Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół oceny elektromechanicznych efektów aktywacji GtACR1 w kardiomiocytach królików. Dostarczamy szczegółowych informacji na temat izolacji komórek, hodowli i transdukcji adenowirusa oraz na temat eksperymentów funkcjonalnych z użyciem technik patch-clamp i włókna węglowego.

Streszczenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad, narzędzia optogenetyczne stały się skutecznymi środkami do modulowania specyficznej dla danego typu komórki aktywności w tkankach pobudliwych, w tym w sercu. Podczas gdy rodopsyna kanałowa-2 (ChR2) jest powszechnym narzędziem do depolaryzacji potencjału błonowego w kardiomiocytach (CM), potencjalnie wywołując potencjały czynnościowe (AP), brakuje skutecznego narzędzia do niezawodnego wyciszania aktywności CM. Zasugerowano stosowanie rodopsyn anionokanałowych (ACR) do inhibicji optogenetycznej. W tym miejscu opisujemy protokół oceny skutków aktywacji naturalnego ACR GtACR1 z Guillardia theta u hodowanych królików CM. Podstawowymi odczytami są elektrofizjologiczne zapisy patch-clamp i optyczne śledzenie skurczów CM, oba wykonywane przy zastosowaniu różnych wzorców stymulacji świetlnej. Protokół obejmuje izolację CM z serca królika, wysiew i hodowlę komórek przez okres do 4 dni, transdukcję za pomocą kodowania adenowirusa dla kanału chlorkowego bramkowanego światłem, przygotowanie układów patch-clamp i włókien węglowych, gromadzenie i analizę danych. Zastosowanie techniki patch-clamp w konfiguracji całoogniwowej pozwala na rejestrację prądów aktywowanych światłem (w trybie cęgowym napięciem, V-cęgowym) i AP (tryb cęgowy prądu, I-cęgi) w czasie rzeczywistym. Oprócz eksperymentów z użyciem patch-clamp przeprowadzamy pomiary kurczliwości w celu funkcjonalnej oceny aktywności CM bez naruszania środowiska wewnątrzkomórkowego. W tym celu komórki są wstępnie obciążane mechanicznie za pomocą włókien węglowych, a skurcze są rejestrowane poprzez śledzenie zmian długości sarkomeru i odległości włókna węglowego. Analiza danych obejmuje ocenę czasu trwania AP na podstawie nagrań I-clamp, prądów szczytowych na podstawie nagrań V-clamp oraz obliczenia siły na podstawie pomiarów włókna węglowego. Opisany protokół może być zastosowany do badania biofizycznego wpływu różnych siłowników optogenetycznych na aktywność CM, co jest warunkiem wstępnym dla rozwoju mechanistycznego zrozumienia eksperymentów optogenetycznych w tkance serca i całych sercach.

Wprowadzenie

Prądy fotologiczne za pośrednictwem ChR zostały po raz pierwszy zarejestrowane w plamce oka jednokomórkowych zielonych alg^1,2. Wkrótce po klonowaniu genetycznym i heterologicznej ekspresji Chlamydomonas reinhardtii ChR1 i ChR2, ChR zostały użyte jako narzędzia do zmiany potencjału błonowego w oocytach Xenopus i komórkach ssaków za pomocą light^3,4. Kationowe nieselektywne ChR depolaryzują błonę komórek o spoczynkowym potencjale błonowym, który jest ujemny w stosunku do potencjału odwrócenia ChR. W ten sposób można je wykorzystać do wywołania AP w pobudliwych komórkach, w tym neuronach i CM, umożliwiając stymulację optyczną^5,6.

Komplementarne do kationów ChR, napędzane światłem pompy protonowe, chlorkowe i sodowe^7,8,9 zostały użyte do hamowania aktywności neuronalnej^10,11,12. Te ostatnie mają jednak ograniczenia, wymagające dużego natężenia światła i ciągłego oświetlenia, ponieważ jeden jon jest transportowany na pochłonięty foton. W 2014 roku dwa niezależne badania przeprowadzone przez Wietek i wsp. oraz Berndt i wsp. opisały konwersję ChR przewodzącego kationy do ACR poprzez mutacje w kanale pore^13,14. Rok później odkryto naturalne ACR u kryptofitu Guillardia theta (GtACR)¹⁵. Ponieważ zmodyfikowane ACR wykazywały szczątkową przewodność kationową, zostały one zastąpione naturalnym ACR, charakteryzującym się dużą przewodnością jednokanałową i wysoką czułością na światło¹⁵. GtACR zostały użyte do wyciszenia aktywności neuronalnej poprzez polaryzację potencjału błonowego w kierunku potencjału odwrócenia chloride^16,17. Govorunova i in. zastosowali GtACR1 do hodowli CM komory szczura i wykazali skuteczne hamowanie fotoinhibicyjne przy niskich poziomach natężenia światła, które nie były wystarczające do aktywacji wcześniej dostępnych narzędzi hamujących, takich jak pompa protonowa Arch¹⁸. Nasza grupa poinformowała niedawno, że fotoinhibicja CM za pośrednictwem GtACR1 opiera się na depolaryzacji i że GtACR1 może być również używany do stymulacji optycznej CM¹⁹.

Tutaj prezentujemy protokół do badania elektrofizjologicznych i mechanicznych efektów fotoaktywacji GtACR1 na CM komory hodowlanego królika. Najpierw opiszemy izolację komórek, hodowlę i transdukcję. Efekty elektrofizjologiczne są mierzone za pomocą zapisów z użyciem klamry krosowej całej komórki. Prądy zależne od światła przy danym napięciu membrany są oceniane w trybie V-clamp. Dynamika potencjału membrany jest mierzona podczas elektrycznego lub optycznego stymulowania CM (tryb I-clamp). Optyczne hamowanie elektrycznie wyzwalanego AP jest testowane przy użyciu długotrwałego światła. Efekty mechaniczne są mierzone za pomocą włókien węglowych w połączeniu ze śledzeniem długości sarkomeru opartym na obrazowaniu. Aby to zrobić, optycznie rozpędzone komórki są wstępnie obciążane mechanicznie poprzez przymocowanie dwóch włókien węglowych do błony plazmatycznej w pobliżu przeciwległych końców komórek. Zmiany długości sarkomeru są rejestrowane podczas stymulacji optycznej lub elektrycznej. Na koniec mierzy się fotoinhibicję podczas stymulacji komórek polem elektrycznym i analizuje generowane siły.

Protokół obejmuje następujące kroki pokazane na schemacie blokowym na rysunku 1: głębokie znieczulenie królika, wstrzyknięcie przedawkowania tiopentalu, wycięcie serca, perfuzja Langendorffa i trawienie tkanek, mechaniczna dysocjacja tkanki w celu uwolnienia komórek, analiza mikroskopowa wydajności CM, hodowla CM, transdukcja adenowirusem typu 5, a następnie inkubacja i eksperymenty funkcjonalne.

Rysunek 1: Schemat blokowy protokołu używanego do uzyskania elektrycznego i optycznego tempa CM. Serca są wycinane od królików w wieku 9-10 tygodni, a tkanka serca jest trawiona podczas perfuzji za pomocą zestawu Langendorffa. Komórki są uwalniane przez mieszanie mechaniczne. Wydajność CM jest liczona pod mikroskopem. CM są hodowane, transdukowane adenowirusem typu 5, a eksperymenty funkcjonalne są wykonywane 48-72 godziny po transdukcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na królikach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zawartymi w Dyrektywie Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych i zatwierdzonych przez władze lokalne w Badenii-Wirtembergii (Regierungspräsidium Freiburg, X-16/10R, Niemcy).

1. Rozwiązania do izolacji komórek

1. Przygotować roztwory do izolacji komórek wodą zgodnie z poniższymi wymaganiami (tabela 1) i zgodnie ze składem jonowym wymienionym w tabeli 2.
   UWAGA: CaCl₂ i MgCl₂ dodaje się z 1 M roztworów podstawowych.

punktu

	Wymagania dotyczące wody
Przewodność [μS/cm] przy 25 °C	0,055
Pirogen [EU/ml]	< 0,001
Cząstka (wielkość > 0,22 μm) [1/mL]	≤ 1
Węgiel organiczny ogółem [ppb]	< 5
Mikroorganizmy [jtk/ml]	≤ 1
RNaza [ng/ml]	< 0,01
DNaza [ng/ml]	< 4

Tabela 1: Wymagania dotyczące wody.

szt. punktu pkt.

