ciała C. elegans i przesuwając igły obok siebie (Rysunek 4A; górne schematy).
  7. Pobrać pipetą 45 μl roztworu podchlorynu do studzienki obok studzienki zawierającej roztwór soli jaj (Rysunek 4B).
  8. Odpipetować 45 μl pożywki wzrostowej Sheltona do kolejnych trzech studzienek obok studzienki zawierającej roztwór podchlorynu (Rysunek 4B).
  9. Przenieś zarodki w stadium 1-komórkowym i we wczesnym stadium 2-komórkowym do roztworu podchlorynu przez pipetowanie doustne za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków (Rysunek 4B).
  10. Poczekaj 40–55 sekund.
  11. Umyj zarodki, przenosząc je z roztworu podchlorynu do pożywki wzrostowej Sheltona, pipetując doustnie za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków (Rysunek 4B).
  12. Ponownie umyj zarodki, przenosząc je do nowego dołka pożywki Sheltona za pomocą doustnego pipetowania za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków (Ryc. 4B).
  13. Przenieś umyte zarodki do nowego dołka pożywki Sheltona za pomocą doustnego pipetowania za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków. Używając ręcznie narysowanej kapilary do usuwania skorupki jajka, ostrożnie powtórz pipetowanie (Rysunek 4C; środkowy schemat). Jeśli skorupka jaja zostanie pomyślnie usunięta, komórki embrionalne staną się bardziej kuliste (Rysunek 4C; po prawej).
  14. Oddziel blastomery embrionalne w stadium 2-komórkowym, delikatnie i w sposób ciągły pipetując ręcznie narysowaną kapilarą w celu usunięcia skorupki jaja (Rysunek 4D).

4. Odtwarzanie wzorców kontaktowych za pomocą blastomerów i koralików

UWAGA: Pracuj pod mikroskopem obrazowania, aby uniknąć dysocjacji komórki od koralika i ułatwić szybkie uzyskanie obrazu.

  1. Aby prowadzić obserwacje za pomocą mikroskopu odwróconego, przygotuj komorę obrazowania, jak w Rysunek 5.
    1. Umieść szkiełko nakrywkowe na uchwycie szkiełka nakrywkowego (Rysunek 5A).
    2. Zaklej krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby je ustabilizować. Strona z taśmą to strona "tylna" (Rysunek 5A,B).
    3. Odwróć uchwyt na szkiełko nakrywkowe na "przednią" stronę i narysuj okrąg na szkiełku nakrywkowym za pomocą hydrofobowego pisaka (Rysunek 5C).
      UWAGA: Każde naczynie ze szklanym dnem również działa, pod warunkiem, że zarodki można manipulować za pomocą pipety doustnej.
  2. Dodaj pożywkę wzrostową Sheltona w okręgu narysowanym przez marker hydrofobowy (Rysunek 5D).
  3. Przenieś wyizolowany blastomer do komory obrazowania.
  4. Dozuj niewielką objętość chemicznie funkcjonalizowanych kulek za pomocą ręcznie rysowanej kapilary do transferu zarodków.
  5. Kontroluj położenie kulek polistyrenu, wdmuchując je w ręcznie rysowaną kapilę, aż koralik przyczepi się do izolowanego blastomeru.
  6. Zamontuj szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć parowania podłoża (Rysunek 5E). Wykonywanie obrazowania na żywo.

