Method Article

Oznaczanie tożsamości i czystości komórek odpornościowych za pomocą epigenetycznego ilościowego PCR

DOI:

10.3791/60465

⸱

February 19th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology, Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific, 2California Polytechnic State University (Cal Poly), 3Epiontis GmbH, Precision for Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy solidną metodę określania tożsamości i czystości komórek odpornościowych za pomocą sygnatur epigenetycznych wykrytych za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Demetylacja DNA w określonym locus służy jako unikalny identyfikator dla określonego typu komórki i umożliwia identyfikację limfocytów T CD8 +, regulatorowych lub Th17.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częstość występowania populacji podtypów komórek odpornościowych może mieć duży wpływ na skuteczność terapii limfocytami T. Obecne metody, takie jak cytometria przepływowa, mają określone wymagania dotyczące próbek, dużą ilość wprowadzanych próbek, mają niską przepustowość i są trudne do standaryzacji, a wszystko to jest szkodliwe dla charakterystyki produktów terapii komórkowej podczas ich opracowywania i wytwarzania.

Opisane tutaj testy dokładnie identyfikują i określają ilościowo typy komórek odpornościowych w heterogenicznej mieszaninie komórek za pomocą izolowanego genomowego DNA (gDNA). Wzorce metylacji DNA ujawniają się poprzez konwersję wodorosiarczynów, proces, w którym niemetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl. Niemetylowane regiony DNA są wykrywane poprzez amplifikację qPCR przy użyciu starterów ukierunkowanych na przekształcone obszary. Mierzony jest jeden unikalny locus na test, który służy jako dokładny identyfikator dla określonego typu komórki. Testy są solidne i identyfikują limfocyty T CD8 +, regulatorowe i Th17 w sposób wysokoprzepustowy. Te zoptymalizowane testy mogą być potencjalnie wykorzystane do testowania w trakcie procesu i testowania uwalniania produktu w procesie terapii komórkowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie limfocytów T w immunoterapii komórkowej znacznie wzrosło w ciągu ostatniej dekady, szczególnie wraz z pojawieniem się technologii limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)1. Chociaż terapie oparte na limfocytach T spotkały się z dużym sukcesem klinicznym, są one niejednorodne, a cechy i tożsamość komórek mogą się znacznie różnić między dawcami2. Heterogeniczność populacji limfocytów T może mieć duży wpływ na skuteczność terapeutyczną i komplikować wnioski z badań klinicznych. Z tego powodu kluczowe znaczenie ma zrozumienie heterogeniczności limfocytów T podczas wytwarzania i formułowania produktu w celu określenia optymalnych formuł immunoterapii limfocytów T.

W szerokim sensie, limfocyty T można podzielić na dwie grupy: limfocyty T pomocnicze CD4+, które wydzielają cytokiny immunomodulujące, oraz limfocyty T cytotoksyczne CD8+, które bezpośrednio lizują komórki prezentujące pokrewny antygen na cząsteczkach głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) I. Limfocyty T pomocnicze CD4 + mogą różnicować się w niezliczone określone podzbiory, które wytwarzają unikalny zestaw cytokin. Niektórzy sugerują, że określony stosunek limfocytów T CD4+ do CD8+ w końcowym produkcie komórkowym maksymalizuje skuteczność i trwałość in vivo, ale może komplikować produkcję komórek3. Limfocyty T regulatorowe (Treg), podzbiór limfocytów T CD4 +, działają immunosupresyjnie i zmniejszają aktywację komórek odpornościowych. Limfocyty T regulatorowe są zaangażowane w pośredniczenie w tolerancji nowotworu i, jeśli są obecne podczas wytwarzania limfocytów CAR T, mogą hamować przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną komórek CAR T4,5,6. Inne podzbiory CD4 +, takie jak limfocyty T pomocnicze 17 (Th17), promują usuwanie guza i mogą być wykorzystane do zwiększenia skuteczności terapii limfocytami T. Tak więc zwiększenie liczby limfocytów T Th17 CD4 + jest szczególnie interesujące w przypadku guzów litych, w których zwiększona produkcja interleukiny 17 (IL-17) sprzyja przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej5,7,8,9. Zrozumienie znaczenia komórek Th17 w odpowiedziach nowotworowych skłoniło do dalszych badań nad strategiami generowania tych komórek in vitro7,9. Dlatego metody wykrywania tych podzbiorów limfocytów T mają kluczowe znaczenie dla optymalizacji terapii limfocytami T i powinny być solidne, łatwe, skalowalne i powtarzalne.

Cytometria przepływowa jest najczęstszą metodą określania tożsamości komórki odpornościowej. Jednak cytometria przepływowa wymaga żywych, nienaruszonych komórek, które muszą zostać przeanalizowane tego samego dnia, w którym zostały pobrane. W przypadku barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych (ICS) wymagane jest hamowanie wydzielania białek, aby zatrzymać cytokiny w limfocytach T. Jednak różne związki inhibitorowe mają zróżnicowany wpływ na wydzielanie określonych cytokin, zmuszając użytkowników do tworzenia specjalistycznych koktajli do wykrywania interesującej nas cytokin10,11. Ponadto wierność cytometrii przepływowej opiera się na klonach przeciwciał, które specyficznie i silnie wiążą się ze swoim celem. Stosowanie różnych klonów przeciwciał może powodować różne wyniki i prowadzić do nieprecyzyjnych wniosków, co utrudnia standaryzację metody12. Co więcej, analiza danych zebranych za pomocą cytometrii przepływowej, a tym samym wnioski wyciągnięte z danych, mogą się znacznie różnić między użytkownikami w zależności od ustawienia bramek13,14. Z tych powodów cytometria przepływowa nie jest idealna do precyzyjnej kontroli jakości podczas opracowywania terapii komórkowej.