	Roztwór soli fizjologicznej (1)	Roztwór o niskiej zawartości wapnia i wysokiej zawartości potasu (2)	Roztwór enzymatyczny (3)	Rozwiązanie blokujące
NaCl [mM]	Rozdział 137	Rozdział 137	Rozdział 137	Rozdział 137
KCl [mM]	4	14	14	14
FILTR ELEKTROMAGNETYCZNY [mM]	10	10	10	10
Kreatyna [mM]	10	10	10	10
Tauryna [mM]	20	20	20	20
Stężenie glukozy [mM]	10	10	10	10
MgCl2 [mM]	1	1	1	1
Adenozyna [mM]	5	5	5	5
L-karnityna [mM]	cyfra arabska	cyfra arabska	cyfra arabska	cyfra arabska
CaCl2 [mM]	1	-	0,1	0,1
Na-heparyna [j.m./l]	5000	-	-	-
EGTA [mM]	-	0,096
Kolagenaza typu 2, 315 U/mg [g/L]	-	-	0,6	-
Proteaza XIV [g/L]	-	-	0,03	-
Albumina surowicy bydlęcej [%]	-	-	-	0,5
Osmolarność [mOsmol/L]	325 ± 5	345 ± 5	345 ± 5	345 ± 5

Tabela 2: Rozwiązania do izolacji CM.

2. Doprowadzić wszystkie roztwory do pH 7,4 w temperaturze 37 °C i sprawdzić osmolarność.
   UWAGA: Rozpuść enzymy (kolagenazę typu 2 i proteazę XIV) bezpośrednio przed wycięciem serca. Natlenić wszystkie roztwory przed użyciem.

2. Przygotowanie zestawu do perfuzji Langendorffa-

UWAGA: Używana konfiguracja jest wykonana na zamówienie. Jak pokazano na rysunku Rysunek 2, konfiguracja składa się z trzech zbiorników z płaszczem wodnym (1-3), jednego spiralnego przeciwprądowego wymiennika ciepła (4) i naczynia perfuzyjnego z płaszczem wodnym (5).

Rysunek 2: Konfiguracja perfuzji Langendorffa zoptymalizowana pod kątem izolacji komórek królika. (1-3) Zbiorniki z płaszczem wodnym z (1) fizjologicznym roztworem soli, (2) roztworem o niskiej zawartości wapnia i wysokiej zawartości potasu oraz (3) roztworem kardioplegicznym zawierającym enzymy. (4) Spiralny przeciwprądowy wymiennik ciepła i (5) zbiornik zbiorczy z płaszczem wodnym. Dopływem systemu z płaszczem wodnym jest spiralny wymiennik ciepła (temperatura roztworów opuszczających kaniulę perfuzyjną na końcu wymiennika ciepła powinna być stała i wynosi 37 °C), a następnie naczynie perfuzyjne i trzy zbiorniki. Wszystkie roztwory są natlenione (linia przerywana). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Włączyć pompę łaźni wodnej w celu cyrkulacji wody o temperaturze 38 °C w systemie wymiany ciepła i podgrzać wszystkie roztwory do temperatury 37 °C.
   UWAGA: Temperatura na wylocie z (4) musi być kontrolowana i stała i wynosić 37 °C.
2. Napełnij trzy zbiorniki odpowiednim roztworem i umyj każdą linię (czarną) odpowiednim roztworem. Napełnij główną (niebieską) linię na końcu bez pęcherzyków powietrza roztworem (1).
   UWAGA: Natleniać roztwory przed (10 min) i w trakcie użytkowania. Napełnij przewód od zbiornika (3) do kranu roztworem o niskiej zawartości wapnia i wysokiej zawartości potasu.
3. Przygotuj szew, aby zawiązać serce wokół aorty przy kaniuli.

3. Izolacja komórek

1. Przygotować następujące strzykawki.
   1. Do sedacji/znieczulenia: Wymieszać 0,5 ml/kg masy ciała chlorowodorek esketaminy (25 mg/ml) i 0,2 ml/kg m.c. chlorowodorek ksylazyny (2%).
   2. Napełnij dwie strzykawki 12 ml roztworu NaCl (0,9%).
   3. Przygotować 6 ml 12,5 mg/ml Na-tiopentalu rozpuszczonego w 0,9% roztworze NaCl.
   4. Wlać 0,2 ml chlorowodorku esketaminy (25 mg/ml) do strzykawki.
   5. Rozcieńczyć 0,2 ml Na-heparyny (5 000 j.m./ml) w 1 ml 0,9% roztworu NaCl (stężenie końcowe 1,000 j.m./ml).
2. Uspokoić/znieczulić króliki (9-10 tygodni, biały królik nowozelandzki, samica lub samiec, ~ 2 kg) poprzez domięśniowe wstrzyknięcie chlorowodorku esketaminy i chlorowodorku ksylazyny (krok 3.1.1).
   UWAGA: Króliki potrzebują co najmniej 10 minut, aby zostać w pełni znieczulone; Dokładny czas trwania zależy od ich masy ciała. Potwierdź znieczulenie z utratą odruchu prostowania.
3. Ogol klatkę piersiową i uszy, w których znajdują się żyły.
4. Włóż elastyczną kaniulę do żyły usznej, przymocuj ją taśmą i przepłucz 0,9% roztworem NaCl.
5. Wstrzyknąć dożylnie 1 ml roztworu Na-heparyny i przepłukać 0,9% roztworem NaCl.
6. Wstrzyknąć 0,2 ml chlorowodorku esketaminy, ponownie przepłukać 0,9% roztworem NaCl i wstrzyknąć Na-tiopental aż do bezdechu.
   UWAGA: Królik nie powinien reagować na odruch wycofania pedału.
7. Otwórz klatkę piersiową po lewej stronie i usuń osierdzie.
8. Uruchom minutnik po wycięciu serca i umyj je dwukrotnie w roztworze soli fizjologicznej.
   UWAGA: Użyj nożyczek z okrągłymi końcówkami, aby zapobiec przypadkowemu uszkodzeniu tkanki serca.
9. Kankatuluj aortę w kąpieli z roztworem soli fizjologicznej i trzymaj wszystkie tkanki w roztworze. Włączyć system perfuzji Langendorffa (roztwór soli fizjologicznej (1), prędkość 24 ml/min).
10. Przenieś serce do układu perfuzji Langendorffa, połącz aortę z dyszą perfuzatu i mocno przywiąż serce ze szwem wokół aorty do kaniuli (< 1 min).
    UWAGA: Wstępnie napełnij kaniulę roztworem soli fizjologicznej, upewnij się, że żadne pęcherzyki powietrza nie dostały się do kaniuli podczas transportu z miejsca kaniulacji do zestawu Langendorffa, podłącz bez pęcherzyków.
11. Ukrwić serce, aż cała krew zostanie wypłukana (2-3 min).
12. Przełącz się na roztwór o niskiej zawartości wapnia i wysokiej zawartości potasu (2). Perfuzja przez kolejne 2 minuty po tym, jak serce przestanie bić i przejść na roztwór enzymu.
13. Rozpocznij recyrkulację roztworu enzymu, po 2 minutach od rozpoczęcia trawienia, z powrotem do zbiornika. Zmniejsz prędkość do 16 ml/min po 5 minutach trawienia.
14. Gdy tkanka wydaje się miękka (40-50 min trawienia), odetnij serce od kaniuli i oddziel lewą komorę.
15. Uwolnij komórki przez mechaniczną dysocjację (delikatne rozdzielenie tkanki za pomocą pipety i cienkich kleszczyków, aby utrzymać tkankę) w roztworze blokującym.
16. Przefiltrować zawiesinę komórek przez siatkę (wielkość porów 1^mm2) i odwirować przez 2 minuty przy 22 x g (przyspieszenie grawitacyjne).
17. Usunąć supernatant zawierający nie-miocyty i ponownie zawiesić CM w roztworze blokującym.

4. Hodowla CM

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w sterylnych warunkach.

1. Rozcieńczyć Lamininę (z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm, 1 mg / ml) 1:10 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (bez Ca^{2 +} / Mg²⁺) do końcowego stężenia 100 μg / ml.
2. Przygotować pożywkę w pożywce M199 z dodatkami, jak wskazano w Tabeli 3.

pkt. pkt.