5. Przygotowanie ważnych odczynników

  1. Roztwór soli jaj (10 ml): Połącz 235 μl 5 M NaCl i 240 μl 2 M KCl z 9525 μl dH2O.
  2. Roztwór podchlorynu (10 ml): Połącz 7,5 ml Cloroxu (zawierającego około 7,5% podchlorynu sodu) z 2,5 ml 10 N NaOH (końcowe stężenie podchlorynu sodu wynosi około 5,625%).
    UWAGA: Chociaż wiele opublikowanych metod wykorzystywało chitynazę do trawienia chitynowych skorupek jaj, przyjęliśmy metodę wykorzystującą roztwór podchlorynu11. Unikając różnic w aktywności chitynazy między partiami, uważamy, że metoda ta jest bardziej powtarzalnym i opłacalnym podejściem.
  3. 0,81 mM roztwór inuliny (40 ml)
    1. Dodać 0,2 g inuliny do 40 ml dH2O.
    2. Autoklaw do rozpuszczenia.
      UWAGA: Przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
  4. Bufor MES 0,5 m (500 ml)
    1. Rozpuścić 48,81 g MES w 400 ml wody destylowanej (dH2O).
    2. Dostosuj pH do 6,0.
    3. Doprowadzić całkowitą objętość do 500 ml za pomocą dH2O.
  5. Roztwór PBS (1 l)
    1. Aby przygotować 10-krotny roztwór PBS, rozpuść 1 opakowanie proszku premiksu PBS w 1 l dH2O.
    2. Połączyć 100 ml 10-krotnego roztworu PBS z 900 ml dH2O.
  6. 5% roztwór poliwinylopirolidonu (PVP) (4 ml)
    1. W sterylnych warunkach rozpuść 0,2 g PVP w 4 ml pożywki Drosophila Schneider's Medium.
      UWAGA: Zawsze otwieraj kaptur Schneider Medium do hodowli tkankowych (TC). Przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
  7. 0,65 mM roztworu podstawowego rodaminy Red-X (2 ml)
    1. Odważyć 1 mg Rhodamine Red-X.
    2. Dodać 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do rozpuszczenia.
    3. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  8. Pożywka Sheltona (SGM) (10,25 ml)
    1. W sterylnych warunkach połącz ze sobą 8 ml pożywki Drosophila Schneider's Medium, 1 ml roztworu PVP, 1 ml roztworu inuliny, 1 ml witamin Basal Medium Eagle (BME), 50 μl penicyliny-streptomycyny i 100 μl koncentratu lipidowego.
    2. Porcję 325 μl SGM do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Przechowywać przez około 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
    3. W dniu izolacji blastomerów dodać 175 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do SGM (dla całkowitej objętości 500 μL).
      UWAGA: Przechowywać FBS w temperaturze -20 °C i rozmrozić przed użyciem. FBS nie musi być zabijany cieplnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do przygotowania koralików, określiliśmy optymalną ilość estru sukcynimidylu Rhodamine Red-X dla transgenicznego szczepu eksprymującego GFP-miozynę II i mWiśniowy histon (Rysunek 1A-D). Użyliśmy histonu oznaczonego mCherry jako markera progresji cyklu komórkowego. Ponieważ zarówno Rhodamine Red-X, jak i mCherry będą oświetlane laserem o długości fali 561 nm, optymalna intensywność sygnału Rhodamine Red-X jest porównywalna z intensywnością histonu, co umożliwia jednoczesne obrazowanie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekonstrukcja uproszczonych wzorców kontaktu komórkowego pozwoli naukowcom przetestować rolę określonych wzorców kontaktu komórkowego w różnych aspektach morfogenezy. Użyliśmy tej techniki, aby pokazać, że oś podziału komórki jest kontrolowana przez fizyczny kontakt z kulkami adhezyjnymi10. Ponieważ specyfikacja osi podziału ma kluczowe znaczenie dla rozwoju wielokomórkowego, przyczyniając się do morfogenezy14, podziału komórek macierzystych15,16

