Artykuł metodologiczny

Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60426

⸱

23 października 2019

 ,  ,  , 
1Paul O'Gorman Leukaemia Research Centre, Institute of Cancer Sciences, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół umożliwia optymalizację i późniejsze efektywne generowanie frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej. Próbki te są wykorzystywane do określenia lokalizacji białek, a także zmian w transporcie białek, które zachodzą między przedziałami jądrowymi i cytoplazmatycznymi po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym.

Streszczenie

Eksport jądrowy makromolekuł jest często deregulowany w komórkach rakowych. Białka supresorowe nowotworu, takie jak p53, mogą stać się nieaktywne z powodu nieprawidłowej lokalizacji komórkowej, która zakłóca ich mechanizm działania. Przeżywalność komórek przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL), wśród innych komórek nowotworowych, jest wspomagana przez deregulację przenoszenia jądrowego do cytoplazmatycznego, przynajmniej częściowo poprzez deregulację receptora transportowego XPO1 i konstytutywną aktywację szlaków sygnałowych za pośrednictwem PI3K. Niezbędne jest zrozumienie roli poszczególnych białek w kontekście ich lokalizacji wewnątrzkomórkowej, aby lepiej zrozumieć rolę takich białek w patobiologii choroby. Co więcej, identyfikacja procesów leżących u podstaw stymulacji komórek i mechanizmu działania określonych inhibitorów farmakologicznych w kontekście subkomórkowego transportu białek zapewni pełniejsze zrozumienie mechanizmu działania. Opisany tutaj protokół umożliwia optymalizację, a następnie efektywne generowanie frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej. Frakcje te można wykorzystać do określenia zmian w transporcie białek między frakcją jądrową i cytoplazmatyczną po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym. Dane można określić ilościowo i przedstawić równolegle z obrazami immunofluorescencyjnymi, zapewniając w ten sposób solidne i wymierne dane.

Wprowadzenie

Transport makrocząsteczek między jądrem a cytoplazmą od dawna odgrywa kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu komórek i często jest deregulowany w komórkach nowotworowych1,2. Taka deregulacja może wynikać z nadekspresji/mutacji białek, które kontrolują eksport jądrowy. Jedno z takich białek, Exportin-1 (XPO1), jest receptorem transportowym, który eksportuje białka zawierające >200 jądrowy sygnał eksportowy (NES) do cytoplazmy z jądra2. Ładunki XPO1 obejmują p53, członków rodziny FOXO i IB, przyczyniając się do ich inaktywacji poprzez hamowanie ich mechanizmu działania1,2,3. Dalsza błędna lokalizacja białek może wystąpić, gdy sygnały mikrośrodowiskowe uderzają w komórki nowotworowe, prowadząc do aktywacji wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, takich jak szlak kinazy fosfatydylo-inozytolo-3 (PI3K)/Akt, co skutkuje inaktywacją członków rodziny FOXO, a następnie eksportem z jądra4,5. Taka błędna lokalizacja białek supresorowych nowotworów jest związana z progresją wielu nowotworów hematologicznych i litych1,2,6.

Rozwój inhibitorów małocząsteczkowych do użytku klinicznego w nowotworach hematologicznych (ostra białaczka szpikowa (AML)/CLL), które wiążą się z funkcją XPO1 i selektywnie ją hamują, podkreśla znaczenie opracowania odpowiednich technik w celu rozwiązania problemu wpływu środków farmakologicznych na przemieszczanie się białek między przedziałami jądrowymi i cytoplazmatycznymi6,7,8. Techniki obrazowania znacznie się rozwinęły, umożliwiając identyfikację białek w przedziałach subkomórkowych po zewnętrznej stymulacji leczenia farmakologicznego, jednak znaczenie solidnych i wspierających technik równoległych ma kluczowe znaczenie dla wiarygodnego informowania odbiorców naukowych o wiarygodności wyników.

Limfocyty spoczynkowe i złośliwe komórki CLL-B wyizolowane z próbek krwi pacjenta stanowią wyzwanie w generowaniu frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych ze względu na wysoki stosunek jądra do cytoplazmy. Optymalizacja warunków eksperymentalnych w celu wygenerowania solidnych i wiarygodnych danych eksperymentalnych ma oczywiście kluczowe znaczenie dla planowania przyszłych programów eksperymentalnych. Opisana tutaj metoda umożliwia ilościowe określenie białek we frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej oraz określenie, w jaki sposób stymulacja komórkowa i/lub leczenie farmakologiczne może wpływać na te białka.

Protokół

Opisane tutaj użycie pierwotnych próbek od pacjentów z PBL zostało zatwierdzone przez West of Scotland Research Ethics Service, NHS Greater Glasgow and Clyde (UK) i wszystkie prace zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.

