Tutaj prezentujemy metodę wykorzystującą przepuszczalne nośniki błonowe, aby ułatwić badanie bezkontaktowej sygnalizacji parakrynnej używanej przez komórki nowotworowe do tłumienia odpowiedzi immunologicznej. System jest podatny na badanie roli czynników wydzielanych przez nowotwór w tłumieniu aktywacji makrofagów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sygnalizacja parakrynna pochodząca z guza jest pomijanym elementem miejscowej immunosupresji i może prowadzić do powstawania środowiska sprzyjającego ciągłemu wzrostowi raka i przerzutom. Sygnały parakrynne mogą obejmować kontakt komórka-komórka między różnymi typami komórek, takimi jak PD-L1 wyrażony na powierzchni guzów oddziałujących bezpośrednio z PD-1 na powierzchni limfocytów T lub wydzielanie ligandów przez komórkę nowotworową w celu wpływu na komórkę odpornościową. Tutaj opisujemy metodę kohodowli w celu zbadania wpływu ligandów wydzielanych przez guz na aktywację komórek odpornościowych (makrofagów). Ta prosta procedura wykorzystuje dostępne na rynku membrany poliwęglanowe o średnicy 0,4 μm, przepuszczalne podłoża i standardowe płytki do hodowli tkankowych. W opisanym procesie makrofagi są hodowane w górnej komorze, a komórki nowotworowe w dolnej komorze. Obecność bariery 0,4 μm pozwala na badanie sygnalizacji międzykomórkowej bez zakłócającej zmiennej, jaką jest kontakt fizyczny, ponieważ te dwa typy komórek mają to samo podłoże i ekspozycję na ligandy parakrynne. Podejście to można połączyć z innymi, takimi jak zmiany genetyczne makrofagów (np. izolacja od myszy z genetycznym nokautem) lub guz (np. zmiany za pośrednictwem CRISPR) w celu zbadania roli określonych wydzielanych czynników i receptorów. Podejście to nadaje się również do standardowych analiz biologii molekularnej, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) lub analiza Western blot, bez konieczności sortowania przepływowego w celu oddzielenia dwóch populacji komórek. Testy immunoenzymatyczne (ELISA) mogą być podobnie wykorzystywane do pomiaru wydzielanych ligandów, aby lepiej zrozumieć dynamiczną interakcję sygnalizacji komórkowej w kontekście wielu typów komórek. Czas trwania kokultury może być również zróżnicowany w celu badania zdarzeń regulowanych czasowo. Ta metoda kohodowli jest solidnym narzędziem, które ułatwia badanie sygnałów wydzielanych przez guz w kontekście immunologicznym.
Wprowadzenie
Ostatnie badania skupiały się na zdolności komórek nowotworowych do unikania wykrycia przez komórki odpornościowe, tłumienia lokalnej aktywacji immunologicznej lub wytwarzania tolerogennego środowiska permisywnego dla guza w mikrośrodowisku guza. Opisano dwie szerokie klasy interakcji między guzem a komórkami odpornościowymi, które ułatwiają te efekty: interakcje kontaktowe lub ligandy wydzielane przez nowotwór. Jednym z najlepiej zbadanych i klinicznie wykonalnych mechanizmów kontaktowego hamowania immunologicznego wykorzystywanego przez nowotwory jest ekspresja PD-L1, która oddziałuje z PD-1 na limfocytach T, hamując ich aktywację i funkcję1,2. W odpowiedzi na interferon-gamma (IFNγ), który ulega ekspresji przez wiele aktywowanych komórek odpornościowych, komórki nowotworowe mogą zwiększać ekspresję PD-L1, aby wywołać wyczerpanie aktywowanych limfocytów T eksprymujących PD-1, uniemożliwiając im w ten sposób skuteczne wyeliminowanie komórek nowotworowych3. Stosowanie przeciwciał w celu zablokowania interakcji między PD-L1 i PD-1 jest obecnie stosowane w leczeniu wielu typów nowotworów u ludzi4. W świetle tego i innych sukcesów klinicznych, coraz większą uwagę poświęca się identyfikacji i celowaniu w mechanizmy immunosupresyjne pochodzenia nowotworowego.