Ocena metylacji genomu w określonych loci genów jest alternatywną metodą określania tożsamości komórki. Uzasadnienie stosowania metylacji DNA do identyfikacji określonych typów komórek zostało opisane w wielu artykułach i opiera się na określonych wzorcach metylacji obecnych w danej populacji komórek15,16,17. W komórkach docelowych niektóre miejsca zawierają niemetylowane nukleotydy, podczas gdy w komórkach niedocelowych miejsca te są metylowane. Wzorzec ten można wykryć poprzez konwersję wodorosiarczynu, proces, który przekształca wyłącznie niemetylowane nukleotydy cytozyny (C) w uracyl (U). Startery i sondy mogą być projektowane na przekształconych miejscach, a następnie wzmacniane i wykrywane za pomocą qPCR16.

Test opisany tutaj mierzy częstość występowania podtypów komórek odpornościowych w heterogenicznych populacjach poprzez ilościowe określenie liczby specyficznych niemetylowanych loci w porównaniu z genem porządkowym. Kopie niemetylowanych elementów regulatorowych dla genu CD8 B są mierzone w teście CD8, FoxP3 w Treg i IL-17 w Th17 w tym teście. Loci te zidentyfikowano poprzez wyizolowanie określonej populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania (np. limfocytów T CD8 +) i wykonanie sekwencjonowania wodorosiarczynów w celu zidentyfikowania loci, które są niemetylowane tylko w tym typie komórki15. Startery i sondy są opracowywane przeciwko unikalnie niemetylowanym loci, a próbki są analizowane za pomocą qPCR. Krzywa standardowa znanych liczb kopii jest tworzona z rozcieńczeń standardowego plazmidu o wysokiej liczbie kopii, co pozwala na konwersję wartości Ct na liczbę kopii transkrypcji.

Aby ocenić wydajność testu, wymagane są próbki kontrolne, w tym referencyjne gDNA i plazmid kalibratora. Referencyjny materiał genomowy jest zbiorczą próbką krwi od wielu dawców o znanej częstości występowania komórek odpornościowych i jest wykorzystywany do kontroli jakości (QC) kontroli wydajności. Próbka kalibratora to zsyntetyzowany plazmid, który zawiera sekwencje genów CD8, FoxP3 i GAPDH w stosunku równomolowym. Jest używany jako miara wydajności konwersji wodorosiarczynu, ponieważ konwersje wodorosiarczynów w różnych regionach genomu będą różnić się wydajnością. Stosunek celu do GAPDH w kalibratorze wynosi 1, ale ze względu na różnice w wydajności konwersji wodorosiarczynu stosunek ten może się różnić. Ten współczynnik kalibracji jest stosowany do testów CD8 i Treg. FoxP3, gen używany w teście Treg, znajduje się na chromosomie X. Ponieważ ten test mierzy tylko niemetylowane kopie FoxP3 i tylko jedna kopia FoxP3 jest niemetylowana w Treg, ten test jest niezależny od płci i może być stosowany zarówno z próbkami męskimi, jak i żeńskimi18. Test Th17 nie wykorzystuje próbki kalibratora ani GAPDH jako genu porządkowego. Zamiast tego dołączany jest inny zestaw starterów ukierunkowany na metylowane loci obecne w komórkach innych niż Th17, a całkowita liczba komórek jest odzwierciedlona przez sumę metylowanych i niemetylowanych kopii IL-17. Dane uzyskane z qPCR są wprowadzane do wstępnie ustawionego szablonu analizy, który przeprowadza kontrolę jakości danych i oblicza procent komórki docelowej w populacji wyjściowej. Zapewnia to zautomatyzowaną i bezstronną analizę danych, eliminując w ten sposób subiektywność użytkownika i poprawiając możliwości standaryzacji.

Ten test wykorzystuje gDNA, które może być wyizolowane za pomocą procedury leukaferezy przy użyciu hodowanych lub utrwalonych komórek, lub zamrożonych granulek komórkowych. Niskie wymagania dotyczące próbki, elastyczność materiału wyjściowego próbki, wysoka dokładność i ustandaryzowana analiza rozwiązują ograniczenia związane z cytometrią przepływową i są idealne do celów kontroli jakości podczas opracowywania procesu terapii komórkowej.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki ludzkie zostały pobrane z komercyjnego źródła, zgodnie z ich wytycznymi dotyczącymi etyki badań na ludziach.

1. Izolacja genomowego DNA

UWAGA: Izolacja genomowego DNA jest wykonywana przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu (patrz Tabela materiałów) z dowolnych komórek hematopoetycznych, takich jak komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), oczyszczone limfocyty T lub jakikolwiek inny typ komórek krwiotwórczych. W tym eksperymencie wykorzystano komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i limfocyty T od trzech różnych dawców ludzkich.