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jamesowi Priessowi i Bruce'owi Bowermanowi za rady i udostępnienie szczepów C. elegans, Donowi Moermanowi, Kota Mizumoto i Life Sciences Institute Imaging Core Facility za udostępnienie sprzętu i odczynników, Aoi Hiroyasu, Lisie Fernando, Min Jee Kimowi za utrzymanie C. elegans i krytyczną lekturę naszego rękopisu. Nasza praca jest wspierana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodimiduAlfa AesarAAA1080703Do przygotowania kulek
Zespół rurki aspiratoraDrummond21-180-13Do izolacji blastomerów.
Szczep Caenorhabditis elegans: N2, typ dzikiCaenorhabditis Genetics CenterSzczep N2użyty w tym badaniu
Szczep Caenorhabditis elegans: KSG5, genotyp: zuIs45; itIs37w domuSzczep KSG5użyty w tym badaniu
Kalibrowane Mircopipety, 10 i mikro; LDrummond21-180-13Do izolacji blastomerów
Koraliki polistyrenowe modyfikowane karboksylanem (30 &mikro; m średnicy)KISKER BiotechPPS-30.0COOHPDo przygotowania kulek
CD Lipid ConcentrateLife Technologies11905031Do izolacji blastomerów. Praca w kapturze do hodowli tkankowych.
CloroxCloroxN. A.Do izolacji blastomerów. Otwórz nową butelkę, gdy leczenie podchlorynem nie działa dobrze.
Uchwyt na szkiełko nakrywkowew domuN.A.Do izolacji blastomerów.
Mikroskop preparacyjny: Zeiss Stemi 508 ze statywem M. Źródłem światła jest wbudowana dioda LED. Powiększenie okularu wynosi 10X.Carl ZeissStemi 508Do izolacji blastomerów.
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana jednorazowa strzał, pochodzeniez Kanady GibcoA3160701Do izolacji blastomerów. Praca w kapturze do hodowli tkankowych.
Igły podskórne ogólnego zastosowania i precyzyjnego ślizgu, 25 gaugeBD14-826AADo izolacji blastomerów
InulinaAlfa AesarAAA1842509Do izolacji blastomerów
Roztwór witaminowy MEM (100x)Gibco11120052Do izolacji blastomerów.
MES (drobne białe kryształy)Fisher BioReagentsBP300-100Do przygotowania kulek
Multitest Slide 10 WellMP BiomedicalsICN6041805Do izolacji blastomerów
PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10 x proszekFisher BioReagentsBP665-1Do przygotowania kulek
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco15140148Dla izolacja blastomerów.
PoliwinylopirolidonFisher BioReagentsBP431-100Do izolacji blastomerów
Chlorek potasuBioshopPOC888Do izolacji blastomerów
Rodamina Red-X, ester sukcynimidylowy, 5-izomerowesondy molekularneR6160Do przygotowania kulek
Schneider' s Drosophila Sterile MediumGibco21720024Do izolacji blastomerów. Praca w kapturze do hodowli tkankowych.
Chlorek soduBioshopSOD001Do izolacji blastomerów
Roztwór wodorotlenku sodu, 10 NFisher ChemicalSS255-1Do izolacji blastomerów
Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem: Yokogawa CSU-X1, odwrócony zakres Zeiss Axiovert, kamera Quant EM 512, 63X NA 1.4 Planaryczna soczewka obiektywowa. System był sterowany przez Slidebook 6.0.Innowacja w zakresie inteligentnego obrazowaniaN.A.Do obrazowania na żywo
Filtry strzykawkowe, PTFE, niesterylneBasix13100115Do izolacji blastomerów.
Rurki laboratoryjne Tygon S3,, Formulacja E-3603, Średnica wewnętrzna 3,175 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-862Do izolacji blastomerów.
Rurki laboratoryjne Tygon S3,, Formulacja E-3603, Średnica wewnętrzna 6,35 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-854Do izolacji blastomerów.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).
  4. Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
  5. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
  6. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  7. Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
  8. Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
  9. Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
  10. Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
  11. Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  14. Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
  15. Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
  16. Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  18. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  19. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
  20. Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
  21. Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
  22. Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  23. Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
  24. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
  25. Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624(2015).
  26. Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
  27. Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

C Elegans EmbryoBlastomere IsolationPolystyrene BeadsCell Contact ReconstitutionEggshell RemovalCapillary PreparationFluorescent LabelingLive ImagingSpindle OrientationCell Division Axis

Powiązane artykuły