1. Izolacja komórek PBL z próbek krwi pacjenta

  1. Próbki krwi obwodowej od pacjentów, którzy wcześniej wyrazili zgodę na PBL, są odbierane z kliniki w probówkach do pobierania krwi EDTA, wraz z morfologią białych krwinek (WCC). Oczyść próbki CLL krwi obwodowej zgodnie z WCC. W przypadku WCC <40 x 10 6 komórek/ml przejdź do kroku 1.1.1; w przypadku WCC ≥40 x 10 6 komórek/ml przejdź do kroku 1.1.2.
    1. Wlej zawartość wszystkich probówek z krwią EDTA do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj 50 μl koktajlu wzbogacającego ludzkie komórki B na 1 ml krwi. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut. Przejdź do kroku 1.1.2.
    2. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:1 buforem do przemywania RT CLL (sól buforowana fosforanami (PBS), 0,5% płodowa surowica bydlęca (FBS) i 2 mM EDTA).
  2. Podwielokrotność pożywki o gradiencie gęstości RT do stożkowej probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości dla próbki (10 ml do probówki o pojemności 50 ml na 30 ml próbki lub 4 ml do probówki o pojemności 15 ml na 10 ml próbki).
  3. Ostrożnie ułożyć próbkę warstwowo na pożywce o gradiacji gęstości i odwirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze RT.
    nuta: Upewnij się, że wirówka ma temperaturę toczną przed umieszczeniem próbek w wirówce, ponieważ zmiana temperatury spowoduje słabe wzbogacenie komórek jednojądrzastych i wyłącz hamulec wirówki, ponieważ nagłe hamowanie może zakłócić granicę faz cieczy.
  4. Delikatnie zebrać białą warstwę komórek jednojądrzastych, które gromadzą się na granicy pożywki gradientu gęstości i buforu płuczącego CLL, do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
  5. Dodać 40 ml buforu płuczącego CLL do izolowanej monowarstwy w celu przepłukania komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze suchej masy.
  6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad, przesuwając dno probówki, a następnie powtórzyć etap płukania opisany w kroku 1.5.
  7. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad zgodnie z opisem w kroku 1.6, a następnie ponownie zawiesić osad w ustalonej objętości buforu do płukania CLL (do 40 ml, w zależności od wielkości osadu komórkowego).
  8. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Następnie przystąp do cytometrii przepływowej, aby sprawdzić czystość komórek CLL.
    nuta: Na tym etapie komórki PBL mogą być hodowane w stężeniu 10 x 106 komórek/ml w pożywce do wykorzystania w eksperymentach i/lub kriokonserwowane w 10% dimetylosulfotlenku (DMSO)/FBS do przyszłych prac w stężeniach do 100 x 10,6 komórek/fiolkę.

2. Cytometria przepływowa komórek PBL

  1. Oznaczyć rurki polistyrenowe z okrągłym dnem o wymiarach 12 mm x 75 mm zgodnie z opisem w tabeli 1.
  2. W tubkach 2 – 5 umieść jedną kroplę kulek kompensacyjnych i przechowuj na lodzie. Dodać 1 μl odpowiedniego przeciwciała (anty-CD5, CD19, CD23 lub CD45, jak wskazano w tabeli 1) do probówek 2–5 i inkubować na lodzie przez 20 minut, chroniąc przed światłem, umieszczając folię aluminiową na wiadrze z lodem.
    nuta: Rurki te służą jako elementy sterujące kompensacją do ustawiania matrycy cytometrii przepływowej.
  3. Umieścić do 1 x 106 komórek CLL w probówkach 1, 6 i 7, dodać 2 ml buforu FACS (PBS + 2% FBS) do każdej probówki i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu przepłukania komórek. Odrzucić sklarowany osad i przechowywać probówki zawierające osady komórkowe na lodzie.
    1. Zawiesić osady komórkowe i dodać odpowiednią kombinację przeciwciał do komórek w probówce 7, zgodnie z instrukcjami w tabeli 1, w końcowej objętości 100 μl z buforem FACS. Przeciwciała stosuje się w odpowiednim stężeniu zgodnie z wytycznymi producenta.
    2. Zawiesić osady komórek w probówkach 2 i 6 w 100 μl buforu FACS.
    3. Inkubować komórki na lodzie, wraz z barwionymi kulkami w probówkach 2 – 5, chronić przed światłem przez 20 minut.
  4. Po inkubacji dodać 2 ml buforu FACS do wszystkich probówek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu przemycia komórek. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki/komórki, delikatnie przesuwając probówki.
  5. Ponownie zawiesić probówki 1 - 5 w 100 μl buforu FACS i umieścić na lodzie, aż będą gotowe do analizy na cytometrze przepływowym.
  6. Rozcieńczyć roztwór DAPI do 0,05-0,2 μg/ml w buforze FACS bezpośrednio przed użyciem. Optymalne stężenie może się różnić i zalecane jest miareczkowanie.
  7. Zawiesić probówki 6 i 7 w 100 μl rozcieńczonego roztworu DAPI i inkubować probówki na lodzie przez co najmniej 5 minut, aby umożliwić zabarwienie komórek.
    nuta: Nie jest konieczne dalsze mycie, ponieważ DAPI musi być obecny w buforze, aby martwe komórki pozostały oznakowane. Po dodaniu DAPI komórki należy przeanalizować na cytometrze przepływowym w ciągu 4 godzin.
  8. Analizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.

3. Przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek PBL

UWAGA: Planując przygotowanie eksperymentu, uwzględnij studzienkę z niestymulowanymi/nieleczonymi komórkami, z których można wygenerować ekstrakt z całych komórek.