  1. Umieścić 1-2 x 106 komórek krwiotwórczych w stożkowej probówce i odwirować przy 400 x g przez 10 minut.
  2. Całkowicie odessać supernatant.
  3. Dodać 350 μl buforu do lizy/wiązania do próbki i inkubować przez 10 minut w temperaturze 55 °C.
  4. Dodaj 50 μl proteinazy K (20 mg/ml) do 350 μl zawiesiny komórkowej i wiruj przez 30 s.
  5. Dodać 50 μl kulek paramagnetycznych wiążących DNA i 400 μl 100% izopropanolu i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty i usuń supernatant, uważając, aby nie naruszyć kulek. Na tym etapie DNA jest wiązane z kulkami magnetycznymi.
  7. Dodać 950 μl buforu do przemywania 1. Wiruj przez 30 s i powtórz krok 1.6.
  8. Powtórz krok 1.7.
  9. Dodać 950 μl buforu do przemywania 2. Wiruj przez 30 s i powtórz krok 1.6.
  10. Dodać 100 μl buforu elucyjnego i wirować przez 2 minuty. Umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę i przenieść supernatant zawierający gDNA do nowej probówki.
  11. Użyj 1 μl gDNA wyizolowanego z komórek krwiotwórczych, aby zmierzyć czystość gDNA za pomocą spektrofotometrii przy użyciu fluorymetru, otrzymując OD przy 260 nm, 280 nm i 230 nm. Upewnij się, że stosunek gęstości optycznej (stosunek OD) przy 260 i 280 nm wynosi od 1,7 do 2,0, a stosunek OD przy 260 i 230 nm wynosi od 1,5 do 2,4.

2. Przygotowanie próbki

  1. Rozgrzej termomikser do 56 °C.
  2. Oznacz probówki o pojemności 2 ml dla wszystkich próbek, kalibratora i materiału odniesienia.
  3. Rozcieńczyć próbki i kalibrator za pomocą buforu elucyjnego (dostępnego z zestawem używanym do kroku 1) w temperaturze pokojowej.
    1. W przypadku wszystkich próbek doświadczalnych należy rozcieńczyć gDNA do całkowitej objętości 142 μl. Na przykład rozcieńczyć 4 μl gDNA przy 100 ng/μl w 138 μl buforu elucyjnego.
      UWAGA: Do testu można użyć 400-1,200 ng gDNA.
    2. Rozcieńczyć 75 μl kalibratora do całkowitej objętości 142 μl.
    3. Sprawdzić referencyjne stężenie gDNA za pomocą spektrofotometru, używając TE (pH = 8,0) jako ślepej próby.
    4. Rozcieńczyć 1 000-1 200 ng referencyjnego gDNA do całkowitej objętości 142 μl. Na przykład rozcieńczyć 10 μl referencyjnego gDNA przy 100 ng/μl w 132 μl buforu elucyjnego.
  4. Inkubować probówki w temperaturze 56 °C przez 5 minut przy 900 obr./min w termomieszalniku. Na krótko odkręć probówki, aby pobrać próbki.

3. Konwersja wodorosiarczynu

UWAGA: Upewnij się, że czasy inkubacji podczas konwersji wodorosiarczynu są zgodne z zalecanymi czasami. Nadmierna lub niedostateczna inkubacja wpłynie na wyniki testu.

  1. Ustawić termomikser na 80 °C.
  2. Dodać 270 μl wodorosiarczynu amonu i 90 μl alkoholu tetrahydrofurfurylowego (THFA) do wszystkich probówek. Wirować, aby całkowicie wymieszać i krótko odwirować próbki, aby zebrać płyn na dnie.
  3. Inkubować probówki w termomikserze w temperaturze 80 °C przez 45 minut przy 900 obr./min. Jeśli używasz bloku grzewczego, wiruj rurki przez 1-2 s co 4,5 minuty podczas inkubacji.
  4. Krótko odwirować próbki i pozostawić do ostygnięcia do temperatury suchej przez 3-5 minut, a następnie przejść do kroku 4 lub 5. Ostateczna objętość powinna wynosić ~500 μL.