Poza tłumieniem odporności adaptacyjnej, nowotwory są również znane z tego, że wydzielają czynniki, które tłumią prozapalne reakcje wrodzonych komórek odpornościowych. Wykazano, że wydzieliny pochodzące z guza lub wywołane przez nowotwór, w tym IL-6, IL-10, VEGF, IL-23 i czynnik stymulujący tworzenie kolonii (CSF-1), hamują odpowiedzi przeciwnowotworowe komórek NK (natural killer), granulocytów i komórek dendrytycznych w mikrośrodowisku guza5,6,7. Komórki nowotworowe mogą również wydzielać czynniki, które zniekształcają rekrutację i różnicowanie komórek pochodzących z mieloidu w mikrośrodowisku guza, aby promować supresję aktywacji limfocytów T8,9.
Jednym z typów wrodzonych komórek odpornościowych, które mają głęboki wpływ na postęp nowotworu, są makrofagi. Przez wiele lat obecność makrofagów związanych z nowotworem (TAM) była wykorzystywana jako negatywny prognostyk przeżycia pacjenta10. Koncepcja, że immunosupresyjne TAM tłumią klirens nowotworów za pośrednictwem komórek odpornościowych, została wprowadzona ponad 40 lat temu11. Niedawno wykazano, że odpowiedź prozapalna makrofagów może być obniżona, podczas gdy fenotyp pronowotworowy może być indukowany w mikrośrodowisku guza. Te immunosupresyjne makrofagi mogą przyczyniać się do odpowiedzi tolerogennej, napędzając progresję guza i oporność na chemio- i immunoterapię12. Biorąc pod uwagę, że makrofagi są często jednymi z najliczniejszych leukocytów z guzem, przywrócenie ich specyficznej dla nowotworu aktywności immunologicznej stanowi potencjalny cel dla terapii przeciwnowotworowych13.
Podczas gdy interakcje kontaktowe między komórkami nowotworowymi a makrofagami mogą być modelowane poprzez bezpośrednią kokulturę, użycie przepuszczalnych podpór błonowych może wyjaśnić, które czynniki wydzielane przez nowotwór są immunomodulujące, bez potencjalnie mylącego wpływu kontaktu komórka-komórka nowotworowo-immunologiczna. Korzystając z nieco podobnych metod, inni wykazali potencjał identyfikacji wydzielanych czynników w interakcjach mikrogleju/neuronów14, a także komórek nowotworowych z komórkami międzybłonka15. Z powodzeniem wykorzystaliśmy również tę technikę kohodowli do scharakteryzowania roli białka wydzielanego przez nowotwór, Pros1, jako supresora ekspresji genów prozapalnych po stymulacji makrofagów otrzewnowych za pomocą LPS i interferonu gamma16. Tutaj opisujemy prostą metodologię, którą można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób czynniki wydzielane przez guz mogą wpływać na aktywację makrofagów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury związane z pozyskiwaniem i używaniem mysich makrofagów otrzewnowych zostały przeprowadzone na Uniwersytecie Północnej Karoliny w Chapel Hill (UNC) i zostały zatwierdzone przez UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Kultura makrofagów
UWAGA: Ta procedura może wykorzystywać pierwotne makrofagi otrzewnowe (opisane szczegółowo poniżej), makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego lub linie komórkowe makrofagów, takie jak J774 (ATCC) lub RAW264 (ATCC).
- Zbierz makrofagi otrzewnowe zgodnie z wcześniejszym opisem16,17 i umieść bezpośrednio w górnej komorze (komorach) płytki 6-dołkowej z wkładką z membrany poliestrowej 0,4 μm (Rysunek 1A).
UWAGA: Przybliżona wydajność makrofagów z każdej izolacji wynosi łącznie 1 x 106 komórek, więc średnia liczba komórek na studzienkę wynosi ~ 1,5–1,6 x 105 komórek na płytce 6-dołkowej. - Hodowla zebranych makrofagów w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)/F12, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1x penicylina/streptomycyna, 20 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
UWAGA: Górna komora zawiera 1 ml pożywki hodowlanej, podczas gdy dolna komora jest wypełniona 1,5 ml. Do każdej komory należy dodać pożywkę.
2. Kokultura komórek nowotworowych z makrofagami
- Przed użyciem należy wyhodować dostępne w handlu komórki nowotworowe w ich odpowiednim pożywce, postępując zgodnie z metodami hodowli tkankowych zalecanymi przez ATCC.
- Przemyć przylegające komórki nowotworowe raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), dodać 0,05% trypsyny + kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki się odłączą. Ponownie zawiesić komórki w pożywce zawierającej FBS, oznaczyć ilościowo całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub licznika komórek, a następnie wirować przez 5 minut przy 220 x g do osadzania.
- Podczas wirowania należy zassać pożywkę z górnej i dolnej komory przepuszczalnych membranowych płytek nośnych zawierających makrofagi i zastąpić świeżą pożywką.