  1. Przeprowadzić pożądaną stymulację i/lub leczenie farmakologiczne linii komórkowej CML1 PBL lub izolowanych pierwotnych komórek PBL, używając 10 – 20 x 106 komórek/warunek. Komórki zostaną następnie wykorzystane do frakcjonowania subkomórkowego (kroki 3.4 i 3.5) lub do wytworzenia ekstraktu z całych komórek (krok 3.6).
  2. Przygotowanie roztworów/probówek: Przygotować wszystkie roztwory/na świeżo w dniu frakcjonowania, przed zebraniem komórek. Roztwory należy przechowywać na lodzie do momentu, gdy będą potrzebne i zużyć w ciągu 4 godzin od przygotowania.
    1. Roztwór inhibitora fosfatazy/PBS: Przygotować inhibitory fosfatazy w PBS, rozcieńczając inhibitory fosfatazy w stosunku 1:20 w 1x PBS (tj. 0,5 ml inhibitorów fosfatazy w 9,5 ml 1x PBS).
      nuta: Upewnij się, że inhibitory fosfatazy nie wytrąciły się. Jeśli obecny jest osad, podgrzewać do 50 °C przez 10 minut.
    2. Bufor hipotoniczny: Przygotuj 1x bufor hipotoniczny wykonując rozcieńczenie 1:10 10x buforu hipotonicznego w wodzie destylowanej (tj. 50 μl 10x buforu hipotonicznego na 450 μ l dH2O).
    3. 10 mM ditiotreitol (DTT): Przygotować 10 mM DTT, rozcieńczając 1M DTT wodą destylowaną w stosunku 1:100 (tj. 10 μL 1 M DTT w 990 μL dH2O).
      nuta: Naziemna telewizja cyfrowa jest bardzo labilna, więc za każdym razem przygotuj ją na świeżo. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
    4. Kompletny bufor do lizy: Określ, ile buforu jest wymagane dla każdego eksperymentu. Każda próbka wymaga 50 μl pełnego buforu do lizy, więc dodaj 5 μl 10 mM DTT (krok 3.2.3) do 44,5 μl buforu do lizy, a następnie dodaj 0,5 μl koktajlu inhibitorów proteazy. Ilość tę można skalować w górę w zależności od liczby próbek w eksperymencie.
    5. Oznaczyć cztery zestawy probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml dla każdej stymulacji i/lub leczenia farmakologicznego dla świeżo stymulowanych komórek (krok 3.3), świeżo wygenerowanych frakcji cytoplazmatycznych (krok 3.4.3), świeżo wygenerowanych frakcji jądrowych (krok 3.5.3) i lizatów całych komórek (krok 3.6.3). Wstępnie schłodź te rurki do mikrofuge na lodzie, aż będą potrzebne.
  3. Przenieść komórki do indywidualnie znakowanych probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i osadu przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego PBS/inhibitorów fosfatazy (etap 3.2.1). Osadzać komórki przez odwirowanie w sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i utrzymać granulki komórek na lodzie.
  4. Przygotowanie frakcji cytoplazmatycznych: Delikatnie ponownie zawiesić granulki komórkowe, które mają być użyte do frakcjonowania subkomórkowego, w 50 μL 1x hipotonicznego buforu (krok 3.2.2). Inkubować komórki na lodzie przez 15 minut, aby umożliwić komórkom pęcznienie.
    nuta: Objętość zastosowanego buforu hipotonicznego można zwiększyć empirycznie w zależności od liczby komórek.
    1. Dodaj 0,8 - 2,5 μl (1:20 do 1:60) detergentu do każdej próbki i wiruj na najwyższym ustawieniu przez 10 sekund.
      1. Aby określić optymalne stężenie detergentu, który należy zastosować dla określonego typu komórki w celu wyizolowania frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych, należy najpierw wykonać gradient detergentu. Zakres od 1:20 do 1:60 (tj. 2,5 μl do 0,8 μl detergentu w 50 μl buforu hipotonicznego) powinien być wystarczający.
        UWAGA: Jeśli objętość buforu hipotonicznego w kroku 3.4 zostanie dostosowana, upewnij się, że zachowane są odpowiednie proporcje detergentu.
      2. Sprawdź lizę komórek, obserwując je za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym przed i po dodaniu detergentu. Całe komórki wydają się większe z gęstym, ciemnym jądrem. Cytoplazma pojawi się jako jasne halo wokół jądra.
        nuta: Właściwa liza jest dodatkowo potwierdzana przez zastosowanie Western blot do analizy określonych białek w zlizowanych frakcjach generowanych z gradientu detergentu.
    2. Po lizie próbki należy odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
    3. Ostrożnie przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej, oznakowanej probówki do mikrofuge. Ta frakcja cytoplazmatyczna może być przechowywana w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebna do dalszej analizy. Pozostała osadka zawiera frakcję jądrową (krok 3.5).
      nuta: Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania próbek.
  5. Przygotowanie frakcji jądrowych: Zawiesić każdą osadkę jądrową w 50 μl pełnego buforu do lizy (etap 3.2.4), pipetując w górę i w dół.
    nuta: Objętość pełnego buforu do lizy można dostosować empirycznie zgodnie z początkową liczbą komórek.
    1. Dodać 2,5 μl detergentu, aby rozpuścić białka związane z błoną jądrową i wirować na najwyższym ustawieniu przez 10 s. Próbki inkubować na lodzie przez 30 minut.
    2. Wirować na najwyższym ustawieniu przez 30 s, a następnie odwirować próbki o stężeniu 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej, oznakowanej probówki do mikrofiltracji. Ta frakcja jądrowa może być przechowywana w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebna do dalszej analizy.
      nuta: Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania próbek.
  6. Otrzymywanie lizatów pełnokomórkowych (WCL) z komórek CLL
    nuta: Przygotowanie ekstraktu z całych komórek można przeprowadzić w tym samym czasie, co przygotowanie frakcji jądrowych (krok 3.5).
    1. Zawiesić granulki ekstraktu z całych komórek w 100 μl kompletnego buforu do lizy (przygotowanego w kroku 3.2.4), pipetując w górę i w dół, a następnie dodać 5 μl detergentu, aby zapewnić całkowitą lizę komórek. Próbki należy inkubować na lodzie przez 30 minut.
    2. Wirować na najwyższym ustawieniu przez 30 s, a następnie odwirować próbki o stężeniu 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki do mikrofuge. Ten lizat całego ogniwa może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebny do dalszej analizy.
      nuta: Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania próbek.