4. Testy CD8 i Treg

  1. Oczyszczanie DNA po konwersji wodorosiarczynu
    UWAGA: Ten krok jest wykonywany przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania DNA (patrz Tabela materiałów) na DNA przekształconym w wodorosiarczyn. Upewnij się, że odczynniki są podgrzane do temperatury pokojowej przed użyciem.
    1. Przed rozpoczęciem oczyszczania należy utworzyć jednorodną mieszaninę kulek paramagnetycznych do izolacji DNA, wirując przez 30 s. Dodać etanol i izopropanol do do płukania, postępując zgodnie z objętościami podanymi na butelkach, i ustawić blok grzewczy na 65 °C.
    2. W temperaturze pokojowej dodaj 870 μl buforu do lizy/wiązania i 105 μl kulek paramagnetycznych wiążących DNA do każdej probówki z kroku 3.4. Wiruj, aby całkowicie wymieszać i krótko odwiruj rurki.
    3. Dodaj 570 μl 2-propanolu i zwiruj do całkowitego wymieszania.
    4. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 7 minut przy 50 obr./min w termomikserze lub standardowym mieszadle obrotowym.
    5. Krótko odkręć rurki. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i inkubuj przez 5 minut.
    6. Gdy próbki nadal znajdują się na stojaku magnetycznym, usuń supernatant, nie naruszając kulek.
      UWAGA: DNA jest związane z koralikami.
    7. Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i dodaj 900 μl buforu do płukania 1. Obracaj rurki, aby całkowicie zawiesić koraliki, a następnie krótko odkręć rurki.
    8. Włóż probówki do stojaka magnetycznego i inkubuj przez 3 minuty.
    9. Gdy próbki nadal znajdują się na stojaku magnetycznym, usuń supernatant bez naruszania kulek.
    10. Powtórzyć płukanie (4.1.7-4.1.9), raz z buforem do płukania 1, a następnie dwa razy z buforem do płukania 2.
    11. Po usunięciu supernatantu należy na krótko odwirować probówki i powrócić do stojaka magnetycznego na 3 minuty.
    12. Usuń wszystkie resztki buforu płuczącego 2 i wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego.
    13. Suszyć kulki przy otwartych pokrywkach probówek w temperaturze 65 °C przez 15 minut.
    14. Dodać 60 μl buforu elucyjnego do każdej probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 7 minut przy 1 400 obr./min. Alternatywnie, wiruj z umiarkowaną prędkością za pomocą adaptera piankowego.
    15. Krótko odkręć rurki i umieść na stojaku magnetycznym na 2 minuty.
    16. Przenieść 55 μl eluatu do nowej probówki, nie naruszając kulek. Eluat zawiera DNA przekształcone w wodorosiarczyn. Pomiar stężenia DNA nie jest wymagany.
  2. Instalowanie i uruchamianie qPCR
    1. Włącz maszynę qPCR i komputer, na którym działa jej oprogramowanie.
    2. W interfejsie użytkownika oprogramowania utwórz nowy eksperyment i wybierz blok, który ma być używany do uruchomienia eksperymentu.
    3. Wybierz opcję Krzywa standardowa jako typ eksperymentu.
    4. W razie potrzeby wybierz chemię detekcji, której chcesz użyć. W tym teście wykorzystuje się odczynniki TaqMan. W przeciwnym razie wybierz ROX jako odniesienie pasywne.
    5. W razie potrzeby wybierz właściwości uruchomienia instrumentu jako Standardowe.
    6. Zdefiniuj swój projekt eksperymentalny, przypisując cele (np. GAPDH lub CD8 z FAM jako reporterem) i niefluorescencyjny wygaszacz.
    7. Przypisywanie nazw próbek do wzorców, próbek i kontrolek.
    8. Następnie przypisz każdą pozycję studzienki zgodnie z płytką qPCR. Każda studnia wymaga celu, takiego jak CD8 lub GAPDH, oraz przykładowej nazwy. Każda próbka jest badana w trzech egzemplarzach i musi być odzwierciedlona na układzie płytki przyrządu.
    9. Przypisz każdemu standardowi zadanie Standard i określ końcowe numery kopii zgodnie z Tabelą 1.
    10. Przypisz próbki, kalibrator i odwołaj się do zadania Nieznane.
    11. Oznacz studnie bez kontroli szablonu jako NTC lub N.
    12. Przygotować seryjne rozcieńczenia DNA lambda (10 ng/μl), które mają być użyte jako wzorzec (patrz Tabela 1).
    13. Przygotować koktajle qPCR master mix, jeden dla docelowego typu komórki i jeden dla GAPDH (patrz Tabela 2). Uruchom wszystkie próbki, wzorce i kontrolkę NTC w trzech egzemplarzach.
      UWAGA: GAPDH służy do ilościowego określania całkowitej liczby komórek i jest uruchamiany równolegle z docelową amplifikacją. Kopie niemetylowanych elementów regulatorowych dla genu CD8 B są mierzone w teście CD8, FoxP3 w Treg i IL-17 w Th17.
    14. Użyj płytki 96-dołkowej do qPCR. Najpierw załaduj 3 μl matrycowego DNA do studzienek. Następnie załaduj 7 μl mieszanki wzorcowej.
    15. Uszczelnić płytkę folią qPCR i krótko odkręcić płytkę przed umieszczeniem jej w przyrządzie qPCR.
    16. Uruchom qPCR, jak pokazano w Tabeli 3.
    17. Po zakończeniu uruchamiania wyeksportuj dane qPCR jako plik .txt lub .xlsx.
    18. Przeanalizuj dane przy użyciu szablonów analizy dla testu CD8 i testu Treg (patrz tabela materiałów), aby obliczyć średnią Ct, odchylenie standardowe Ct i liczbę kopii.
szt. szt. szt. szt. szt. szt. Rozdział szt.
Początkowy numer kopii plazmidu/3 μLgłośnośćRozcieńczalnik DNA [1]Ostateczny numer kopii na 3 μletykieta
Numer katalogowy: 312501000 μL-Numer katalogowy: 31250Choroba przenoszona drogą płciową#1
Numer katalogowy: 31250200 μL800 μL6250Choroba przenoszona drogą płciową#2
6250200 μL800 μL1250Choroba przenoszona drogą płciową#3
1250200 μL800 μLZ kolei 250Choroba przenoszona drogą płciową#4
Z kolei 250200 μL800 μL50Choroba przenoszona drogą płciową#5
125030 μL1200 μLRozdział 30STD#6 [2]
[1] 10 ng/μL Lambda DNA w TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0)
[2] Użyj STD#3, aby przygotować STD#6

Tabela 1: Przygotowanie standardowych rozcieńczeń. Wzorce rozcieńczenia 4 log obejmujące 31250-30 kopii przygotowano zgodnie z tabelą, używając TE / lambda DNA jako rozcieńczalnika. Te same standardowe rozcieńczenia zastosowano zarówno dla CD8, jak i GAPDH. Wzorce przechowywano w temperaturze -20 °C.

Odczynnikikwota
DNA lambda (50 ng/μL w TE, pH 8,0)1 μL
Test TaqMan0,5 μL
Woda, wolna od nukleaz0,5 μL
Mistrz Mix5 μL
łączny7 μL

Tabela 2: Przygotowanie koktajlu qPCR. Przygotować główną mieszankę qPCR w dwóch oddzielnych probówkach, po jednej dla CD8 i GAPDH, z wyłączeniem matrycy DNA zgodnie z tabelą.

krokGodzinaNajwyższa tempCykli
Wstępna inkubacjaCzas trwania: 35 min95°C1X
Wzmocnienie15 sekund95°C50X
1 min61°C
Ochłonąć5 sekund42°C1X

Tabela 3: parametry przebiegu qPCR dla testu CD8 i Treg. qPCR przeprowadzono zgodnie z parametrami określonymi w tabeli.