- W przypadku dolnych komór, w których komórki nowotworowe będą powlekane, należy wypełnić 1 ml pożywki zamiast 1,5 ml, aby zapewnić wystarczającą objętość do dodania komórek.
- Odessać pożywkę z granulowanych komórek nowotworowych i zawiesić komórki w DMEM/F12 z 10% FBS, 1x penicyliną/streptomycyną i 20 ng/mL M-CSF w stężeniu 3 x 105 komórek/ml.
- Dodaj 0,5 ml 3 x 105 komórek/ml komórek nowotworowych do dolnej komory pożądanych studzienek (Rysunek 1B).
UWAGA: Komórki można leczyć natychmiast.
3. Leczenie komórek współhodowanych
- Aby indukować prozapalną ekspresję genów makrofagów, należy traktować makrofagi hodowane pojedynczo lub w kogeneracji, dodając 100 ng / ml IFNγ i 50 ng / ml LPS.
- W razie potrzeby należy zmieniać czas trwania leczenia w hodowli. Aktywacja makrofagów następuje w ciągu 2 godzin, a pewna supresja za pośrednictwem guza następuje po 8 godzinach. Kohodowla przez 24 godziny zapewnia solidną i spójną supresję pochodzącą z guza.
UWAGA: Alternatywnie, makrofagi można skłonić do przyjęcia fenotypu sprzyjającego gojeniu się ran poprzez dodanie czynników, takich jak interleukina-10 (IL10) i oceniany wpływ ligandu wydzielanego przez nowotwór.
- W razie potrzeby należy zmieniać czas trwania leczenia w hodowli. Aktywacja makrofagów następuje w ciągu 2 godzin, a pewna supresja za pośrednictwem guza następuje po 8 godzinach. Kohodowla przez 24 godziny zapewnia solidną i spójną supresję pochodzącą z guza.
- Jako kontrolę negatywną, makrofagi hoduje się pojedynczo i pozostawia nieleczone. Jako kontrolę pozytywną należy traktować makrofagi hodowane pojedynczo za pomocą 100 ng/ml IFNγ i 50 ng/ml LPS.
4. Dalsza analiza współhodowanych komórek
- Po upływie pożądanego czasu inkubacji należy wyizolować lizat komórkowy lub kondycjonowaną pożywkę hodowlaną zgodnie z potrzebami, w zależności od potrzeb testowych.
- Aby wyizolować lizat komórkowy do ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), należy odessać pożywkę z obu komór studzienki i przemyć raz 2 ml PBS. Nałożyć bufor do lizy RNA do górnej komory zawierającej makrofagi. Delikatnie zeskrob membranę, aby uwolnić lizat komórkowy i przenieś do probówki zbiorczej w celu dalszego przetwarzania zgodnie z protokołem producenta zestawu do izolacji RNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu określenia wpływu ligandów wydzielanych przez guza na polaryzację makrofagów zastosowano opisaną procedurę. Makrofagi otrzewnowe hodowane bez komórek nowotworowych posłużyły jako kontrola ujemna (niepoddane działaniu czynników = skrajna lewa strona) oraz dodatnia (stymulowane IFNγ i LPS = 2nd (od lewej) kontrole (Rycina 2A). Alternatywnie, makrofagi otrzewnowe współhodowano z komórkami czerniaka B16F10 (ATCC) (Rycina 1A). Bezpośrednio po wysiew...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj test kohodowli jest modyfikacją wcześniej ustalonych testów, która pozwala na badanie czynników wydzielanych przez nowotwór na aktywację komórek odpornościowych. Podczas gdy wiadomo, że kontakt komórka-komórka indukuje zmiany w aktywności immunologicznej, zdolność ligandów wydzielanych przez guz do modulowania aktywacji immunologicznej jest mniej dobrze poznana. Opisujemy metodę, która, w przeciwieństwie do bezpośredniej kohodowli, może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób czynniki wydzielane p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Eric Ubil został częściowo sfinansowany przez American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Prace były wspierane przez grant z NIH (R01-CA205398) oraz nagrodę Fundacji Badań nad Rakiem Piersi (BCRF-18-041) dla HSE.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| do syntezy cDNA | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 | podłoże ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Milipore Milipore | płodowej surowicy bydlęcej | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolisacharydy z Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Mysz mysia M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Rekombinowana mysz IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Zestaw Sensimix SYBR Low-ROX | Bioline | QT625-05 | |
| Przepuszczalne podpory Transwell | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsyna-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
Bibliografia
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