4. Dalsza analiza frakcji subkomórkowych

UWAGA: W tym protokole, analiza wygenerowanych frakcji komórkowych została przeprowadzona za pomocą Western blotting przy użyciu standardowych protokołów, ładując równą liczbę komórek/linię (co odpowiada ~10 μg białka) dla frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych.

  1. Kwantyfikacja transportu białek między frakcjami jądrowymi i cytoplazmatycznymi: Wykonaj ilościową analizę Western blot poprzez kwantyfikację intensywności sygnału lub densytometrię przy użyciu bezpłatnego oprogramowania do analizy Western blot.
  2. Importowanie obrazów: Obrazy Western blot wygenerowane za pomocą różnych instrumentów wywoływania muszą być importowane jako pliki JPG, PNG lub TIFF. Zalecany jest plik RAW o 16-bitowej głębi. Aby zaimportować obraz, kliknij ikonę oprogramowania i najedź kursorem na Importuj. Następnie kliknij Obrazy innych firm. Wybierz plik obrazu i kliknij przycisk Otwórz.
  3. Wyświetlanie obrazu: Na wstążce Obraz kliknij przycisk Wybierz w grupie Wyświetlanie. Otworzy się okno dialogowe Dostosuj wyświetlanie, aby w razie potrzeby umożliwić dalsze regulacje. Zaimplementuj dodatkowe ulepszenia, w tym jasność lub kontrast, za pomocą regulowanych suwaków na karcie Image LUTs. Użyj karty Krzywe, aby uzyskać dokładniejsze korekty.
  4. Analiza danych (usunięcie wyboru kanału): Kliknij wstążkę Analiza. Aby przeanalizować tylko jeden kanał, usuń zaznaczenie kanałów, które nie są analizowane. Kliknij miniaturę kanału Nie pokazuj kanału w tablicach LUT obrazu, pozostawiając wyświetlany tylko żądany kanał. Obrazy importowane jako pliki JPG, PNG lub TIFF mogą wymagać odznaczenia wielu niechcianych kanałów RGB.
    1. Dodawanie kształtów: Aby określić ilościowo intensywność sygnału, kliknij przycisk Dodaj prostokąt, aby dodać prostokąt do obrazu. Kliknij środek obiektu (np. pasma białka), aby umieścić wokół niego prostokąt. Alternatywnie, aby ręcznie narysować kształt, wybierz opcję Rysuj prostokąt. Po dodaniu wszystkich żądanych kształtów kliknij przycisk Wybierz, aby powrócić kursorem do narzędzia do zaznaczania.
      nuta: Dodaj wiele kształtów w kolejności logicznej, ponieważ dane są sortowane według numeru identyfikacyjnego, który jest generowany sekwencyjnie.
    2. Odejmowanie tła: Aby odjąć szum tła, kliknij pierwszy przycisk w grupie Tło i wybierz opcję Mediana z menu rozwijanego. Ustaw szerokość obramowania na 3 w oknie dialogowym Tło i wybierz segmenty, które mają być używane do obliczania tła. Wybierając segmenty, które mają być używane, wybierz segmenty, które najlepiej reprezentują tło obrazu.
      nuta: Szum tła może wpływać na kwantyfikację sygnału, dlatego należy go odjąć, aby dokładnie obliczyć sygnał z kształtów będących przedmiotem zainteresowania.
    3. Przytnij sygnał i przytnij tło — OPCJONALNIE: Pliki importowane w formatach JPG, PNG lub TIFF mogą wykazywać nasycenie pikseli: podświetlone/jasne obszary w paśmie białkowym. Opcja Przytnij sygnał i przytnij tło (Bkgnd) usuwa nasycone piksele z analizy. Aby wyświetlić te wartości, dodaj Trim Signal i Trim Bkgnd do tabeli, klikając przycisk Columns (Kolumny) po prawej stronie widoku tabeli.
      nuta: Nasycenie pikseli może prowadzić do niewiarygodnej kwantyfikacji. Nasycone piksele można usunąć tylko wtedy, gdy nasyconych jest mniej niż 5% pikseli w kształcie.
  5. Eksportowanie danych: Kliknij w kartę Kształty nad tabelą. W przypadku densytometrii wymagane są wartości w kolumnie Sygnał. Sygnał to suma wartości intensywności pikseli (Total) dla kształtu pomniejszona o iloczyn Bkgnd i Obszaru. Kliknij przycisk Zgłoś. Kliknij Zapisz jako lub uruchom Arkusz kalkulacyjny.
    Sygnał = Razem - (Bkgnd x Obszar)
    nuta: Karta kształtów zawiera tabelę wartości ilościowych, w tym Sygnał, Suma, Obszar i Bkgrnd.
  6. Kwantyfikacja ekspresji białka: W zapisanym arkuszu kalkulacyjnym oblicz znormalizowane wyrażenie białka będącego przedmiotem zainteresowania dla każdego pasa lub zmiennej, dzieląc uzyskany sygnał dla białka będącego przedmiotem zainteresowania przez sygnał dla odpowiedniego pasma kontrolnego obciążenia białka.
    nuta: Porównania między ilościami znormalizowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych nie mogą być bezpośrednio porównywane ze względu na różne kontrole obciążenia stosowane do rozróżnienia frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej. Właściwe są jednak porównania w obrębie poszczególnych frakcji, np. po leczeniu farmakologicznym.
  7. Eksportuj obraz do publikacji lub prezentacji: Kliknij kartę Obrazy znajdującą się nad tabelą, a następnie kliknij obraz, który chcesz wyeksportować. Jeśli używasz obrazu do prezentacji slajdów lub innych formatów cyfrowych, kliknij ikonę oprogramowania, najedź kursorem na Eksportuj i kliknij Obraz do multimediów cyfrowych. Zapisz obraz jako plik JPG, PNG lub TIFF, zgodnie z wymaganiami.