5. Test Th17

  1. Oczyszczanie DNA po konwersji wodorosiarczynu
    1. Wykonaj etapy oczyszczania zgodnie z opisem w sekcji 4.1.
    2. Aby wymyć próbki, dodać 25 μl buforu elucyjnego do każdej probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 7 minut przy 1 400 obr./min. Alternatywnie, wiruj z umiarkowaną prędkością za pomocą adaptera piankowego.
    3. Krótko odkręć rurki i umieść na stojaku magnetycznym na 2 minuty.
    4. Przenieść 20 μl eluatu do nowej probówki, nie naruszając kulek. Eluat zawiera DNA przekształcone w wodorosiarczyn.
  2. Wstępna amplifikacja DNA
    UWAGA: Wstępna amplifikacja DNA jest zalecana dla celów o niskiej liczebności w celu dokładnej kwantyfikacji za pomocą qPCR19. Z tego powodu test metylacji Th17 został zaprojektowany tak, aby wymagał wstępnej amplifikacji.
    1. Przenieś 2 μl DNA przekształconego w wodorosiarczyn do probówek paskowych PCR. Stwórz probówkę NTC z 2 μl wody.
    2. Utwórz główny miks przedwzmacniacza dla wszystkich próbek (patrz Tabela 4).
    3. Dodać 23 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki. Zakryj rurki, odwiruj i krótko zakręć rurkami.
    4. Uruchom preampprotokół lifikacji na termocyklerze za pomocą podgrzewanej pokrywy. (Tabela 5). Po zakończeniu biegu krótko odkręć rurki.
    5. Przenieść 2 μl amplifikowanego DNA do nowych probówek i dodać 78 μl wody, rozcieńczając próbki w stosunku 1:40.
  3. Konfiguracja i uruchamianie qPCR
    1. Postępuj zgodnie z sekcją 4.2, aby skonfigurować i uruchomić qPCR.
  4. Analizuj dane przy użyciu szablonu analizy dla testu Th17 (patrz Tabela materiałów), aby obliczyć średnią Ct, odchylenie standardowe Ct i liczbę kopii.
Odczynnikkwota
Woda, wolna od nukleaz9,5 μl
Gorący start PCR Master Mix12,5 μl
Podkład do PCR Th171 μL
łączny23 μL

Tabela 4: Wstępna amplifikacja DNA do testu Th17. Główny miks reakcji przed amplifikacją został przygotowany zgodnie z tabelą.

krokGodzinaNajwyższa tempCykli
Wstępna inkubacjaCzas trwania: 35 min95°C1X
denaturacja1 min95°C12X
Wyżarzanie45 sekund55°C
Wydłużenie30 sekund72°C
Wydłużenie końcoweCzas trwania: 10 min72°C1X
trzymaćnieokreślony4°C

Tabela 5: Preamplifikacja DNA Th17. DNA Th17 było wstępnie amplifikowane przez 12 cykli przed właściwym qPCR.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie trzy testy metylacji rozpoczynają się od wprowadzenia gDNA i dają pewien procent limfocytów T CD8+, limfocytów Treg lub Th17 w całej populacji komórek. Dane wygenerowane z qPCR po konwersji wodorosiarczynu przeanalizowano przy użyciu dostarczonego szablonu analizy. W tym szablonie wykorzystano standardowe krzywe uzyskane z próbek standardowych do oszacowania liczby kopii celów i całkowitej liczby komórek w próbkach testowych. Typ komórki procentowej został następnie obliczony przy użyciu formuł zintegrowanych z szablonami analizy. Rysunek 1 pokazuje reprezentatywne dane z testu CD8+, uzyskane z analizy zarówno komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs), jak i limfocytów T od trzech różnych dawców przy użyciu zarówno cytometrii przepływowej, jak i opisanego testu metylacji. Tendencje między tymi dwiema metodami u wszystkich dawców w obu typach komórek były podobne. Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne dane z testu Treg. Trzech oczyszczonych dawców Treg analizowano zarówno przy użyciu qPCR opartego na metylacji, jak i cytometrii przepływowej, a wyniki przedstawiono na pokazanym wykresie. Wyniki dla obu metod były stosunkowo podobne. Jednak we wszystkich przypadkach cytometria przepływowa dała wyższe wartości. Rysunek 3 pokazuje porównanie komórek Th17 wykrytych za pomocą cytometrii przepływowej i metylacji. Na tym wykresie znajdują się warunki wymuszone i niestymulowane dla metod eksperymentalnych. Komórki wymagają stymulacji PMA i jonomycyną oraz leczenia inhibitorem transportu białek w celu zwiększenia ilości IL-17A obecnej w każdej komórce, tak aby można ją było wykryć za pomocą cytometrii przepływowej20. Stan metylacji można wykryć niezależnie od stanu stymulacji. Cytometria przepływowa wykazała niższe poziomy komórek Th17 w porównaniu z metylacją. Czułość i swoistość testu wykazano za pomocą wartości granicy ślepej próby (LOB), granicy wykrywalności (LOD) i granicy oznaczalności (LOQ) przedstawionych w tabeli 6.