	Pożywka do hodowli komórkowych w pożywce M199-Medium
Kreatyna [mM]	5
Chlorowodorek L-karnityny [mM]	cyfra arabska
Tauryna [mM]	5
Na-Pyruvat [mM]	1
Insulina (trzustka bydlęca) [U/L]	0,25
Cytozyno-β-D-arabinofuranozyd [mM]	0,01
Gentamycyna [mg/ml]	0,05

Tabela 3: Pożywka do hodowli komórkowych.

3. Sterylny roztwór filtrujący (0,22 μm) i dodać 5% płodowej surowicy bydlęcej.
4. Do eksperymentów z patch-clamp autoklawe szkiełka nakrywkowe ø 16 mm, grubość nr 0, należy je pokryć 100 μg/ml lamininą bezpośrednio przed hodowlą.
5. W przypadku eksperymentów z włóknem węglowym pokryj powierzchnię szalki Petriego poli(2-hydroksyetylometakrylanem) (poli-HEMA, 0,12 g / ml w 95:5 EtOH:H₂0) i pozwól jej zastygnąć.
   UWAGA: Komórki nie "przyklejają się" do szalek Petriego pokrytych poli-HEMA; Ma to kluczowe znaczenie dla ich skurczu bez tarcia w badaniach mechaniki komórki.
6. Po ustabilizowaniu się ponownie zawieszonego CM (~10-15 min) należy usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić CM w pożywce hodowlanej.
7. Policz CM za pomocą komory Neubauera i zasiewu o docelowej gęstości 17 500 komórek/ml na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą lub na szalkach Petriego pokrytych poli-HEMA.
8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 3-4 godziny. Wymienić podłoże (37 °C) komórek nasiennych szkiełka nakrywkowego.
9. Dodać kodowanie adenowirusa (typu 5) dla GtACR1-eGFP przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 75 i rozpocząć eksperymenty funkcjonalne po 48 godzinach.
   UWAGA: Po transdukcji utrzymuj komórki w ciemności. Użyj czerwonego podświetlenia podczas pracy z białkami aktywowanymi niebieskim lub zielonym światłem. Dostępny na rynku system dostarczania adenowirusa (patrz tabela materiałów) jest używany do klonowania genów kodujących GtACR1-eGFP do wektora adenowirusowego. Wkładka, która jest przedmiotem zainteresowania, w tym przypadku GtACR1-eGFP, jest amplifikowana metodą PCR, a następnie łączona z wektorem adenowirusowym, w tym promotorem CMV, w reakcji klonowania IN-Fusion. Promotor CMV (ludzki wirus cytomegalii) jest powszechnie stosowany do napędzania nadekspresji transgenów w komórkach ssaków. eGFP jest wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji pochodzącym z Aequorea victoria o maksimum wzbudzenia 488 nm i maksimum emisji przy 507 nm. Adenowirus (typ 5) został wyprodukowany zewnętrznie w Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin, Prof. Dr. Michael Schupp.
   UWAGA: Transdukcja adenowirusowa jest klasyfikowana jako praca na poziomie bezpieczeństwa BSL-2, a odpowiednie środki bezpieczeństwa są wymagane prawnie.

5. Eksperymenty funkcjonalne

UWAGA: Nagrania są wykonywane przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Przefiltrować światło transmisyjne przez czerwony filtr pasmowo-przepustowy (630/20 nm) w kondensatorze, aby uniknąć koaktywacji GtACR1.

1. Konfiguracja zacisku krosowego
   1. Użyj wzmacniacza w połączeniu z przetwornikiem analogowo-cyfrowym. Użyj oprogramowania do akwizycji danych, aby zarejestrować dane dotyczące prądu i napięcia (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Nagrane dane są digitalizowane z częstotliwością 10 kHz i filtrowane z częstotliwością 5 kHz.
2. Konfiguracja z włókna węglowego
   1. Użyj kamery, aby wykryć położenie włókna węglowego i długość sarkomeru, śledząc zmiany kontrastu optycznego (włókna węglowe pojawiają się jako ciemniejsze struktury, nałożone na prążkowany wzór komórek). Schematyczne przedstawienie konfiguracji jest pokazane w Rysunek 3.
      UWAGA: Długość sarkomeru jest obliczana w czasie rzeczywistym przy użyciu szybkiej transformaty Fouriera (FFT) widma mocy wzoru prążkowania.

Rysunek 3: Schemat przedstawiający eksperymentalną konfigurację do pomiarów włókna węglowego. (Rysunek nie jest w skali). Dwa włókna węglowe są przymocowane do ogniwa, a ich położenie jest kontrolowane przez pozycjoner piezoelektryczny. Stymulator służy do stymulacji polem elektrycznym. Wielokolorowe diody LED są sprzężone z portem epifluorescencji mikroskopu odwróconego w celu oświetlenia komórek w płaszczyźnie obiektu. Zasilanie diod LED jest sterowane za pomocą dedykowanej skrzynki sterowniczej, która odbiera impulsy cyfrowe za pośrednictwem wyjścia cyfrowego przetwornika cyfrowo-analogowego (DAC). Przetwornik cyfrowo-analogowy komunikuje się poprzez wyjście analogowe z interfejsem systemu fluorescencyjnego. Czarno-biała kamera (774 piksele na 245 linii) do obrazowania komórkowego jest podłączona do komputera w celu śledzenia długości sarkomeru i wygięcia włókna węglowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Oświetlenie czasowe
   1. Zapewnij światło do mikroskopii fluorescencyjnej i aktywacji kanałów jonowych bramkowanych światłem za pomocą zewnętrznej, specjalnie zbudowanej skrzynki kontrolnej LED, składającej się z trzech diod LED o różnych kolorach (460 nm, 525 nm, 640 nm, patrz tabela materiałów).
   2. Zmodyfikuj kod mikrokontrolera i graficznego interfejsu użytkownika (GUI) dla skrzynki sterowniczej, aby umożliwić sterowanie diodą LED za pomocą zewnętrznych impulsów czasu życia (TTL), generowanych w protokołach oprogramowania do akwizycji danych (patrz tabela materiałów). Przesyłaj impulsy TTL do skrzynki sterowniczej LED za pomocą konwertera cyfrowo-analogowego.
   3. Steruj diodą LED i wybierz liczbę impulsów za pomocą graficznego interfejsu użytkownika. Po otrzymaniu polecenia z GUI mikrokontroler rozpoczyna proces na nowym rdzeniu. W tym procesie wejście TTL oraz przełącznik sterujący ustawiony z GUI będą stale sprawdzane.
   4. Gdy wejście TTL jest dodatnie, mikrokontroler włącza diodę LED, a następnie wznawia sprawdzanie wejścia TTL. Gdy sygnał TTL powróci do zera, mikrokontroler wyłącza diodę LED i zmniejsza liczbę pozostawionych impulsów o jeden. Jeśli w dowolnym momencie przełącznik sterujący jest fałszywy lub liczba impulsów wynosi zero, mikrokontroler zatrzymuje ten proces do momentu otrzymania nowego polecenia z GUI.
   5. Bezpośrednio podłącz diody LED do tylnego portu mikroskopu.
4. Wyznaczanie natężenia światła w płaszczyźnie obiektu
   1. Zmierz oświetlony obszar za pomocą mikrometru stolikowego (powiększenie obiektywu 40x, A = 0,8 mm²).
   2. Użyj miernika mocy optycznej (patrz Tabela materiałów).
   3. Zdefiniuj ustawienia dla eksperymentów: długość fali wzbudzenia (525 nm), powiększenie obiektywu (40x), filtr wzbudzenia (530/20 nm) lub lustro i odczytaj moc światła [W] przy różnych napięciach wejściowych LED.
   4. Oblicz natężenie światła [W/mm²], dzieląc moc światła [W] przez oświetlany obszar [mm²] (tutaj: 0,8 mm²).
      UWAGA: Zmierz rzeczywistą moc światła za pomocą odpowiednich protokołów w kroku 5.6, aby sprawdzić, czy krótkie czasy trwania impulsów świetlnych wynoszące 10 ms osiągają i długie czasy trwania utrzymują ustawioną wartość (rysunek uzupełniający 1).
5. Przygotowanie do eksperymentów z zaciskami krosowymi
   1. Przygotować następujące roztwory zewnętrzne i wewnętrzne (Tabela 4; wymagania dotyczące wody patrz Tabela 1).
   2. Dostosować osmolarność z glukozą do 300 ± 5 mOsmol/L. Podwielokrotność roztworu wewnętrznego i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Roztwór wewnętrzny należy przechowywać na lodzie w dniu nagrania. Roztwór zewnętrzny należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Opisane tutaj rozwiązania patch-clamp zostały oparte na wcześniej stosowanych roztworach, a stężenie Cl^- zostało zmienione na niższe, bardziej fizjologiczne poziomy⁷. W celu scharakteryzowania selektywności jonowej odpowiedniego siłownika optogenetycznego sugerujemy zmianę stężeń głównych jonów (np. Cl^-, Na⁺, K⁺, H⁺) w roztworach zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych¹⁹.
   3. Zdjąć elektrodę rejestrującą z uchwytu na pipety i usunąć warstwę chlorku srebra z drutu srebrnego bardzo drobnym papierem ściernym.
      UWAGA: Wykonaj ten krok na początku każdego dnia pomiarowego.
   4. Podłącz przewód do bieguna dodatniego akumulatora 1.5 V i zanurz w roztworze 3 M KCl do powlekania chlorkiem srebra na 10 minut
      UWAGA: Biegun ujemny jest podłączony do referencyjnego srebrnego drutu zanurzonego w roztworze 3 M KCl.
   5. Przygotować komorę pomiarową: nałożyć smar silikonowy na ramę komory pomiarowej i umieścić szkiełko nakrywkowe (średnica: 50 mm, grubość nr 0) na górze ramy, w której komora jest uszczelniona.
   6. Umieść referencyjną elektrodę z granulkami srebra/chlorku srebra w kąpieli i połącz ją ze stopniem głównym.
   7. Wyciągnij pipety krosowe 1,7 - 2,5 MΩ z kapilar ze szkła sodowo-wapniowego (średnica zewnętrzna: 1,55 mm, średnica wewnętrzna: 1,15 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet (patrz tabela materiałów).
   8. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych i dostosuj test membranowy (impuls 10 mV przez 15 ms, linia bazowa 0 mV).