Wyniki

Podczas planowania eksperymentów na pierwotnych komórkach CLL, jeśli analizy wymagają dużej liczby komórek (>50 x 106 komórek), zaleca się stosowanie świeżo izolowanych komórek CLL zamiast komórek kriokonserwowanych wymagających rozmrożenia, choć nie zawsze jest to możliwe. Wynika to z faktu, że proces zamrażania i rozmrażania może prowadzić do śmierci do 50% komórek CLL, choć zależy to od próbki. Wzbogacenie komórek CLL przy WCC >40 x 106/mL z wykorzystaniem wirowania gradientowego zgodnie z opisem (kroki 1.3 – 1.5) pozwala na uzyskanie wysokiego odzysku komórek przy wysokiej czystości (≥ 95%) pierwotnych komórek CLL. W przedstawionej próbce WCC = 177 x 106/mL: z 30 mL próbki krwi odzyskano 5 x 109 komórek, co stanowi wydajność na poziomie 94% całkowitej liczby komórek. Analiza tej próbki metodą cytometrii przepływowej wykazała czystość komórek CLL >95%, co potwierdzono poprzez podwójną ekspresję powierzchniową markerów komórek CLL CD19 i CD5 po bramkowaniu FSC/SSC oraz wyselekcjonowaniu pojedynczych komórek negatywnych względem DAPI (komórki żywe) (Rycina 1).

Optymalizację procedury frakcjonowania subkomórkowego przeprowadzono, stosując różne stosunki detergentu (od 1:20 do 1:60) podczas przygotowywania frakcji cytoplazmatycznej (krok 3.4). Następnie przygotowano frakcje jądrowe oraz WCL (kroki 3.5 i 3.6 odpowiednio). Immunobloty wykonano na otrzymanych frakcjach linii komórkowej CLL MEC1 (Rysunek 2A) oraz pierwotnych komórkach CLL (Rysunek 2B). Bloty analizowano pod kątem markerów frakcji: Laminy A/C (jądrowy; 74/63 kDa) i β-tubuliny (cytoplazmatyczny; 55 kDa), aby potwierdzić prawidłowe frakcjonowanie komórek. Frakcjonowanie wskazuje, że optymalny poziom detergentu dla komórek MEC1 to rozcieńczenie 1:60 (Rysunek 2A), podczas gdy dla pierwotnych komórek CLL optymalne jest rozcieńczenie 1:30 (Rysunek 2B), co potwierdza wzbogacenie w białka jądrowe przy jednoczesnym braku białek cytoplazmatycznych we frakcjach jądrowych i odwrotnie. WCL reprezentują całkowitą zawartość białek i służą jako kontrola pozytywna dla przeciwciał użytych do analizy frakcji subkomórkowych. Ważny jest wybór odpowiednich białek jako markerów frakcji: Rysunek 2C przedstawia immunobloty frakcji jądrowych/cytoplazmatycznych przygotowanych z komórek MEC1, w których polimeraza RNA II (Rpb1 CTD; 250 kDa) oraz Lamina A/C zostały użyte jako markery frakcji jądrowych, natomiast β-tubulina i γ-tubulina (50 kDa) posłużyły jako markery cytoplazmatyczne. Wyraźnie widać, że γ-tubulina jest wzbogacona w cytoplazmie, jednak jej ekspresja jest widoczna również w jądrze, co wykazano wcześniej9.

Po optymalizacji warunków eksperymentalnych można przeprowadzić doświadczenie. W przedstawionych przykładach określono lokalizację subkomórkową FOXO1 w frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych po stymulacji komórek za pomocą receptora antygenu komórek B (BCR) w obecności lub w nieobecności podwójnego inhibitora mTORC1/2 AZD8055, w komórkach MEC1 (Rysunek 3A) oraz pierwotnych komórkach CLL (Rysunek 3B)5,10. W obu przykładach uzyskano silnie wzbogacone frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne, o czym świadczyła niemal wyłączna ekspresja laminy w frakcji jądrowej oraz β-tubuliny w frakcjach cytoplazmatycznych. W obu typach komórek ekspresja FOXO1 w cytoplazmie była zmniejszona po zastosowaniu AZD8055 w porównaniu z NDC, co towarzyszyło wzrostowi ekspresji FOXO1 w przedziale jądrowym, wykazując tym samym translokację białka (Rysunek 3). Aby wyeliminować subiektywizm w interpretacji danych, poszczególne immunobloty z pięciu pierwotnych próbek CLL poddano kwantyfikacji w obrębie frakcji subkomórkowych (krok 4; Rysunek 4A), wykorzystując odpowiednie białka jądrowe lub cytoplazmatyczne jako wewnętrzne kontrole ilości białka (loading controls) dla każdej próbki, a następnie normalizując każdą frakcję do nie stymulowanej (US) kontroli bez leku (NDC), zgodnie z oznaczeniem. Wynikowy wykres pokazuje trendy przemieszczania się FOXO1 między frakcją jądrową a cytoplazmatyczną, gdzie AZD8055 obniża poziom ekspresji FOXO1 w cytoplazmie, jednocześnie zwiększając ekspresję w jądrze. Ponadto widoczny jest wzrost ekspresji FOXO1 w cytoplazmie po sieciowaniu BCR.