figure-results-1
Rycina 1: Porównanie przepływu i metylacji procentów CD8 + zarówno dla PBMC, jak i limfocytów T dla trzech różnych dawców. PBMC i limfocyty T od trzech różnych dawców oznaczono pod kątem procentu limfocytów T CD8 + w całej populacji przy użyciu cytometrii przepływowej lub metylacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Porównanie przepływu i metylacji procentowej zawartości Treg dla oczyszczonego Treg dla trzech różnych dawców. Oczyszczone komórki Treg oznaczono pod kątem procentowej zawartości komórek Treg w całej populacji przy użyciu cytometrii przepływowej lub metylacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Porównanie przepływu i metylacji procentów Th17 dla stymulowanych i niestymulowanych grup eksperymentalnych. Stymulowane i niestymulowane limfocyty T analizowano zarówno przy użyciu cytometrii przepływowej, jak i metylacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: Rozdział
TestLobLodLoq
Płyta CD80Rozdział 19Rozdział 52
Gapdh0721
FoxP30312
Th17 TpG03573 Rozdział 73
Th17 CpG038 Rozdział 3873 Rozdział 73

Tabela 6: LoB, LoD, LoQ liczby kopii dla testów opartych na metylacji. Czułość i swoistość testu jest szczegółowo opisana przez wartości LoB, LoD i LoQ uzyskane przez wytyczne MIQE21,22. Ogólnie rzecz biorąc, za pomocą tych testów można dokładnie wykryć zaledwie 40 kopii.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z pojawieniem się nowych immunoterapeutyków istnieje zapotrzebowanie na ustandaryzowane metody wykrywania tożsamości i czystości komórek odpornościowych. Metody oceny testów w trakcie procesu i uwalniania, które są solidne, zwalidowane i skalowalne, nadal nie zostały ustalone i stanowią poważne wyzwanie dla komercjalizacji terapii komórkowych. Chociaż cytometria przepływowa jest obecnie najpowszechniejszą metodą fenotypowania komórek odpornościowych, wysokie wymagania dotyczące jakości i ilości próbek utrudniają jej regularne stosowanie. Co więcej, wdrożenie cytometrii przepływowej w środowisku dobrej praktyki wytwarzania (GMP) jest ograniczone przez zależne od operatora strategie bramkowania i wymóg wzorców referencyjnych dla każdego zastosowanego markera13,14. Chociaż wykazano, że zautomatyzowane bramkowanie poprawia solidność testów, nie jest to jeszcze dobrze ugruntowana strategia kontroli jakości. Chociaż profilowanie ekspresji genów może być również wykorzystywane do scharakteryzowania tożsamości i czystości produktu terapii komórkowej, dane są półilościowe i pracochłonne. Ponadto RNA i mikroRNA są stosunkowo mniej stabilne niż DNA i mogą przyczyniać się do braku solidnych i powtarzalnych wyników. W ten sposób wykorzystanie statusu metylacji epigenetycznego DNA określonego locus zapewnia stabilną, łatwą do wykonania, solidną i skalowalną metodę identyfikacji i ilościowego określania typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania.

Wykrywanie wzorców metylacji komórek fenotypowych opiera się na trzech krytycznych etapach: Po pierwsze, test wymaga użycia gDNA, które jest izolowane zgodnie z opisanymi metodami. Wymagana jest wysoka jakość DNA, a jeśli nie zostanie użyta, konwersja wodorosiarczynu może zostać zaburzona23,24. W przypadku uzyskania DNA niskiej jakości zaleca się dalsze oczyszczanie w celu zapewnienia wiarygodności testu. Po drugie, wymagana jest udana konwersja wodorosiarczynu niemetylowanej cytozyny do uracylu. Najbardziej krytycznym etapem konwersji wodorosiarczynu jest denaturacja DNA23,25. Denaturacja w wysokiej temperaturze przy użyciu wodorosiarczynu amonu, w przeciwieństwie do wodorosiarczynu sodu, zwiększa wydajność i konsystencję konwersji i jest zalecanym procesem dla tych testów25,26. Użytkownicy muszą upewnić się, że reakcja zachodzi w temperaturze 80 °C i że mieszanie próbki odbywa się często. Z tych powodów zalecany jest termomikser cyfrowy (patrz tabela materiałów). Po trzecie, podczas przygotowywania qPCR należy przestrzegać właściwej techniki pipetowania. Podczas reakcji qPCR wymagane są trzy kontrpróby techniczne, aby zachować minimalne wymagania dotyczące publikacji wytycznych dotyczących ilościowych eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym (MIQE)27. Włączenie bardziej technicznych replik jest dopuszczalne, ale nie jest wymagane. Niewłaściwa technika pipetowania i/lub brak powtórzeń technicznych może prowadzić do niewiarygodnych wyników qPCR.

Jeśli krytyczne kroki zostaną wykonane, a pożądane wyniki nadal nie zostaną uzyskane, można wykorzystać wiele kontroli w ramach testu, aby wskazać problem. Właściwa konwersja wodorosiarczynu jest najważniejszym krokiem w tym teście. Niewłaściwa konwersja wodorosiarczynu byłaby uwidoczniona przez nieudany współczynnik kalibracji i/lub wartości odniesienia obliczone za pomocą szablonu analizy. Jeśli konwersja wodorosiarczynu została przeprowadzona nieprawidłowo (np. jeśli reakcja została przeprowadzona w temperaturze RT), nie byłoby amplifikacji podczas qPCR. Nie zaobserwowano również amplifikacji, gdyby popełniono błąd podczas przygotowania reakcji qPCR (np. jeśli nie dodano głównej mieszanki qPCR). Te dwie kwestie można rozdzielić, badając standardowe próbki. Amplifikacja w próbkach wzorcowych, ale nie w próbkach referencyjnych, kalibratorowych i eksperymentalnych, wskazywałaby, że konwersja wodorosiarczynu nie została przeprowadzona prawidłowo. Brak amplifikacji w żadnej z próbek wskazywałby, że qPCR nie został wykonany prawidłowo.