szt.

	Rozwiązanie do kąpieli zewnętrznej	Roztwór do pipet wewnętrznych
NaCl [mM]	140	-
KCl [mM]	5.4	11
CaCl2 [mM]	1	-
MgCl2 [mM]	cyfra arabska	cyfra arabska
Stężenie glukozy [mM]	10	-
FILTR ELEKTROMAGNETYCZNY [mM]	10	10
K-asparaginian [mM]	-	Rozdział 119
Mg-ATP [mM]	-	3
EGTA [mM]	-	10
ph	7.4 (NaOH)	7.2 (KOH)
Osmolarność (dostosuj za pomocą glukozy) [mOsmol/L]	300 ± 5	300 ± 5

Tabela 4: Rozwiązania z zaciskiem krosowym.

6. Protokoły pomiarów typu patch-clamp
   1. Zapis protokołu fotoaktywacji w trybie V-clamp przy potencjale podtrzymania -74 mV. Używaj impulsów świetlnych o częstotliwości 300 ms.
      UWAGA: Sugerujemy wykonywanie nagrań V-clamp w pobliżu spoczynkowego potencjału błonowego hodowanego CM (ustalonego w I-clamp; w naszych rękach między -79 mV a -77 mV zarówno dla transdukowanego, jak i nietransdukowanego CM¹⁹). Świeżo wyizolowane ogniwa wykazują średni spoczynkowy potencjał błonowy wynoszący -79 mV (rysunek uzupełniający 2, wszystkie wartości po korekcie o potencjał złącza cieczy).
   2. Nagrywaj AP w trybie I-clamp przy 0 pA.
      1. W przypadku stymulacji elektrycznej wstrzyknij impulsy prądu o długości 10 ms (przejście od 0 pA do ustawionej wartości w ciągu 10 ms), 0,25 Hz i znajdź próg wywołania AP. Zarejestruj AP przez wstrzyknięcia prądu o 50% większe niż próg.
      2. Do stymulacji optycznej używaj impulsów świetlnych o długości 10 ms, 0,25 Hz przy minimalnym natężeniu światła, aby uzyskać niezawodny punkt dostępowy.
   3. Zapis fotoinhibicji w trybie I-clamp przy 0 pA. Wywołaj AP zgodnie z opisem w kroku 5.6.2.1 i stosuj światło ciągłe przez 64 s przy 4 mW/^mm2 po 15 elektrycznie wyzwalanych AP.
      UWAGA: Rysunek 6F pokazuje protokół fotoinhibicji, w którym podczas długotrwałego światła stosuje się zastrzyki o wyższym natężeniu. Począwszy od 1,5-krotności progu (tutaj: 0,7 nA) wstrzykiwany prąd był zwiększany w krokach co 0,1 nA (poziom końcowy: 2,2 nA). Przy wszystkich badanych amplitudach prądu, długotrwałe zastosowanie światła hamowało generowanie AP.
      1. W ramach eksperymentu kontrolnego przerwij stymulację elektryczną na 64 s bez aplikacji światła.
7. Eksperymenty z zaciskiem krosowym
   UWAGA: Wykonaj następujące eksperymenty w ciemności (czerwone światło może być używane do narzędzi aktywowanych niebieskim/zielonym światłem).
   1. Umieścić szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze pomiarowej z roztworem zewnętrznym i wybrać fluorescencyjny CM.
      UWAGA: Ogniwa eGFP-dodatnie można wykryć za pomocą niebieskiej diody LED (460 nm) w połączeniu z filtrem wzbudzenia pasmowo-przepustowym (450 nm - 490 nm), zwierciadłem dichroicznym 510 nm i długoprzepustowym filtrem emisyjnym 515 nm. Jeśli używane są inne znaczniki fluorescencyjne, użyj odpowiednich zestawów diod LED i filtrów fluorescencyjnych. Jeśli zostanie osiągnięta wysoka wydajność transdukcji (w naszych rękach >99% z adenowirusem GtACR1), nie ma potrzeby sprawdzania fluorescencji eGFP przed eksperymentami funkcjonalnymi; pozwala to uniknąć potencjalnej wstępnej aktywacji GtACR1.
   2. Napełnij pipetę z plastrem roztworem wewnętrznym. Upewnij się, że w końcówce nie ma pęcherzyków powietrza.
   3. Przymocuj pipetę do uchwytu pipety, wkładając do roztworu wewnętrznego drut ze srebra pokryty chlorkiem srebra.
   4. Po osiągnięciu konfiguracji podłączonej do ogniwa przełącz się w tryb całego ogniwa w oprogramowaniu do akwizycji danych o potencjale podtrzymania -74 mV. Rozerwij membranę, delikatnie stosując podciśnienie, aby uzyskać dostęp do konfiguracji całych komórek. Wskazuje na to natychmiastowy wzrost mierzonej pojemności.
   5. Uruchom protokoły opisane w sekcji 5.6.
8. Technika włókna węglowego
   1. Produkuj włókna węglowe.
      1. Należy stosować kapilary szklane o następujących parametrach: średnica zewnętrzna: 2,0 mm, średnica wewnętrzna: 1,16 mm, długość: 100 mm (patrz Tabela Materiałów). Za pomocą ściągacza do mikropipet wciągnąć szklaną kapilę do dwóch pipet o tej samej długości (całkowita długość stożka ~11 mm, Rysunek 5) do końcowej średnicy wewnętrznej ~30 μm.
         UWAGA: Ustawienia używane dla pierwszego i drugiego pociągnięcia to odpowiednio 85.2% (proporcja do maksymalnej mocy ściągacza) i 49.0% (zależy od ściągacza, typu i wieku filamentu).
      2. Wyginaj pipety do 45° za pomocą samodzielnie wykonanej mikrokuźni, korzystając z ustawień 12 V, 24 A (patrz Rysunek 4, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konfiguracji gięcia pipet).
         1. Wyrównaj kapilarę (2) na czerwonej linii w okręgu orientacyjnym (5), utrzymuj stałe położenie kapilary, tak aby długość części zgiętej była zawsze taka sama po środku okręgu orientacyjnego (promień 4,5 mm).
         2. Zegnij kapilę do 45° (zielona linia), dociskając końcówkę kapilary za pomocą giętarki (3) i kuj, podgrzewając włókno (4), aż kapilara uchwyci kąt 45°, nawet po wyjęciu giętarki.
      3. Dopasuj włókna węglowe (dostarczone przez prof. Jean-Yves Le Guennec) do cienkiej końcówki szklanej kapilary pod mikroskopem stereoskopowym. Używaj cienkich kleszczyków z miękką rurką na końcu, aby zwiększyć przyczepność i zmniejszyć ryzyko uszkodzenia włókien.
         UWAGA: Włókna te charakteryzują się mikrostrukturami, które zwiększają powierzchnię kontaktu między włóknami a komórkami, poprawiając w ten sposób adhezję²⁰.
      4. Przytnij włókna węglowe na długości 2 mm i użyj super kleju (cyjanoakrylanu), aby przymocować włókno do przedniej części kapilary.
         UWAGA: Im dłuższe są włókna, tym bardziej wyginają się pod wpływem tej samej siły.
   2. Kalibruj włókna węglowe.
      1. Skalibruj włókna węglowe za pomocą przetwornika siły o czułości 0,05 mN/V i zakresie siły 0 - 0,5 mN (patrz Tabela materiałów).
         UWAGA: Ta konfiguracja jest wykonywana na zamówienie w celu pomiaru kompresji, a nie "ciągnięcia".
      2. Przymocuj kapilarnę z włóknem węglowym do uchwytu, który jest sterowany przez mikromanipulator i silnik piezoelektryczny.
      3. Umieść końcówkę światłowodu w kontakcie z czujnikiem siły, ale bez wytwarzania siły i przesuwaj silnik piezoelektryczny w krokach co 10 μm (całkowity ruch 60 μm) w kierunku czujnika i odczytaj zmierzone napięcie (E) w woltach
         UWAGA: Upewnij się, że przetwornik siły styka się z samym końcem wolnego końca włókna węglowego.
      4. Powtórz te pomiary trzy razy.
      5. Użyj wzoru 1, aby obliczyć siłę dla każdej pozycji piezoelektrycznej (ΔΕ różnica zmierzonego napięcia między stopniami silnika piezoelektrycznego):
         