ProbetkaNazwa probówkiKomórki/KuleczkiAntygenFluorofor
1NebarwionyKomórkiNDND
2Barwienie pojedynczeKuleczkiCD5FITC
3Barwienie pojedynczeKuleczkiCD19PE-Cy7
4Barwienie pojedynczeKuleczkiCD23APC
5Barwienie pojedynczeKuleczkiCD45APC-Cy7
6Barwienie pojedynczeKomórkiŻywotnośćDAPI
7Barwienie CLLKomórkiCD5, CD19, CD23, CD45 & żywotnośćFITC, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 & DAPI

Tabela 1: Tabela przedstawiająca optymalny zestaw probówek z próbkami wymaganych do cytometrii przepływowej komórek CLL. Każdy eksperyment musi obejmować wszystkie odpowiednie kontrole w celu dokładnej analizy uzyskanych wyników.

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywny wykres analizy cytometrycznej z przepływem komórek dla wzbogaconych próbek od pacjentów z CLL. Komórki mononuklearne CLL wzbogacone z krwi obwodowej pacjenta z CLL zostały wyselekcjonowane (gated) przy użyciu FSC-A vs. SSC-A, a następnie wykluczono dublety przy użyciu FSC-A vs. FSC-H (A). Niebarwione komórki (probówka 1) oraz kontrole kompensacji (probówki 2-6) zostały wykorzystane do konfiguracji cytometru przepływowego w celu detekcji komórek i kompensacji między kanałami fluorescencyjnymi, co zapewniło prawidłową detekcję sygnałów fluorescencji. (B) Przykład barwienia negatywnego (komórki niebarwione; probówka 1) w kanałach fluorescencji CD19 i CD5. Wyselekcjonowano komórki żywe (DAPI negatywne) i CD45 pozytywne (C), a następnie określono proporcję komórek CD19+CD5+ (95,5%) oraz CD19+CD23+ (91,2%) w obrębie populacji DAPI-CD45+ (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Optymalizacja frakcjonowania jądrowego/cytoplazmatycznego. Frakcje cytoplazmatyczne i jądrowe oraz lizaty całych komórek (WCL) przygotowano z osadów komórkowych (10 – 20 x 106 komórek) linii komórkowej CLL (A) MEC1 lub (B) pierwotnych komórek CLL wzbogaconych z krwi obwodowej pacjentów, zgodnie z opisem w kroku 3. Optymalizację frakcjonowania subkomórkowego przeprowadzono, stosując różne proporcje detergentu (od 1:20 do 1:60) podczas przygotowywania frakcji cytoplazmatycznej (jak opisano w kroku 3.4). Uzyskane próbki poddano immunoblottingowi i inkubowano z przeciwciałami anty-Lamin A/C (jądrowe) oraz anty-β-tubuliną (cytoplazmatyczne), aby potwierdzić prawidłowe frakcjonowanie komórek wraz z WCL. Markery masy cząsteczkowej przedstawiono po lewej stronie blotu (M). * oznacza optymalne warunki detergentu dla lizy komórek. (C) Immunoblot frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z komórek MEC1 w warunkach kontrolnych (NDC) lub po zastosowaniu leku (8055) w obecności lub przy braku stymulacji (odpowiednio + lub – sieciowanie BCR). Bloty inkubowano z przeciwciałami anty-Rbp1 CTD (klon 4H8; rozpoznającym podjednostkę B1 polimerazy RNA II), anty-Lamin A/C, anty-β-tubuliną lub anty-γ-tubuliną (klon GTU-88), aby zidentyfikować frakcje subkomórkowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Frakcjonowanie subkomórkowe wykazuje przemieszczanie się FOXO1 między jądrem a cytoplazmą w CLL. (A) komórki MEC-1 i (B) pierwotne komórki CLL poddano 30-minutowej obróbce wstępnej 100 nM AZD8055 (8055) lub pozostawiono nieleczone (NDC), zgodnie z oznaczeniem, a następnie dokonano ligacji BCR przez 1 h lub pozostawiono bez stymulacji (US). Następnie przygotowano frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne i wykonano immunoblotting. Po potwierdzeniu poprawności frakcjonowania za pomocą przeciwciał anty-Lamin A/C (jądrowe) i anty-β-tubulinę (cytoplazmatyczne), oceniono wpływ zarówno leczenia lekiem, jak i ligacji BCR na ekspresję białka FOXO1 przy użyciu przeciwciała anty-FOXO1. M oznacza marker masy cząsteczkowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Przykład przeprowadzonej ilościowej analizy Western blot (densytometrii). (A) Densytometria została wykonana przy użyciu oprogramowania do analizy Western blot dostępnego online. W skrócie, w karcie Analiza narysowano prostokąty wokół prążków białkowych na obrazie w celu obliczenia intensywności sygnału. Przedstawiono densytometrię reprezentacyjnego obrazu Western blot próbki pacjenta z CLL, która została poddana frakcjonowaniu cytoplazmatycznym/jądrowym. Frakcje cytoplazmatyczne i jądrowe są rozróżnione poprzez ekspresję markerów cytoplazmatycznych (β-tubulina) i jądrowych (Lamin A/C). Znormalizowaną ekspresję FOXO1 dla danego stanu można obliczyć, dzieląc sygnał uzyskany dla FOXO1 przez odpowiadający mu sygnał dla β-Tubuliny lub Lamin A/C, w zależności od analizowanej frakcji. Względną ekspresję FOXO1 (w stosunku do kontroli nośnika US) można obliczyć, dzieląc znormalizowaną ekspresję FOXO1 dla danego stanu przez znormalizowaną ekspresję FOXO1 kontroli nośnika US w danej frakcji komórkowej. (B) Wykres przedstawiający poziomy ekspresji FOXO1 w frakcjach cytoplazmatycznych (lewo) lub jądrowych (prawo), znormalizowane do kontroli US-NDC w obrębie każdej frakcji komórkowej. Czerwona kropka na wykresie to przedstawiony przykład. Dane te pokazują średnią krotność zmiany ekspresji FOXO1 w porównaniu do US-NDC ± SEM. Wartości P określono za pomocą obustronnego sparowanego testu t Studenta. n = 5 indywidualnych próbek pacjentów z CLL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opisany protokół zapewnia szybką i wydajną metodę generowania frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek CLL, a następnie ilościowego oznaczania transportu białek między frakcjami jądrowymi i cytoplazmatycznymi po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym. Przedstawione dane wskazują na zdolność do wykrywania transportu określonych białek, na przykład FOXO1, między frakcją jądrową i cytoplazmatyczną, po leczeniu podwójnym inhibitorem mTOR AZD8055 w obecności/braku sieciowania BCR poprzez stymulację fragmentów F(ab')2 (Figura 3 i Figura 4). Sprzężenie tych eksperymentów z kwantyfikacją Western blot z indywidualnych próbek pacjentów z PBL, umożliwia obiektywną analizę wygenerowanych danych i pokazuje solidność testu opisanego w celu ilościowego określenia globalnych zmian w lokalizacji białek w komórkach CLL wyizolowanych z kohort pacjentów (Figura 4). Z danych jasno wynika, że średnio pięć próbek pobranych od pacjentów we frakcjach cytoplazmatycznych osiągnęło bliskie istotności. Biorąc pod uwagę niejednorodność kliniczną pacjentów z PBL11, analizy te byłyby zwykle przeprowadzane na większych kohortach pacjentów i/lub koncentrowałyby się na określonych podgrupach prognostycznych pacjentów, aby uzyskać pełniejsze zrozumienie odpowiedzi komórkowej komórek PBL na określone leczenie farmakologiczne.