Chociaż test ten odnosi się do rygorystycznych wymagań dotyczących próbek i zmienności analizy związanych z innymi metodami fenotypowania, w szczególności cytometrią przepływową, istnieją ograniczenia, na które należy zwrócić uwagę. Test ten jest ukierunkowany na pojedynczy locus, który jest używany jako unikalny identyfikator komórki docelowej, co uniemożliwia analizę multipleksowaną, która jest zwykle wykonywana za pomocą cytometrii przepływowej. To sprawia, że identyfikacja złożonych typów komórek, takich jak Th17, jest trudna. Wykazano jednak, że zastosowanie wzorców metylacji w pojedynczym locus jest dokładnym markerem fenotypowym wielu komórek i zostało wykorzystane w wielu badaniach klinicznych15,16. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku limfocytów Treg, w których ocena sygnatur metylacji FOXP3 jest dokładną i jednoznaczną metodą wykrywania prawdziwych limfocytów Treg z przejściowo eksprymujących FOXP3komórek 28. Utrata analizy multipleksowej jest kompensowana przez dokładność badanych loci. Przyszłe iteracje testu mogą obejmować wiele barwników qPCR i wygaszaczy, aby umożliwić wykrycie wielu loci w jednej reakcji qPCR.

Test ten może być stosowany jako alternatywna metoda cytometrii przepływowej w określaniu fenotypu i tożsamości komórki. Należy zauważyć, że test ten nie daje dokładnych wartości, które daje cytometria przepływowa (ryc. 1-3). Wynika to częściowo ze zmienności analizy danych związanej z cytometrią przepływową. W zależności od strategii bramkowania, wyniki cytometrii przepływowej mogą się znacznie różnić. Dzieje się tak zwłaszcza w przypadku stosowania złożonych protokołów barwienia w celu przyjrzenia się celom wewnątrzkomórkowym, takim jak IL-17, gdzie współczynnik zmienności (CV) może wynosić nawet 15%14. Prezentowany test dla wielu użytkowników miał konsekwentnie CV na poziomie <15%, co potwierdza solidność testu i ulepszone możliwości standaryzacji. Największe różnice między fenotypowaniem epigenetycznym a fenotypowaniem opartym na cytometrii przepływowej obserwuje się, gdy wymagana jest stymulacja komórek (ryc. 3). Wykrywanie komórek Th17 za pomocą cytometrii przepływowej osiągnięto przy użyciu wspólnego protokołu stymulacji limfocytów T i barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych 29,30,31. Różnice obserwowane w fenotypowaniu Th17 między pomiarem epigenetycznym a cytometrią przepływową mogą wynikać z kinetyki produkcji IL-17. Podczas gdy sygnatury metylacji są stałe, produkcja białek wymaga czasu i musi być obecna w wystarczających ilościach, aby mogła zostać wykryta przez przeciwciała fluorescencyjne20,32. 6-godzinna inkubacja z inhibitorem transportu białek i koktajlem stymulacji komórek może wymagać przedłużenia, aby zobaczyć poziom komórek Th17 wykrytych za pomocą metod fenotypowania opartych na epigenetyce. Potrzebne są dalsze badania, aby określić dokładny powód, dla którego wartości nie są zgodne, i określić najdokładniejszą metodę fenotypowania.

W tym raporcie szczegółowo opisujemy, jak w prosty i niezawodny sposób zidentyfikować i określić ilościowo typy komórek odpornościowych w heterogenicznej mieszaninie komórek. Testy zostały zaprojektowane i zoptymalizowane pod kątem potencjalnego wykorzystania w testach w trakcie procesu i uwalniania terapii opartych na komórkach. Opisane testy spełniają wymagania dotyczące wysoko kwalifikowanych surowców do stosowania w zastosowaniach terapii komórkowej. Odnosząc się do niedociągnięć cytometrii przepływowej i innych metod molekularnych, takich jak stabilność, wymagania dotyczące próbki, wcześniejsza stymulacja, przepuszczalność komórkowa do barwienia wewnątrzkomórkowego i subiektywność analizy danych, opisane testy są zgodne z celami komercjalizacji terapii komórkowych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Suman K. Pradhan, Jerry Guzman, Carl Dargitz, Mark Landon i Uma Lakshmipathy są zatrudnieni w Thermo Fisher Scientific. Sven Olek, Bjoern Samans i Ulrich Hoffmueller są założycielem i pracownikami firmy Epiontis. Przy tworzeniu tego rękopisu nie korzystano z pomocy pisarskiej.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt został sfinansowany z grantu Thermo Fisher Scientific Intramural