         UWAGA: Czułość przetwornika siły jest zależna od modelu przetwornika (tutaj: 0,05 mN/V = 50 μN/V). Wzmocnienie można ustawić na sterowniku.
      6. Wykreślić siłę [μN] w stosunku do pozycji piezoelektrycznej. Nachylenie odpowiada sztywności włókien [μN/μm].
   3. Rekordowa siła kontraktacji CM.
      UWAGA: Wykonaj następujące eksperymenty w ciemności (czerwone światło może być używane do narzędzi aktywowanych niebieskim/zielonym światłem).
      1. Pokryj powierzchnię komory pomiarowej poli-HEMA. Napełnić komorę pomiarową zewnętrznym roztworem do kąpieli i umieścić w komorze kilka kropli zawiesiny komórek hodowlanych (krok 4.9).
      2. Przymocuj kapilary z włóknami węglowymi do mikromanipulatora scenicznego. Wybierz CM z ekspresją GtACR1, sprawdzając zdolność do wywoływania skurczów poprzez zastosowanie krótkich impulsów zielonego światła. Wyrównaj włókna węglowe prawie poziomo z powierzchnią komory pomiarowej.
      3. Opuść pierwsze włókno na powierzchnię komórki. Przymocuj drugie włókno równolegle do pierwszego włókna na drugim końcu CM. Idealne wyrównanie jest prawie prostopadłe do osi komórki.
         UWAGA: Przymocuj światłowód, delikatnie dociskając ogniwo do dolnej powierzchni. Zwolnij ciśnienie przed przymocowaniem drugiego włókna. Nie rozciągaj komórki, przyczepiając drugie włókno.
      4. Po przymocowaniu obu włókien do ogniwa, podnieś włókna, aby ogniwo nie miało już kontaktu z powierzchnią komory i było w stanie kurczyć się bez tarcia.
      5. Skoncentruj sarkomery w oprogramowaniu do akwizycji danych (patrz Tabela materiałów) i ustaw okno śledzenia długości sarkomeru (Rysunek 7A I (3)) między włóknami.
         UWAGA: Wynikowe widmo mocy FFT (Rysunek 7A I (2)) pokazuje idealnie jeden ostry pik, reprezentujący średnią długość sarkomeru.
      6. Śledź gięcie włókien za pomocą modułu wykrywania krawędzi. Ustaw obszary detekcji za pomocą czerwonego i zielonego okna i zdefiniuj próg (czerwona i zielona linia pozioma) na pierwszej pochodnej śladu natężenia światła (Rysunek 7A III).
      7. Zacznij optycznie nadawać tempo komórce przy 0,25 Hz (jeśli to możliwe, spróbuj szybszych temp) i śledź długość sarkomeru i zginanie włókien.
         UWAGA: Pozycja uchwytu światłowodu, wyzwalacz LED i impulsy stymulacji elektrycznej są kontrolowane za pomocą oprogramowania do akwizycji danych (patrz Tabela materiałów).
      8. Po zarejestrowaniu co najmniej 15 optycznie wywołanych skurczów, stymuluj komórkę polem elektrycznym (patrz Tabela Materiałów). Znajdź próg, aby wywołać skurcze i nagrywaj, przykładając 1,5-krotność napięcia progowego.
      9. W przypadku protokołu hamowania zastosuj bodźce elektryczne w celu wywołania skurczów, a następnie wystaw się na działanie ciągłego światła przez 64 s (przy różnym natężeniu światła).

Rysunek 4: Konfiguracja gięcia pipet. (1) Mikromanipulator po lewej stronie służy do kontrolowania położenia kapilary, a drugi mikromanipulator po prawej służy do jej zginania. (2) Kapilara. (3) Giętarka. (4) Mikrokuźnia. (5) Okrąg orientacyjny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Pipeta z włóknem węglowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Analiza danych

1. Nagrania z zaciskiem krosowym
   UWAGA: Po eksperymencie skoryguj wszystkie nagrane i zadane napięcia dla potencjału złącza cieczy. Określ potencjał złącza cieczowego w oprogramowaniu do akwizycji danych za pomocą kalkulatora potencjału złącza narzędzia (dla podanych rozwiązań patch-clamp w tabeli 4: 14,4 mV przy 21 °C). Odejmij potencjał złącza cieczy od zarejestrowanego/sterującego napięcia.
   1. W przypadku nagrań AP z zaciskiem I-clamp sprawdź stymulację elektryczną w porównaniu ze stymulacją optyczną. Oblicz czas trwania AP (APD) przy 20 i 90% repolaryzacji za pomocą niestandardowego skryptu (materiał uzupełniający). Określ spoczynkowy potencjał błonowy i amplitudę AP.
      UWAGA: Określ APD zgodnie z opisem w Wang K. et al.²¹ Skrypt do ładowania plików .abf jest ogólnie dostępny pod następującym linkiem: https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload. Średnie wartości APD dla co najmniej 6 AP.
   2. W przypadku fotoaktywacji V-clamp sprawdź, czy linia bazowa wynosi 0 pA. Jeśli nie, ustaw linię bazową na zero. Analizuj zarejestrowany prąd wyzwalany impulsami świetlnymi o długości 300 ms przy napięciu -74 mV. Przenieś dane do oprogramowania do analizy danych i określ szczytowy i średni prąd stacjonarny.
2. Eksperymenty z włóknem węglowym
   1. Zapisy skurczów podczas stymulacji optycznej: Załaduj zarejestrowane dane do oprogramowania do akwizycji danych i odczytaj linię bazową i maksima wygięcia włókna węglowego oraz zmiany długości sarkomeru.
      UWAGA: Średnie wartości dla 10 skurczów stabilnego nagrania.
   2. Zmierz szerokość komórki i oblicz pole przekroju poprzecznego komórki, przyjmując przekrój eliptyczny (Rysunek 7B II).
      UWAGA: Wzór na pole elipsy to A = π·a·b (Wzór 2), gdzie a jest odległością od środka do wierzchołka, a b jest odległością od środka do współwierzchołka. W naszym przypadku oznacza to a = (szerokość komórki)/2 i b = (grubość komórki)/2. Według Nishimura et al.²² grubość CM można oszacować na jedną trzecią szerokości komórki, więc A = π·(1/2)·szerokość·(1/2)·grubość = π·(1/4)·szerokość·(1/3)·szerokość = π·(1/12)·szerokość².
   3. Obliczać końcowo-skurczową siłę (F):
      
   4. Obliczać końcowoskurczowe odkształcenie komórek (ESD):
      
      UWAGA: Można analizować dalsze parametry kurczliwości: długość spoczynkowego sarkomeru, czas do szczytu, czas do 90% relaksacji, frakcyjne skrócenie sarkomeru, maksymalną prędkość skurczu i relaksacji (patrz instrukcja akwizycji oprogramowania).