Przedstawione dane pokazują, jak ważny jest wybór markerów białkowych, które znajdują się wyłącznie we frakcji cytoplazmatycznej lub jądrowej, ponieważ czystość frakcjonowania zostanie potwierdzona przez te markery. Do potwierdzenia frakcji cytoplazmatycznej wybrano β-tubulinę, a jako marker jądrowy Laminę A/C. Dodatkowymi powszechnie stosowanymi białkami są GAPDH i α-tubulina do identyfikacji frakcji cytoplazmatycznej lub Brg1 (SMARCA4), TFIID i polimerazy RNA II dla czystości frakcji jądrowej 4,5. Należy jednak zachować ostrożność przy wyborze białek, które są wysoko wzbogacone w określone frakcje, a nie występują w obu frakcjach (np. γ-tubulina) (ryc. 2C)9. Rzeczywiście, GAPDH i aktyna, choć ogólnie uważane za białka cytoplazmatyczne, mogą lokalizować się w jądrze 12,13, co podkreśla znaczenie wyboru markera frakcji, który nie przemieszcza się, gdy stymulacja lub leczenie jest stosowane do komórek. Ponadto ważne jest, aby potwierdzić, że wybrany marker białkowy ulega ekspresji w komórce będącej przedmiotem zainteresowania, prowadząc WCL wraz z frakcjonowaniem subkomórkowym.

W przedstawionym reprezentatywnym doświadczeniu użyto tej samej liczby komórek PBL dla każdego stanu (stymulacja/leczenie farmakologiczne), a następnie natychmiast przygotowano próbki frakcjonowane. Obciążenie 10 μg frakcjonowanego białka/tor zapewnia wystarczający materiał do wykrycia białek będących przedmiotem zainteresowania. Ponieważ próbki te poddano jedynie krótkotrwałemu leczeniu farmakologicznemu i stymulacji (do 4 godzin), założono, że poziom białka pozostanie taki sam w każdej próbce i nie przeprowadzono testu białkowego. Jeśli jednak leczenie komórkami zostanie przedłużone (18 - 72 godziny), poziom śmierci lub proliferacji komórek w komórkach może znacząco zmienić jakość i ilość wyekstrahowanego białka, w zależności od zastosowanego leku/stymulacji komórki, zmieniając w ten sposób poziom białka w próbkach poddanych działaniu środka/stymulowanych. W takich przypadkach, w przypadku długotrwałego leczenia farmakologicznego, zaleca się przeprowadzenie kwantyfikacji białka za pomocą testu Bradforda lub równoważnego, przed Western blot, aby upewnić się, że taka sama ilość białka jest uruchamiana w każdym pasie immunoblot. Obecność detergentów może zakłócać działanie określonych testów białkowych14, interferencję tę można zmniejszyć, rozcieńczając próbki białek frakcji komórkowej. Ponadto należy użyć pełnego buforu do lizy jako próby ślepej, stosując takie samo rozcieńczenie, jak w badanych próbkach.