.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,0 ml probówek Eppendorf Safe-LockSzablon analizy Eppendorf22363344
do testuKliknij tutaj
Szablon analizy dla testuTh17Kliknij tutaj
Szablon analizy do testuKliknij tutaj
Attune Cytometr akustyczny NxT, niebieski/czerwony/fioletowy6/żółtyThermo Test komórek T Fisher ScientificA29004
CTS PureQuant CD8 +Thermo Fisher ScientificA43674
Test CTS PureQuant Th17Thermo Fisher ScientificA43676
Test CTS PureQuant TregThermo Fisher ScientificA43675
Dynabeads SILANE Zestaw genomowego DNAThermo Fisher Scientific37012DSłuży do izolacji i oczyszczania genomowego DNA po konwersji wodorosiarczynu. Zawiera bufor elucyjny do rozcieńczania próbek.
Magnes DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321DUżywany jako stojak magnetyczny podczas izolacji i oczyszczania DNA
eBioscience Niezbędny zestaw do fenotypowania ludzkich komórek TThermo Fisher ScientificA42923
eBioscience Essential Human Th1/Th17 Zestaw do fenotypowaniaThermo Fisher ScientificA42927
eBioscience Niezbędny zestaw do fenotypowania ludzkiego TregThermo Fisher ScientificA42925
Eppendorf SmartBlock 2 mLEppendorf5362000035
Eppendorf ThermoMixer CEppendorf5382000023
Mikser próbek HulaMixerThermo Fisher Scientific15920DZalecany mikser próbek
NanoDropThermo Fisher ScientificND 1000
Nieprzywierający, bez RNaz Microfuge Probówki, 1,5 mlApplied BiosystemsAM12450
QuantStudio 12S FlexApplied Biosystems4470661
TE, pH 8,0, bez RNazThermo Fisher ScientificAM9849
Mieszalnik wirowyThermo Fisher ScientificH2KT17113
CD8 Treg

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartmann, J., Schüßler-Lenz, M., Bondanza, A., Buchholz, C. J. Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts. EMBO Molecular Medicine. 9, 1183-1197 (2017).
  2. Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., Benjamin, R. Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access? Cells. 7, E155(2018).
  3. Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. Journal of Clinical Investigation. 126, 2123-2138 (2016).
  4. Akalin, I., et al. Effects of Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expression on Regulatory T Cells. Molecular Therapy. 17, S25(2009).
  5. Knochelmann, H. M., et al. CAR T Cells in Solid Tumors: Blueprints for Building Effective Therapies. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  6. Chen, M. L., et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-β signals in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 419-424 (2005).
  7. Muranski, P., et al. Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood. 112, 362-373 (2008).
  8. Majchrzak, K., et al. Exploiting IL-17-producing CD4+ and CD8+ T cells to improve cancer immunotherapy in the clinic. Cancer Immunology, Immunotherapy. 65, 247-259 (2016).
  9. Guedan, S., et al. ICOS-based chimeric antigen receptors program bipolar TH17/TH1 cells. Blood. 124, 1070-1080 (2014).
  10. Vicetti Miguel, R. D., Maryak, S. A., Cherpes, T. L. Brefeldin A, but not monensin, enables flow cytometric detection of interleukin-4 within peripheral T cells responding to ex vivo stimulation with Chlamydia trachomatis. Journal of Immunological Methods. 384, 191-195 (2012).
  11. Lovelace, P., Maecker, H. T. Multiparameter Intracellular Cytokine Staining. Methods in Molecular Biology. 699, 165-178 (2011).
  12. Presicce, P., Moreno-Fernandez, M. E., Lages, C. S., Orsborn, K. I., Chougnet, C. A. Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3. Cytometry A. 77, 571-579 (2010).
  13. Pachón, G., Caragol, I., Petriz, J. Subjectivity and flow cytometric variability. Nature Reviews Immunology. 12, 396(2012).
  14. Westera, L., et al. Centrally Determined Standardization of Flow Cytometry Methods Reduces Interlaboratory Variation in a Prospective Multicenter Study. Clinical and Translational Gastroenterology. 8, e126(2017).
  15. Baron, U., et al. Epigenetic immune cell counting in human blood samples for immunodiagnostics. Science Translational Medicine. 10, (2018).
  16. Kleen, T. O., Yuan, J. Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic - based immune cell quantification in blood and tissue. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 46(2015).
  17. Rapko, S., et al. DNA methylation analysis as novel tool for quality control in regenerative medicine. Tissue Engineering. 13, 2271-2280 (2007).
  18. Wieczorek, G., et al. Quantitative DNA Methylation Analysis of FOXP3 as a New Method for Counting Regulatory T Cells in Peripheral Blood and Solid Tissue. Cancer Research. 69, 599-608 (2009).
  19. Andersson, D., et al. Properties of targeted preamplification in DNA and cDNA quantification. Expert Review of Molecular Diagnosis. 15, 1085-1100 (2015).
  20. Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 159, 197-207 (1993).
  21. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation. Clinical Biochemistry Reviews. 29, S49-S52 (2008).
  22. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55, 611-622 (2009).
  23. Li, Y., Tollefsbol, T. O. DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis. Methods in Molecular Biology. 791, 11-21 (2011).
  24. Warnecke, P. M., et al. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 27, 101-107 (2002).
  25. Genereux, D. P., Johnson, W. C., Burden, A. F., Stöger, R., Laird, C. D. Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failed-conversion frequencies. Nucleic Acids Research. 36, e150(2008).
  26. Darst, R. P., Pardo, C. E., Ai, L., Brown, K. D., Kladde, M. P. Bisulfite Sequencing of DNA. Current Protocols in Molecular Biology. 91, 7.9.1-7.9.7 (2010).
  27. Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50, S1-S5 (2010).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. European Journal of Immunology. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Yao, Z., et al. Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. Journal of Immunology. 155, 5483-5486 (1995).
  30. Lockhart, E., Green, A. M., Flynn, J. L. IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Immunology. 177, 4662-4669 (2006).
  31. Liang, S. C., et al. Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. Journal of Experimental Medicine. 203, 2271-2279 (2006).
  32. Olsen, I., Sollid, L. M. Pitfalls in determining the cytokine profile of human T cells. Journal of Immunological Methods. 390, 106-112 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epigenetic Based Quantitative PCRDNA Methylation AnalysisBisulfite ConversionGenomic DNA IsolationImmune Cell PurityCD8 T Cell AssayRegulatory T Cell AssayTh17 T Cell AssayAutomated Data AnalysisCell Therapy Manufacturing

Related Articles