Wyniki

GtACR1-eGFP wyrażono w hodowli królików CM (Figura 6 insert), a fotoprądy zostały zmierzone techniką patch-clamp. Fotoaktywacja GtACR1 wykazuje duże prądy skierowane do wewnątrz przy -74 mV. W Rysunek 6Prąd szczytowy (I_P) przy 4 mW/^mm2 wynosi 245 pA. AP były wyzwalane elektrycznie (Rysunek 6B) lub optycznie (Rysunek 6C) z zastrzykami prądu odpowiednio 1,5 razy przekraczającymi próg, lub krótkimi depolaryzującymi impulsami świetlnymi o długości 10 ms. Analizując wartości APD, CM z impulsem elektrycznym pokazują APD 20 wynoszące 0,24 ± 0,08 s i APD 90 wynoszące 0,75 ± 0,17 s, podczas gdy CM ze stymulacją optyczną pokazują APD 20 wynoszące 0,31 ± 0,08 s i APD 90 wynoszące 0,81 ± 0,19 s (SE, n = 5, N = 2, w przedstawionym przykładzie APD 20_electrical = 0,17 s; APD 20_optyczny = 0,27 s i APD 90_elektryczny = 0,61 s; APD 90_optyczny = 0,68 s; Rysunek 6D). Optycznie sterowany CM wykazuje wolniejszy początek AP (Rysunek 6D). Aktywacja CM została zahamowana przy długotrwałym oświetleniu (przez 64 s, 4 mW/^mm2) poprzez polaryzację potencjału błonowego w kierunku potencjału odwrócenia chlorku, tutaj -58 mV (Rysunek 6E). Wyższe wstrzyknięcia prądu niż 1,5-krotność progu nie wywołują generowania AP (Rysunek 6F). Wygenerowane siły szczytowe zostały określone na podstawie zginania włókna węglowego (Rysunek 7B,C,E). CM wygenerował 232 μN/^mm2 po stymulacji elektrycznej (Rysunek 7B) i 261 μN/^mm2 po stymulacji optycznej (Rysunek 7C). Przedłużone impulsy zielonego światła hamują skurcze (Rysunek 7E). Po zahamowaniu optycznym przez 64 s, powtarzające się skurcze generują mniejszą siłę skurczu, a wartości siły wracają do wartości wyjściowej po ~10 skurczach (tempo przy 0,25 Hz, Rysunek 7D) zgodnie z rozkurczową utratą wapnia z CM królika.

Rysunek 6: Reprezentatywne nagrania patch-clamp CM o stymulacji elektrycznej i optycznej/hamowaniu. (A) Reprezentatywny prąd fotologiczny przy napięciu -74 mV przy impulsie świetlnym 300 ms, 4 mW/mm². I_P oznacza prąd szczytowy. Wkładka pokazuje komórkę dodatnią GtACR1-eGFP. (B) Reprezentatywny zapis AP przy 0 pA przy użyciu rampy prądowej 10 ms, 0,6 nA w celu elektrycznego nadążania CM. (C) Reprezentatywny zapis AP przy 0 pA przy użyciu impulsów świetlnych 10 ms, 0,4 mW/mm². (D) Górny wykres pokazuje nakładanie się 10-tego AP aktywowanego elektrycznie (niebieski) i optycznie (zielonego) CM. AP zostały wyrównane przez maksymalną zmianę potencjału błony (dV/dt max). Dolny wykres przedstawia różnicę potencjału błonowego między optycznie i elektrycznie wyzwalanym AP (E_{optical-E electrical).} (E) Elektrycznie wyzwalane AP były hamowane w ciągłym świetle 64 s, 4 mW/mm². (F) AP są hamowane przez wstrzyknięcia prądu wyższego niż 1,5-krotność progu (od 0,7 nA w krokach od 0,1 nA do 2,2 nA) w świetle ciągłym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Reprezentatywne dane z zapisów włókien węglowych optycznie i elektrycznie przyspieszonego/zahamowanego CM. (A) Wyświetlanie w oprogramowaniu do akwizycji danych. Rysunek (I) przedstawia zmierzony CM z okienkiem do obliczania długości sarkomeru. Szerokość komórki jest oznaczona kolorem pomarańczowym. (1) Zakres odpowiednich częstotliwości. (2) Widmo mocy FFT pokazuje częstotliwość odstępów sarkomerowych na komórce. Średnia długość sarkomeru jest obliczana na podstawie częstotliwości szczytowej. (3) Okno śledzenia długości sarkomeru. (4) Ślad intensywności. (5) Ślad intensywności pomnożony przez okno Hamminga jest śladem intensywności w okienku. Schemat (II) przedstawia eliptyczny przekrój komórki. Szerokość w kolorze pomarańczowym i grubość w przerywanym kolorze niebieskim. Rysunek (III) pokazuje położenie włókien węglowych wraz z odpowiednimi polami detekcji, po lewej stronie na czerwono, a po prawej na zielono. (6) Ślad intensywności. (7) Pierwsza pochodna śladu intensywności (zob. instrukcja obsługi oprogramowania do akwizycji danych). (B) Reprezentatywny ślad skurczów wywołanych elektrycznie. Panel (I) pokazuje skrócenie długości sarkomeru, panel (II) odległość między dwoma włóknami węglowymi. (C) Reprezentatywny ślad optycznie wywołanych skurczów (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm²). Panel (I) pokazuje skrócenie długości sarkomeru, panel (II) odległość między dwoma włóknami węglowymi. (D) Wygenerowana siła szczytowa od skurczu 1 do 11 po przerwie spowodowanej zahamowaniem wytwarzania AP. (E) Reprezentatywny ślad optycznego hamowania skurczów przy stałym oświetleniu (525 nm, 64 s, 6 mW/mm²). Panel (I) pokazuje skrócenie długości sarkomeru, panel (II) długość między dwoma włóknami węglowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

ZA	obszar
Konferencja ACR	Anion kanałrrodopsyna
Ap	potencjał czynnościowy
APD (Dawka Przeciw	Czas trwania potencjału czynnościowego
Jednostka CFU	Jednostka tworząca kolonie
Chr	Rodopsyna kanałowa
centymetr	kardiomiocyty
Certyfikat eGFP	Wzmocnione białko zielonej fluorescencji
Esd	koniec skurczowej deformacji komórek
UE	Jednostki endotoksyn
Z	siła
Fft	szybka transformata Fouriera
GtACR (GtACR)	Guillardia theta anion channelrhodopsyna
interfejs graficzny	Graficzny interfejs użytkownika
Zacisk dwuteowy	cęgi prądowe
J.m.	Jednostki międzynarodowe
MOI (Urząd Miasta)	Mnogość infekcji
poli-HEMA	poli(metakrylan 2-hydroksyetylu)
Zacisk V	cęgi napięciowe

Tabela 5: Lista skrótów.