Aby dostarczyć dowodów potwierdzających opisane tutaj wyniki, równoległe eksperymenty można przeprowadzić przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej w celu analizy lokalizacji FOXO1 w komórkach CLL, aby umożliwić wizualizację tych wyników5. Co więcej, wygenerowane frakcje subkomórkowe mogą być również wykorzystane do oznaczania aktywności enzymatycznej lub analizy proteomicznej w dalszych analizach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Natashy Malik za krytyczną recenzję manuskryptu. Badanie to zostało sfinansowane z grantu w ramach projektu Bloodwise przyznanego AMM (18003). Osprzęt analityczny FACS został sfinansowany przez Fundację Howat. MWM zostało sfinansowane ze stypendium doktoranckiego z Friends of Paul O'Gorman Leukaemia Research Centre, JC zostało sfinansowane przez Friends of Paul O'Gorman Leukaemia Research Center, a JH zostało sfinansowane z grantu projektu Bloodwise (18003).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlGriener Bio jeden616201
3 ml Pipety PasteuraGriener Bio one612398
12 mm x 75 mm Probówki FACSElkay2052-004
15 ml ProbówkaGriener Bio jedna188271
50 ml ProbówkaGriener Bio jeden227261
przeciwciało anty-CD5 FITCBD Biosciences555352fenotypowy marker powierzchniowy
przeciwciało anty-CD19 PE Cy7BD Biosciences557835fenotypowy marker powierzchniowy
przeciwciało anty-CD23 APCBD Biosciences558690fenotypowy marker powierzchniowy
anty-CD45 Przeciwciało APC Cy7BD Biosciences557833fenotypowy marker powierzchniowy
anty-β-tubulinaKomórka Sygnalizacja2146marker cytoplazmatyczny
anty-γ-tubulina Przeciwciało myszy (klon GTU-88)Sigma-AldrichT5326
anty-FoxO1 (C29H4) Przeciwciało królikaSygnalizacja komórkowa2880
przeciwciało anty-Lamina A / CSygnalizacja komórkowa2032marker jądrowy
anty-mysi IgG, sygnalizacja komórkowa przeciwciała sprzężona z HRP7076Przeciwciało wtórne
anty-królicze IgG, przeciwciało sprzężone z HRPSygnalizacja komórkowa7074Przeciwciało drugorzędowe
przeciwciało anty-Rpb1 Przeciwciało CTD (klon 4H8)Sygnalizacja komórkowaMarker jądrowy2629
BDFACS Canto IIBD BiosciencesNa żądanieCytometr przepływowy
Rozwiązanie DAPI BDBiosciences564907dyskryminator żywy/martwy
DMSOSigmaD2650
EDTASigmaEDS
Płodowa surowica bydlęcaThermofisher10500064
GraphPad Prism 6OprogramowanieGraphPad Oprogramowanie
Histopaque1077 gradient gęstościSigmaH8889
HyperPAGE 10 - 190 kDa marker białkowyBiolineBIO-33066Molekularny
znacznik wagi Image Studio Lite (wersja 5.2.5)Oprogramowanie LI-CORwww.licor.com
Labnet VX100Fisher ScientificVortex
Nucelar Extract KitActive Motif40010
OneComp eBeadsThermofisher01-111-42
Trypan Blue SolutionThermofisher15250061
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26619Marker masy cząsteczkowej
Tabletki PBSFisher ScientificBR0014G
RosetteSep Koktajl wzbogacający ludzkie komórki BTechnologie komórek macierzystych15064
WirówkaSigma 3-16PSciQuip
WirówkaSigma 1-15PKSciQuip

Bibliografia

  1. Kau, T. R., Way, J. C., Silver, P. A. Nuclear transport and cancer: from mechanism to intervention. Nature Reviews Cancer. 4, 106-117 (2004).
  2. Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer. Biochemical Pharmacology. 83, 1021-1032 (2012).
  3. Nakamura, N., et al. Forkhead transcription factors are critical effectors of cell death and cell cycle arrest downstream of PTEN. Molecular and Cellular Biology. 20, 8969-8982 (2000).
  4. Calnan, D. R., Brunet, A. The FoxO code. Oncogene. 27, 2276-2288 (2008).
  5. Cosimo, E., et al. AKT/mTORC2 inhibition activates FOXO1 function in CLL cells reducing B cell receptor-mediated survival. Clinical Cancer Research. 25, 1574-1587 (2019).
  6. Mahipal, A., Malafa, M. Importins and exportins as therapeutic targets in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 135-143 (2016).
  7. Hing, Z. A., et al. Next-generation XPO1 inhibitor shows improved efficacy and in vivo tolerability in hematological malignancies. Leukemia. 30, 2364-2372 (2016).
  8. Lapalombella, R., et al. Selective inhibitors of nuclear export show that CRM1/XPO1 is a target in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 120, 4621-4634 (2012).
  9. Hořejší, B., et al. Nuclear γ-tubulin associates with nucleoli and interacts with tumor suppressor protein C53. Journal of Cellular Physiology. 227, 367-382 (2012).
  10. McCaig, A. M., Cosimo, E., Leach, M. T., Michie, A. M. Dasatinib inhibits B cell receptor signalling in chronic lymphocytic leukaemia but novel combination approaches are required to overcome additional pro-survival microenvironmental signals. British Journal of Haematology. 153, 199-211 (2011).
  11. Fischer, K., Hallek, M. Optimizing frontline therapy of CLL based on clinical and biological factors. Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2017, 338-345 (2017).
  12. Butera, G., et al. Regulation of autophagy by nuclear GAPDH and its aggregates in cancer and neurodegenerative disorders. International Journal of Molecular Sciences. 20, 2062(2019).
  13. Virtanen, J. A., Vartiainen, M. K. Diverse functions for different forms of nuclear actin. Current Opinion in Cell Biology. 46, 33-38 (2017).
  14. Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178, 263-268 (1989).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Frakcjonowanie j drowo cytoplazmatyczneanaliza transportu bia ekmetoda frakcjonowania subkom rkowegowirowanie w gradiencie g sto cioptymalizacja gradientu detergent wkwantyfikacja metod Western blotkontrola czysto ci metod cytometrii przep ywowejbadanie lokalizacji FOXO1regulacja transportu XPO1

Powiązane artykuły