Rysunek uzupełniający 1: Pomiary natężenia światła za pomocą miernika mocy optycznej. (A) Pomiar impulsów świetlnych o długości 10 ms przy 4 mW/mm². (B) Pomiar ciągłego natężenia oświetlenia przez 64 s przy 4 mW/mm². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 2: Właściwości świeżo wyizolowanego CM i ich adaptacja strukturalna w hodowli. (A) Zapis AP świeżo wyizolowanego CM (APD 20 z 1,11 ± 0,34 s, APD 90 z 1,96 ± 0,32 s, n = 7, N = 2). Średni spoczynkowy potencjał błonowy: -79,3 ± 0,8 mV (n = 7, N = 2). (B) Zapis z włókna węglowego świeżo odizolowanego CM z napędem elektrycznym. Średnia siła szczytowa 205 ± 78 μN/^mm2 (n = 7, N = 2). (C) Obrazy konfokalne świeżo wyizolowanego CM (I); nietransdukowany (II) i transdukowany (III) CM po 48 godzinach w hodowli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Materiał uzupełniający: Skrypt MatLab do określania APD i spoczynkowego potencjału błony. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Podczas gdy narzędzia optogenetyczne umożliwiają modulację elektrofizjologii komórek pobudliwych w sposób nieinwazyjny, wymagają one dokładnej charakterystyki w różnych typach komórek (np. CM), aby umożliwić wybór najlepszego dostępnego narzędzia dla konkretnego projektu eksperymentalnego. Technika patch-clamp jest standardową metodą oceny elektrofizjologii komórkowej. W konfiguracji całej komórki pozwala na rejestrowanie fotoaktywowanych prądów przez błonę plazmatyczną lub czasowych zmian napięcia błony po stymulacji/hamowaniu światła. Optogenetyczna manipulacja pobudzenia elektrycznego wpływa również na skurcze CM. Używamy śledzenia sarkomeru i pomiarów siły wspomaganych włóknem węglowym, aby określić ilościowo wpływ przesłuchania optycznego na aktywność mechaniczną miocytów.

Opisujemy protokół charakteryzujący podstawowe efekty kanału chlorkowego bramkowanego światłem, GtACR1, w CM. Jako system modelowy wybraliśmy CM królików, ponieważ ich cechy elektrofizjologiczne (np. kształt AP i okres refrakcji) bardziej przypominają te obserwowane u CM człowieka niż CM gryzoni. Co więcej, CM królika może być hodowany przez kilka dni, wystarczająco długo, aby dostarczyć adenowirusa i uzyskać ekspresję GtACR1-eGFP. Warto zauważyć, że izolowane CM zmieniają swoje właściwości strukturalne w hodowli w czasie, w tym zaokrąglanie zakończeń komórek i stopniową utratę prążkowania krzyżowego, układu T-rurkowego i kaweoli^23,24. Zgodnie z tym, w hodowanym CM odnotowano zmiany funkcjonalne: depolaryzację spoczynkowego potencjału błonowego, wydłużenie AP i zmiany w komórkowej obsłudze Ca^{2 +}. Aby zapoznać się z przeglądem adaptacji komórkowych w hodowli, zobacz Louch et ^al.25. Rysunek uzupełniający 2 przedstawia przykładowe pomiary AP i skurczu świeżo wyizolowanego CM w celu porównania z tymi obserwowanymi w hodowlanym CM (Figura 6, Ryc. 7) przy użyciu przedstawionego tutaj protokołu.

Zapisy typu patch-clamp dla całych komórek umożliwiają bezpośrednie pomiary właściwości fotoprądowych (np. amplitudy i kinetyki) oraz wywołanych światłem zmian potencjału błonowego lub charakterystyki AP w wysokiej rozdzielczości czasowej. Jednak takie zapisy mają kilka ograniczeń: po pierwsze, cytozol jest zastępowany roztworem pipety w nagraniach całych komórek, co jest korzystne dla kontrolowania jonowych gradientów elektrochemicznych, ale ma wewnętrzną wadę wypłukiwania organelli komórkowych, białek i innych związków, co potencjalnie wpływa na komórkowe odpowiedzi elektryczne. Po drugie, skutki uboczne, takie jak aktywacja dodatkowych kanałów jonowych wynikająca z niefizjologicznie długiej depolaryzacji (np. powolne stałe czasowe kanałów jonowych bramkowanych światłem) są trudne do oceny, ponieważ nasza metoda pozwala jedynie na wykrycie zmian w APD, ale nie pozwala na przeprowadzenie bezpośrednich pomiarów stężeń jonów w elektrofizjologicznie istotnych przedziałach komórkowych. Można to zrobić za pomocą wskaźników fluorescencyjnych (np. czujników Ca²⁺ ) lub elektrod jonoselektywnych. Dalsza charakterystyka może obejmować miareczkowanie natężenia światła, określenie zależności pH, kinetykę fotoprądów przy różnych potencjałach błonowych oraz kinetykę odzyskiwania podczas powtarzalnej stymulacji światłem.

W przeciwieństwie do nagrań patch-clamp, pomiary siły pojedynczej komórki umożliwiają analizę skurczów komórkowych nienaruszonych miocytów bez wpływu na ich środowisko wewnątrzkomórkowe. Wtórny wpływ na stężenia jonów (np. Ca²⁺) można pośrednio ocenić poprzez określenie generowanej amplitudy i dynamiki siły (np. maksymalna prędkość skurczu i relaksacji; tutaj nie analizowane). Pomiary siły techniką włókna węglowego mają przewagę nad swobodnie kurczącymi się ogniwami, ponieważ dostarczają bezpośrednich informacji o siłach biernych i czynnych w ogniwach wstępnie obciążonych (tj. w warunkach bardziej zbliżonych do warunków in situ lub in vivo). Mechaniczne napięcie wstępne jest szczególnie ważne przy analizie kurczliwości komórek, ponieważ rozciągliwość wpływa na wytwarzanie siły i relaksację^26,27.

Podejścia optogenetyczne pozwalają na czasoprzestrzennie precyzyjną manipulację potencjałem błony komórkowej, zarówno w pojedynczym CM, jak i nienaruszonej tkance serca. Klasycznie, ChR2, nieselektywny kanał kationowy bramkowany światłem, został użyty do depolaryzacji potencjału błonowego, podczas gdy napędzane światłem pompy protonowe i / lub chlorkowe zostały użyte do hiperpolaryzacji błony. Obie grupy siłowników optogenetycznych wymagają wysokich poziomów ekspresji, ponieważ ChR2 charakteryzuje się wewnętrznie niską przewodnością jednokanałową²⁸, a pompy napędzane światłem maksymalnie transportują jeden jon na pochłonięty foton. Ponadto przedłużona aktywacja ChR2 w CM może prowadzić do przeciążenia Na⁺ i/lub Ca²⁺, a pompy napędzane światłem mogą zmieniać transsarkolemmalne gradienty H⁺ lub Cl^{- 29,30}. W poszukiwaniu alternatywnych narzędzi do optogenetycznej kontroli aktywności CM, niedawno przetestowaliśmy naturalną rodopsynę anionokanałową GtACR1, charakteryzującą się lepszą przewodnością jednokanałową i wyższą wrażliwością na światło w porównaniu z kationami ChR, takimi jak ChR2. Odkryliśmy, że aktywacja GtACR1 depolaryzuje CM i może być używana do stymulacji optycznej i hamowania, w zależności od czasu i czasu trwania impulsu świetlnego. Dodatkową zaletą stosowania ACR zamiast kationu ChR może być bardziej ujemny potencjał odwrócenia Cl^- w porównaniu do Na⁺, redukujący sztucznie wprowadzane prądy jonowe. Jak pokazaliśmy wcześniej, stymulacja optyczna z GtACR1 może prowadzić do wydłużenia AP w wyniku powolnej składowej zamykania kanału GtACR1, którą można przezwyciężyć poprzez zastosowanie szybszych mutantów GtACR1¹⁹. Jednak wydłużenie AP jest znacznie mniej wyraźne przy stosowaniu niższego, bardziej fizjologicznego wewnątrzkomórkowego stężenia Cl^- (patrz ryc. 6). Co więcej, hamowanie za pośrednictwem GtACR1 przez przedłużone oświetlenie powoduje głęboką depolaryzację błony, która ponownie może aktywować wtórny napływ Na⁺ i Ca²⁺, zmieniając w ten sposób aktywność kanałów bramkowanych napięciem. W naszych pomiarach stwierdzamy, że parametry AP i skurczu wracają do wartości wyjściowej w ciągu 40 s po inhibicji wywołanej światłem przez 1 minutę (patrz Kopton i in. 2018, Rysunek 6, Rysunek 7). Bramkowane światłem kanały K⁺ stanowią potężną alternatywę dla wyciszania CM bez wpływu na spoczynkowy potencjał błonowy CM³¹.

W przyszłości chcielibyśmy ilościowo porównać różne narzędzia optogenetyczne pod kątem ich potencjału do hamowania czynności serca. W tym celu testujemy różne kanały jonowe bramkowane światłem, w tym ACR, ChR2 i warianty ChR z przesunięciem ku czerwieni³², a także aktywatory hiperpolaryzacyjne, takie jak halorodopsyna lub bramkowana światłem cyklaza adenylowa bPAC w połączeniu z kanałem potasowym SthK (PAC-K)³¹.

Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do dogłębnej charakterystyki właściwości elektromechanicznych CM. Ma ona zasadnicze zastosowanie również do CM innych gatunków oraz do CM wyizolowanego z chorego mięśnia sercowego. Stymulacja optyczna pozwala na nadawanie tempa CM na różnych częstotliwościach, a różne napięcia wstępne mogą być testowane podczas eksperymentów ze skurczem włókien węglowych. Ciekawym eksperymentem byłoby wykorzystanie oświetlenia o niskiej intensywności do depolaryzacji podprogowej, aby naśladować stopniowy wzrost spoczynkowego potencjału błonowego, co można zaobserwować podczas rozwoju przebudowy tkanki serca podczas progresji choroby. Wreszcie, pomiary funkcjonalne można połączyć z obrazowaniem^Ca2+ w celu uzyskania dalszego wglądu w sprzężenie wzbudzenia-skurczu lub z interwencjami farmakologicznymi w celu oceny wpływu różnych leków na aktywność CM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Equipment - Izolacja komórek/Hodowla/Transdukcja
Adeno-X Adeno-X Adenoviral System 3 CMV	TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, Kalifornia, USA
Kaniula aorty	Radnoti		4,8 OD x 3,6 ID x 8-9 L
mm Szkiełka nakrywkowe i ukośniki 16 mm, grubość nr 0	VWR International GmbH, Leuven, Belgia	631-0151	Szkło borokrzemianowe
Griffin Silk, czarne, 2 m długości, rozmiar 3, 0,5 mm	Samuel Findings, Londyn, Wielka Brytania	TSGBL3
	Nowy Brunszwik, Eppendorf, Schö nenbuch, Szwajcaria	Galaxy 170S
Langendorff-perfuzja	konfiguracja Zitt-Thoma Laborbedarf Glasblä serei, Fryburg Bryzgowijski, Niemcy		Pompa
Langendorff	na zamówienie Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zü bogaty, Szwajcaria	ISM444
Siatka: Nylonowa tkanina filtracyjna Monodur	Cadisch Precision Meshes Ltd		800 & m otworów, 1 m
szerokości Komora Neubauera	VWR International GmbH, Leuven, Belgia	717806
Rabbit, Nowa Zelandia White	Charles River	Kod szczepu: 052
Nożyczki	Aesculap AG, Tuttlingen, Niemcy	BC774R	Bauchdeckenschere ger. 18cm
Filtr sterylny, 0,22 &mikro; m	Merck, Darmstadt, Niemcy	SLGP033RB
Equipment - Patch-clamp
Amplfier	AxonInstruments, Union City, CA, Stany Zjednoczone	Axopatch 200B
Szkiełko nakrywkowe i ukośnik; 50 mm, grubość nr 1	VWR International GmbH, Leuven, Belgia	631-0178	Digitizer ze szkła borokrzemianowego
Axon Digidata	Molecular Devices, San José, Kalifornia, Stany Zjednoczone	1550A
(530/20)	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	11513878	BZ:00
Filter (630/20)	Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, Stany Zjednoczone	227155
Headstage	AxonInstruments, Union City, CA, Stany Zjednoczone	CV203BU
Interface	Scientifica, Uckfield, Wielka Brytania	Rack 1U, 352036
LED 525 nm	Luminus Devices, Sunnyvale, CA, Stany Zjednoczone	PT-120-G
	Essel Research and Development, Toronto, Kanada
System sterowania LED	wykonany
ściągacz do mikropipet	Narishige Co., Tokio, Japonia	Mikroskop PP-830
odwrócony	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	DMI4000B
Zmotoryzowany mikromanipulator	Scientifica, Uckfield, Wielka Brytania	Miernik
	Thorlabs, Newton, NJ, Stany Zjednoczone	PM100D
	RS Components, Corby, Wielka Brytania	494-124
Srebrny drut	A-M Systems, Sequim, WA, Stany Zjednoczone	787500	Srebrny, goły 0,015 '', powlekany 0,0190 '', długość 25 stóp
Kapilary ze szkła sodowo-wapniowego	Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Dania	160213 BRIS, ISO12772	1,55 OD x 1,15 ID x 75 L mm
Oprogramowanie Axon pClamp	Molecular Devices, San José, CA, Stany Zjednoczone	Wersja 10.5
Oprogramowanie MatLab2017	The MathWorks, Inc.
Mikrometr sceniczny	Graticules Optics LTD, Tonbridge, Wielka Brytania	1 mm
Sprzęt - włókno węglowe
włókna węglowe	dostarczone przez Prof. Jean-Yves Le Guennec		BZ:00
Digitizer Axon Digidata	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Stany Zjednoczone	1550B
(530/20)	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	11513878
Filter (630/20)	Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, Stany Zjednoczone	227155
Interfejs systemu fluorescencji	IonOptix, Milton, MA Stany Zjednoczone	FSI-800	2.0 OD x 1.16 ID x 100 L
przetwornika siły	Aurora Scientific Inc., Ontario, Kanada	406A
Szklane kapilary do pomiaru siły pomiary	Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, Stany Zjednoczone	GC200F-10
Interface National Instruments	National Instruments, Budapeszt, Węgry	BNC-2110
LED 525 nm	Luminus Devices, Sunnyvale, CA, Stany Zjednoczone	PT-120-G
	Essel Research and Development, Toronto, Kanada
Sterowanie LED system	na
Mikrokontroler	Parallax Inc., Rocklin, Kalifornia, Stany Zjednoczone	śmigłowych
	Narishige Co., Tokio, Japonia	PC-10
odwrócony	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	DMI4000B
Kamera MyoCam-S	IonOptix, Dublin, Irlandia
Kamera MyoCam-S Power	IonOptix, Milton, MA, Stany Zjednoczone	MCS-100
Stymulator pola MyoPacer	IonOptix Cooperation, Milton, MA, Stany Zjednoczone	MYP100
Piezo Motor	Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Niemcy	E-501.00
Smar silikonowy	RS Components, Corby, Wielka Brytania	494-124
Oprogramowanie Axon pClamp	Molecular Devices, San José, CA, Stany Zjednoczone	Wersja 10.5
Oprogramowanie IonWizard	IonOptix, Dublin, Irlandia	Wersja 6.6.10.125
Oprogramowanie MatLab2017	The MathWorks, Inc.
Mikrometr sceniczny	Graticules Optics LTD, Tonbridge, Wielka Brytania	1 mm
Chemicals
Adenosine	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	A9251-100G
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	A7030-50G
CaCl2	Honeywell Fluka, Muskegon, MI, Stany Zjednoczone	21114-1L
Chlorowodorek L-karnityny	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	C9500-25G
Kolagenaza typu 2, 315 U/mg	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS004177
Creatine	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	C0780-50G
Cytozyna-β- D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	C1768-100MG
EGTA	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy	3054.3
Chlorowodorek esketaminy, Ketanest S 25 mg/ml	Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Niemcy	PZN-07829486
Surowica bydlęca	płodu Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	F9665
Gentamycyna 50 mg/ml	Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA	15750-037
Glukoza	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	G7021-1KG
Heparyna sodowa, 5,000 IU/ml	Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy	PZN-03029843
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	H3375-1KG
Insulina (bydlęca trzustka)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	I6634-50MG
K-asparaginian	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	A6558-25G
KCl	VWR International GmbH, Leuven, Belgia	26764.260	1 mg/ml
KOH	Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA	35113-1L
Laminina z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm membrana podstawna	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	L2020-1MG
M199-Medium	Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	M4530
Mg-ATP	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	A9187-1G
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	63069-500ML
NaCl	Fisher Scientific, Loughborough, Leics., Wielka Brytania	10428420
NaCl-Solution 0,9%, Izoton Kochsalz-Lö sung 0.9%	Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy	3200950
NaOH	AppliChem GmbH, Darmstadt, Niemcy	A6579	bez Ca2+/Mg2+
Na-pyruvat	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	P2256-100MG
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	D1408-500ML
Poli(2-hydroksyetylometakrylan)	Sigma, Poole, Wielka Brytania	192066
Proteaza XIV ze Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	P5147-1G
Tauryna	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	T0625-500G
Tiopental Inresa 0,5 g	Inresa Arzneimittel GmbH, Fryburg, Niemcy	PZN-11852249
Chlorowodorek ksylazyny, Rompun 2%	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Niemcy	PZN-01320422